EP4025713A1

EP4025713A1 - Verfahren und mittel zur diagnose von lungenkrebs

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Publication number: EP4025713A1
Application number: EP20764417.0A
Authority: EP
Inventors: Torsten GOLDMANN; Sebastian MARWITZ; Ole Ammerpohl; Swetlana SCHEUFELE; Martin Reck
Original assignee: Lungenclinic Grosshansdorf; Christian Albrechts Universitaet Kiel; Forschungszentrum Borstel Leibniz Lungenzentrum FZB
Current assignee: Lungenclinic Grosshansdorf; Christian Albrechts Universitaet Kiel; Forschungszentrum Borstel Leibniz Lungenzentrum FZB
Priority date: 2019-09-05
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2022-07-13
Also published as: EP3789505A1; WO2021043986A1; US20230203590A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Diagnose von Lungentumoren. Sie stellt Verfahren zur Verfügung, die sowohl zur Diagnose von Lungentumoren auf Basis von OP-Proben als auch Lungenbiopsien (hier z.B. mit Hilfe von DNA-Mikroarrays) und von Flüssigbiopsien (Liquid Biopsies) geeignet sind. Bei Flüssigbiopsien wird zellfreie DNA (zfDNA) eingesetzt. Dabei werden sowohl besonders geeignete Analyseverfahren als auch besonders geeignete Sätze an Methylierungsmarkern beschrieben. Gegenstand der Erfindung sind auch Mittel, geeignet zur Diagnose von Lungenkrebs durch Untersuchung der Methylierung eines Satzes von Methylierungsmarkern, z.B. in zellfreier DNA (zfDNA) aus Flüssigbiopsie-Proben von Patienten, wobei das Mittel Oligonukleotide umfasst, welche mit DNA hybridisieren können, welche die Methylierungsmarker umfasst, sowie die Verwendung dieser Verfahren und Mittel zur Diagnose, also z.B. Bestimmung, Subtypisierung und prognostischen Charakterisierung von Lungentumoren.

Description

Verfahren und Mittel zur Diagnose von Lungenkrebs

Die vorliegende Erfindung betrifft die Diagnose von Lungentumoren. Sie stellt Verfahren zur Verfügung, die sowohl zur Diagnose von Lungentumoren auf Basis von OP-Proben als auch Lungenbiopsien (hier z.B. mit Hilfe von DNA-Mikroarrays) und von Flüssigbiopsien (Liquid Biop- sies) geeignet sind. Bei Flüssigbiopsien wird zellfreie DNA (zfDNA) eingesetzt. Dabei werden sowohl besonders geeignete Analyseverfahren als auch besonders geeignete Sätze an Methyl ierungsmarkern beschrieben. Gegenstand der Erfindung sind auch Mittel, geeignet zur Diagno se von Lungenkrebs durch Untersuchung der Methylierung eines Satzes von Methylierungs markern, z.B. in zellfreier DNA (zfDNA) aus Flüssigbiopsie-Proben von Patienten, wobei das Mittel Oligonukleotide umfasst, welche mit DNA hybridisieren können, welche die Methylie rungsmarker umfasst, sowie die Verwendung dieser Verfahren und Mittel zur Diagnose, also z.B. Bestimmung, Subtypisierung und prognostischen Charakterisierung von Lungentumoren.

Lungenkrebs ist weltweit die zweithäufigste Krebsart bei Männern und Frauen. In Deutschland werden jährlich ca. 52.500 Neuerkrankungen registriert. Das mittlere Erkrankungsalter liegt für Männer bei 70 und für Frauen bei 69 Jahren. Dabei wird zwischen dem kleinzelligen (engl. small cell lung cancer, SCLC) und nicht-kleinzelligen (engl non-small cell lung cancer, NSCLC) Lungenkarzinom unterschieden. NSCLC sind deutlich häufiger und treten bei 85% der betroffe nen Patienten auf. Des Weiteren werden bei NSCLC mehrere Subentitäten unterschieden, da von sind die häufigsten Adeno- und Plattenepithelkarzinome. Dass die Symptome der Erkrankung meistens sehr spät auftreten, spiegelt sich in einer schlechten Prognose wieder. Die 5-Jahres-Überlebensrate liegt bei 15%.

Lungenkarzinome weisen, wie die meisten anderen Tumore, eine hohe genomische Heteroge nität auf. So können z.B. Mutationen innerhalb von KRAS, EGFR, BRAF, MEK1, MET, HER2, ALK, ROS1, RET, FGFR1, DDR2, PTEN, LKB1, RB1, CDKN2A oder TP53 Genen die Entste- hung eines primären Lungenkarzinoms induzieren. Zusätzlich akkumulieren im Laufe der Tu mor-Evolution die sogenannten Passenger- Mutationen, die zu verschiedenen Subklonen führen können. Diese Tatsache macht die Entwicklung eines zuverlässigen, nur auf molekulargeneti schen Mutationsanalysen basierten Früherkennungstests sehr schwierig, was an vielen Bei spielen in der Literatur sichtbar wird. So haben z.B. Uchida et al. ein Lungenkarzinom-Screen/ng basierend auf typischen Mutationen des EGFR-Gens durchgeführt. Die durchschnittliche Sensitivität dieses Tests betrug nur 54,4% und fiel bei frühen Stadien IA-IIIA auf 22,2% (Uchida et al. [2015] Clin. Chem. 61: 1191-1196). Couraud et al. entwickelten einen NGS-basierten Test, bei dem die bekanntesten Mutationen innerhalb der EGFR, BRAF, KRAS, HER2 und PIK3CA Gene im Plasma analysiert wurden. Die Sensitivität dieses Tests betrug 58%. Auch hier stellte die Erkennung von Tumoren in frühen Stadien ein Problem dar (Couraud et al. [2014] Clin. Cancer Res. 20: 4613-4624). Newmann et al. entwickelten 2014 das CAPP-Seq. Hierbei handelte es sich um ein optimiertes NGS- Protokoll mit einer dazugehörigen bioinformatischen Auswertepipeline. Beim CAPP-Seq. wer den die bekanntesten NSCLC-Mutationen im Plasma sequenziert und analysiert, wodurch 100% der Lungenkrebspatienten Stadien II bis IV identifiziert werden konnten. Die Identifikation von Tumoren im Stadium I stellte aber auch hier wieder ein Problem dar, und die entsprechen de Sensitivität betrug nur 50% (Newman et al. [2014] Nat. Methods 20: 548-554). Diese Bei spiele zeigen deutlich die Problematik bei der Entwicklung eines zuverlässigen, nur auf genomi- schen Analysen basierten Lungenkarzinomfrüherkennungstests.

Zusätzlich zu Mutationen spielen während der Tumor-Evolution auch Epimutationen eine ent scheidende Rolle. So werden z.B. Promotoren innerhalb bestimmter Tumor-Suppressorgene hypermethyliert, was wiederum deren transkriptioneile Repression zur Folge hat. Dieses Phä nomen ist durch die Überexpression von DNA-Methyltransferasen begleitet. Besonders häufig wurde eine Promotor-Hypermethylierung in der Literatur innerhalb der P16INK4A, RASSF1A, APC, RARB, CDH1, CDH13, DAPK, FHIT und MGMT Gene beschrieben (Langevin et al. [2015] Transl. Res. 165: 74-90).

Die genomweite Hypomethylierung von NSCLC ist mit einer genomischen Instabilität assoziiert. Eine gezielte Hypomethylierung der Gene konnte bisher nur bei MAGEA3/6, TKTL1, BORIS, DDR1, YWHAZ sowie TMSB10 identifiziert werden (u.a. Newman et al. [2014] Nat. Methods 20: 548-554).

Des Weiteren weisen maligne Lungentumore häufig eine veränderte Histon-Acetylierung an den Positionen H4K5, H4K8, H4K12 und H4K16 auf. Auch der globale Anteil an H4K20me3 ist in NSCLC geringer als in gesundem Lungengewebe (Newman et al. [2014] Nat. Methods 20: 548- 554). Zusätzlich kann es zu aberranten ncRNA-Expression kommen, wie z.B. MIR196A, MIR200B, MALAT1 sowie HOTAIR.

Laut nationalen und internationalen Empfehlungen werden die betroffenenen Patienten im Mo ment bei einer Verdachtsdiagnose zunächst einer umfassenden körperlichen Untersuchung un terzogen. Nachfolgend wird der Brustkorb durch bildgebende Verfahren wie z.B. Röntgen oder Computertomographie (CT) untersucht. Falls dabei Tumore detektiert werden, sind nachfolgend Bronchoskopien empfohlen, bei der die Lungen endoskopisch gründlich analysiert sowie Biop sien der Tumore entnommen werden. Diese Biopsien werden nun histologischen, immunhisto- chemischen und molekulargenetischen Analysen unterzogen. Während der histologischen Untersuchungen wird festgestellt, ob die Tumoren bösartig sind. Falls dies der Fall ist, wird deren Entität ermittelt. Um die optimale Therapie zu identifizieren, werden zusätzlich molekulargenetische sowie bildgebende Verfahren herangezogen. Vor allem die bildgebenden sowie endoskopischen Verfahren können hierbei aufgrund der Strahlenbelas tung und Invasivität für die betroffenen Patienten belastend sein.

Das Detektionslimit der radiologischen Verfahren liegt bei einer Tumor-Größe von 7 bis 10 mm, was Zellhaufen bestehend aus bereits rund einer Milliarde Tumor-Zellen entspricht. Eine alter native, weniger invasive Methode beruht auf Flüssigbiopsien ( Liquid Biopsies), mittels derer Tumore viel früher, ab einer Größe von ca. 50 Millionen Zellen, detektiert werden können.

Bei Liquid Biopsies werden dem Patienten einige Milliliter Blut entnommen. Aus dem Blutplas ma oder Blutserum kann anschließend zirkulierende zellfreie DNA (zfDNA) isoliert werden. Im menschlichen Körper entsteht die zfDNA im Laufe apoptotischer sowie nekrotischer Prozesse. Dabei wird zelluläre, genomische DNA (gDNA) durch DNAsen in ca. 167 bp lange Fragmente gespalten und im Blutkreislauf freigesetzt.

Bei Patienten, die an malignen Erkrankungen leiden, ist in der Gesamtmenge an zfDNA zusätz lich Tumor-DNA enthalten. Je nach Entität bzw. Stadium der Erkrankung kann die zfDNA- Menge stark variieren. Sie enthält jedoch diagnostisch, therapeutisch und prognostisch relevan te Informationen.

Zusätzlich zu genetischen Mutationen eines Tumors können auch Epimutationen analysiert werden. Besonders interessant ist in diesem Zusammenhang die DNA-Methylierung. Das DNA- Methylierungsmuster ist gewebespezifisch und ändert sich bereits in frühen Phasen der Tumor- Evolution. Des Weiteren machte eine Studie des G/VASf-Locus deutlich, dass die zfDNA- Methylierung im Blut stabil bleibt. Sie wird weder modifiziert noch verfälscht und eignet sich so mit als Biomarker in der klinischen Diagnostik (Puszyk et al. [2009] Clin. Chim. Acta 400: 107- 110).

Mehrere Studien haben das diagnostische Potential der DNA-Methylierung bereits deutlich ge macht. So zeigte eine SOX17- Studie beim Magenkarzinom, dass das Gesamtüberleben der Patientenkohorte mit der nachgewiesenen Menge an methylierter SOX17- zfDNA korrelierte (Balgkouranidou et al. [2013] Clin. Chem. Lab. Med. 51: 1505-1510). Eine Studie mit Patientin nen, die an Mammakarzinom litten, zeigte eine signifikante Hypermethylierung des CST6- Gens (Chimonidou et al. [2013] Clin. Biochem. 46: 235-240). Liggett et al. ist es gelungen, anhand des DNA-Methylierungsmusters das Pankreaskarzinom von seiner Vorstufe, der chronischen Pankreatitis, zu unterscheiden (Liggett et al. [2010] Cancer 116: 1674-1680). Auch beim NSCLC wurden von mehreren Arbeitsgruppen Veränderungen des DNA- Methylierungsmusters beschrieben. So konnten z.B. Balgkouranidou et al. eine signifikante Hy permethylierung des BRMS1- Gens bei Patienten mit Bronchialkarzinom nachweisen (Balg kouranidou et al. [2014] Brit. J. Cancer 110: 2054-2062). 2016 detektierten Marwitz et al. DNA- Hypomethylierung innerhalb der CTLA4- sowie PDCDf-Gene. Auf Transkriptom-Ebene waren diese Gene überexprimiert. Da es sich hier um therapeutisch wichtige Checkpoint-Regulatoren handelt, hat diese Arbeit starke therapeutische Relevanz (Marwitz et al. [2017] Clin. Epigenet. 9: 51).

Das diagnostische Potential der DNA-Methylierung wird auch am Beispiel des „Epi proLung“ Assays („Epigenomics AG“, Deutschland) deutlich. Dabei wird das zfDNA-Methylierungsmuster der SHOX2 und PTGER4 Gene analysiert. Bei einer Spezifität von 90% beträgt die Sensitivität 67% (Weiss et al. [2017] J. Thorac. Oncol. 12: 77-84). Für ein zuverlässiges Lungenkrebs- Screening reicht die Empfindlichkeit des „Epi proLung“ Tests daher nicht aus. Bisher gibt es keine weiteren auf Liquid Biopsies basierende Verfahren, die eine zuverlässige, präventive Lungenkrebs-Früherkennung ermöglichen.

Dem gegenüber stellten sich die Erfinder die Aufgabe, ein zuverlässigeres Verfahren zur Diag nose von Lungenkrebs zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung, ins besondere durch den Gegenstand der Ansprüche, gelöst.

Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose von Lungenkrebs, bei dem man die Methylierung eines Satzes von Methylierungsmarkern in einer Probe eines Patienten be stimmt, wobei man z.B. zfDNA aus einer Flüssigbiopsie untersuchen kann. Alternativ kann die Probe auch eine Gewebeproben sein, z.B. eine solide Gewebeprobe aus einem Tumor oder aus einem Gewebe, in dem möglicherweise ein Tumor vorliegt. Insbesondere kann die Gewe beprobe aus einer Biopsien oder OP-Material von Lungengewebe stammen. Auch Pleuraflüs sigkeit kann untersucht werden. Es zeichnet das erfindungsgemäße Verfahren aus, dass es aufgrund der Auswahl der Marker besonders gut dafür geeignet ist, sowohl für eine Untersu chung von Gewebeproben, die bei einer Operation genommen werden, als auch für eine Unter suchung von Lungenbiopsie-Gewebe als auch für eine Untersuchung von zfDNA aus einer Flüssigbiopsie verwendet zu werden. Operationen, bei denen Gewebe als Probe entnommen wird, werden im Rahmen der Erfindung üblicherweise Operationen zur Entfernung eines diag nostizierten Lungentumors sein. Auch dann treten aber noch Fragen auf, die das erfindungs gemäße Verfahren beantworten kann, etwa nach der Entität und/oder Prognose des Tumors oder zur Abgrenzung zwischen Tumorgewebe und angrenzendem normalen Gewebe.

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Diagnose von Lungenkrebs zur Verfügung, bei dem die Methylierung eines Satzes von Methylierungsmarkern, z.B. in zfDNA aus einer Flüssigbiopsie- Probe eines Patienten, bestimmt wird, wobei optional ein Alignment gegen ein Referenzgenom mit dem Segemehl-Algorithmus durchführt wird.

Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Diagnose von Lungenkrebs zur Verfügung, bei dem die Methylierung eines Satzes von Methylierungsmarkern, z.B. in zfDNA aus einer Flüssigbiop- sie-Probe eines Patienten, bestimmt wird, wobei optional die Methylierung von Methylierungs markern in den Genen SERPINB5, DOCK10, PCDHB2, HIF3A, FGD5, RCAN2, HOXD12, O- CA2, SLC22A20, FADL-1, NRXN1, ACOXL, FAM53A, UBE3D und AUTS2 bestimmt wird.

Zur minimalinvasiven Diagnostik von Lungentumoren (Lungenkarzinomen) wird erfindungsge mäß z.B. die zirkulierende zellfreie DNA (zfDNA) aus Flüssigbiopsien, z.B. aus Plasma, Blut, oder Serum , bevorzugt aus Plasma, genutzt. Falls ein Patient an einer malignen Tumorerkran kung leidet, ist in der Gesamtmenge der zirkulierenden DNA auch die Tumor-DNA enthalten, welche alle therapeutisch und prognostisch relevanten Informationen über die genetischen und epigenetischen Charakteristika des Tumors enthält. Die Erfindung stellt sowohl bevorzugte Ver fahren zur Diagnose von Lungenkrebs auf dieser Basis also auch bevorzugte Sätze von Methyl ierungsmarkern bereit.

Im Rahmen der Erfindung wurde gezeigt, dass die Methylierungssignaturen in festen Tumoren, z.B. in Proben aus Operationen oder Biopsien sich z.T. von den Signaturen aus zfDNA aus Flüssigbiopsien unterschieden. Dies kann erklären, warum die bereits erwähnte „Epi proLung“- Studie, bei der das zfDNA-Methylierungsprofil innerhalb der SHOX2 und PTGER4 Gene analy siert wurde, bei einer Spezifität von 90% nur eine Sensitivität von 67% aufwies (Weiss et al. [2017] J. Thorac. Oncol. 12: 77-84). Die verwendeten SHOX2 und PTGER4 Biomarker stam men aus Analysen primärer Tumorgewebe (Murn et al. [2008] J. Exp. Med. 205: 3091-3103; und Schneider et al. [2011] BMC Cancer 11: 102). Die vorliegende Erfindung zeigt jedoch deut lich (siehe Abschnitt 2.1.3), dass die DNA-Methylierungsmuster zwischen der zfDNA aus dem Plasma und der gDNA aus einem primären Tumor nur bedingt korrelieren. In der Tat enthält die Gesamtmenge der zfDNA nicht nur aus der Lunge bzw. einem Tumor stammende DNA, son dern auch DNA aus weiteren Geweben und Organen.

Das bedeutet, dass die im primären Tumorgewebe stark aberrant methylierten DNA-Regionen im Plasma nicht unbedingt eine differentielle Methylierung aufweisen. Daher reicht es für die Entwicklung eines nicht-invasiven, zfDNA-basierten Früherkennungstests nicht aus, bekannte Biomarker aus den primären Tumoren zu nutzen. Vielmehr ist es notwendig, neue zfDNA- spezifische, starke und eindeutige Methylierungssignaturen im Plasma der betroffenen Patien ten zu identifizieren. zfDNA-spezifische Methylierungssignaturen sind jedoch im Gegenzug auch nicht zwingend für eine Diagnose und Untersuchung von Gewebeproben geeignet. Ziel war daher - in Abgrenzung gegenüber den im Stand-der-Technik bekannten Ansätzen, die De- terminierung universeller Methylierungssignaturen, mittels derer unterschiedlichste (auch kom plexe) Patientenproben (auch mit stark variierendem Gehalt an Tumorzellen) robust und zuver lässig untersucht werden können. Dies wurde mit der vorliegenden Erfindung erreicht. Erfin dungsgemäß vorteilhaft ist es, dass die identifizierten Marker sowohl mit Gewebeproben z.B. soliden Gewebeproben aus Tumorgewebe als auch mit Flüssigbiopsien gute Ergebnisse liefern und somit zur Diagnose von Lungenkrebs aus verschiedenen Arten von Proben geeignet sind.

Um einen erfindungsgemäßen Satz an Methylierungsmarkern, der besonders aussagekräftige differentiell methylierte Regionen umfasst, zu identifizieren, wurden im Rahmen der Erfindung mehrere Schritte durchgeführt, die im Detail im Beispielteil beschrieben sind. Zuerst wurden DNA-Methylierungssignaturen in 40 malignen Lungentumoren sowie deren korrespondierenden Kontrollen untersucht. Dann erfolgte eine Analyse von DNA-Methylierungssignaturen im Blut plasma von neun Patienten. Davon litten fünf Patienten an einem Adeno- und vier an Plat tenepithelkarzinom der Lunge. Die übrigen Patienten waren dagegen frei von malignen Erkran kungen und bildeten die Kontrollkohorte. Schließlich wurden zusätzliche Datensätze mehrerer zur Verfügung gestellter Studien ausgewertet, was das Identifizieren weiterer tumorspezifischer und prognostischer CpG Loci ermöglichte. Der auf dieser Basis synthetisierte Satz an Methylie rungsmarkern, auch als Plasma Panel (siehe Tabelle 1) bezeichnet, wurde anschließend im Rahmen einer Pilotstudie validiert. Dieser Satz an Methylierungsmarkern umfasst eine Vielzahl von Regionen, die z.B. in zfDNA differenziell methyliert sind und überraschenderweise eine spezifische Aussage über das Vorhandensein eines Tumors, die Tumorentität, das Tumorstadi um und/oder die Prognose gestatten.

In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung daher ein Verfahren zur Diagnose von Lungen krebs, bei dem die Methylierung eines Satzes von Methylierungsmarkern in einer Probe des Patienten bestimmt wird, wobei der Satz an Methylierungsmarkern aus der Gruppe bestehend aus den in Tabelle 1a, 1b und 1c aufgelisteten Regionen ausgewählt ist und mindestens 60 Re gionen umfasst, bevorzugt mindestens 64 Regionen, mehr bevorzugt mindestens 340 oder mindestens 350 Regionen, am meisten bevorzugt mindestens 630 Regionen. Z.B. können Me thylierungsmarker bestimmt werden, um das Vorhandensein eines Tumors zu bestimmen.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Diagnose von Lungenkrebs, bei dem die Methylie rung eines Satzes von Methylierungsmarkern in einer Probe des Patienten bestimmt wird, wo bei der Satz an Methylierungsmarkern aus der Gruppe bestehend aus den in Tabelle 1a, 1b und 1c aufgelisteten Regionen ausgewählt ist und mindestens 134 Regionen umfasst, bevor zugt 138 Regionen, mehr bevorzugt mindestens 240 Regionen, am meisten bevorzugt mindes- tens 247 Regionen. Z.B. können Methylierungsmarker bestimmt werden, um die Entität eines Tumors zu bestimmen.

Erfindungsgemäß kann der Satz von Methylierungsmarkern mindestens 194 Regionen umfas sen, bevorzugt mindestens 600 Regionen, optional alle 630 Regionen. Z.B. können mindestens 60, bevorzugt mindestens 64 Methylierungsmarker bestimmt werden, um das Vorhandensein eines Tumors zu bestimmen, z.B. Methylierungsmarker aus Tabelle 1a, und es können mindes tens 134, bevorzugt 138 Regionen, Methylierungsmarker bestimmt werden, um die Entität des Tumors zu bestimmen, z.B. Methylierungsmarker aus Tabelle 1b. Je mehr Methylierungsmarker bestimmt werden, umso genauer wird die Analyse. Daher können auch mindestens 150 bevor zugt mindestens 340 oder sogar 350 Methylierungsmarker bestimmt werden, um das Vorhan densein eines Tumors zu bestimmen, z.B. Methylierungsmarker aus Tabelle 1a, und es können mindestens 240 oder sogar 247 Methylierungsmarker bestimmt werden, um die Entität des Tu mors zu bestimmen, z.B. Methylierungsmarker aus Tabelle 1b. Optional können zusätzlich min destens 15, bevorzugt mindestens 30 oder sogar 33 Methylierungsmarker aus Tabelle 1c be stimmtwerden, um die Prognose zu bestimmen.

In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung daher ein Verfahren zur Diagnose von Lungen krebs, bei dem die Methylierung eines Satzes von Methylierungsmarkern in einer Probe eines Patienten, z.B. in zfDNA aus einer Flüssigbiopsie-Probe eines Patienten, bestimmt wird, wobei der Satz von Methylierungsmarkern mindestens 60 Regionen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

Die vorgenannten Methylierungsmarker sind die in Tabelle 1a genannten Marker, die nur bei zfDNA identifiziert wurden. Bei dieser Analyse wird bevorzugt das Vorhandensein eines Tumors geprüft, wobei der Satz von Methylierungsmarkern optional alle Regionen der Gruppe umfasst.

Dabei kann der Satz von Methylierungsmarkern mindestens 340 Regionen umfassen, ausge- wählt aus der Gruppe bestehend aus den in Tabelle 1a aufgelisteten Regionen, wobei der Satz von Methylierungsmarkern bevorzugt alle in Tabelle 1a aufgelisteten Regionen umfasst.

In einer Ausführungsform der oben genannten Verfahren umfasst der Satz von Methylierungs markern mindestens 134 Regionen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

Die vorgenannten Methylierungsmarker sind die in Tabelle 1b genannten Marker, die nur bei zfDNA identifiziert wurden. Bei dieser Analyse wird bevorzugt die Entität eines Tumors geprüft, wobei insbesondere zwischen Adenokarzinom und Plattenepithelkarzinom unterschieden werden kann. Dabei kann der Satz von Methylierungsmarkern alle Regionen der Gruppe umfassen.

Bei dieser Analyse kann der Satz von Methylierungsmarkern auch mindestens 240 Regionen umfassen, wobei die Gruppe aus den in Tabelle 1b aufgelisteten Regionen besteht. Bevorzugt umfasst der Satz von Methylierungsmarkern alle in Tabelle 1b aufgelisteten Regionen der Gruppe.

Da gezeigt wurde, dass alle in Tabelle 1a und 1b definierten Regionen in den untersuchten Proben differentiell methyliert sind, ist es vorteilhaft alle in Tabelle 1a und 1b definierten Regio nen zu analysieren, insbesondere wenn sowohl das Vorhandensein als auch die Entität eines potentiellen Tumors analysiert werden sollen.

Am größten ist die Aussagekraft der Analyse, wenn der Satz von Methylierungsmarkern min destens 620 Regionen aus einer Gruppe umfasst, welche aus allen in Tabelle 1 aufgelisteten Regionen besteht, insbesondere wenn man ferner die Prognose bestimmt, bevorzugt, wenn der Satz von Methylierungsmarkern alle Regionen der Gruppe umfasst.

Bei der weiteren Analyse der Daten und der Überprüfung anhand von zfDNA von Patienten wurde im Rahmen der Erfindung ein zweiter Satz an Methylierungsmarkern mit verschiedenen Untergruppen identifiziert, mit deren Hilfe unterschiedliche Fragestellungen beantwortet werden können (siehe Tabellen 2-4). Die entsprechenden Methylierungsmarker stellen definierte diffe rentiell methylierte Positionen dar, die in den in Tabelle 1 genannten Regionen liegen. Damit repräsentieren die in Tabellen 2-4 genannten Methylierungsmarker geeignete Untergruppen zur Untersuchung der im Plasma-Panel enthaltenen Methylierungsmarker.

Im Rahmen der Erfindung können also entweder differentiell methylierte Regionen, z.B. die in Tabelle 1a, 1b und/oder 1c definierten Regionen, als Methylierungsmarker dienen, oder diffe rentiell methylierte Positionen. Dabei führt die Analyse ganzer Regionen zu zuverlässigeren Er gebnissen, da bei einzelnen Patienten spezifische Positionen nicht unbedingt die gleiche Aus sagekraft haben müssen. Dafür ist eine Analyse spezifischer Positionen mit geringerem Auf wand, z.B. über einen Array, möglich und ist daher günstig, wenn eine kostengünstige Diagno se gestellt werden soll. Die Auswahl richtet sich also nach einer Abwägung zwischen der im je weiligen Fall nötigen Zuverlässigkeit und dem möglichen Aufwand. Selbstverständlich können auch beide Typen von Methylierungsmarkern gleichzeitig zur Diagnose herangezogen werden. Ferner spielt auch die Menge an vorliegender Probe eine Rolle, da vor allem Gewebeproben aus Operationen ausreichende Mengen DNA enthalten, um eine Analyse von einzelnen methyl- ierten Positionen über ein Array zu bestimmen.

In diesem Rahmen identifizierte, besonders aussagekräftige Methylierungsmarker liegen z.T. in den Genen SERPINB5, DOCK10, PCDHB2, HIF3A, FGD5, RCAN2, HOXD12, OCA2, SLC22A20, FADL-1, NRXN1, ACOXL, FAM53A, UBE3D und AUTS2. Diese Gene wurden bis her noch nie speziell im Zusammenhang mit Lungenkarzinomen oder bestimmten NSCLC- Entitäten beschrieben.

Die Rolle einiger dieser Gene bei der Tumor-Evolution und Prognose ist bei anderen Krebsar ten bekannt. Bei SERPIN5 handelt es sich z.B. um ein bekanntes Onkogen (Lei et al. [2011] Oncol. Rep. 26: 1115-1120). HOX-Gene werden in vielen Krebsarten aberrant exprimiert (Bhat- lekar et al. [2014] J. Mol. Med. 92: 811-823). Fehlregulation von RCAN2 führt zu Proliferation der Tumorzellen (Niitsu et al. [2016] Oncogenesis 5: e253). Veränderte Expression von DOCK10 hatte bei einigen Studien die Migration von Melanomzellen zur Folge (Gadea et al. [2008] Curr. Biol. 18: 1456-1465). Auch einige OCA2-Mutationen sind mit erhöhtem Melanom- Risiko assoziiert (Hawkes et al. [2013] J. Dermatol. Sei. 69: 30-37). Des Weiteren sind HIF3A und FGD5 wichtige Angiogenese-Regulatoren und spielen somit eine entscheidende Rolle wäh rend der Tumor-Evolution (Jackson et al. [2010] Expert Opin. Therap. Targets 14: 1047-1057); und Kurogane et al. [2012] Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 32: 988-996). Die DNA- Methylierung einiger PCDHB2- CpG Loci ist mit einer schlechten Prognose der Neuroblastom- Patienten assoziiert (Abe et al. [2005] Cancer Res. 65: 828-834). Veränderter Metabolismus ist z.B. ein Kennzeichen maligner Tumore, dabei können der FADL-1 Fettsäuren-Transporter so wie einige SLC-Transporter eine wichtige Rolle spielen (Lin et al. [2015] Nat. Rev. Drug Discov. 14: 543-560; und Black [1991] J. Bacteriol. 173: 435-442). UBE3D kodiert für eine Ubiquitin- Protein-Ligase. Mehrere Studien haben gezeigt, dass einige Ubiquitin-Protein-Ligasen während der Tumor-Evolution eine wichtige Rolle spielen können (u.a. Lisztwan et al. [1999] Genes Dev. 13: 1822-1833). Bei AUTS2 und NRXN1 handelt es sich um neuronale Gene. Eine AUTS2- Überexpression wurde in Lebermetastasen nachgewiesen (Oksenberg & Ahituv [2013] Trends Genet. 29: 600-608). NRXN1 könnte für die Nikotinsucht verantwortlich sein (Ching et al. [2010] Am. J. Med. Genet. B. Neuropsychiatr. Genet. 153B: 937-947). Erhöhte Expression von ACOXL wurde bereits bei Prostatakarzinomen beschrieben (O'Hurley et al. [2015] PLoS One 10: e0133449). Einige Studien beschreiben FAM53A als einen prognostischen und therapeutischen Mammakarzinom-Marker (Fagerholm et al. [2017] Oncotarget 8: 18381-18398). Die vorgenann ten Studien gestatten jedoch keinerlei Rückschlüsse darauf, dass eine Methylierung in diesen Genen, geschweige denn in den in Tabelle 2-4 genannten Positionen, mit einer Lungenkrebs- Erkrankung korreliert und entsprechend als diagnostischer Marker für das Vorliegen von Lun- gentumoren oder die Feststellung der Entität oder die Ermittlung des Tumorstadiums herange zogen werden kann.

Damit stellt die Erfindung erstmalig ein Verfahren zur Diagnose von Lungenkrebs zur Verfü gung, bei dem die Methylierung eines Satzes von Methylierungsmarkern, z.B. in zfDNA aus ei- ner Flüssigbiopsie-Probe eines Patienten, bestimmt wird, wobei die Methylierung von Methylie rungsmarkern in den Genen SERPINB5, DOCK10, PCDHB2, HIF3A, FGD5, RCAN2, HOXD12, OCA2, SLC22A20, FADL-1, NRXN1, ACOXL, FAM53A, UBE3D und AUTS2 bestimmt wird.

Bevorzugt umfassen diese Methylierungsmarker die in Tabelle 2 genannten Methylierungsmar ker, insbesondere, wenn das Vorliegen eines Lungenkarzinoms bestimmt werden soll. Alterna- tiv, insbesondere wenn die Entität eines Lungenkarzinoms bestimmt werden soll, und insbe sondere wenn zwischen NSCLC-Typen Adenokarzinom und Plattenepithelkarzinom differen ziert werden soll, umfassen die Methylierungsmarker die in Tabelle 3 genannten Methylie rungsmarker. Bevorzugt werden sowohl die in Tabelle 2 als auch in Tabelle 3 genannten Methy lierungsmarker bestimmt, um beide Fragestellungen zu beantworten. Optional können ferner auch die in Tabelle 4 genannten Methylierungsmarker analysiert werden, was ferner Rück schlüsse auf das Stadium des Tumors gestattet.

Die Erfindung stellt damit ferner ein Verfahren zur Diagnose von Lungenkrebs zur Verfügung, bei dem die Methylierung eines Satzes von Methylierungsmarkern, z.B. in zfDNA aus einer Flüssigbiopsie-Probe eines Patienten, bestimmt wird, wobei der Satz von Methylierungsmarkern die 10 folgenden Positionen (siehe auch Tabelle 2) umfasst:

Es wurde gezeigt, dass diese Marker besonders aussagekräftig sind, wenn der kNN- Algorithmus zur Analyse verwendet wird. Mit diesen Markern kann insbesondere das Vorhan densein eines Tumors analysiert werden. Alternativ oder zusätzlich kann der Satz von Methylierungsmarkern die 10 folgenden Positionen umfassen (siehe auch Tabelle 3):

Es wurde gezeigt, dass diese Marker besonders aussagekräftig sind, wenn der RT-Algorithmus zur Analyse verwendet wird. Mit diesen Markern kann insbesondere die Entität eines Tumors identifiziert werden.

Optional, insbesondere, wenn ferner das Stadium eines Tumors identifiziert werden soll (also z.B. zwischen frühem (l+ll) und spätem (lll+IV) Stadium eines Lungenkarzinoms differenziert werden soll), kann der Satz von Methylierungsmarkern ferner alle in Tabelle 4 aufgelisteten Po sitionen umfassen. In diesem Fall kann der SVM-Algorithmus zur Analyse verwendet werden. Bei Regionen, die sich unter Verwendung von Proben aus frühen Lungenkarzinom-Stadien nicht validieren ließen, könnte es sich z.B. um für Metastasen spezifische Signaturen handeln. Diese Regionen wurden daher für die Berechnung des Sfag/ng-Parameters genutzt, also für die Berechnung des Stadiums. Bisher kann der in dieser Arbeit beschriebene Staging- Parameter die späten Lungenkarzinomstadien mit 80%iger Richtigkeit von frühen Stadien unterscheiden. Generell sollte der Staging- Parameter nur als Hinweis genutzt werden. Falls das entwickelte Panel ein Lungenkarzinom detektiert, wäre es weiterhin ratsam, therapeutisch relevante Infor mationen z.B. bezüglich der Größe oder Lage des Tumors durch bildgebende Verfahren, wie z.B. wie MRT, CT oder PET CT zu generieren. Damit ist es auch nicht essentiell, die auf das Stadium bezogenen Methylierungsmarker in jedem Fall mit zu analysieren. Im Rahmen der Erfindung kann der Lungenkrebs NSCLC oder SCLC sein, bevorzugt NSCLC. Der NSCLC ist bevorzugt ein Adenokarzinom oder Plattenepithelkarzinom. Es wurde gezeigt, dass erfindungsgemäße Marker zwischen diesen Entitäten differenzieren können und somit zur Differentialdiagnose geeignet sind. Die erfindungsgemäße Diagnose erlaubt eine Aussage über das Vorhandensein eines Tumors, über die Entität eines Tumors (insbesondere die Unterscheidung zwischen Adenokarzinom und Plattenepithelkarzinom), über das Tumor-Stadium und/oder über die Prognose. Am wichtigsten ist die Aussage über Vorhandensein und Entität des Tumors. Weitere Aussagen können optio nal auch mittels ergänzender Verfahren getroffen werden, wenn das Vorhandensein eines Tu mors erfindungsgemäß festgestellt wurde. Optional erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren aber auch bereits eine Aussage über das Vorhandensein eines Tumors, über die Entität eines Tumors (insbesondere die Unterscheidung zwischen Adenokarzinom und Plattenepithelkarzi nom) und über das Tumorstadium, sowie bevorzugt über die Prognose. Der Begriff der Diagno se schließt also eine Differentialdiagnose ein.

Im Unterschied zu bisher bekannten Verfahren ist das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Lungenkrebsfrüherkennung, also auch zur Diagnose in Stadium I oder II, geeignet. Vorteilhaf terweise ist diese Diagnose ferner auch auf Basis einer Flüssigbiopsie-Probe, also z.B. einer Blutprobe, möglich, so dass dem Patienten nicht zwingend anderes Gewebe entnommen wer den muss. Erfindungsgemäß wird daher z.B. eine Flüssigbiopsie-Probe eines Patienten analy siert.

Außerdem kann das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafterweise auch auf Basis von Lun- genbiopsie-Gewebe zuverlässig durchgeführt werden. In diesem Fall ist es auch möglich, eine "paired biopsy" durchzuführen und somit Gewebe aus Lungenbiopsien des vermutlich erkrank ten und des vermutlich gesunden Lungenflügels eines Patienten parallel zu untersuchen und zu vergleichen. In der Klinik wird in der Regel nur der tumor bzw. das verdächtige Gewebe biop- siert, wobei als Referenz ggf. zuvor erhobene Datensätze gesunder Gewebe dienen können.

Bevorzugt ist der Patient ein Mensch. Das Wort Patient wird im Allgemeinen synonym mit Sub jekt verwendet. Es kann sich um einen Patienten mit Symptomen handeln, die den Verdacht nahelegen, dass der Patient einen Lungentumor aufweist. Es kann sich aber auch um ein Sub jekt ohne Symptome handeln. Das Subjekt bzw. der Patient kann ein Risikopatient für einen Lungentumor sein. Dazu zählen Subjekte, die aufgrund bestimmter Risikofaktoren und/oder ih res Lebensstils (z.B. Rauchen, Verwendung von E-Zigaretten oder anderweitige erhöhte Expo sition gegenüber kanzerogenen Agentien, Symptome) ein erhöhtes Risiko für eine Lungen krebserkrankung besitzen und/oder radiologische Auffälligkeiten aufweisen. Der Patient kann auch ein Patient mit einem bereits behandelten, z.B. einem operierten Lungentumor sein, wobei das Wiederauftreten eines Tumors und/oder eine Metastasierung untersucht werden kann.

Generell kann die zfDNA aus einer Vielzahl von Körperflüssigkeiten extrahiert werden. So wur de z.B. bereits eine erfolgreiche Extraktion aus Blutplasma und -serum, Pleuraerguss oder Urin in der Literatur beschrieben. Erfindungsgemäß kann die Flüssigbiopsie-Probe Blut, Plasma, Se rum, Sputum, Bronchialflüssigkeit und Pleuraerguss sein. Bevorzugt ist sie von Blut abgeleitet, z.B. Serum oder Plasma, bevorzugt Plasma. Da Pleuraerguss erst im Laufe der Erkrankung auftritt, ist dieses Material vor allem für die Erkennung späterer Stadien geeignet. Die zfDNA- Extraktion aus dem Plasma oder Serum ist deutlich schneller und kostengünstiger als aus dem Urin, was diese Materialien für ein Screening interessanter macht. Schließlich ist die zfDNA- Stabilität relevant, denn zfDNA ist in Plasma stabiler als in Serum.

In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Mittel zur Verfügung, welche zur Diagnose von Lungenkrebs mit einem erfindungsgemäßen Verfahren durch Untersuchung der Methylierung eines Satzes von Methylierungsmarkern, z.B. in zfDNA aus einer Flüssigbiopsie-Probe eines Patienten, geeignet sind. Die Mittel sind bevorzugt auch zur Diagnose von Lungenkrebs mit ei nem erfindungsgemäßen Verfahren durch Untersuchung der Methylierung eines Satzes von Methylierungsmarkern in einer anderen Probe eines Patienten, insbesondere einer soliden Ge webeprobe aus einem Tumor oder einem Gewebe, in dem ein Tumor vermutet wird, oder aus einer Lungenbiopsie, geeignet.

Dabei umfasst das Mittel Oligonukleotide, welche mit DNA (z.B. zfDNA oder davon z.B. durch Bisulfitkonvertierung abgeleiteter DNA) hybridisieren können, welche erfindungsgemäße Me thylierungsmarker umfasst bzw. daraus besteht. Bevorzugt sind hierbei Methylierungsmarker aus den in den Ansprüchen genannten Untergruppen. Unter "hybridisieren können" ist eine spezifische Hybridisierung zu verstehen, insbesondere unter stringenten Bedingungen, wie sie etwa im experimentellen Teil geschildert sind.

Geeignete Oligonukleotide sind z.B. Oligonukleotide, welche mit den in Tabelle 1a, 1b und/oder 1c, bevorzugt in Tabelle 1a, genannten Regionen hybridisieren können, weil sie komplementär zu diesen Regionen oder einem Fragment daraus sind, welches mindestens 20 Nukleotide, z.B. bei Kopplung an einen festen Träger bevorzugt 60-352, optional 100-190 oder 135-157 Nukleo tide umfasst. Die Länge hängt dabei u.a. von der Basenzusammensetzung bzw. Sequenz und der Hybridisierungstemperatur sowie der ausgewählten Technik ab. Da es sich um doppel- strängige DNA handelt, können die Oligonukleotide zu dem Strang in 5'-3' Richtung oder zu dem Strang in 3'-5' Richtung komplementär sein, oder zu beiden. Wichtig ist, dass die ausge wählten Oligonukleotide nicht mit anderen als den in den Tabellen genannten Regionen hybridi sieren können, was ebenfalls eine Voraussetzung für eine spezifische Hybridisierung ist. Bei spielhafte geeignete Oligonukleotide, die mit den in Tabelle 1a, 1b und 1c genannten Regionen auf Chromosom 1 hybridisieren können, sind in Tabelle 5 aufgeführt. Der Fachmann ist in der Lage, auf Basis der hierin offenbarten Informationen über die Marker auch für andere Marker geeignete Oligonukleotide auszuwählen. Solche Oligonukleotide können optional weitere Bestandteile umfassen, z.B. spacer oder linker- Regionen.

Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können z.B. an einen festen Träger gekoppelt werden, oder sind Oligonukleotide, die an einen festen Träger gekoppelt sind. Eine solche Kopplung ist z.B. über Adaptoren oder Tags möglich. Eine Option dafür ist die Kopplung an Biotin, welches an Streptavidin oder Avidin binden kann (oder bereits gebunden ist), das an den festen Träger gekoppelt ist.

Der feste Träger kann z.B. ein Genchip, ein Kügelchen oder Bead, z.B. ein magnetischer Bead oder eine Säulenmatrix sein. Der T räger erlaubt damit eine einfache Abtrennung der hybridisier ten DNA. Im Beispielteil sind an magnetische Beads beschrieben, die über eine Streptavidin- Biotin-Bindung an Oligonukleotide gekoppelt sind, welche spezifisch mit den in Tabelle 1 ge nannten Regionen hybridisieren und als Capture Probes eingesetzt werden können. Optional umfassen die erfindungsgemäßen Mittel 638 Oligonukleotide, z.B. Capture Probes, die mit allen in Tabelle 1 genannten Methylierungsmarkern hybridisieren können.

Es kann sich alternativ oder zusätzlich bei den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden auch um ein Kit umfassend PCR-Primern zur Amplifikation von Regionen handeln, welche die Methylie rungsmarker umfassen oder (insbesondere im Fall von Regionen aus Tabelle 1) daraus beste hen. PCR-Primer weisen bevorzugt eine Länge von ca. 12-40, optional 15-25 Nukleotiden auf, welche mit den genannten Regionen hybridisieren können. Ein solches Kit kann auch Blockie- rungs-Oligonukleotide oder Detektionssonden umfassen, welche nach Bisulfitkonvertierung spezifisch an vorher methylierte oder unmethylierte DNA binden können. Solche Oligonukleoti de können z.B. in PCR-basierten erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden.

Eine Analyse per PCR ist vor allem zweckmäßig, wenn nur eine begrenzte Anzahl an Markern analysiert werden soll, also z.B. die Marker in den oben genannten Genen. Bevorzugt werden mit diesem Verfahren die in Tabelle 2 definierten Marker analysiert, alternativ oder zusätzlich auch die in Tabelle 3 definierten Marker, so dass entsprechend geeignete Oligonukleotide aus gewählt werden können.

Optional können ein oder mehrere für Multiplex-PCR geeignete Primer ausgewählt werden. Sonden zur Detektion sind bevorzugt mit geeigneten Farbstoffen markiert.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verfügung, bei dem die erfindungsgemäßen Mittel für eine Diagnose von Lungenkrebs in einer Probe eines Patienten einsetzt werden, wobei opti onal zfDNA aus einer Flüssigbiopsie-Probe eines Patienten (auch: Subjekts) untersucht wird. Aufgrund der Auswahl der Marker können aber auch andere Proben, z.B. aus Biopsien und- Bronchoskopien oder aus bei einer Operation entnommenen Gewebeproben, mit den erfin dungsgemäßen Mitteln untersucht werden, insbesondere mit solchen, die Marker aus Tabelle 1 a, b und/oder c umfassen, bevorzugt alle Marker aus Tabelle 1a und 1b, optional auch aus Ta belle 1c. Biopsien können auch von außen entnommen sein, ggf. unter Bildgebung.

Sollen Sequenzierungsdaten verwendet werden, so stellt die bioinformatische Auswertepipeline ein weiteres Problem dar. Die herkömmlichen gDNA-WGBS-Libraries werden nach dem Pro zessieren meist mit dem „Bismarck“ Algorithmus aligned. Die Ergebnisse des Alignments kön nen dann anschließend von zahlreichen Auswertepipelines analysiert werden, wobei genom weite DNA-Methylierungssignaturen extrahiert werden. Das in den Ausführungsbeispielen durchgeführte WGBS-Experiment der zirkulierenden DNA war das erste seiner Art. Dabei stellte sich heraus, dass die zfDNA-L/brar/es eine andere Komplexität sowie Fragmentverteilung als herkömmliche gDNA-L/brar/es besitzen (siehe Abschnitt 1.1.2.5). Dies könnte der Grund dafür sein, dass der im Stand der Technik am häufigsten verwendete „Bismarck“ Algorithmus eine nicht-zufriedenstellende Mapping Effizienz von nur 70% lieferte. Aus diesem Grund wurden wei tere Algorithmen ausgetestet. Die besten Ergebnisse, mit einer Mapping Effizienz von mindes tens 98%, lieferte hierbei der „Segemehl“ Algorithmus (siehe Abschnitt 1.1.2.5).

Daher wird in der Ausführungsform der Erfindung, die auf Sequenzierung bisulfit-konvertierter zfDNA beruht, besonders der Segemehl-Algorithmus zum Alignment (also zur Anordnung) der Sequenzierungsinformationen der zfDNA gegenüber einem Referenzgenom verwendet. Der Segemehl-Algorithmus findet sich unter https://www.bioinf.uni-leipziq.de/Software/seqemehl/. und wird z.B. in Otto et al. genauer beschrieben (Otto et al. [2012] Bioinformatics 28: 1698- 1704). Es kann, wie im unten geschilderten Beispiel, Version 0.2.0 verwendet werden, aber auch eine andere Version, wie z.B. 0.3.4.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Diagnose eines Lun gentumors, welches folgende Schritte umfasst: a. Extraktion von zfDNA aus einer Flüssigbiopsie-Probe oder genomischer DNA aus einer Lungenbiopsie-Gewebeprobe oder einer soliden Gewebeprobe, die z.B. bei einer Ope ration entnommen wird, optional von zfDNA aus einer Flüssigbiopsie-Probe, b. Durchführung einer Bisulfitkonvertierung, c. Herstellung einer Whole Genome Bisulfite Sequencing Library, d. Anreicherung der die definierten Methlierungsmarker umfassenden DNA-Regionen, wobei diese bevorzugt mit einem erfindungsgemäßen Mittel zur Diagnose in Kontakt gebracht werden, e. Sequenzierung der angereicherten DNA-Regionen, f. Alignment der Sequenzierungsdaten gegen ein Referenzgenom unter Verwendung des Segemehl Algorithmus, g. Berechnung der Methylierungsraten.

Mittel und Verfahren zur Extraktion von genomischer DNA, zur Extraktion von zfDNA aus dem Plasma, Quantifizierung, Qualitätskontrolle (QC) sowie Bisulfitkonvertierung sind dem Fach mann aus dem Stand der Technik bekannt und/oder hierin beschrieben.

Die konvertierte DNA, z.B. zfDNA, kann für die Herstellung der Libraries verwendet werden. Die Library Präparation erfolgt in zwei Schritten. Im ersten Schritt wird, z.B. wie im Abschnitt 1.1.2.4 beschrieben, von jeder Probe eine WGBS Library hergestellt, welche Informationen über das gesamte Methylom bzw. das zfDNA-Methylom des entsprechenden Patienten enthält. Da im weiteren Verlauf jedoch nur die bestimmten, differentiell methylierten Regionen sequenziert und analysiert werden, können diese aus dem gesamten Methylom angereichert werden. Dies kann als zweiter Schritt auf Basis der Whole Genome Bisulfite Sequencing Library erfolgen.

Es können für die Anreicherung verschiedene erfindungsgemäße Sätze von Methylierungsmar kern eingesetzt werden, z.B. die erstmalig im Rahmen der vorliegenden Arbeit in zfDNA identifi zierten Marker aus Tab. 1a, alle Marker aus Tabelle 1a, alternativ oder zusätzlich die Marker aus Tabelle 1b und/oder 1c. Es ist aber auch möglich, nur Methylierungsmarker einzusetzen, bei denen im Rahmen der Klassifikation, insbesondere für das Vorhandensein eines Tumors (Tabelle 2) oder die Bestimmung der Entität des Tumors (Tabelle 3), aber optional auch für die Bestimmung des Tumorstadiums (Tabelle 4), eine besondere Bedeutung gefunden wurde.

Zur Anreichung können z.B. Capture Probes eingesetzt werden. Diese Capture Probes können das gesamte Plasma-Panel oder Teile davon abdecken (siehe Abschnitt 1.2.1).

Die angereicherte Library kann einer QC unterzogen sowie quantifiziert werden (siehe Abschnitt 1.1.2.2). Sie wird bevorzugt sequenziert, z.B. auf dem „MiSeq“ („Illumina“, USA) (siehe Ab schnitt 1.2.2). Die Sequenzierdaten können z.B. im „FastQ“-Format gespeichert und anschlie ßend analysiert werden (siehe z.B. Abschnitt 1.2.3). Bevorzugt soll nicht das gesamte Methylom analysiert werden, sondern nur definierte Methylierungsmarker. Bevorzugte Methylierungsmar ker sind z.B. die in Tabelle 1 bestimmten 638 Regionen (Plasma-Panel).

Für die Analyse wird, wie erwähnt, insbesondere der Segemehl-Algorithmus zum Alignment ge gen ein Referenzgenom eingesetzt. Danach werden die Methylierungsmuster berechnet.

Das Format des „Segemehr-OufpL/f-Files ist ein anders als das typische „Bismarck“-Format. Daher kann ggf. eine geeignete, mit „Segemehl“ kompatible Analysepipeline eingesetzt werden. Beispielhaft kann in diesem Kontext z.B. das „Bisulfite Analysis Toolkit“ genannt werden. Diese modular aufgebaute Software kann auf zahlreichen Rechenclustern verwendet und durch weite re Software sowie eigene Skripte erweitert werden. Für die Identifikation der für Lungenkrebsdi agnose geeigneten, differentiell methylierten Marker kann die Analysepipeline mit eigenen bio- informatischen Skripten ergänzt werden, z.B. den hierin offenbarten.

Alternativ zu dem Diagnoseverfahren mittels Sequenzierung ist es auf Basis der erfindungsge mäßen Ergebnisse auch möglich, eine Analyse über PCR durchzuführen. Dies ist vor allem für kleinere Untergruppen der bestimmten Marker relevant, z.B. wenn zunächst eine Probe eines Patienten nur auf das Vorhandensein eines Tumors und/oder die Bestimmung der Tumorentität untersucht werden soll. In diesem Fall können z.B. geeignete Primer eingesetzt werden, um Regionen der z.B. zfDNA zu amplifizieren und die in Tabelle 2 und/oder 3 genannten Positionen nachzuweisen. Dies kann aus aufgereinigter, bisulfit-konvertierter DNA z.B. mittels Realtime- PCR erfolgen. Es können aber auch Multiplex-PCRs oder parallele Ansätze eingesetzt werden.

Als interne Kontrolle kann z.B. beta-Aktin analysiert werden, um zu prüfen, ob die Menge an Gesamt-DNA in der Probe ausreichend ist. Dafür kann z.B. zfDNA aus einer Flüssigbiopsie, be vorzugt aus Plasma, z.B. wie in den Ausführungsbeispielen beschrieben, aufgereinigt, bisulfit- konvertiert und wiederum aufgereinigt werden. Es können für die PCR ferner Blocker und De tektionssonden eingesetzt werden, die spezifisch die bisulfit-konvertierten, unmethylierten Se quenzen innerhalb der Regionen erkennen und deren Amplifikation blockieren, so dass die me thylierten Sequenzen bevorzugt amplifiziert werden. Methylierungsspezifische Sonden defekte ren dann ausschließlich methylierte Sequenzen, die während der PCR amplifiziert wurden.

Vergleichbare Verfahren sind bereits beschrieben, z.B. für das Epi proLung Kit (Epigenomics AG, Berlin) und können für die erfindungsgemäß relevanten Methylierungsmarker z.B. aus Ta belle 2 und 3 adaptiert werden. Selbstverständlich ist es auch möglich, weitere Methylierungs marker z.B. aus dem Plasma-Panel, zusätzlich mit diesem Verfahren zu untersuchen, z.B. mehr als 25 differentiell methylierte Positionen oder mehr als 30 differentiell methylierte Positionen, wobei diese bevorzugt die in Tabellen 2 und 3 genannten Methylierungsmarker umfassen und/oder in den in Tabelle 1 genannten Regionen liegen, bevorzugt beides.

Die in der Probe eines Patienten (über Sequenzierungs-basierte Verfahren oder PCR-basierte Verfahren) festgestellten Methylierungsmuster, d.h. die Ergebnisse der Methylierungsmarker- Analyse, können mit den hierin bekannten Mustern für Tumore, optional einer bestimmten Enti tät und/oder eines bestimmten Stadiums korreliert werden, wie z.B. in den Tabellen angegeben. Dies lässt erfindungsgemäß Aussagen über das Vorhandensein, die Entität, das Stadium und/oder die Prognose eines Lungentumors zu und gestattet so eine zuverlässige erweiterte Diagnose. Erfindungsgemäß kann diese Diagnostik eingesetzt werden, um bei Vorhandensein eines Tu mors eine Therapie auszuwählen bzw. über die Einleitung einer Therapie zu entscheiden.

In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung damit auch ein Verfahren zur Behandlung eines Lungentumors, welches ein erfindungsgemäßes Diagnoseverfahren umfasst, wobei bei Vorlie gen eines Tumors dieser Tumor behandelt wird. Vorteilhafterweise kann auch die Entität des Tumors festgestellt werden, wodurch eine z.B. für ein Adenokarzinom oder ein Plattenepithel karzinom geeignete Therapie ausgewählt werden kann. Eine geeignete Therapie kann z.B. die Verabreichung von geeigneten Medikamenten oder Kombinationen von Medikamenten und/oder eine Bestrahlung umfassen.

Alternativ kann das Diagnoseverfahren eingesetzt werden, um bei Nachweis eines Tumors wei tere Diagnoseschritte, wie die Entnahme einer festen Biopsie und oder bildgebende Verfahren durchzuführen.

Gegenstand der Erfindung ist auch eine Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens o- der eines erfindungsgemäßen Mittels zur Diagnose von Lungenkrebs, wobei die Diagnose eine Aussage über das Vorhandenseins eines Tumors, über die Entität eines Tumors, über das Tu morstadium und/oder über die Prognose erlaubt, bevorzugt über Vorhandensein und Entität des Tumors, optional über alles gleichzeitig.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es im Rahmen der vorliegenden Erfindung erstmalig gelungen ist, ein NGS -Panel zu entwickeln, das u.a. auf genomweiten zfDNA- Methylierungssignaturen aus Plasma basiert. Dieses Plasma-Panel konnte unter Verwendung von Liquid Biopsies einer Patientenkohorte (n=12) erfolgreich validiert werden. Es zeichnet das erfindungsgemäße Verfahren jedoch explizit aus, dass es aufgrund der Auswahl der Marker neben der Untersuchung von zfDNA aus einer Flüssigbiopsie auch besonders gut für eine Un tersuchung z.B. Gewebeproben, die bei einer Operation genommen werden, oder Lungenbiop- sie-Gewebe geeignet ist. Während der Pilot-Studie differenzierte das Plasma Panel mit 100%iger Richtigkeit maligne Lungentumore bereits ab Stadium I, identifizierte die häufigsten NSCLC-Subtypen und lieferte weitere Informationen bezüglich der Bestimmung des Stadiums der Lungentumore (Staging).

Die Erfindung wird im Folgenden durch Beispiele erläutert, die die Erfindung illustrieren, aber nicht einschränken sollen. Alle in dieser Anmeldung zitierten Referenzen werden durch die Be zugnahme vollumfänglich hierin aufgenommen. Legende

Fig. 1: Die Auswertung der WGBS Sequenzierdaten erfolgte in mehreren Schritten. A. Zu nächst wurden die Daten einer QC (z.B. mit FastQC) unterzogen und anschließend prozessiert.

B. Dann wurden die prozessierten Daten gegen ein Referenzgenom (z.B. „HG19“) aligned und anschließend C. zum Berechnen der DNA-Methylierungsraten verwendet. Die Positionen, an denen eine Methylierungsrate ermittelt wurde, wurden dann nach bestimmten Kriterien gefiltert (z.B. Coverage und CpG Kontext) und schließlich D. weiteren Analysen unter Verwendung ei gener Skripte unterzogen.

Fig. 2: Prozessierte Sequenzierdaten wurden gegen das „HG19“ Referenzgenom aligned, wo bei das „Bisulfite Analysis Toolkit“ unter Verwendung des Segemehl-Algorithmus eingesetzt wurde. Des Weiteren erfolgten die Detektion von DNA-Methylierungsraten und differentiell me- thylierter Regionen sowie das Erstellen von Übersichtsgraphiken.

Fig. 3: Die Anreicherung von erfindungsgemäß wichtigen, differentiell methylierten Regionen des Satzes von Methylierungsmarkern war in mehrere Schritte unterteilt. A. zunächst wurden, z.B. wie im Abschnitt 1.1.2.4 beschrieben, WGBS Libraries hergestellt. Zur Validierung können diese äquimolar gepoolt werden; wenn dies zur Diagnose von Patienten durchgeführt wird, was vom Sequencer und dessen Kapazität sowie dem Probenaufkommen abhängt, dann können Einzelproben durch ein "Barcoding" individuell markiert und gemeinsam squenziert werden, um die Proben dann wieder bioinformatisch zu trennen. B. Die 638 differentiell methylierten Regio nen wurden dann, hier mit dem „SeqCap Epi Enrichment Kit“, an „Capture Probes“ hybridisiert,

C. unter Verwendung von „Capture Beads“ angereichert und schließlich D. in einer PCR- Reaktion amplifiziert. E. Die fertigen NGS Libraries wurden dann quantifiziert, einer QC unter zogen und auf dem „MiSeq“ sequenziert.

Fig. 4: Das Funktionsprinzip eines Klassifikators. Aus den Daten der Validierungskohorte (12 Patienten) wird zunächst ein Annotationsfile generiert, welcher zusätzlich mit den ermittelten DNA-Methylierungsraten der im Plasma-Panel enthaltenen Regionen (siehe Tabelle 1) in die „Qlucore Omics Explorer“ Software geladen wird. Die DNA-Methylierungsdaten (Variablen) und der Annotationsfile werden von implementierten Algorithmen („k-Nearest Neighbors Algorithm“ (kNN), „Support Vector Machines“ (SVM) und „Random Trees“ (RT)) dazu verwendet, ein opti males Model zu erstellen. Dieser Vorgang wird als Predictive Modelling bezeichnet. Nachdem der optimale Klassifikator generiert ist, ist dieser in der Lage, das zfDNA-Methylierungsmuster eines unbekannten Patienten zu analysieren und somit eine Diagnose zu stellen (Adenokarzi nom (A.K.), Plattenepithelkarzinom (P.K.)). Fig. 5: Ergebnisse der differentiellen Methylierungsanalyse mit HM 450K. Die hierarchische Clusteranalyse von 40 OP-Präparaten und deren korrespondierenden Kontrollen identifizierte A. 898 differentiell methylierte CpG Loci in Tumorproben (q< 1 ^c10²³, o/o_max> 0,4) (linke Hälfte: ganz links drei Tumorproben, dann benignes Gewebe, rechte Hälfte Tumorgewebe) und B. 1.167 differentiell methylierte CpG Loci in unterschiedlichen Lungenkarzinomentitäten (FDR < 1 x 10⁴) (heller oberer Rand: Adenokarzinom, grauer oberer Rand: Plattenepithelkarzinom, dunk ler oberer Rand: Adenosquamöses Karzinom. Ergebnisse: dunkel: wenig Methylierung, hell: viel Methylierung).

Fig. 6: Die mit den „BAT_calling“ und „BAT_filter_vcf“ Modulen ermittelten DNA- Methylierungsraten wurden in das „BAT_summarize“ Modul des „Bisulfite Analysis Toolkit“ ge laden. A. Das Streudiagramm zeigt deutlich, dass die Lungenkarzinomgruppe anhand des DNA-Methylierungsmusters von der Kontrollgruppe (tumorfreie Patientenkohorte) unterschieden werden kann. B. Die mittlere sowie C. die gestaffelte Darstellungen der DNA- Methylierungsraten pro Gruppe verdeutlichen die genomweite Hypermethylierung der Lungen karzinomgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe.

Fig. 7: Die ermittelten zfDNA-Methylierungsmuster wurden normalisiert und einer hierarchi schen Clusteranalyse unterzogen. Dabei wurden A. 18.000 für das Lungenkarzinom und B. 44.000 für die jeweilige Entität spezifische differentiell methylierte CpG Loci identifiziert (Adeno karzinom (A.K.), Plattenepithelkarzinom (P.K.)).

Fig. 8: „Pearson“-Korrelationsanalyse der mit beiden Methoden (HM 450K und WGBS) detek- tierten DNA-Methylierungswerte (Adenokarzinom (A.K.), Plattenepithelkarzinom (P.K.)).

Fig. 9: Die ermittelten zfDNA-Methylierungsraten wurden in die „Qlucore Omics Explorer“ Soft ware geladen und unter Verwendung folgender Klassifikationsalgorithmen analysiert: „k-Nearest Neighbors Algorithm“ (kNN), „Support Vector Machines“ (SVM) und „Random Trees“ (RT). Ein hoher z-Wert steht für eine starke Methylierung. A. Der kNN Algorithmus konnte unter Analyse von 10 differentiell methylierten Positionen (Markern) die gesunden (Kontrolle) von den an ei nem malignen Lungenkarzinom erkrankten Patienten unterscheiden. Sowohl die frühen (I, II) als auch die späten (III, IV) Lungenkarzinomstadien wurden mit 100%iger Richtigkeit klassifiziert (helle Balken an Oberseite der Abbildung: maligner Lungentumor, dunkler Balken (3 Spalten links): Kontrolle). Bei 9 der 10 Positionen findet sich im Tumorgewebe eine stärkere Methylie rung, bei einer eine schwächere. B. Der RT Algorithmus analysierte 10 Positionen, um mit einer 100%igen Richtigkeit die Entität des Tumors zu ermitteln (helle Balken an Oberseite der Abbil dung (6 Spalten rechts): Plattenepithelkarzinom, dunkle Balken (4 Spalten links): Adenokarzi nom). Bei allen gezeigten Markern findet sich beim Adenokarzinom eine stärkere Metylierung als beim Plattenepithekarzinom. C. Die späten Tumorstadien (III, IV) konnten mit einer 80%igen Richtigkeit mit dem SVM Algorithmus identifiziert werden, dabei wurden 523 Positionen analy siert ((helle Balken an Oberseite der Abbildung (4 Spalten links): frühes Stadium (I, II), dunkle Balken an der Oberseite der Abbildung (5 Spalten rechts): spätes Stadium (III, IV)). Dabei sind die ausgewerteten Positionen z.T. in den frühen, z.T. in den späten Stadien stärker methyliert.

Beispiele

1.1 Methoden: „Entwicklung des Plasma-Panels“

Um eine nichtinvasive Lungenkrebsdiagnostik zu ermöglichen, wurde im Rahmen der Erfindung ein geeignetes Panel, also ein Satz von Methylierungsmarkern, zur DNA-Methylierungsanalyse im Blutplasma entwickelt. Der Satz von Methylierungsmarkern wird daher auch als Plasma Pa nel bezeichnet. Die Entwicklung des Plasma Panels erfolgte in drei voneinander unabhängigen Ansätzen. Im ersten Ansatz wurde geprüft, ob die DNA-Methylierung sich generell als Biomar ker für die Lungenkrebsdiagnostik eignet (siehe Abschnitt 1.1.1). Hierfür wurden 40 Lungenkar zinome sowie deren korrespondierenden Kontrollen unter Verwendung des „Illumina Infinium Human Methylation450K BeadChips“ (HM 450K) analysiert. Die Methode identifizierte deutli che, tumorspezifische DNA-Methylierungssignaturen. Als nächstes wurden, wie im Abschnitt

1.1.1 beschrieben, die Regionen mit den stärksten DNA-Methylierungsunterschiede ermittelt und in das Panel aufgenommen.

Im zweiten Ansatz wurde untersucht, ob tumorspezifische DNA-Methylierungssignaturen auch im Blutplasma der betroffenen Patienten detektiert werden können (siehe Abschnitt 1.1.2). Da für wurde zirkulierende, zellfreie DNA aus dem Plasma von Adeno- (n=5) und Plattenepithelkar zinompatienten (n=4) extrahiert und anschließend zu 3 Pools vereinigt. Als Kontrolle diente Plasma einer tumorfreien Patientenkohorte (n=19). Die detaillierten Informationen zu den Pati enten sind im Abschnitt 1.1.2 zusammengestellt. Durch das Poolen wurden individuelle DNA- Methylierungsmuster weitgehend eliminiert, und die allgemeinen tumor- bzw. lungenspezifi schen Signaturen dagegen hervorgehoben. Dann wurden die zfDNA -Pools einer genomweiten Bisulfitsequenzierung unterzogen (engl whole genome bisulfite sequencing (WGBS), siehe Ab schnitt 1.1.2.4). Die Methode detektierte mehrere tausend aberrant methylierte CpG Loci, die nicht nur tumor- sondern auch entitätsspezifisch waren. Davon wurden die am besten geeigne ten Regionen für die Differenzierung für das Plasma Panel ausgewählt (siehe Abschnitt 1.1.2.5.5). Da die Diagnose erfindungsgemäß bevorzugt anhand von Flüssigbiopsien vorge nommen werden soll, sind die hier identifizierten Methylierungsmarker von besonderer Bedeu tung. Im dritten Ansatz wurde das Plasma Panel mit 59 tumorspezifischen sowie prognostisch rele vanten CpG Loci aus weiteren Studien ergänzt (siehe Abschnitt 1.1.3).

1.1.1 Nachweis der aberranten DNA-Methylierung in primärem Tumorgewebe

Der HM 450K Datensatz enthielt Informationen über den Methylierungsstatus von 40 Lungen karzinomen (Adeno- und Plattenepithelkarzinome) und deren korrespondierenden Kontrollen. Der Datensatz wurde mit der „Qlucore Omics Explorer“ Software (Version 3.2, „Qlucore“, Schweden) ausgewertet und ergab:

1.) 897 CpG Loci (T-Test: FDR < 1 ^c 10²³, o/o_{m ax}> 0,4), die zwischen dem Tumor- und ge sundem Lungengewebe differenziert methyliert waren.

2.) 1.167 CpG Loci (T-Test: FDR < 1 ^c 10^-4), die zwischen dem Adeno- und Plattenepithel karzinomgewebe differenzierten.

Um die CpG Loci mit den stärksten DNA-Methylierungsunterschieden zu ermitteln, wurden die beiden Listen zunächst nach differentieller Methylierung größer 35% (avg.beta > 0,35) gefiltert und unter Verwendung von „Bedtools“ (Version 2.2.6, „The University of Utah“, USA) gegen das „HG19“ Referenzgenom annotiert. Alle CpG Loci , die innerhalb von häufigen SNPs (>1% der Bevölkerung) lokalisiert waren und nicht proteinkodierend waren, wurden verworfen. Die übrig gebliebenen Loci wurden in das finale Plasma Panel aufgenommen (Tab. 1).

1.1.2 Nachweis der aberranten DNA-Methylierung in Blutplasma

Die zirkulierende zellfreie DNA wird erfindungsgemäß zur nichtinvasiven Diagnostik von soliden Tumoren genutzt. Falls ein Patient an einer malignen Tumorerkrankung leidet, ist in der Ge samtmenge der zirkulierenden DNA auch die Tumor-DNA enthalten, welche alle therapeutisch und prognostisch relevanten Informationen über die genetischen und epigenetischen Charakte ristika des Tumors enthält. Daher muss die zfDNA aus dem Blut bzw. Blutplasma isoliert wer den. Da zfDNA nur in einer sehr geringen Menge aus dem Blutplasma extrahiert werden kann, wurde hierfür eine Methode gewählt, die sehr spezifisch und effizient die zfDNA anreichert, oh ne dabei weitere Bestandteile des Plasmas zu isolieren.

Dafür kann z.B. das „PME free-circulating DNA Extraction Kit“ („Analytik Jena“, Deutschland, siehe Abschnitt 1.1.2.1) eingesetzt werden. Es enthält ein Polymer, welches nur sehr spezifisch kurzsträngige dsDNA-Fragmente komplexiert. Der Polymer-zfDNA-Komplex wird anschließend ausgefällt und aufgereinigt. Nach der Aufreinigung kann die Komplexverbindung gelöst werden. Die dabei freigegebene DNA wird in weiteren Schritten, z.B. über Bindung an eine Silica-Säule, vom Polymer gereinigt und aufkonzentriert. Auch andere Methoden, die z.B. auf dem gleichen oder ähnlichen Wirkprinzipien beruhen, können eingesetzt werden. Das dabei entstehende Produkt ist sehr sauber und kann auch für empfindliche NGS-basierte Analysemethoden wie z.B. WGBS verwendet werden.

1.1.2.1 Extraktion der zirkulierenden, zellfreien DNA (zfDNA) aus Blutplasma

Blutplasma wurde präpariert und auf Trockeneis verschickt. Hierfür wurde das Vollblut innerhalb von 30 min nach der Entnahme bei 1.500g 10 min lang zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Plasmaüberstand vorsichtig abpipettiert, auf „CryoPure“ Gefäße („Sarstedt AG&Co“, Deutschland) verteilt und sofort bei -80°C eingefroren.

Die eingefrorenen Plasmaproben wurden langsam unter lauwarmem Wasser aufgetaut und an schließend bei 4.500g 10 min lang zentrifugiert. Das Pellet wurde verworfen, der klare Über stand in ein 10 ml_ Röhrchen überführt und mit dem „PME free-circulating DNA Extraction Kit“ gemäß den Weisungen des Herstellers prozessiert.

1.1.2.2 Quantifizierung und Qualitätskontrolle (QC) der extrahierten zfDNA

Die zfDNA wurde fluorometrisch unter Verwendung des „Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit“ („Thermo Fisher Scientific“, USA) quantifiziert. Hierfür wurde jeweils 1 pl_ der Probe mit den 198 mI_ „Qubit dsDNA HS Buffer“ sowie 1 mI_ „Qubit dsDNA HS Reagent“ vermischt, 2 min lang inkubiert und anschließend im „Qubit 2.0“ Fluorometer („Thermo Fisher Scientific“, USA) ver messen. Bei dem „Qubit dsDNA HS Reagent“ handelte es sich um einen Farbstoff, der unter normalen Bedingungen ein sehr schwaches Fluoreszenzsignal erzeugt. Bei Vorhandensein von doppelsträngiger DNA (dsDNA) interkaliert es jedoch in die dsDNA, verändert seine Struktur und erzeugt ein starkes Fluoreszenzsignal. Dabei wird weder einzelsträngige DNA (ssDNA) noch RNA gebunden. Somit korreliert die Signalintensität ausschließlich mit der in der Probe vorhandenen Menge an dsDNA.

Die Qualität der extrahierten zfDNA wurde mit Hilfe des „Agilent 2100 High Sensitivity DNA Kit“ („Agilent“, USA) analysiert. Bei der Methode handelte es sich um eine Kapillar- Gelelektrophorese. Zunächst musste das „Gel-Dye Mix“ vorbereitet werden. Dabei wurden 300 mI_ der Gelmatrix mit 15 pL des Farbstoffkonzentrats versetzt, gemischt und auf einen „Spin Fil ter“ gegeben. Die Zentrifugation erfolgte 10 min lang bei 2.240g. Als nächstes wurde der DNA- Chip in der „Priming Station“ platziert und äquilibriert. Dafür wurden 9 mI_ des „Gel-Dye Mix“ in das für den Äquilibriervorgang vorgesehene Well pipettiert. Der Stempel der „Priming Station“ wurde auf einen Milliliter justiert. Nachdem die „Priming Station“ fest verschlossen war, wurde der Stempel eine Minute lang heruntergedrückt. Schließlich wurden die restlichen Wells des Chips nach Angabe des Herstellers beladen. Der Chip wurde 1 min inkubiert und direkt danach gemessen. Während der Inkubationszeit interkalierte ein im „Gel-Dye Mix“ enthaltener fluores zierender Farbstoff zwischen den Basen der dsDNA. Die dsDNA Fragmente wurden anschlie- ßend durch die mikroskopisch kleinen Kapillaren des „Agilent 2100 Bionalyzer“ („Agilent“, USA) gezogen und dabei nach Fragmentgröße aufgetrennt und detektiert.

1.1.2.3 Bisulfitkonvertierung der zfDNA

Für die genomweite Analyse des DNA-Methylierungsmusters z.B. durch den HM 450K oder die WGBS, wird DNA einer genomweiten PCR-basierten Amplifikation unterzogen. Die DNA- Polymerasen können nicht zwischen Cytosinen und 5-Methylcytosinen unterscheiden, so dass während der Reaktion alle 5-Methylcytosine durch Cytosine ersetzt werden. Die neu syntheti sierten Stränge werden nicht erneut methyliert.

Um Cytosine von 5-Methylcytosinen unterscheiden zu können, wird die Probe vor der PCR ei ner Behandlung mit Natriumbisulfit unterzogen. Dieser Prozess wird als Bisulfitkonvertierung bezeichnet, dabei werden alle unmethylierten Cytosine in Uracile umgewandelt. Die methylier- ten Cytosine bleiben dagegen unter den gewählten Reaktionsbedingungen unverändert. Die Reaktion der Bisulfitkonvertierung ist in NEB, N.E.B. Bisulfitkonvertierung (verfügbar unter: http://www.neb-online.de/wp-content/uploads/2015/04/NEB epigenetik bisulfit3.jpg) sowie in Clark et al. (Clark et al. [1994] Nucl. Acids Res 22: 2990-2997) dargestellt.

Die Bisulfitkonvertierung der zfDNA kann z.B. mit dem „EZ DNA Methylation-Gold™ Kit“ („Zymo Research“, USA) erfolgen. Dafür wurden 10 ng der zuvor extrahierten zfDNA in 20 pl_ Wasser gelöst, mit 130 mI_ „CT“-Konvertierungsreagenz versetzt und im Thermocycler bei folgendem Programm prozessiert: 10 min 98°C, 2,5 h 64°C, bis zu 20 h bei 4°C. Im nächsten Schritt wur den die bisulfitkonvertierten Proben desulfoniert und aufgereinigt. Hierfür wurden sie mit 600 mI_ „M-Binding Buffer“ versetzt, auf die „Zymo-Spin™ IC“ Säulen pipettiert und bei 10.000g 30 s lang zentrifugiert. Dann wurden 100 mI_ „M-Wash Buffer“ auf die Säulen gegeben. Die Säulen wurden 30 s lang bei 10.000g zentrifugiert und für 20 min mit 200 mI „M-Desulphonation Buffer“ behandelt. Nach anschließender 30 s langen Zentrifugation bei 10.000g wurden die „Zymo- SpinTM IC“ Säulen mit 200 mI_ „M-Wash Buffer“ gewaschen, zur Entfernung verbliebener Flüs sigkeiten für 30 s bei 10.000g zentrifugiert und die DNA mit 15 pL „Elution Buffer“ bei 10.000g 30 s lang eluiert.

1.1.2.4 Whole Genome Bisulfite Sequencing (WGBS)

Um das zfDNA-Methylierungsprofil genomweit analysieren zu können, wurden die zuvor bisul fitkonvertierten Proben einer WGBS unterzogen. WGBS ist eine NGS-basierte Methode (engl. next generation sequencing). Heutzutage existieren zahlreiche Technologien, die NGS ermögli chen. Die am meisten verbreitete und auch hier verwendete NGS Technologie bietet die Firma „Illumina“ (USA) an. Die zugrunde liegende Sequenzierreaktion ist fluoreszenzbasiert und er folgt auf einem Glasträger, auch Flowcell genannt. Um die DNA-Fragmente an der Flowcell zu immobilisieren, werden zunächst spezielle „Illumina“ Adapter (kurze Oligonukleotide) ligiert. Nachfolgend wird die Probe einer Denaturierungsreaktion unterzogen. Da sich auf der Flowcell nicht nur die Adapterbindestellen, sondern auch Primer befinden, kommt es zum "Umknicken" des zu sequenzierenden ssDNA-Fragments. Während der nachfolgenden PCR-Reaktion wer den die DNA-Stränge vervielfältigt. Dieser Vorgang wird als Bridge Amplification bezeichnet. Dabei entstehen durch die fortschreitende Amplifikation an begrenzten Positionen die soge nannten Sequenziercluster, die nachfolgend dissoziieren. Nach der Clusterbildung erfolgt die eigentliche Sequenzierreaktion, bei der DNA-Basen eingebaut werden, die je nach eingebauter Base Fluoreszenzsignale unterschiedlicher Wellenlängen erzeugen. Nach jedem abgeschlos senem Einbauzyklus werden diese Fluoreszenzsignale detektiert und liefern somit die Informa tionen über die Basenabfolge innerhalb eines Reads.

Je nach gewünschtem Durchsatz, können unterschiedliche „Illumina“ Plattformen genutzt wer den. Für die Sequenzierung gezielter Regionen, sogenannten Panels, wie dem erfindungsge mäß identifizierten Panel oder Satz an Methylierungsmarkern, ist im allgemeinen die schnellere und preisgünstigere „MiSeq“ Plattform ausreichend. Die die Sequenzierung kann aber z.B. auch auf den „NextSeq 500“ oder „HiSeq“ oder anderen geeigneten Sequenzier-Plattformen erfolgen.

1.1.2.4.1 Erstellen der WGBS Libraries (WGBS Bibliotheken)

Während der Bisulfitkonvertierung wird DNA durch die verwendeten Reagenzien sehr stark be ansprucht und somit zu einem hohen Anteil degradiert. Deswegen verwenden die herkömmli chen WGBS Protokolle sehr hohe Mengen an DNA, mindestens 500 ng. Da die zellfreie, zirku lierende DNA zum einen von Anfang an schon sehr stark fragmentiert ist und zum anderen nur in einer sehr geringen Menge gewonnen werden kann, ist die Herstellung von WGBS Libraries mit herkömmlichen Kits zurzeit schwierig.

Deshalb wurde für folgende Experimente das „Accel-NGS^® Methyl-Seq DNA Library Kit“ („Swift Biosciences“, USA) etabliert. Das Kit wurde speziell für WGBS der zfDNA entwickelt. Bereits bei zfDNA-Mengen von weniger als 10 ng können damit komplexe WGBS Libraries generiert wer den. Die zentrale Rolle spielt dabei das Enzym „Adaptase“, welches einen 10 nt langen Über hang am 3‘-Ende der bisulfitkonvertierten ssDNA anfügt. Dieser Überhang ermöglicht ein bes seres Ligieren der Sequenzieradapter und somit eine effizientere Library Herstellung. Daher wird erfindungsgemäß bevorzugt ein Verfahren zur Herstellung der WBGS Libraries eingesetzt, welches mittels des Enzyms Adaptase einen 10 nt langen Überhand am 3'-Ende der bisulfit konvertierten ssDNA einfügt.

Die Library Herstellung wurde mit dem „Accel-NGS^® Methyl-Seq DNA Library Kit“ („Swift Biosciences“, USA) in vier Schritten durchgeführt: Behandlung mit dem Enzym „Adaptase“, Ex- tension, Ligation, PCR. Für die Behandlung mit dem Enzym „Adaptase“ wurden 10 ng bisulfit- konvertierter zfDNA in 15 pL Wasser aufgenommen und bei 95°C für 2 min denaturiert. Dann wurden zu der Probe 25 pl_ des „Adaptase Reaction Mix“ gegeben, vorsichtig gemischt und im Thermocycler prozessiert (Programm 1: 37°C 15 min; 95°C 2 min; 4°C; bei allen Programmen war der Deckel des Thermocyclers vorgeheizt). Als nächstes erfolgte die Extension. Hierfür wurde die Probe mit 44 mI_ „Extension Reaction Mix“ versetzt, vorsichtig gemischt und im TI ier- mocycler inkubiert (Programm 2: 98°C 1 min; 62°C 2 min; 65°C 5 min; 4°C).

Das Produkt wurde aufgereinigt. Dafür können z.B. „SPRI Beads“ („Beckman Coulter“, USA) eingesetzt werden. Danach erfolgte die Ligation, für die 15 pL des Produkts mit 15 pL „Ligation I Reaction Mix“ versetzt und im Thermocycler prozessiert wurden (Programm 3: 25°C 1 min; 4°C). Auch bei diesem Schritt wurde das fertige Produkt unter Verwendung von „SPRI Beads“ („Beckman Coulter“, USA) aufgereinigt. Schließlich wurde die PCR durchgeführt. Dabei wurden pro Probe 5 pL des jeweiligen Index sowie 25 pL des „Indexing PCR Reaction Mix“ hinzugege ben. Die fertige PCR-Reaktion wurde im Thermocycler inkubiert (Programm 4: 98°C 30 s; PCR- Zyklen: 98°C 10 s; 60°C 30 s; 68°C 1 min (7-9 Zyklen); 4°C) und über die „SPRI Beads“ („Beckman Coulter“, USA) nach den Instruktionen des Herstellers aufgereinigt.

Die fertigen WGBS Libraries wurden wie im Abschnitt 1.1.2.2 beschrieben quantifiziert und auf ihre Qualität überprüft.

„SPRI Beads“ Aufreinigung

Die Proben wurden in 1,5 mL Eppendorf Reaktionsgefäße überführt und im vorgeschriebenen Verhältnis mit „SPRI Beads“ („Beckman Coulter“, USA) versetzt (Tab. A). Dann wurden die Pro ben gemischt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Da die Beads magnetisch waren, konn te zum Pelletieren das Prinzip der magnetischen Separation genutzt werden. Hierfür wurden die Reaktionsgefäße auf einem magnetischen Ständer platziert und dann 2 min lang bei Raumtem peratur inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Überstand entfernt, die Beads mit je 500 pL 80%igen Ethanol („Merck Millipore“, USA) zwei Mal gewaschen und anschließend an der Luft getrocknet. Sobald das Ethanol verdampft war, wurden die Proben vom magnetischen Ständer entnommen. Die „SPRI Beads“ wurden in der vorgeschriebenen Menge „Low EDTA TE“ Puffer resuspendiert (Tab. A) und 2 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurden die Proben wieder auf den magnetischen Ständer platziert. Nach ca. 2 min erfolgte eine vollständi ge Trennung des Überstands und der „SPRI Beads“. Der Überstand enthielt das aufgereinigte Produkt, wurde abpipettiert und für den nächsten Schritt verwendet.

Tab. A: Proben- und Reagenzvolumina für die Aufreinigungsschritte mit den „SPRI Beads“. Schritt Probe „SPRI Beads“ „Low EDTA TE“ Puffer

1.1.2.4.2 Sequenzierung der WGBS Libraries

Die Sequenzierung der WGBS Libraries erfolgte auf der „NextSeq 500“ Plattform („Illumina“, USA) im „TATAA- Biocenter“ (Göteborg, Schweden). Dabei wurden vier 76 pair end (PE) Läufe im Hochdurchsatzmodus durchgeführt.

1.1.2.5 Bioinformatische Auswertung der WGBS Ergebnisse

Die WGBS Libraries konnten aufgrund der starken Fragmentierung und geringen Mengen an zfDNA nicht mit herkömmlichen Protokollen angefertigt werden. Die mit dem „Accel-NGS^® Me- thyl-Seq DNA Library Kit“ („Swift Biosciences“, USA) hergestellten zfDNA Libraries wiesen somit eine andere Komplexität und Fragmentverteilung auf, als die herkömmlichen WGBS Libraries. Deswegen musste auch eine geeignete bioinformatische Auswertepipeline etabliert werden, um die Daten optimal analysieren zu können.

Generell müssen mehrere Schritte etabliert werden, um WGBS Daten auswerten zu können (Fig. 1). Zunächst wird die Qualität der Rohdaten überprüft. Hierfür wird am häufigsten die „FastQC“ Software (Version 0.11.15, „Babraham Bioinformatics“, England) verwendet (siehe Abschnitt 1.1.2.5.1). Die Software visualisiert die Qualität der Sequenzierung, Längenverteilung und Zusammensetzung der Reads. Des Weiteren werden Informationen über mögliche Adap terkontaminationen sowie Anzahl an Kmeren und PCR-Duplikaten geliefert. Als Kmere werden Sequenzen mit einer Mindestlänge von zwei Nukleotiden bezeichnet, die sich in den Rohdaten immer wieder wiederholen.

Falls die Qualitätskontrolle zufriedenstellende Ergebnisse liefert, erfolgt das Trimmen der Adap tersequenzen. Bei den zfDNA Libraries musste außerdem der von der „Adaptase“ erzeugte 10 nt lange Überhang aus den Rohdaten eliminiert werden (siehe Abschnitt 1.1.2.5.2).

Nach dem Trimmen können die Reads gegen ein Referenzgenom der Wahl angeordnet wer- den, dieser Vorgang wird auch als Alignment bezeichnet (siehe Abschnitt 1.1.2.5.3). Für das Alignment sind viele Algorithmen verfügbar. Je nach Beschaffenheit der WGBS Library muss der passende ausgewählt und optimiert werden. Hierfür kann die Mapping Effizienz analysiert werden. Dabei wird berechnet wie viel Prozent an analysierten Reads dem Referenzgenom zu geordnet werden können. Für die herkömmlichen WGBS Libraries wird am häufigsten der „Bis- marck“ Algorithmus verwendet (Krueger & Andrews [2011] Bioinformatics 27: 1571-1572). Bei den hier beschriebenen zfDNA Libraries lieferte „Bismarck“ (Version 0.15.0, „Babraham Institu te“, England) jedoch keine zufriedenstellende Ergebnisse ( Mapping Effizienz von ca. 70%). Deshalb wurden weitere Algorithmen ausgetestet.

Die besten Ergebnisse mit einer Mapping Effizienz von mindestens 98% lieferte der „Segemehl“ Algorithmus (Version 0.2.0, „Interdisziplinäres Zentrum für Bioinformatik, Universität Leipzig“, Deutschland) (Otto et al. [2012] Bioinformatics 28: 1698-1704).

Nach dem Alignment werden die Daten nach CpG Kontext sowie der gewünschten Coverage (mindestens vierfach) z.B. mit dem „Bisulfite Analysis Toolkit“ (Version 0.1, „Interdisziplinäres Zentrum für Bioinformatik, Universität Leipzig“, Deutschland) gefiltert und erst dann für das Peak Calling verwendet (siehe Abschnitt 1.1.2.5.3). Die Coverage, auch Sequenziertiefe ge nannt, gibt an, wie häufig eine Position beim Sequenzieren abgelesen wurde. Z.B. sagt eine mittlere Coverage von 100fach aus, dass jede sequenzierte Base im Durchschnitt 100 Mal ab gelesen wurde. Das Peak Calling ist der eigentliche Schritt, in dem der Methylierungsstatus des jeweiligen CpG berechnet wird. Dabei werden alle Reads angeschaut, die ein bestimmtes CpG enthalten, das Cytosin zu Uracil Verhältnis wird berechnet und das Ergebnis als eine Zahl zwi schen 0 und 1 ausgegeben, wobei 0 einer Methylierung von 0% und 1 einer Methylierung von 100% entspricht. Die herkömmlichen Libraries haben eine durchschnittliche Coverage von 30 bis 40fach, worauf auch die herkömmlichen Methoden für das Peak Calling ausgelegt sind. Die zfDNA Libraries hatten aufgrund der geringeren Komplexität eine durchschnittliche Coverage von 8 bis 10fach. Dementsprechend musste auch das Filtern und Peak Calling z.B. mit dem „Bisulfite Analysis Toolkit“ optimiert werden.

Sobald die DNA-Methylierungsraten feststehen, können weitere, spezifische Analysen je nach Fragenstellung in einer Programmiersprache der Wahl erfolgen. Für die hier beschriebenen Analysen wurden „R“ (Version 3.2.0, „R Foundation for Statistical Computing“, Österreich), „Perl“ (Version 5.26.0, „The Perl Foundation“, USA) und „Python“ (Version 3.3.6, „Python Soft ware Foundation“, USA) verwendet (siehe Abschnitt 1.1.2.5.3).

Da die hier beschriebenen Analysen eine sehr hohe Rechenkapazität benötigten, erfolgten sie auf einem „NEC-HPC-Linux-Cluster“. Zugang zum Vorrechner erfolgte über eine SSH- Verbindung unter Verwendung der „MobaXterm Personal Edition“ Software („Mobatek“, Frank reich).

1.1.2.5.1 Oualitätskontrolle der Rohdaten

Die Rohdaten wurden im „FastO“- Format geliefert. Hierbei handelt es sich um ein text-basiertes

Format, das zum Speichern der Reads sowie dazugehöriger Oualitätsparameter verwendet wird. Um die Qualität der Sequenzierung zu überprüfen, wurde die „FastQC“ Software verwen det.

1.1.2.5.2 Datenprozessierung ( Trimmen )

Die Rohdaten wurden unter Verwendung der „Cutadapt“ Software (Version 1.9.1, „TU Dort mund”, Deutschland) (Martin EMBnet.journal 17) prozessiert. Dabei wurden zwei Schritte durchgeführt.

1.) Eliminierung der überrepräsentierten Sequenzen

Während der Sequenzierung wurden die ersten 76 Basen jedes DNA-Fragments von beiden Enden abgelesen (76 PE Sequenzierung). Die mit dem „Accel-NGS^® Methyl-Seq DNA Library Kit“ generierten Libraries, enthielten DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge. Das bedeutet, wenn ein DNA-Fragment kürzer als 152 bp war, wurden auch die „Illumina Adapter“ bzw. die Flowcell sequenziert. Das resultierte im Vorhandensein von „NNNNNNNNNNN“-Sequenzen. Da im weiteren Verlauf der Datenanalyse das Align- ment der dazugehörigen und sonst qualitativ guten Reads aus diesem Grund verhindert werden würde, mussten die überpräsentierten Sequenzen entfernt werden. Der hierfür verwendete Befehl lautete: cutadapt -q 20 -o 5 -minimum-length 30 -a GATCGGAAGAG -A AGATCGGAAGAG -o <Name_Read_1>.clipped.fastq.gz -p <Name_Read_2> .ciipped.fastq.gz <Na- me_Read_1>.fastq.gz <Name_Read_2>.fastq.gz &><Name>.clipping.stats

2.) Beseitigung des von der „Adaptase“ erzeugten Überhangs

Während der Herstellung der WGBS Library wurde das Enzym „Adaptase“ verwendet, welches am 3‘-Ende des zweiten Reads einen Überhang mit niedriger Komplexität er zeugte. Dieser Bereich würde genauso wie die überpräsentierte Sequenzen beim späte ren Alignment stören und musste somit entfernt werden. Der Befehl lautete: cutadapt -minimum-length 25 -u 11 -o <Name_Read_2>.clipped.trimmed.fastq.gz -p <Name_Read_ 1>. ciipped. trimmed. fastq. gz <Name_Read_2>. clipped. fastq. gz <Na- me_Read_ 1 >. clipped. fastq. gz

1.1.2.5.3 Auswertung der prozessierten Daten

Die anschließende Datenanalyse erfolgte mit dem „Bisulfite Analysis Toolkit“ [201] Die Funktion der modular aufgebauten Software ist in Fig. 2 dargestellt.

Das Alignment wurde gegen das „HG19“ Referenzgenom durchgeführt. Dabei wurden mehrere Algorithmen getestet, wobei überraschenderweise der„Segemehl“-Algorithmus die besten Er gebnisse lieferte (vgl. Abschnitt 1.1.2.5). Der Algorithmus beruht auf der Suche nach einem op- timalen Treffer im Referenzgenom (Hoffmann et al. [2009] PLoS Comput. Biol. 5: e1000502). Die maximal erlaubte Anzahl an Ungenauigkeiten pro Read (z.B. Insertionen, Deletionen, Punktmutationen) betrug 10%. Alle Treffer, die diesen Schwellenwert unterschritten, wurden zu dem semi-globalen Alignment zugelassen. Letztendlich wurden nur die Reads mit einer Genau igkeit von mindestens 90% in einer finalen Datei aufgelistet und für die weiteren Analysen ver wendet.

Das dabei bevorzugt eingesetzte „BAM“-Format ist eine komprimierte Version der „SAM“-Datei, ein text-basiertes Format, das zum Speichern von Ergebnissen des Alignments vom Algorith mus generiert wird. Die statistische Auswertung der Mapping Effizienz erfolgte z.B. mit dem „BAT_mapping_stat“ Modul (Kretzmer et al. [2017] F1000Res. 6: 1490).

Schließlich wurden alle Reads, die zu einer Probe gehörten, in ein „BAM“-File mit dem „BAT_merging“ Modul zusammengeführt. Die überlappenden Sequenzen wurden mit dem „Cli- pOverlap“ (BamUtil Version 1.0.13) Modul eliminiert. Die Befehle lauteten: perl BAT_mapping.pl -g hg19.fa -i hg19 -p <Name_Read_1>.dipped.trimmed.fastq.gz -q <Name_Read_2>.dipped.trimmed.fastq.gz -t 16 -tmp <Folder> -segemehl segemehl.x -o <Folder>/<Name> perl BAT_mapping_stat.pl -bam <Name>.bam -fastq <Name>.dipped.trimmed.fastq.gz -b > <Name>.stat perl BAT_merging.pl -o <Name>.bam -bam <fiel_1>.bam,<file_2>.bam, <file_n>.bam bamUtil_1.0.13/bamUtil/bin/bam ClipOverlap -in <Name>.bam -out <Name>.nooverlap.bam

Im nächsten Schritt wurde die DNA-Methylierung mit Hilfe von „BAT_calling“ detektiert. Das Modul erzeugt eine „VCF“-Datei. Hierbei handelt es sich um eine Textdatei, die nur Informatio nen über die detektierten DNA-Methylierungsraten, Coverage, Anzahl an abgedeckten Nukleo tiden und den Sequenzkontext enthält. Im weiteren Verlauf der Analysen wurde diese Datei nach CpG Kontext und einer Coverage von mindestens achtfach gefiltert. Dabei wurden Abbil dungen generiert und weitere „VCF“- sowie „BedGraph“-Dateien erzeugt.

Als nächstes wurde das „BAT_summarize“ Modul verwendet, welches die Mittelwerte detektier- ter DNA-Methylierungsraten zweier Gruppen ermittelte. Die berechneten DNA- Methylierungsraten sowie die genomischen Koordinaten der Cytosine wurden in eine text basierte „BedGraph“-Datei geschrieben, die im weiteren Verlauf für die Identifikation differentiell methylierter Regionen verwendet wurde. Die Visualisierung der DNA-Methylierung pro Gruppe erfolgte unter Verwendung des „BAT_overview“ Moduls [201] Die Befehle lauteten:

BAT_calling.pl -d hg19.fa -q <Name> .nooverlap.bam -haarz segemehl_0_2_0/segemehl/ haarz.x -o <Folder>

BAT_filter_vcf.pl -vcf <Name> .nooveriap.vcf.gz -out <Name>_CG_cov_final -context CG - MDP_min 8 -MDP_max 50

BAT_summarize.pl -in1 Adeno_CG_cov.bedgraph,PEKA_CG_cov.bedgraph -in2 Con- trol_CG_cov.bedgraph -I cancer, control ~h1 Adeno,PEKA ~h2 Control -out pilot -cs hg19.chrom.sizes -bgbw bedGraphToBigWig

Rscript BAT_overview.R -i pilot_cancer_control.txt -o pilot_overview.pdf -p cancer -q control

1.1.2.5.4 Korrelationsanalysen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Daten von zwei Methoden zur genomweiten Untersuchung von DNA-Methylierungsmustern verwendet: WGBS und Methylation Array (HM 450K).

Für die Korrelationsanalysen wurde die „Bedtools“ Software verwendet. Das „Bedtools Inter- sect“ Modul liest sowohl die WGBS als auch HM 450K Ergebnisse ein, prüft sie auf Überlap pung und schreibt die überlappenden CpG Loci in eine neue „BED“-Datei. Bei dem „BED“- Format handelt es sich um eine Textdatei. Jede Zeile der Datei enthält genomische Koordinaten eines CpG. Die Spalten sind durch ein Tabulatorzeichen getrennt. Die „BED“-Datei wurde nach folgend direkt in „R“ geladen und der „Pearson“ Korrelationsanalyse unterzogen (p-Wert < 0,01). Die Visualisierung der Ergebnisse erfolgte ebenfalls in R.

1.1.2.5.5 Auswählen der CpG Loci für das Plasma Panel

Die WGBS Daten wurden wie beschrieben ausgewertet. Die mit dem „BAT_summarize“ Modul generierte „BedGraph“-Datei enthielt drei Gruppen (Kontrolle, Adenokarzinom, Plattenepithel karzinom) mit jeweils 11.289.424 Positionen pro Gruppe. Die „BedGraph“-Datei wurde in zwei Listen unterteilt. Die erste Liste enthielt 29.877 Loci , die DNA-Methylierungsunterschiede zwi schen der Tumor- und Kontrollgruppen zeigten. Die zweite Liste enthielt 76.374 CpG Loci , die unterschiedlich jeweils in Adeno- und Plattenepithelkarzinomgruppen methyliert waren. Als dif ferentiell methyliert wurden die Regionen bezeichnet, welche einen DNA-Methylierungsunter- schied von mindestens 15% aufwiesen.

Als nächstes wurden die beiden Listen nach Chromosomen sortiert und mit dem „HG19“ Refe renzgenom annotiert. Die CpG Loci , die auf Chromosomen X, Y und M (mitochondriales Chro- mosom) sowie innerhalb von häufigen SNPs (>1% der Bevölkerung) lokalisiert waren und nicht proteinkodierend waren, wurden verworfen.

Die verbliebenen CpG Loci mussten eines der drei Kriterien erfüllen, um in das Plasma Panel aufgenommen zu werden:

1.) differentiell methyliertes CpG wurde von beiden Methoden detektiert (WGBS und HM

450K),

2.) differentiell methyliertes CpG liegt innerhalb eines Clusters bestehend aus mindestens zwei weiteren differentiell methylierten CpG Loci , alle CpG Loci des Clusters sind ent weder hypo- oder hypermethyliert, der Abstand zwischen den CpG Loci beträgt 2 bis 20 Nukleotide,

3.) es handelt sich um ein CpG mit der höchsten differentiellen DNA-Methylierungsrate

(>0.8).

Die DNA-Regionen, die eines der drei Kriterien erfüllten, wurden in das Plasma Panel aufge nommen (siehe Tab. 1). Alle verwendeten Aufrufe sind unten detailliert beschrieben.

1.1.3 Weitere Komponenten des Plasma Panels (in silico Datenanalysen)

1.1.3.1 Die prognostische Studie

Zusätzlich zu den diagnostisch bzw. therapeutisch relevanten Informationen (z.B. Stadium und Tumorentität) sollte das Panel auch prognostische Informationen beinhalten. Deswegen wurde es um 33 CpG Loci erweitert, die im Rahmen einer klinischen Studie erhoben wurden. Der Titel der Studie lautete: „Comprehensive characterization of non-small cell lung cancer (NSCLC) by integrated clinical and molecular analysis”.

Der zur Verfügung gestellte HM 450K-Datensatz enthielt Informationen über den DNA- Methylierungsstatus von insgesamt 41 Lungenkarzinomen. Die Patienten wurden je nach Über lebensdauer klassifiziert. Dabei wurden 28 Patienten zu der prognostisch günstigen (Überle bensdauer länger als 15 Monate) und 13 zu der ungünstigen Gruppe (Überlebensdauer kürzer als 13 Monate) gezählt. Die 33 in das Panel aufgenommene CpG Loci konnten beide Gruppen anhand des DNA-Methylierungsmusters voneinander trennen und enthielten somit für die Prog nose relevanten Informationen.

1.1.3.2 Die bivalente Chromatin Studie

Zusätzlich zu den WGBS und HM 450K Ergebnissen wurden 26 differentiell methylierte Regio nen aus der Studie zu bivalentem Chromatin in Tumoren in das Plasma Panel aufgenommen. Die bivalenten Promotoren tragen sowohl aktivierende als auch reprimierende Histonmodifikati- onen, die vor allem während der Zelldifferenzierungsprozesse eine wichtige Rolle spielen. In Tumorzellen sind sie häufig fehlerhaft reguliert. Während der Studie wurden WGBS- und HM 450K-Datensätze verschiedener Tumorproben und -zelllinien (n=7000) analysiert.

1.2 Methoden: „Validierung des Plasma Panels/ Untersuchung von Patientenproben"

Der erfindungsmäßige Satz an Methylierungsmarkern, das Plasma Panel, enthielt 630 differen tiell methylierte Regionen (Tab. 1). Es wurde von der Firma „Roche“ (Schweiz) synthetisiert und auf Trockeneis verschickt. Hierbei handelte es sich um ein nach Kundenwunsch synthetisiertes, nicht kommerziell erhältliches „SeqCap Epi Enrichment Kit“ („Roche“, Schweiz). Laut Hersteller war das Panel sowohl für die Analyse von Gewebeproben als auch zirkulierender, zellfreier DNA geeignet.

Es wurde im Rahmen einer Pilotstudie validiert. Hierfür wurde vom DZL Blutplasma von 12 Pa tienten zur Verfügung gestellt. Davon waren drei Patienten zum Zeitpunkt der Untersuchung gesund bzw. tumorfrei (Kontrollgruppe) und neun litten an nicht-kleinzelligem Lungenkarzino men unterschiedlicher Stadien (Tumorgruppe).

Die Validierung erfolgte in mehreren Schritten. Zunächst wurde das Validierungsmaterial, die zirkulierende, zellfreie DNA, vorbereitet. Die Extraktion aus dem Plasma, Quantifizierung, Quali tätskontrolle (QC) sowie Bisulfitkonvertierung erfolgten wie bereits in Abschnitten 1.1.2.1-1.1.2.3 beschrieben.

Je 10 ng der konvertierten zfDNA wurden dann für die Herstellung der Libraries verwendet. Die Library Präparation erfolgte in zwei Schritten. Im ersten Schritt wurde wie im Abschnitt 1.1.2.4 beschrieben von jeder Probe eine WGBS Library hergestellt, die Informationen über das ge samte zfDNA-Methylom des entsprechenden Patienten enthielt. Da jedoch im weiteren Verlauf nur die 638 differentiell methylierten Regionen sequenziert und analysiert werden sollten, wur den sie im zweiten Schritt aus dem gesamten Methylom extrahiert und angereichert. Das ge schah unter Verwendung des „SeqCap Epi Enrichment Kit“, dessen Bestandteil das von „Ro che“ synthetisierte Plasma Panel war (siehe Abschnitt 1.2.1).

Die fertige Library wurde einer QC unterzogen sowie quantifiziert (siehe Abschnitt 1.1.2.2) und anschließend auf dem „MiSeq“ („Illumina“, USA) sequenziert (siehe Abschnitt 1.2.2). Die Se quenzierdaten wurden im „FastQ“- Format gespeichert und mussten anschließend analysiert werden (siehe Abschnitt 1.2.3). Hierfür wurde die bioinformatische Pipeline aus dem Abschnitt 1.1.2.5 angepasst, da diesmal nicht das gesamte Methylom, sondern nur die 638 bestimmten Regionen des Plasma Panels analysiert werden sollten. Die Ergebnisse wurden schließlich für die Entwicklung eines Klassifikators verwendet, der nach folgend die DNA-Methylierungsmuster interpretierte und diagnostisch sowie klinisch relevante Informationen über den gesundheitlichen Zustand eines Patienten lieferte (siehe Abschnitt 1.2.3.3).

Nach dem gleichen Prinzip können auch Proben eines Patienten analysiert werden, bei dem eine Diagnose von Lungentumoren erfolgen soll. Hier werden die Proben jedoch zur Analyse nicht gepoolt.

2.2.1 Anreicherung von differentiell methylierten Regionen

Für die Extraktion und Anreicherung von 630 differentiell methylierten Regionen aus dem ge samten zfDNA-Methylom wurde das „SeqCap Epi Enrichment Kit“ verwendet. Einer der Be standteile des Kits war das designte Plasma Panel (siehe Tab. 1). Die dort enthaltenen Oligo- nukleotide, auch „Capture Probes“ genannt, hybridisierten an die differentiell methylierte Regio nen und konnten im weiteren Verlauf angereichert und amplifiziert werden (Fig. 3).

Hybridisierungsreaktion

Die 12 hergestellten WGBS Libraries wurden innerhalb der verschiedenen Gruppen äquimolar gepoolt und zunächst für eine Hybridisierungsreaktion vorbereitet. Bei diagnostischen Proben werden entweder Einzelproben hybridisiert oder Pools von Proben, die jeweils mit einem "Bar code" versehen sind, zum Einsatz kommen. Hierfür wurden 1 pg des WGBS L/bra/y-Pools mit 10 pL „Bisulfite Capture Enhancer“, 1 pL „SeqCap HE Universal Oligo“ und 1 pL „SeqCap HE Index Oligo“ in ein 1,5 mL Reaktionsgefäß mit einem kleinen Loch im Deckel pipettiert. Die Pro be wurde in einem Vakuumkonzentrator solange eingedampft, bis ein klares weißliches Pellet zu sehen war. Die „SeqCap HE Universal“ und „SeqCap HE Index“ Oligonukleotide wurden in einem Überschuss hinzugegeben (1 pL entsprach 1.000 pmol) und dienten dazu, die freiliegen den WGBS Universal- und Indexadapter zu binden. Somit sollte verhindert werden, dass die WGBS Adapter die nachfolgende Hybridisierungsreaktion stören.

Für die eigentliche Hybridisierungsreaktion wurden 7,5 pL zweifacher „Hybridisation Buffer“ so wie 3 pL „Hybridisation Component A“ direkt auf das Pellet gegeben, 10 s gemischt, kurz zentri fugiert und 10 min bei 95°C inkubiert. Dann wurde die Probe in ein 0,2 pL Reaktionsgefäß über führt, mit 4,5 pL „Capture Probes“ versetzt, gut gemischt und bei 47°C 72 h lang in einem Thermocycler inkubiert. Der Deckel des Thermocyclers war auf 57°C vorgeheizt. Die „Capture Probes“ wurden speziell für dieses Projekt synthetisiert. Sie enthielten 638 unterschiedliche Oli gonukleotide, die komplementär zu den untersuchten differentiell methylierten Regionen (siehe Tab. 1) waren und im Laufe der Hybridisierungsreaktion diese gezielt banden. Anreicherung und Waschen der hybridisierten „Capture Probes“

Im nächsten Schritt wurden die gebundenen „Capture Probes“ angereichert und mehrfach ge waschen. Hierfür wurden mehrere Waschpuffer sowie die „Capture Beads“ nach Angaben des Herstellers vorbereitet.

Die hybridisierte Probe wurde mit 100 mI_ „Capture Beads“ versetzt, kurz gemischt und 45 min bei 47°C im Thermocycler inkubiert. Der Deckel des Thermocyclers war auf 57°C vorgeheizt. Um das Absetzen der Beads zu verhindern, wurden die Proben alle 15 min kurz aus dem Thermocycler entnommen und gemischt. Bei den hier verwendeten „Capture Beads“ handelte es sich um Streptavidin -Beads, die mit den bioti nylierten „Capture Probes“ interagierten.

Nach der Inkubation wurden die Proben aus dem Thermocycler entnommen und die „Capture Beads“ mehreren Waschschritten unterzogen. Das Trennen der Beads vom Puffer erfolgte je des Mal bei Raumtemperatur unter Verwendung des „DynaMag™-PCR“ Magnets („Thermo Fis her Scientific“, USA).

Im ersten Teil des Waschprotokolls wurden nur Puffer verwendet, die zuvor auf 47°C vorge wärmt wurden. Dabei wurde die Probe mit 100 mI_ einfachem „Wash Buffer I“ versetzt, kurz ge mischt und mit Hilfe eines Magneten pelletiert. Der Überstand wurde verworfen, die Beads in 200 mI_ einfachem „Stringent Wash Buffer“ gelöst, 5 min lang im Thermocycler bei 47°C inku biert und wieder mit Hilfe eines Magneten pelletiert. Der Überstand wurde wieder verworfen und die Beads zwei weitere Male mit 200 mI_ einfachem „Stringent Wash Buffer“ gewaschen.

Der zweite Teil des Waschprotokolls erfolgte komplett bei Raumtemperatur, dementsprechend mussten die hierfür verwendeten Puffer auf Raumtemperatur vorgewärmt werden. Zunächst wurden die zuvor bei 47°C gewaschene „Capture Beads“ in 200 mI einfachen „Wash Buffer I“ gelöst, 2 min lang gemischt und mit Hilfe eines Magneten pelletiert. Der Überstand wurde ver worfen, die Beads mit 200 ml_ einfachem „Wash Buffer II“ versetzt, 1 min lang gemischt und wieder mit Hilfe eines Magneten pelletiert. Auch hier wurde der Überstand verworfen, die Beads in 200 ml_ „Wasch Buffer III“ gelöst, kurz gemischt und schließlich auf dem Magneten vom Überstand getrennt.

Für die darauffolgende Elution wurden 50 mI_ dH2Ü direkt auf die Beads gegeben, 2 min lang bei Raumtemperatur inkubiert und mit Hilfe eines Magneten pelletiert. Der Überstand wurde aus dem Reaktionsgefäß vorsichtig abpipettiert und für alle weiteren Schritte verwendet.

Amplifikation der angereicherten differentiell methylierten Regionen Nach dem Waschen erfolgte die Amplifikation der angereicherten, differentiell methylierten Re gionen. Hierfür wurden z.B. zu den 20 pl_ des Eluats 25 mI_ zweifacher „KAPA HiFi HotStart Ready Mix“ („Roche“, Schweiz) sowie 5 mI_ „Post LM PCR Oligonukleotide“ („Roche“, Schweiz) gegeben, gut gemischt und unter Verwendung von folgendem PCR-Programm im Thermocycler mit vorgeheiztem Deckel amplifiziert:

Schritt 1 : 45 s 98°C Schritt 2: 15 s 98°C Schritt 3: 30 s 60°C Schritt 4: 30 s 72°C

Schritt 5: Wiederholung der Schritte 1-4 für 15 weitere Male Schritt 6: 60 s 72°C Schritt 7: Pause bei 4°C

Aufreinigung der angereicherten und amplifizierten differentiell methylierten Regionen

Die amplifizierten Regionen wurden nachfolgend aufgereinigt, z.B. unter Verwendung der „Am- pureXP“ Beads („Beckman Coulter“, USA). Hierfür wurden die Beads zunächst auf Raumtem peratur vorgewärmt. Die Probe wurde in ein 1,5 ml_ Reaktionsgefäß überführt. Zu 50 mI_ Probe wurden 50 mI_ dH Ü und 180 mI_ „AmpureXP“ Beads gegeben. Die Probe wurde kurz gemischt, 15 min lang bei Raumtemperatur inkubiert, kurz zentrifugiert und auf den „DynaMag™-2“ Mag neten („Thermo Fisher Scientific“, USA) gestellt. Der Überstand wurde verworfen und die Beads zwei Mal mit jeweils 200 mI_ frisch zubereitetem 80%igem Ethanol gewaschen. Dann wurden die Beads 15 min lang bei Raumtemperatur getrocknet. Um die Libraries zu eluieren, wurden 52 pL dH Ü auf die trockenen Beads pipettiert. Die Beads wurden gut gemischt, 2 min lang bei Raum temperatur inkubiert und wieder auf „DynaMag™-2“ gestellt. Der Überstand wurde vorsichtig abpipettiert und für die Quantifizierung, QC (siehe Abschnitt 1.1.2.2) sowie Seguenzierung auf dem „MiSeg“ verwendet.

1.2.2 Seguenzierung des Plasma Panels

Die Seguenzierung der NGS Library aus angereicherten, differentiell methylierten Regionen er folgte auf dem „MiSeg“.

Hierfür wurde die hergestellte Library zunächst auf 4 nM verdünnt und denaturiert. Dann wur den 5 mI der 4 nM Library in ein 1,5 mL Reaktionsgefäß überführt, mit 5 pL 0,2 N NaOH ver setzt, kurz gemischt, 1 min lang bei 280g zentrifugiert und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die denaturierte Library wurde dann mit 990 pL „Buffer HT1“ („Illumina“, USA) versetzt und wie- der gut gemischt. Das ergab eine 20 pM Library , die anschließend mit „Buffer HT1“ auf 4 pM verdünnt und mit 10% „PhiX“ („Illumina“, USA) versetzt wurde.

Schließlich wurde eine „MiSeq 150 V3“ Kassette („Illumina“, USA) mit der fertigen Probe bela den und in einem 76 PE Lauf sequenziert.

1.2.3 Bioinformatische Auswertung der Sequenzierdaten

1.2.3.1 Qualitätskontrolle und Prozessieren der Rohdaten

Die Daten wurden wie in Abschnitten 1.1.2.5.1 und 1.1.2.5.2 beschrieben einer „FastQC“ Ana lyse unterzogen und anschließend prozessiert.

1.2.3.2 Auswertung der prozessierten Daten

Die prozessierten Daten wurden wie in Abschnitt 1.1.2.5.3 beschrieben gegen das „HG19“ Re ferenzgenom mit dem „Segemehl“ Algorithmus aligned. Die PCR-Duplikate wurden unter Ver wendung von „Samtools“ (Version 1.3.1, „Wellcome Trust Sänger Institute“, England, „Broad Institute of MIT and Harvard“, USA) entfernt. Der Befehl lautete: samtools rmdup -S <Name>.bam <Name>_wo_dup.bam

Die DNA-Methylierungsraten innerhalb der sequenzierten Regionen wurden mit dem „BAT_calling“ Modul berechnet und mit dem „BAT_filter_vcf“ Modul nach dem CpG Kontext und einer Coverage von mindestens achtfach gefiltert (siehe Abschnitt 1.1.2.5.3). Schließlich wur den die Daten gegen die Regionen des Plasma Panels annotiert. Die Aufrufe lauteten: gzip tmp. vcf perl BAT_filter_vcf -vcf tmp.vcf. gz -out $o -context CG -MDP_min 8 ~MDP_max 200 rm tmp. vcf.gz done bedtools unionbedg -filier NA -header -names <sample_1> ... <sample_n> -i <name_sample_1>_wo_dup_CG.cov.region.bedgraph ... <na- me_sample_n>_wo_dup_CG. cov. region. bedgraph > <name>.bed

1.2.3.3 Erstellen eines Klassifikators

Mit Hilfe des Plasma Panels sollte das DNA-Methylierungsmuster eines Patienten analysiert werden. Daraus sollte geschlossen werden, ob ein Patient an einem malignen Lungentumor erkrankt ist. Falls ja, sollten aus dem DNA-Methylierungsprofil Informationen über die Entität des Tumors und die Prognose des betroffenen Patienten abgeleitet werden. Dies kann anhand der Korrelation zwischen den bei dem Patienten vorliegenden Methylierungsmuster und den erfindungsgemäß wichtigen Methylierungsmarkern erfolgen.

Hierfür kann ein Klassifikator erstellt werden, der in der Lage ist, die Ergebnisse der in den Ab schnitten 1.2.3.1 und 1.2.3.2 beschriebenen Pipeline, schnell und zuverlässig zu interpretieren. Ein Klassifikator, auch Predictive Modelling genannt, ist ein Beispiel für das supervidierte Ler nen. Das Ziel eines Klassifikators ist es, nach dem Erhalt von Variablen (z.B. DNA- Methylierungsmustern) und einer Annotation, zunächst ein Modell zu erstellen, das später in der Lage ist, die Variablen von unabhängigen Proben richtig zu klassifizieren (Fig. 4).

Die Software „Qlucore Omics Explorer“ z.B. bietet mehrere Möglichkeiten an, unter Verwen dung von DNA-Methylierungsdaten einen für die jeweilige Fragestellung optimalen Klassifikator zu erstellen. Dabei kann aus drei Algorithmen gewählt werden: „k-Nearest Neighbors Algorithm“ (kNN), „Support Vector Machines“ (SVM) und „Random Trees“ (RT). Bei kNN wird eine Klas senzuordnung anhand der Berücksichtigung von k nächsten Nachbarn vorgenommen. SVM be schreibt jedes Objekt durch einen Vektor in einem Vektorraum. Innerhalb des Vektorraums wird eine Hyperebene so gesetzt, dass sie als Trennfläche zwischen den Gruppen agiert und sie in zwei Klassen unterteilt. RT besteht aus mehreren unkorrelierten Entscheidungsbäumen, die während des Lernprozesses generiert wurden. Jeder Baum fällt eine Entscheidung, die Klasse mit den meisten Stimmen entscheidet letztendlich über die endgültige Klassifikation.

Generell ist es schwierig für eine neue Fragestellung im Voraus die Aussage treffen zu können, welcher Algorithmus die optimalen Ergebnisse liefern wird. Daher wurden alle drei verfügbaren Algorithmen getestet, um den jeweils besten für die jeweilige Kategorie zu finden.

2. Ergebnisse

2.1 Ergebnisse: „Entwicklung des Plasma Panels“

2.1.1 Detektion der tumor- und entitätsspezifischen DNA-Methylierung in primärem Tumorge webe 40 OP-Präparate und korrespondierende Kontrollen wurden unter Verwendung des „Illumina Infinium HumanMethylation450K BeadChips“ auf ihre genomweite DNA-Methylierung unter sucht.

Im Vergleich zum gesunden Lungengewebe wurden im malignen Tumorgewebe 898 aberrant methylierte CpG Loci identifiziert (q< 1^c10^-23, o/o_max> 0,4; Abb. 5A). Adeno- und Plattenepithel karzinome stellen die zwei häufigsten Entitäten des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms dar. Eine Analyse ergab 1.167 zwischen den Tumorentitäten differentiell methylierte CpG Loci (FDR < 1 10⁴; Abb. 5B).

Nachfolgend wurden die CpG Loci ausgewählt, die eine zuverlässige Klassifikation von Lungen tumoren aufgrund von Malignität und Entität ermöglichten. Hierfür wurden die im Abschnitt 1.1.1 beschriebenen bioinformatische Analysen durchgeführt, welche 287 CpG Loci ergaben. Diese Loci wurden in einen erfindungsgemäß bevorzugten Satz an Methylierungsmarkern, das Plama Panel, aufgenommen (Tab. 1).

2.1.2 Detektion der tumor- und entitätsspezifischen DNA-Methylierung in Blutplasma

Wie in Abschnitt 1.1.2.2 beschrieben, wurde jede einzelne zellfreie, zirkulierende DNA Probe nach der Extraktion quantifiziert und einer strikten Qualitätskontrolle unterzogen. Die Gesamt menge der extrahierten DNA betrug pro Probe 10 bis 30 ng, davon wurden 1 ng mit dem „Agilent 2100 Bioanalyzer“ analysiert. Dabei zeigten die Proben einen klaren Peak bei ca. 167 bp. Die Peaks bei 35 und 10.380 bp entsprachen den unteren bzw. oberen Markern (nicht ge zeigt).

Nach der Bisulfitkonvertierung wurden die zfDNA Proben zur Herstellung von WGBS Libraries verwendet. Die fertigen Libraries wurden wiederum quantifiziert und nachfolgend einer Quali tätskontrolle unter Verwendung des „Agilent 2100 Bioanalyzers“ unterzogen. Alle Proben zeig ten einen klaren Peak be ca. 300 bp und entsprachen somit den Sequenzieranforderungen.

Die hergestellten WGBS Libraries wurden auf Trockeneis zu „TATAA Biocenter“ geschickt, dort gepoolt und je nach Probe mit einer mittleren Coverage von acht- bis zehnfach auf einer „Next- Seq 500“ Plattform sequenziert. Die Rohdaten wurden im „FastQ“-Format geliefert.

Die Qualität der Rohdaten wurde unter Verwendung der „FastQC“ Software überprüft. Da die Proben 76 PE sequenziert wurden, lag die Read Länge wie erwartet bei 76 bp. Innerhalb eines Reads betrug der Gehalt an Adaptern sowie nicht identifizierbaren Signalen 0%. Die Genauig keit der Sequenzierung wurde in „Ph red“- Werten angegeben. Jeder „Phred“-Wert beschreibt, wie genau das Ablesen von Nukleotiden im Verlauf der Sequenzierung erfolgte. Die Rohdaten wiesen einen „Phred“-Score von über 30 auf, was einer Genauigkeit von mehr als 99,9% ent- sprach. Des Weiteren konnte nur eine sehr geringe Menge an Kmeren detektiert werden. Als Kmere werden Sequenzen mit einer Mindestlänge von zwei Nukleotiden bezeichnet, die sich in den Rohdaten immer wieder wiederholen. Die Anzahl an PCR-Duplikaten lag bei nahezu 0%. Die Menge an PCR-Duplikaten wird ermittelt, indem die Prozentanzahl deduplizierter Sequen zen berechnet und mit der Anzahl aller Sequenzen verglichen wird. Eine geringe Menge an Kmeren sowie PCR-Duplikaten weist auf eine gute Library- und Sequenzierqualität hin.

Des Weiteren wurde eine für WGBS typische Basenzusammensetzung analysiert. Im Laufe der Bisulfitkonvertierung wurden die meisten unmethylierten Cytosine durch Thymine ersetzt. Des halb lag derThymingehalt der Rohdaten bei ca. 50% und der Cytosingehalt bei nahezu 0%. Die Adenin- und Guaninzusammensetzung wurde während der Bisulfitkonvertierung nicht beein flusst und lag bei jeweils 25%.

Nachfolgend wurden die WGBS Rohdaten unter Verwendung der „Cutadapt“ Software prozes siert (siehe Abschnitt 1.1.2.5.2). Durch das Prozessieren wurden sowohl überpräsentierte Se quenzen, als auch der 10 nt lange Überhang am Anfang von Read 2 entfernt.

Die prozessierten Sequenzierdaten wurden dann in das „Bisulfite Analysis Toolkit“ geladen und mit dem dort implementierten „Segemehl“ Algorithmus gegen das „HG 19“ Referenzgenom alig- ned. Die Effizienz des AHgnments wird als Mapping Effizienz angegeben. Dabei wird ermittelt, wie viel Prozent an Reads dem Referenzgenom zugeordnet werden können. In diesem Fall be trug die Mapping Effizienz des „Segemehl“ Algorithmus 98% bis 99% und war somit für alle wei teren Analysen geeignet.

Die AHgnments der Kontroll-, Adenokarzinom- und Plattenepithelkarzinomgruppen wurden als nächstes in das „BAT_calling“ Modul geladen. Das Modul ermittelte DNA-Methylierungsraten jeweiliger Cytosine. Die Cytosine, die innerhalb einer CpG-Region lagen und eine Coverage von mindestens achtfach aufwiesen, wurden dann unter Verwendung des „ BAT_f i Iteri ng “ Mo duls identifiziert und für alle weiteren Analysen verwendet.

Mehr als 4 Millionen CpG Loci pro Gruppe erfüllten die Kriterien und wurden im weiteren Verlauf mit dem „BAT_overview“ Modul analysiert. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass sowohl Lun genkarzinom- als auch Kontrollgruppe anhand der DNA-Methylierungsmuster voneinander un terschieden werden können (Fig. 6A). Des Weiteren wird eine genomweite Hypermethylierung der Lungenkarzinomgruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe sichtbar (Fig. 6A).

Um die für die jeweilige Gruppe spezifische, differentiell methylierte Regionen zu detektieren, erfolgte das Filtern nach einem DNA-Methylierungsunterschied von mindestens 15%. Die An zahl an differentiell methylierten CpG Loci im Plasma von Lungenkarzinompatienten betrug da- bei 18.000 (Fig. 7A). Des Weiteren wurden 44.000 CpG Loci identifiziert, die je nach Entität in Adeno- und Plattenepithelkarzinompatienten differentiell methyliert waren (Fig. 7B). Diese Loci wurden wie im Abschnitt 1.1.2.5.5 beschrieben weiteren Analysen unterzogen und für das Er stellen des Plasma Panels verwendet. Der fertige Satz an Methylierungsmarkern, d.h. das ferti ge Plasma Panel, enthielt 630 differenziell methylierte Regionen (Tab. 1). Mit diesen differentiell methylierten Regionen hybridisierende Oligonukleotide wurden als "Capture Probes" syntheti siert und stellen damit Mittel zur Diagnose von Lungentumoren dar.

2.1.3 Korrelationsanalysen der verwendeten Methoden zur genomweiten Detektion von DNA- Methylierungsmustern

Um die detektierten DNA-Methylierungsmuster in den OP-Präparaten mit denen im Blutplasma der Lungenkarzinompatienten zu vergleichen, wurde unter Verwendung von „R“ und „Bedtools“ eine „Pearson“ Korrelationsanalyse durchgeführt (siehe Abschnitt 1.1.2.5.4), welche je nach Probe eine Übereinstimmung von 71 bis 77% ergab (p-Wert < 2,2 ^c 10¹⁶, Fig. 8).

Dies zeigt, dass Ergebnisse auf Basis von OP-Präparaten oder festen Biopsien nicht ohne wei teres auf Flüssigbiopsien übertragen werden können, so dass die vorliegend erfolgte Validie rung mit Flüssigbiopsien entscheidend für die Aussagekraft des Diagnoseverfahrens ist.

2.2 Ergebnisse zur „Validierung des Plasma Panels“

2.2.1 Erstellen der NGS Libraries

Zunächst wurden die extrahierten zfDNA-Proben wie im Abschnitt 1.1.2.2 beschrieben quantifi ziert und einer Qualitätskontrolle unterzogen. Hierfür wurden jeweils 1 ng der Proben mit dem „Agilent 2100 Bioanalyzer“ untersucht. Alle verwendeten zfDNA-Proben zeigten einen klaren Peak bei ca. 167 bp. Nachfolgend wurden die Proben bisulfitkonvertiert und zur Herstellung von NGS Libraries verwendet. Wie im Abschnitt 1.2.1 beschrieben, erfolgte die Herstellung der Libraries in zwei Schritten.

Im ersten Schritt wurden WGBS Libraries hergestellt, welche die Informationen über das ge samte zfDNA-Methylom umfassten. Alle 12 hergestellten WGBS Libraries zeigten einen klaren, großen Peak bei ca. 300 bp. Bei den größeren 300 bis 1.000 bp Peaks handelte es sich um die sogenannte Daisy Chains, d.h. aneinander hybridisierte ssDNA-Fragmente. Nach Angaben des Herstellers beeinflussen sie weder die darauffolgende Hybridisierungsreaktion noch die eigent liche Sequenzierung und müssen somit nicht eliminiert werden.

Im zweiten Schritt wurden die hergestellten WGBS Libraries quantifiziert, äquimolar gepoolt und mit dem „SeqCap Epi Enrichment Kit“ prozessiert. Das hier verwendete Kit enthielt die soge nannten „Capture Probes“, die speziell hierfür synthetisiert wurden. Die „Capture Probes“ hybri- disieren gezielt an die 638 Regionen des Plasma Panels (siehe Tab. 1). Nach der Hybridisie rung wurden die „Capture Probes“ samt den gebundenen differentiell methylierten Regionen angereichert, gewaschen und amplifiziert. Die amplifizierte Library wurde dann quantifiziert und einer Qualitätskontrolle unterzogen (z.B. „Agilent 2100 High Sensitivity DNA Kit“). Die fertige Library wies einen hohen Peak bei ca. 300 bp auf und entsprach somit den Sequenzieranforde rungen des „MiSeq“.

2.2.2 Sequenzierung und Datenanalyse

Zunächst wurde die Sequenzierung auf dem „MiSeq“ optimiert. Die Sequenzierung erfolgte in einem 76 PE Modus. Es wurden also von beiden Enden die ersten 76 bp der sequenzierten DNA-Fragmente abgelesen. Um die optimale Clusterdichte zu erzielen, wurde die Library auf 4 pM verdünnt. Die hier beschriebene Libraries waren unbalanciert. Als unbalanciert werden Libraries bezeichnet, deren AT- bzw. GC-Konzentration weniger als 40% oder mehr als 60% beträgt. Solche Libraries weisen aufgrund ihrer Zusammensetzung meist eine nicht zufrieden stellende Sequenzierqualität auf. Um diese zu verbessern, kann die Library mit „PhiX Control V3“ versetzt werden. Die Konzentration an „PhiX“ muss je nach Library individuell angepasst werden. Die optimale Konzentration an „PhiX Control V3“ betrug im vorliegenden Fall 10%.

Nach der Sequenzierung wurden die Daten im „FastQ“-Format gespeichert. Die Qualität der Rohdaten wurde unter Verwendung der „FastQC“ Software überprüft.

Aufgrund der 76 PE Sequenzierung, lag die Read Länge bei 76 bp. Der Gehalt an Adaptern sowie nicht identifizierbaren Signalen innerhalb eines Reads betrug 0%. Die Rohdaten wiesen einen „Phred“-Score von über 30, was einer Sequenziergenauigkeit von mehr als 99,9% ent sprach. Die Basenzusammensetzung (Thymin-Gehalt bei ca. 50%, Cytosin-Gehalt bei nahezu 0%, Adenin- und Guanin-Gehalt bei 25%) wies auf eine erfolgreiche Bisulfitkonvertierung hin. Bei den ersten 10 nt des zweiten Reads handelte es sich um einen durch das Enzym „Adapta- se“ erzeugten Überhang. Das Abweichen des experimentell ermittelten vom theoretisch be rechneten GC-Gehalt lag auch an der Bisulfitkonvertierung.

Die Anzahl an PCR-Duplikaten lag bei ca. 15%. Die Anzahl an deduplizierten Sequenzen wich stark von der Gesamtmenge ab. Das ist jedoch für ein Panel nicht ungewöhnlich. Im Gegensatz zu einer genomweiten Sequenzierung, wird bei einem Panel nur ein kleiner Bereich des Ge noms sequenziert. Das führt zu einer sehr geringen Komplexität der Library und dementspre chend zur Entstehung von PCR-Duplikaten. Die Anzahl an Kmeren ist sehr gering und für die weitere Auswertung nicht störend.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Panel Sequenzierdaten eine sehr gute Qualität aufwiesen. Um die Daten zu prozessieren, wurden zwei Schritte durchgeführt. Zunächst wurde unter Verwendung der „Cutadapt“ Software der 10 nt lange Überhang am Anfang von Read 2 sowie Adapter entfernt. Dann wurden die PCR-Duplikate mit der „Samtools“-Software vollstän dig eliminiert.

Die prozessierten Sequenzierdaten wurden dann in das „Bisulfite Analysis Toolkit“ geladen. Das Alignment erfolgte mit „Segemehl“ gegen das „HG19“ Referenzgenom. Die Mapping Effizienz betrug mindestens 90%. D.h., mindestens 90% der Rohdaten konnten dem Referenzgenom zugeordnet werden. Die mittlere Coverage, also die Sequenziertiefe, betrug je nach Probe 10 bis 30fach.

Im nächsten Schritt sollte die DNA-Methylierung detektiert werden. Hierfür wurden die 12 A- lignments in das „BAT_calling“ Modul geladen. Die ermittelten Positionen wurden dann zu nächst unter Verwendung der „Bedtools“ gegen das „HG 19“ Referenzgenom annotiert. Dann wurden die methylierten Positionen mit dem „BAT_filtering“ Modul nach einer Coverage von mindestens achtfach gefiltert. Des Weiteren wurden mit dem Modul für das Erstellen eines Klassifikators nur solche Positionen ausgewählt, die sich zum einen in einer CpG Region be fanden und zum anderen im Plasma Panel (Tab. 1) aufgelistet waren.

2.2.3 Erstellen eines Klassifikators

Die ermittelten zfDNA-Methylierungsraten wurden zum Erstellen eines Klassifikators verwendet. Wie in Abschnitt 1.2.3.3 beschrieben, wurde hierfür die „Qlucore Omics Explorer“ Software ver wendet, die folgende Klassifikationsalgorithmen enthielt: „k-Nearest Neighbors Algorithm“ (kNN), „Support Vector Machines“ (SVM) und „Random Trees“ (RT).

Das Plasma Panel wurde so entworfen, dass es optimal in der Lage sein sollte, die Informatio nen bezüglich der Malignität, der Entität und des Stadiums eines Tumors und zu liefern. Diese Fragestellungen konnten durch die Wahl eines geeigneten Klassifikators zuverlässig beantwor tet werden. Ferner sollten sich auch Informationen zur Prognose entnehmen lassen.

Um einen Klassifikator zu bewerten, wurden zwei Parameter betrachtet: die Richtigkeit (engl. accuracy) und die Komplexität. Die Richtigkeit eines Klassifikators wurde in Werten zwischen 0 und 1 angegeben, wobei 0 einer Richtigkeit von 0% und 1 einer Richtigkeit von 100% ent sprach. Die Komplexität gab an, wie viele differentiell methylierte Positionen oder Marker analy siert werden mussten, damit der Klassifikator diese Richtigkeit erzielte. Je weniger Marker aus gewertet werden mussten, desto geeigneter war der Klassifikator für die Klinik. Denn mit der Anzahl an zu analysierenden Positionen steigen die Fehlerrate, Zeit und Kosten der Methode.

Die erste Fragestellung lautete, ob ein Patient generell an einem malignen Lungentumor litt. Hierfür lieferten sowohl der kNN als auch der RT Algorithmus eine Richtigkeit von 100%. Der RT Algorithmus benötigte für die Klassifikation 237 differentiell methylierte, im Panel enthaltene Positionen. Der kNN dagegen nur 10 Positionen, was ihn damit für diese Fragestellung als op timal qualifizierte (Fig. 9A). Bei 9 der 10 Positionen findet sich im Tumorgewebe eine stärkere Methylierung, bei einer eine schwächere.

Die Fragestellung bezüglich der Entität konnten alle drei Algorithmen mit einer Richtigkeit von 100% beantworten. Für die Berechnungen benötigte kNN 22 Positionen, SVM 22 Positionen und RT 10 Positionen. Somit war der RT Algorithmus für diese Fragestellung am besten geeig net (Fig. 9B), aber auch die anderen Algorithmen können verwendet werden. Bei allen ausge werteten Markern findet sich beim Adenokarzinom eine stärkere Methylierung als beim Plat- tenepithekarzinom.

Für die letzte Fragestellung des Tumorstadiums war es am schwierigsten, einen geeigneten Klassifikator zu wählen. Der SVM Algorithmus schaffte es, unter Verwendung von 523 Positio nen die späten Tumorstadien mit einer 80%igen Richtigkeit zu differenzieren (Fig. 9C). Dabei sind die ausgewerteten Positionen z.T. in den frühen, z.T. in den späten Stadien stärker methyl- iert.

Alle Positionen und Klassifikationsparameter sind im Anhang detailliert beschrieben (siehe Tab. 2-4). Die beschriebenen Ergebnisse machen es somit möglich, eine Diagnose von Lungenkrebs aus einer Flüssigbiopsie eines Patienten mit Hilfe von Sequenzierung von aufgereinigter, bisul- fit-konvertierter und über an die Methylierungsmarker hybridisierende Oligonukleotide angerei cherte DNA durchzuführen. Dabei wenden die Sequenzierungsdaten bevorzugt mit dem Sege- mehl-Algorithmus gegen ein Referenzgenom aligned und dann anhand der Korrelation der Me thylierung, optional anhand der Klassifikation wie oben beschrieben, ausgewertet.

3.1 Weitere Informationen zu Entwicklung und Validierung des Plasma Panels

Auswahlen der CpG Loci für das Plasma Panel a. Filtern nach Chromosom

Die Chromosome M, X und Y wurden verworfen, die Befehle lauteten: grep -v "chrM" <Name>.bedgraph \ grep -v "chrX" \ grep -v "chrY" > <Na- me>. ohneMXY. bedgraph cut -f1 <Name>ohneMXY. bedgraph \ sort \ uniq b. Annotation mit dem „HG19“ Referenzqenom less gencode.v19.only.genes.bed \ perl -ane 'if($F[5] eq "+ ") {$F[ 1 ]=$F[ 1]-1500}else{$F[2] =$F[2]+ 1500}; print "$F[0]\t$F[1 ]\t$F[2]\t$F[3]\t$F[4]\t$F[5]\n > gen- code. v19. only. genes. TSS_ 1500nt.bed bedtools intersect -wa -wb -a <Name>ohneMXY.bedgraph -b gencode.v19.only.genes.TSS_ 1500nt.bed c. Auswählen der CPG Loci , die von WGBS und HM 450K detektiert wurden bedtools intersect -wa -wb -a <WGBS_data>.bedgraph -b <450K_BeadChip_data>.bed \ perl -ane 'if(($F[3]>0 && $F[7]>0) || ($F[3]<0 && $F[7]<0)){print $ J' > over- lap_WGBS_450K_BeadChip.bed bedtools intersect -wa -wb -a overlap_WGBS_450K_BeadChip.bed -b gen- code.v19.only.genes. TSS_1500nt.bed \ cut -f1-4,8,9, 13 > over- lap_WGBS_450K_BeadChip_gencode.v19.bed d. Auswählen der differentiell methylierten CPG Cluster

Hierbei wurden CpG Loci ausgewählt, die innerhalb eines Clusters bestehend aus mindestens zwei weiteren differentiell methylierten CpG Loci lagen. Alle CpG Loci des Clusters waren ent weder hypo- oder hypermethyliert. Der Abstand zwischen den CpG Loci betrug zwei bis 20 nt. less <Name>ohneMXY.bedgraph \ sort -k10, 10 \ bedtools groupby -g 7,8,9, 10, 11, 12 -c 1,2, 3, 1 -o collapse,collapse,collapse, count \ perl -ane 'if($F[-1]>=3){print $ _}' \ perl -ane '@chr=split(/,/,$F[6]); @start=split(//,$F[7]); @end=split(/ ,$F[8]); for($i=0; $i<$F[-1J; $i++){print "$chr[$i]\t$start[$i]\t$end[$i]\ t$F[0]\t$F[1]\t$F[2]\t$F[3]\t$F[4]\t$F[5]\n"}' > < Name>ohneMXY _mind3CpG_annotation.bedgraph perl CpG_cluster_Swetlana -min 2 -max 20 -in <Na- me>ohneMXY_mind3CpG_annotation.bedgraph \ grep protein > <Na- me>ohneMXY_mind3CpG_3diffCpG.bedgraph less <Name>ohneMXY _mind3CpG_3diff CpG. bedgraph \ bedtools groupby -g 7, 11 -c 3, 1,2, 3 -o collapse,distinct,min,max \ perl -ane 'print "$F[3]\t$F[4]\t$F[5]\t$F[2];$F[0]\n"' > <Na- me>ohneMXY _mind3CpG_3diffCpG_sortiert. bedgraph e. Auswählen der Positionen mit der höchsten differentiellen DNA-Methylierunq bedtools intersect -v -a <Name>ohneMXY.bedgraph -b <Na- me>ohneMXY_mind3CpG_3diffCpG_ sortiert_beste_150_regionen.bedgraph \ bedtools intersect -wa -wb -a stdin -b gencode.v19.only .genes.TSS_1500nt_ohnechrM.bed \ grep protein \ perl -ane ’$a=abs($F[5]); chomp $_; print "$_\t$a\n"' \ sort -V -k13, 13n \ cut -f1, 2, 3, 10, 13 \ tail -100 > <Name>ohneMXY_die_besten_einzel_ cpg.bedgraph

Tab. 1: Satz von Methylierungsmarkern ( Plasma Panel, 630 differentiell methylierte Regionen). In der Spalte "Tumor" ist angegeben, ob in Tumorgewebe eine verstärkte (hypermethyliert) oder verminderte (hypomethyliert) Methylierung identifiziert wurde. A. 350 Regionen, die einen ma lignen Tumor der Lunge detektieren. B. 247 Regionen, welche die häufigsten Lungenkarzino- mentitäten (Adeno- und Plattenepithelkarzinom) voneinander unterscheiden. C. 33 prognostisch relevante CpG Loci. Methode: zfDNA (WBGS): zfDNA oder OP-Präparate (HM 450 K): OP, Die bivalente Chromatin Studie: bChrSt.

Tab. 2: Der kNN Algorithmus verwendete zehn Positionen, um die Lungenkarzinompatienten von den gesunden Probanden unterscheiden zu können. In der Spalte "Tumor" ist angegeben, ob in Tumorgewebe eine verstärkte (+) oder verminderte (-) Methylierung identifiziert wurde. A

Tab. 3: Der RT Algorithmus analysierte zehn Positionen um die Entität eines Tumors zu ermit teln. Alle Positionen waren beim Adenokarzinom im Vergleich zum Plattenepithelkarzinom hy- permethyliert.

Tab. 4: Für das Staging (Feststellen des Tumorstadiums) wurden vom SVM Algorithmus 523 Positionen analysiert. Einige Positionen sind im späten Stadium verstärkt methyliert

(+), andere Positionen hingegen vermindert methyliert (-).

Rangordnung Vergleich zweier Gruppen Filtern nach Gruppe Bedingung ungleich, != Normalisierung Mittelwert = 0, Varianz = 1 Fehlende Mi l Wert

Tab. 5: Beispielhafte, in dem erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbare Oligonukleotide (Capture Targets ) für Marker auf Chromosom 1.

Start Stop Länge [bp]

2198804 2198961 chr1:2198830-2198930 157

3289010 3289139 chr1 : 3289034-3289134 129

3607047 3607181 chr1:3607067-3607167 134

6130197 6130338 chr1:6130273-6130274 141

6165201 6165361 chr1:6165229-6165329 160

6515521 6515702 chr1 :6515548-6515648;chr1 :6515574-6515674 181

6520115 6520257 chr1:6520145-6520245 142

8787128 8787253 chr1 : 8787221 -8787321.upstream 125

15426262 15426418 chr1 : 15426289-15426389 156

15670403 15670539 chr1 : 15670433-15670533 136 chr1 : 17567922-17568022;chr1 : 17568066-

17567892 17568189 17568166 297

18063027 18063184 chr1: 18063106-18063107 157

19177630 19177804 chr1: 19177728-19177729 174

19764609 19764757 chr1 : 19764637-19764737 148

23284417 23284507 chr1 :23284374-23284474 90

24277975 24278154 chr1 :24278024-24278124 179

26699371 26699517 chr1 : 26699448-26699449 146

27234664 27234812 chr1 :27234575-27234675,downstream 148

34642324 34642455 chr1 : 34642347-34642447 131

36194564 36194662 chr1 :36194581 -36194582 98

38591827 38591977 chr1 :38591903-38591904 150

47694840 47694995 chr1 :47694870-47694970 155

47738990 47739142 chr1 :47739010-47739110 152

50883315 50883461 chr1 : 50883345-50883445 146

50886707 50886857 chr1 : 50886733-50886833 150

50886870 50887021 chr1 :50886900-50887000 151

52158087 52158220 chr1 :52158112-52158212 133

57955028 57955174 chr1 : 57955057-57955157 146

61668739 61668922 chr1 :61668786-61668886 183 63489039 63489179 chr1 :63489116-63489117 140

64578151 64578293 chr1 :64578178-64578278 142

77533495 77533671 chr1 : 77533543-77533643 176

79467955 79468081 chr1 : 79467974-79468074 126

79472375 79472516 chr1 : 79472403-79472503 141

85449266 85449364 chr1 :85449395-85449495,upstream 98

108975333 108975476 chr1 : 108975362- 108975462 143

109383819 109383912 chr1 :109383701-109383801.downstream 93

110610821 110610964 chr1 :110610850-110610950 143

110611386 110611542 chr1 :110611416-110611516 156

110611971 110612108 chr1 :110611995-110612095 137

115677141 115677297 chr1 :115677211-115677212 156

119522559 119522707 chr1 :119522588-119522688 148

150595130 150595282 chr1 : 150595157- 150595257 152

153896523 153896648 chr1 :153896541-153896641 125

154379671 154379808 chr1 : 154379748- 154379749 137

155162673 155162808 chr1 : 155162703- 155162803 135

158079244 158079395 chr1 :158079311-158079312 151

158324396 158324540 chr1 : 158324422- 158324522 144

158549201 158549351 chr1 : 158549228- 158549328 150

158575697 158575854 chr1 : 158575724- 158575824 157

158736216 158736378 chr1 : 158736263- 158736363 162

159284004 159284160 chr1 : 159284033- 159284133 156

159284209 159284363 chr1 : 159284249- 159284349 154

159682419 159682564 chr1 : 159682448- 159682548 145

160782978 160783141 chr1 : 160783005-160783105 163 ch r 1 : 161008656- 161008756 ; chr1 : 161008701 - 161008634 161008907 161008801;chr1:161008777-161008877 273

161284882 161285026 chr1 :161284950-161284951 144

161306252 161306382 chr1 : 161306151 - 161306251.downstream 130

166039366 166039510 chr1 : 166039395-166039495 144

169138792 169138934 chr1 : 169138868-169138869 142

170464175 170464329 chr1 : 170464254- 170464255 154

171868017 171868187 chr1 :171868066-171868166 170

175050401 175050549 chr1 : 175050430- 175050530 148

180202441 180202578 chr1 : 180202463- 180202563 137

182025968 182026117 chr1 : 182025995- 182026095 149

193191311 193191476 chr1 :193191356-193191456 165

196682870 196683025 chr1 : 196682896- 196682996 155

214646125 214646279 chr1 :214646154-214646254 154

217310510 217310654 chr1 :217310537-217310637 144

220101648 220101795 chr1 :220101678-220101778 147

220101867 220102015 chr1 :220101896-220101996 148

223948836 223948969 chr1 :223948861-223948961 133 chr1 :226187853-226187854;chr1 :226187877- 226187776 226188068 226187878;chr1:226188006-226188007 292 236557105 236557253 chr1 :236557182-236557183 148

236849398 236849548 chr1 :236849424-236849524 150

236849891 236850048 chr1 :236849917-236850017 157

237765796 237765947 chr1 :237765826-237765926 151 chr1 : 240656502-240656602 ; chr1 :240656537- 240656480 240656649 240656637 169

240746545 240746706 chr1 :240746575-240746675 161

246241918 246242056 chr1 :246241939-246242039 138

248903024 248903175 chr1 :248903051-248903151 151

Claims

Ansprüche

1. Verfahren zur Diagnose von Lungenkrebs, bei dem man die Methylierung eines Satzes von Methylierungsmarkern in einer Probe eines Patienten bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei der Satz von Methylierungsmarkern ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den in Tabelle 1a, 1b und 1c aufgelisteten Regionen und min destens 60 Regionen umfasst, bevorzugt mindestens 64 Regionen, mehr bevorzugt min destens 340 Regionen, z.B. mindestens 350 Regionen.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der Satz von Methylierungsmarkern ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den in Tabelle 1a, 1b und 1c aufgelisteten Regionen und mindestens 134 Regionen umfasst, bevorzugt 138 Regionen, mehr bevor zugt mindestens 240 Regionen, z.B. bevorzugt mindestens 247 Regionen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, wobei der Satz von Methylierungsmarkern ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den in Tabelle 1a, 1b und 1c aufgelisteten Regionen und mindestens 600 Regionen umfasst, optional alle 630 Regionen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei der Satz von Methylierungsmarkern mindestens 60 Regionen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: wobei man das bevorzugt Vorhandensein eines Tumors analysiert, wobei der Satz von Methylierungsmarkern optional alle Regionen der Gruppe umfasst.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Satz von Methylierungsmarkern mindestens 340 Regionen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den in Tabelle 1a aufgelis teten Regionen, wobei der Satz von Methylierungsmarkern bevorzugt alle in Tabelle 1a aufgelisteten Regionen umfasst.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Satz von Methylie rungsmarkern mindestens 134 Regionen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: wobei man die bevorzugt Entität eines Tumors identifiziert, wobei der Satz von Methylierungsmarkern optional alle Regionen der Gruppe umfasst.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Satz von Methylierungsmarkern mindestens 240

Regionen umfasst, wobei die Gruppe aus den in Tabelle 1b aufgelisteten Regionen be steht, wobei der Satz von Methylierungsmarkern optional alle in Tabelle 1b aufgelisteten Regionen der Gruppe umfasst.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Satz von Methylie rungsmarkern mindestens 620 Regionen umfasst, wobei die Gruppe aus den in Ansprü chen 3 und 5 definierten Methylierungsmarkern und ferner den in Tabelle 1c aufgelisteten Regionen besteht, wobei man bevorzugt ferner die Prognose bestimmt, wobei der Satz von Methylierungsmarkern optional alle Regionen der Gruppe umfasst.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Satz von Methylie rungsmarkern die 10 folgenden Positionen umfasst: und man optional den kNN-Algorithmus zur Analyse verwendet, wobei man das Vorhan densein eines Tumors analysiert.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Satz von Methylie rungsmarkern die 10 folgenden Positionen umfasst: und man optional den RT-Algorithmus zur Analyse verwendet, wobei man die Entität ei nes Tumors identifiziert.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Satz von Methylie rungsmarkern alle in Tabelle 4 aufgelisteten Positionen umfasst und man optional den SVM-Algorithmus zur Analyse verwendet, wobei man das Stadium eines Tumors identifi ziert.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Lungenkrebs NSCLC, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Adenokarzinom und Plattenepithelkarzinom, oder SCLC ist, bevorzugt NSCLC, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Adenokarzinom und Plattenepithelkarzinom.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aussage über das Vorhandenseins eines Tumors, über die Entität eines Tumors, über das Tumorstadium und/oder über die Prognose erlaubt, bevorzugt über Vorhanden sein und Entität des Tumors, optional über alles gleichzeitig.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren sowohl dazu geeignet ist, eine Probe zu untersuchen, die eine Flüssigbiopsie-Probe ist, als auch eine Probe aus einer Lungenbiopsie und eine solide Gewebeprobe, die bei einer Operation entnommen wird.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man zfDNA aus einer Flüs sigbiopsie untersucht.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Flüssigbiopsie-Probe ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Blut, Plasma, Serum, Sputum, Bronchialflüs sigkeit und Pleuraerguss, bevorzugt Plasma.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-15, wobei die Probe eine Lungenbiopsie-Probe ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-15, wobei die Probe eine Gewebeprobe ist, die bei einer Operation entnommen wird.

20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren zur Diagno se von Lungenkrebs in Stadium I eingesetzt wird.

21. Mittel, geeignet zur Diagnose von Lungenkrebs mit einem Verfahren nach einem der An sprüche 2-20 durch Untersuchung der Methylierung eines Satzes von Methylierungsmar kern in zfDNA aus einer Flüssigbiopsie-Probe eines Patienten, wobei das Mittel Oligonukleotide umfasst, welche mit DNA hybridisieren können, welche die genannten Methylierungsmarker umfasst, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Oli gonukleotide, die an einen festen Träger gekoppelt werden können, Oligonukleotide, die an einen festen Träger gekoppelt sind und/oder ein Kit umfassend PCR-Primer zur Ampli fikation von Regionen, welche die Methylierungsmarker umfassen.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-20, wobei man Sequenzierungsdaten von bisulfit- konvertierter DNA, z.B. zfDNA, gegen ein Referenzgenom mit dem Segemehl Algorithmus aligned, wobei man bevorzugt: a. zfDNA aus der Flüssigbiopsie-Probe oder genomische DNA aus einer soliden Gewe beprobe oder Lungenbiopsie-Probe extrahiert, b. eine Bisulfitkonvertierung durchführt, c. eine Whole Genome Bisulfite Sequencing Library hergestellt, d. DNA-Regionen umfassend die definierten Methlierungsmarker anreichert, wobei man sie bevorzugt mit dem Mittel nach Anspruch 21 in Kontakt bringt, e. die angereicherten DNA-Regionen sequenziert, f. die Sequenzierungsdaten gegen ein Referenzgenom mit dem Segemehl Algorithmus aligned, g. die Methylierungsraten berechnet.

23. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-20 oder 22 oder eines Mittels nach Anspruch 21 zur Diagnose von Lungenkrebs, wobei die Diagnose eine Aussage über das Vorhandenseins eines Tumors, über die Entität eines Tumors, über das Tu morstadium und/oder über die Prognose erlaubt, bevorzugt über Vorhandensein und Enti tät des Tumors, optional über alles gleichzeitig.