CN113106151A - 基于qPCR检测肺小结节甲基化的核酸组合物、试剂盒 - Google Patents

基于qPCR检测肺小结节甲基化的核酸组合物、试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种用于检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的核酸组合物、检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的方法、试剂盒。本发明提供的检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的试剂盒，其包括核酸组合物，所述核酸组合物包括引物组合物，利用所述试剂盒，通过qPCR联合检测p16INK4a、RASSF1A、MGMT和SHOX2四个基因或RASSF1A、MGMT和SHOX2三个基因的甲基化水平，提高了检测的灵敏度和特异性。

Description

基于qPCR检测肺小结节甲基化的核酸组合物、试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种用于检测非小细胞肺癌相关基因甲基化的核酸组合物、检测非小细胞肺癌相关基因甲基化水平的方法、试剂盒。
背景技术
DNA甲基化是哺乳动物中深入研究的表观遗传修饰之一。在正常细胞中，它可以确保基因表达的适当调节和稳定的基因沉默。DNA甲基化与癌症的发生密切相关。尤其是CpG岛区的启动子超甲基化可能会导致抑癌基因转录沉默，从而影响肿瘤发生的进程。由于DNA甲基化几乎在所有癌症中均有发现，并且多发生在癌前或者癌症早期阶段，因而有望成为癌症早期诊断的理想标志物。
非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌的80％，已成为世界上导致癌症死亡的主要原因。DNA甲基化异常的基因与癌症的诊断，治疗的预测和预后有关，而DNA甲基化异常出现在许多癌症类型的早期阶段。此外，在不同类型的样品(例如血浆，尿液，精液和粪便)中发现了异常甲基化的DNA，这表明DNA甲基化有可能成为非侵入性诊断生物标记物，这可能有助于NSCLC的早期诊断。
现有的肺癌DNA甲基化检测试剂盒，选用SHOX2、RASSF1A基因研发了甲基化DNA检测试剂盒。针对肺泡灌洗液样本，结合亚硫酸盐修饰和Taqman探针两种技术，在实时荧光PCR平台实现样本甲基化DNA特异检测。研究结果显示，肺癌和非肺癌对照的患者肺泡灌洗细胞中SHOX2和RASSF1A基因甲基化检测具有明显的差异，两基因联合检测对肺癌辅助诊断的灵敏度和特异性可分别达到71.5-83.2％和90-97.4％。但该试剂盒的灵敏度不高，导致检测结果不准确。
因此，亟需开发一种具有较高灵敏度、检测结果准确的用于检测非小细胞肺癌的试剂盒。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种用于检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的试剂盒，其包括引物组合物，利用所述试剂盒，通过qPCR联合检测p16 INK4a、RASSF1A、MGMT和SHOX2四个基因或RASSF1A、MGMT和SHOX2三个基因的甲基化水平，提高了检测的灵敏度和特异性。
为此，本发明一方面提供了一种用于检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的核酸组合物。根据本发明的实施例，所述核酸组合物包括引物组合物，所述引物组合物包括：
(1)用于检测RASSF1A基因的DNA甲基化的第一引物对；
(2)用于检测MGMT基因的DNA甲基化的第二引物对；
(3)用于检测SHOX2基因的DNA甲基化的第三引物对；
以及任选地(4)用于检测p16 INK4a基因的DNA甲基化的第四引物对。
DNA甲基化异常的基因与癌症的诊断，治疗的预测和预后有关，而DNA甲基化异常出现在许多癌症类型的早期阶段。本发明的发明人选择血液中的基因甲基化与非小细胞肺癌NSCLC有显著性相关的基因，设计特异性的引物检测样品的甲基化水平。在癌症类型的早期阶段，对样本的DNA甲基化水平检测难度较大，而本申请的发明人创造性的发现，利用特异性的引物对，检测p16 INK4a、RASSF1A、MGMT和SHOX2四个基因或RASSF1A、MGMT和SHOX2三个基因的DNA甲基化水平，提高了对早期非小细胞肺癌样本检测的灵敏度和特异性。
根据本发明的实施例，所述第一引物对包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物。
根据本发明的实施例，所述第二引物对包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物。
根据本发明的实施例，所述第三引物对包括SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物。
根据本发明的实施例，所述第四引物对包括SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的引物。
本发明第二方面提供一种检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的方法。根据本发明的实施例，所述方法用于非诊断目的，所述方法包括：
利用第一方面所述的核酸组合物，进行qPCR联合检测RASSF1A、MGMT和SHOX2基因以及任选地p16 INK4a基因的DNA甲基化水平，以便获得非小细胞肺癌相关基因的DNA甲基化水平。
本发明提供的检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的方法，利用qPCR检测血液中的基因甲基化与非小细胞肺癌NSCLC有显著性相关的基因的DNA甲基化水平，相比现有的检测方法，提升了检测结果灵敏度和特异性。
本发明第三方面提供第一方面所述的核酸组合物在制备用于检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的试剂盒中的用途。
将本发明的核酸组合物应用于检测非小细胞肺癌相关基因甲基化的试剂盒中，利用该试剂盒能够准确检测临床样本非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平。p16 INK4a、RASSF1A、MGMT和SHOX2四个基因联合检测的灵敏度能达到85％，特异性90％，在临床样本检测中有90％灵敏度和100％特异性；RASSF1A、MGMT和SHOX2三个基因的联合检测能达到灵敏度能达到80％，特异性95％，在临床样本检测中有90％灵敏度和100％特异性。
本发明第四方面提供一种用于检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括第一方面所述的核酸组合物。
利用本发明提供的试剂盒，能够准确检测临床样本非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平。p16 INK4a、RASSF1A、MGMT和SHOX2四个基因联合检测的灵敏度能达到85％，特异性90％，在临床样本检测中有90％灵敏度和100％特异性；RASSF1A、MGMT和SHOX2三个基因的联合检测能达到灵敏度能达到80％，特异性95％，在临床样本检测中有90％灵敏度和100％特异性。而现有的肺癌DNA甲基化检测试剂盒，对肺癌辅助诊断的灵敏度和特异性分别为71.5-83.2％和90-97.4％，因此，本发明提供的试剂盒显著提高了检测的灵敏度。
根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括特异性检测内参基因的检测试剂。
根据本发明的实施例，所述特异性检测内参基因的检测试剂包括检测β-Actin基因的引物。
根据本发明的实施例，所述检测β-Actin基因的引物包括SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10所示的引物。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
根据本发明的具体实施例，本发明提供的用于检测非小细胞肺癌相关基因甲基化的试剂盒，其包括：
(1)用于检测RASSF1A基因的DNA甲基化的第一引物对；
(2)用于检测MGMT基因的DNA甲基化的第二引物对；
(3)用于检测SHOX2基因的DNA甲基化的第三引物对；
以及任选地(4)用于检测p16 INK4a基因的DNA甲基化的第四引物对。
所述第一引物对包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物；
所述第二引物对包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物；
所述第三引物对包括SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物；
所述第四引物对包括SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的引物。
用于检测RASSF1A基因的上游引物，SEQ ID NO:1：5'-GGGTTTTGCGAGAGCGCG-3'；
用于检测RASSF1A基因的下游引物，SEQ ID NO:2：5'-GCTAACAAACGCGAACCG-3'；
用于检测MGMT基因的上游引物，SEQ ID NO:3：5'-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3'；
用于检测MGMT基因的的下游引物，SEQ ID NO:4：5'-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3'；
用于检测SHOX2基因的上游引物，SEQ ID NO:5：5'-GTTAGGTAATTTTCGTTTCGTTT-3'；
用于检测SHOX2基因的下游引物，SEQ ID NO:6：5'-TAACCCGACTTAAACGACGA-3'；
用于检测p16 INK4a基因的上游引物，SEQ ID NO:7：5'-TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC-3'；
用于检测p16 INK4a基因的下游引物，SEQ ID NO:8：5'-GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3'。
所述试剂盒进一步包括特异性检测内参基因的检测试剂，所述特异性检测内参基因的检测试剂包括检测β-Actin基因的引物；所述检测β-Actin基因的引物包括SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的引物。
用于检测β-Actin基因的上游引物，SEQ ID NO:9：5'-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT-3'；
用于检测β-Actin基因的下游引物，SEQ ID NO:10：5'-CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3'。
根据本发明的具体实施例，本发明提供的检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的方法，包括：
利用前述核酸组合物，进行qPCR联合检测RASSF1A、MGMT和SHOX2基因以及任选地p16 INK4a基因的DNA甲基化水平，以便获得非小细胞肺癌相关基因的DNA甲基化水平。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1基于MSP-qPCR的检测方法
1、选择检测的特异性位点
选择血液中的基因甲基化与NSCLC有显著性相关的基因。发明人选择非小细胞肺癌中甲基化水平会有较明显变化的几个基因，共有八个位点分别是ACP1A、DAPK、p16INK4a、RARB、RASSF1A、MGMT、CDH13和SHOX2，内参为β-Actin。
2.设计检测引物
表1
序号 基因 前引物 后引物
1 APC1A TATTGCGGAGTGCGGGTC TCGACGAACTCCCGACGA
2 DAPK GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC CCCTCCCAAACGCCGA
3 p16 INK4a TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC GACCCCGAACCGCGACCGTAA
4 RARβ TCGAGAACGCGAGCGATTCG GACCAATCCAACCGAAACGA
5 RASSF1A GGGTTTTGCGAGAGCGCG GCTAACAAACGCGAACCG
6 CDH13 TCGCGGGGTTCGTTTTTCGC GACGTTTTCATTCATACACGCG
7 MGMT TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC GCACTCTTCCGAAAACGAAACG
8 SHOX2 GTTAGGTAATTTTCGTTTCGTTT TAACCCGACTTAAACGACGA
9 ACTB GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA
3、利用引物进行qPCR
1)qPCR体系：
表2
2X MSP Buffer 10μL
PCR前引物 0.5μL
PCR后引物 0.5μL
TB Green Solution(X100) 0.2μL
MSP Enzyme 0.5μL
ROX Reference Dye II(50X) 0.4μL
DNA模板 3μL
灭菌水 4.9μL
总共 20μL
2)qPCR条件：
(1)Temp 95℃，time 30sec(预变性)；
(2)Temp 98℃，time 5sec(变性)；
(3)Temp 55℃，time 30sec；
(4)Temp 72℃，time 1min；
(5)Go to(2)，40more times；
(6)融解曲线分析
4、在组织样本中筛选检测位点
选择20位肺癌患者的组织DNA和血细胞DNA进行检测，筛选检测结果较明显的位点组合。
首先，将八个位点进行编号根据检测结果，剔除了特异性很差的位点(ACP1A、DAPK、CDH13)，剩余五个位点如下显示：3-P16 INK4a，4-RARB，5-RASSF1A，7-MGMT，8-SHOX2。
然后，通过五个位点的交叉组合筛选出最优的检测组合(表3)。
表3
序号 1 2 3 4 5 6 7 8
组合编号 3 4 5 7 8 34 35 37
灵敏度 0.35 0.5 0.45 0.15 0.45 0.65 0.6 0.4
特异性 0.9 0.95 1 1 0.95 0.85 0.9 0.9
约登指数 0.25 0.45 0.45 0.15 0.4 0.5 0.5 0.3
序号 9 10 11 12 13 14 15 16
组合编号 38 45 47 48 57 58 78 345
灵敏度 0.55 0.6 0.5 0.7 0.5 0.75 0.55 0.75
特异性 0.9 0.95 0.95 0.9 1 0.95 0.95 0.85
约登指数 0.45 0.55 0.45 0.6 0.5 0.7 0.5 0.6
序号 17 18 19 20 21 22 23 24
组合编号 347 348 357 358 378 457 458 478
灵敏度 0.65 0.75 0.65 0.75 0.65 0.6 0.8 0.7
特异性 0.85 0.85 0.9 0.9 0.9 0.95 0.9 0.9
约登指数 0.5 0.6 0.55 0.65 0.55 0.55 0.7 0.6
序号 25 26 27 28 29 30 31
组合编号 578 3457 3458 3478 3578 4578 34578
灵敏度 0.8 0.75 0.85 0.75 0.85 0.8 0.85
特异性 0.95 0.85 0.85 0.85 0.9 0.9 0.85
约登指数 0.75 0.6 0.7 0.6 0.75 0.7 0.7
上述表3中，组合编号“578”表示的是利用相应的引物检测5-RASSF1A、7-MGMT、8-SHOX2这三个基因的DNA甲基化水平。
约登指数是指灵敏度+特异性-1，约登指数越大表示筛查实验的效果越好。
通过比较不同位点组合下的灵敏度和特异性，获取最优的位点组合，即p16INK4a、RASSF1A、MGMT、SHOX2四个位点的组合或者RASSF1A、MGMT、SHOX2三个位点的组合。
实施例2在样本中测试
根据检测较稳定的MSP引物后，进行20位患者癌组织样本和同一患者血细胞样本的甲基化检测。灵敏度和特异性如下：
表4
组合 灵敏度 特异性
p16 INK4a+RASSF1A+MGMT+SHOX2 0.85 0.9
四个位点p16 INK4a、RASSF1A、MGMT和SHOX2基因的联合检测的灵敏度能达到85％，特异性90％。
表5
组合 灵敏度 特异性
RASSF1A+MGMT+SHOX2 0.8 0.95
三个位点RASSF1A、MGMT和SHOX2基因的联合检测的灵敏度能达到80％，特异性95％。
实施例3荧光PCR的结果判断
根据荧光PCR的结果判断样本的阴阳性，主要看荧光的扩增曲线是否起峰，当起峰小时，从CT值判断，若单个基因位点的样本CT值与阳性样本CT值的差值的绝对值小于等于1，那此样本判断为阳性，若CT值相差大于1，则判断为阴性，NTC不起峰。
四个位点组合结果判定如下表6：
表6
Figure BDA0002992194720000071
Figure BDA0002992194720000081
三个位点组合结果判定如下表7：
表7
Figure BDA0002992194720000082
注：“+”为甲基化DNA检测阳性，“-”为甲基化DNA检测阴性。
实施例4临床样本检测
选择10位患者的阳性样本和阴性样本进行验证检测，将组织样本中检测结果较好的两个组合进行检测并验证结果。
表8
Figure BDA0002992194720000083
Figure BDA0002992194720000091
表9
Figure BDA0002992194720000092
四个位点p16 INK4a、RASSF1A、MGMT和SHOX2基因的联合检测结果如下：
表10
Figure BDA0002992194720000093
Figure BDA0002992194720000101
三个位点RASSF1A、MGMT和SHOX2基因的联合检测结果如下：
表11
验证组 真实NSCLC 阴性对照 统计
预测NSCLC个数 9 0 -
预测正常个数 1 10 -
共计个数 10 10 20
正确检测个数 9 10 19
灵敏度(％) 90 - -
特异性(％) - 100 -
从以上结果可以发现，四个位点组合在验证组的灵敏度和特异性分别是90％和100％；三个位点组合在验证组的灵敏度和特异性分别是90％和100％。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州瑞普基因科技有限公司
<120> 基于qPCR的肺小结节甲基化的核酸组合物、试剂盒
<130> PIDC3204467
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测RASSF1A基因的上游引物
<400> 1
gggttttgcg agagcgcg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测RASSF1A基因的下游引物
<400> 2
gctaacaaac gcgaaccg 18
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测MGMT基因的上游引物
<400> 3
tttcgacgtt cgtaggtttt cgc 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测MGMT基因的的下游引物
<400> 4
gcactcttcc gaaaacgaaa cg 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测SHOX2基因的上游引物
<400> 5
gttaggtaat tttcgtttcg ttt 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测SHOX2基因的下游引物
<400> 6
taacccgact taaacgacga 20
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ttattagagg gtggggcgga tcgc 24
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测p16 INK4a基因的下游引物
<400> 8
gaccccgaac cgcgaccgta a 21
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测β-Actin基因的上游引物
<400> 9
gtgatggagg aggtttagta agtt 24
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测β-Actin基因的下游引物
<400> 10
ccaataaaac ctactcctcc cttaa 25

Claims (9)

1.一种用于检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物包括引物组合物，所述引物组合物包括：
(1)用于检测RASSF1A基因的DNA甲基化的第一引物对；
(2)用于检测MGMT基因的DNA甲基化的第二引物对；
(3)用于检测SHOX2基因的DNA甲基化的第三引物对；
以及任选地(4)用于检测p16 INK4a基因的DNA甲基化的第四引物对。
2.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述第一引物对包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物。
3.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述第二引物对包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物。
4.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述第三引物对包括SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物。
5.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述第四引物对包括SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的引物。
6.一种检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的方法，所述方法用于非诊断目的，其特征在于，所述方法包括：
利用权利要求1-5中任一项所述的核酸组合物，进行qPCR联合检测RASSF1A、MGMT和SHOX2基因以及任选地p16 INK4a基因的DNA甲基化水平，以便获得非小细胞肺癌相关基因的DNA甲基化水平。
7.权利要求1-5中任一项所述的核酸组合物在制备用于检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的试剂盒中的用途。
8.一种用于检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-5中任一项所述的核酸组合物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒进一步包括特异性检测内参基因的检测试剂；
任选地，所述特异性检测内参基因的检测试剂包括检测β-Actin基因的引物；
任选地，所述检测β-Actin基因的引物包括SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的引物。
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