CN112266964A - 一种多位点结直肠癌甲基化检测引物、探针及试剂盒 - Google Patents

一种多位点结直肠癌甲基化检测引物、探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多位点结直肠癌甲基化检测引物探针组及试剂盒，使用两个四重荧光定量PCR反应即可完成六个靶基因的检测，不仅能高效准确地完成粪便样本甲基化检测，而且能进一步降低了检测费用，最低检测限为1％；重复性良好；灵敏度为100％；特异性为94.5％；具有广阔的应用空间。

Description

一种多位点结直肠癌甲基化检测引物、探针及试剂盒
技术领域
本发明分子检测技术领域，更具体地，涉及一种多位点结直肠癌甲基化检测引物、探针及试剂盒。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer)是消化系统中最常见的恶性肿瘤，由于其早期症状不明显，常常会被人们所忽视，随着癌肿的增大才会表现出排便习惯改变、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛以及便血等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状。其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。
结直肠癌是人类高发恶性肿瘤，其发病率一直呈上升趋势，而且早期结直肠癌的症状不明显，导致大部分病例在发现时已为晚期，预后效果极差。因此结直肠癌的早期筛查十分重要。目前最常用的结直肠癌筛查方法是肠镜检查和粪便隐血检测。前者为结直肠癌确诊的“金标准”之一，具有95％以上的灵敏度，但具有侵入性，检查过程中会产生疼痛以及让筛查者心理产生不适，很大部分病人由于对侵入性肠镜的恐惧而错过了早期病灶的筛查和发现，待确诊已为中晚期；后者虽然为无创检查，但是靶向性很低，仅有73％的灵敏度，还需要进一步配合肠镜才能确诊，因此寻找一种无创的高靶向性的结直肠癌早期筛查手段刻不容缓。
随着人类基因组学的蓬勃发展，人体表观遗传学的改变，特别是基因启动子区发生甲基化，被认为是癌症首发的重要原因。近年越来越多的研究显示人类肿瘤的发生、发展与DNA甲基化的异常有关，而且早在肿瘤临床确诊之前就可检测出特异基因的甲基化异常现象。因此特异基因的甲基化可以作为癌症早期诊断的分子标记物、治疗的靶点甚至是判断预后的手段。美国FDA批准的第一个粪便DNA检测试剂盒“colonguard”是通过检测粪便中的NDRG4基因和BMP3基因的甲基化程度，辅助结直肠癌的诊断，但其特异性仅有86.6％。目前市面上还有对外周血的Septin9基因的甲基化程度进行检测的试剂盒，但灵敏度仅有70％，也无法满足临床要求。目前市面上对粪便样本甲基化进行检测以辅助诊断结直肠癌的试剂盒仍存在较多不足，其检测的灵敏度不够或特异性不高，不仅如此，其检测费用也较高，为大部分人群所不能接受，也就无法广泛应用到结直肠癌的筛查中去。
发明内容
本发明要解决的技术问题为针对粪便样本甲基化检测技术的现有不足，提供灵敏度高和特异性强的甲基化检测材料及其试剂盒与应用。可以降低试剂盒检测的成本，以满足结直肠癌大规模筛查的需要，提高结直肠癌的早期确诊率和治愈率。
本发明的第一个方面，提供一组特异性引物，包括用于扩增NDRG4基因、SDC2基因、PDX1基因、TFPI2基因、BMP3基因和SFRP2基因的启动子区高甲基化区域的特异性引物。
本发明的第二个方面，提供一组特异性探针，包括靶向NDRG4基因、SDC2基因、PDX1基因、TFPI2基因、BMP3基因和SFRP2基因的启动子区高甲基化区域的特异性探针。
本发明的第三个方面，提供一种检测材料，包括本发明第一个方面所述的特异性引物和/或本发明第二个方面所述的特异性探针。
本发明的第四个方面，提供一种检测试剂盒，包含本发明第三个方面所述的检测材料。
本发明的第五个方面，提供本发明第三个方面所述的检测材料在制备结直肠癌检测制剂中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一组特异性引物，包括用于扩增NDRG4基因、SDC2基因、PDX1基因、TFPI2基因、BMP3基因和SFRP2基因的启动子区高甲基化区域的特异性引物。
进一步地，所述特异性引物的核苷酸序列如下所示：
用于扩增NDRG4基因的引物：
NDRG-F2：GAGCCGTTATTTCGTCGG(SEQ ID NO.2)；
NDRG-R2：GCGTAACCGAAAATTCTAC(SEQ ID NO.5)；
用于扩增BMP3基因的引物：
BMP-F1：CGTTATCACGAAGTATCACGA(SEQ ID NO.10)；
BMP-R1：GAAACCGACACGAATAAACTC(SEQ ID NO.11)；
用于扩增SDC2基因的引物：
SDC-F2：GAGTAGGGCGGGCGTAAG(SEQ ID NO.14)；
SDC-R1：AACACACGTCGATTGAAACA(SEQ ID NO.15)；
用于扩增TFPI2基因的引物：
TFPI-F2：AGGCGTTTTTTATCGCGTT(SEQ ID NO.18)；
TFPI-R2：CACACACCCGTCTTACCCA(SEQ ID NO.20)；
用于扩增PDX1基因的引物：
PDX-F1：ACGCGCGTTTATTATGCACGGTCCCG(SEQ ID NO.22)；
PDX-R1：AATTACCTGCGATTATCGGCACAGT(SEQ ID NO.23)；
用于扩增SFRP2基因的引物：
SFRP-F1：CGTTCGTAGGGTTACGATCG(SEQ ID NO.25)；
SFRP-R1：ACGCGCTATGTTCGCAAATTA(SEQ ID NO.28)。
本发明的第二个方面，提供一组特异性探针，包括靶向NDRG4基因、SDC2基因、PDX1基因、TFPI2基因、BMP3基因和SFRP2基因的启动子区高甲基化区域的特异性探针。
进一步地，本发明所述特异性探针的核苷酸序列如下所示：
靶向NDRG4的探针：
NDRG-P2：TTCGTTCGGGAGTTCGTTCCGCGTTTT(SEQ ID NO.8)；
靶向BMP3的探针：
BMP-P1：CGAGTCGGGTTTCGTGCGTTTTCGT(SEQ ID NO.12)；
靶向SDC2的探针：
SDC-P1：CGAGCACCGAGAACTCGCGTTCGCGAG(SEQ ID NO.16)；
靶向TFPI2的探针：
TFPI-P1：AGCGAACCGACGAATATCGG(SEQ ID NO.21)；
靶向PDX1的探针：
PDX-P1：AGCTGAACCGTTCGCAGCCGGGAGTATT(SEQ ID NO.24)；
靶向SFRP2的探针：
SFRP-P1：TAATCGCGTTATCGTCGACGCGTGTATG(SEQ ID NO.30)。
进一步地，根据本发明第二个方面所述的特异性探针，所述特异性探针标记有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团优选为FAM、VIC、ROX、CY5中的一种；所述淬灭基团优选为BHQ1、BHQ2中一种。
更进一步地，所述特异性探针标记有不同的荧光基团和淬灭基团。
具体地，所述特异性探针的荧光基团和淬灭基团如下所示：
NDRG4基因的特异性荧光探针上标记的荧光基团为CY5，淬灭基团为BHQ2；
BMP3基因的特异性荧光探针上标记的荧光基团为VIC，淬灭基团为BHQ1；
SDC2基因的特异性荧光探针上标记的荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1；
TFPI2基因的特异性荧光探针上标记的荧光基团为CY5，淬灭基团为BHQ2；
PDX1基因的特异性荧光探针上标记的荧光基团为VIC，淬灭基团为BHQ1；
SFRP2基因的特异性荧光探针上标记的荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1；
本发明的第三个方面，提供一种检测材料，包括本发明第一个方面所述的特异性引物和/或本发明第二个方面所述的特异性探针。
进一步地，根据本发明第三个方面所述的检测材料，还包括内参基因的检测材料。
优选地，所述内参基因优选为ACTB基因。
更优选地，所述ACTB基因的检测材料为用于扩增ACTB基因非启动子区的保守区域的特异性引物和/或靶向ACTB基因非启动子区的保守区域的特异性探针。
进一步优选地，所述ACTB基因的引物、探针的核苷酸序列如下所示：
用于扩增ACTB基因的引物：
ACTB-F1：TGGACATCGACGACGTTCAGCGAGT(SEQ ID NO.31)；
ACTB-R1：ATCCTATAGGACCAGACGACCCGTAT(SEQ ID NO.32)。
靶向ACTB的探针：
ACTB-P1：CACCACCCAACACACAATAACAAACAC(SEQ ID NO.33)。
更进一步地，所述ACTB基因特异性探针标记的荧光基团为ROX，淬灭基团为BHQ2。
本发明的第四个方面，提供一种检测试剂盒，包含本发明第三个方面所述的检测材料。
进一步地，根据本发明第四个方面所述的检测试剂盒，所述检测试剂盒还包括荧光定量PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品。
优选地，所述荧光定量PCR反应液包括：10×荧光定量PCR缓冲液，dNTPs，酶，镁离子，甜菜碱。
优选地，所述阳性质控品为经过亚硫酸氢盐转化处理的甲基化人类基因组。
优选地，所述阴性质控品为经过亚硫酸氢盐转化处理的非甲基化人类基因组。
更优选地，所述阳性质控品和阴性质控品的浓度为10ng/μL。
本发明的第五个方面，提供本发明第三个方面所述的检测材料在制备结直肠癌检测制剂中的应用。
本发明的第六个方面，提供一种结直肠癌的检测方法，采用本发明第四个方面所述的检测材料或本发明第五个方面所述的试剂盒对粪便样品进行检测。
进一步地，根据本发明第六个方面所述的检测方法，包括以下步骤：
S1.提取粪便样品中的DNA；
S2.使用本发明第四个方面所述的检测材料或本发明第五个方面所述的试剂盒对S1中提取的DNA进行荧光定量PCR检测；
S3.根据扩增结果，判断样品来源是否患有结直肠癌。
更进一步地，步骤S2中荧光定量PCR反应体系如下所示：
Figure BDA0002792921270000051
更进一步地，步骤S2中荧光定量PCR的扩增程序如下所示。
Figure BDA0002792921270000052
更优选地，步骤S2中使用以下两个引物探针组合(primer mix-1和primer mix-2)对样品进行荧光定量PCR反应：
Figure BDA0002792921270000053
更进一步地，基于两个引物探针组合(primer mix-1和primer mix-2)的荧光定量PCR检测结果，步骤S3中判断样品来源是否患有结直肠癌的判断标准如下所示：
Figure BDA0002792921270000054
Figure BDA0002792921270000061
当待检样本的判定结果为待定，该样本需再进行一次荧光定量PCR扩增反应，若荧光定量PCR结果为“内参基因ACTB有扩增信号，Ct值＜40；靶基因均无扩增信号或Ct值≥40”，则判定该样本为“阴性”，出现其他情况则判定为“阳性”。
本发明的有益效果是：
为了有效提高结直肠癌甲基化检测的灵敏度和特异性，本发明公开一种多位点结直肠癌甲基化检测引物探针组及试剂盒，本发明使用两个四重荧光定量PCR反应即可完成六个靶基因的检测，不仅能高效准确地完成粪便样本甲基化检测，而且能进一步降低了检测费用。本发明提供的试剂盒可用于辅助诊断结直肠癌，使得病灶能在早期甚至癌前阶段就被确诊，提高结直肠癌的早期确诊率和治愈率。
本发明提供的多位点结直肠癌甲基化检测引物探针组及试剂盒，最低检测限为1％，即最低能检测出1％的甲基化；且重复性良好。此外，灵敏度为100％，特异性为94.5％；能显著提高结直肠癌甲基化检测试剂盒的准确性以及应用范围，具有广阔的应用空间。
附图说明
图1 NDRG4基因的扩增曲线图。
图2 BMP3基因的扩增曲线图。
图3 SFRP2基因的扩增曲线图。
图4 TFPI2基因的扩增曲线图。
图5 SDC2基因的扩增曲线图。
图6 PDX1基因的扩增曲线图。
图7 ACTB基因的扩增曲线图。
图8引物探针组合Primer mix-1对SFRP2基因的扩增曲线图。
图9引物探针组合Primer mix-1对BMP3基因的扩增曲线图。
图10引物探针组合Primer mix-1对ACTB基因的扩增曲线图。
图11引物探针组合Primer mix-1对NDRG4基因的扩增曲线图。
图12引物探针组合Primer mix-2对SDC2基因的扩增曲线图。
图13引物探针组合Primer mix-2对PDX1基因的扩增曲线图。
图14引物探针组合Primer mix-2对ACTB基因的扩增曲线图。
图15引物探针组合Primer mix-2对TFPI2基因的扩增曲线图。
图16不同稀释比例阳性质控品条件下引物探针组合对SDC2基因的扩增曲线。
图17不同稀释比例阳性质控品条件下引物探针组合对BMP3基因的扩增曲线。
图18不同稀释比例阳性质控品条件下引物探针组合对TFPI2基因的扩增曲线。
图19不同稀释比例阳性质控品条件下引物探针组合对PDX1基因的扩增曲线。
图20不同稀释比例阳性质控品条件下引物探针组合对NDRG4基因的扩增曲线。
图21不同稀释比例阳性质控品条件下引物探针组合对SFRP2基因的扩增曲线。
具体实施方式
以下结合具体的实施例及附图对本发明的内容作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
实施例1引物设计及筛选
本发明基于TCGA(The cancer genome atlas)肿瘤数据库，通过挖掘与结直肠癌表观遗传相关的基因标志物，再进一步的筛选出与结直肠癌发生、发展相关性最显著的6个基因，即NDRG4基因、SDC2基因、PDX1基因、TFPI2基因、BMP3基因、SFRP2基因，作为本发明研究检测的靶基因。并针对上述靶基因启动子区高甲基化区域设计荧光定量PCR引物和探针，所述探针两端分别标记有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团为FAM、VIC、ROX、CY5中的一种，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2中的一种。其中引物探针的核酸序列如表1中的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.30所示，探针两端的荧光基团和淬灭基团如下所示：
NDRG4基因的特异性荧光探针上标记的荧光基团为CY5，淬灭基团为BHQ1；
BMP3基因的特异性荧光探针上标记的荧光基团为VIC，淬灭基团为BHQ1；
SDC2基因的特异性荧光探针上标记的荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1；
TFPI2基因的特异性荧光探针上标记的荧光基团为CY5，淬灭基团为BHQ2；
PDX1基因的特异性荧光探针上标记的荧光基团为VIC，淬灭基团为BHQ1；
SFRP2基因的特异性荧光探针上标记的荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1；发明人在一类始终保持着低甲基化水平的管家基因中，选择最常用的ACTB基因作为检测的内参基因，用于质控提取、转化、检测的效果以及作为样本结果判定的依据。并针对ACTB基因的非启动子区的保守区域设计荧光定量PCR引物，引物探针的核苷酸序列如表1中的SEQ IDNO.31～SEQ ID NO.33所示，其探针两端的荧光标记如下：
ACTB基因的特异性荧光探针上标记的荧光基团为ROX，淬灭基团为BHQ2。
表1甲基化特异性引物及荧光探针
Figure BDA0002792921270000081
Figure BDA0002792921270000091
同时设置阳性质控品和阴性质控品，用于检测上述甲基化特异性引物和荧光探针的性能，阳性质控品为经过亚硫酸氢盐转化处理的甲基化人类基因组，阴性质控品为经过亚硫酸氢盐转化处理的非甲基化人类基因组，浓度都为10ng/μL。
使用荧光定量PCR仪对上述甲基化特异性引物和荧光探针的性能进行检测，如表2所示配制PCR反应体系，扩增程序如表3所示。
表2 PCR反应体系
Figure BDA0002792921270000092
表3 PCR扩增程序
Figure BDA0002792921270000093
发明人从检测结果中筛选出扩增效率最高且扩增曲线呈现良好的“S”型、无非特异扩增的引物探针组合，筛选后的引物探针序列如表4所示。
表4筛选后的甲基化特异性引物及荧光探针
Figure BDA0002792921270000094
Figure BDA0002792921270000101
通过多轮优化实验，最后筛得两组四重引物探针检测组合Primer mix-1和Primermix-2，如表5、表6所示。
表5 Primer mix-1
Figure BDA0002792921270000102
表6 Primer mix-2
Figure BDA0002792921270000103
使用上述荧光定量PCR反应液反应，及使用上述阳性质控品和阴性质控品检测Primer mix-1和Primer mix-2的性能。如下表7所示配制PCR反应体系：
表7四重引物探针检测PCR反应体系
Figure BDA0002792921270000104
使用荧光定量PCR仪对上述甲基化特异性引物和荧光探针的性能进行检测，扩增程序如上述表3所示。两组四重引物探针检测组合Primer mix-1和Primer mix-2扩增曲线如图8～图15所示。
测试结果表明，使用两组四重引物探针检测组合Primer mix-1和Primer mix-2进行PCR反应，每个引物探针组合中的四组引物探针的扩增均一性较好，扩增曲线呈现良好的“S”型，每个通道均无非特异扩增，特异性较强。
实施例2结直肠癌甲基化检测试剂盒
将实施例1中筛选得到的引物探针组合以及阳性质控品、阴性质控品、荧光定量PCR反应液组合成结直肠癌甲基化检测试剂盒。
其中，荧光定量PCR反应液包括：10×荧光定量PCR缓冲液，dNTPs，酶，镁离子，甜菜碱等。
试剂盒中还可以包括DNA提取试剂。
试剂盒的使用方法包括以下步骤：
S1.提取粪便样品中的DNA；
S2.使用本发明第四个方面所述的检测材料或本发明第五个方面所述的试剂盒对S1中提取的DNA进行荧光定量PCR检测；
S3.根据扩增结果，判断样品来源是否患有结直肠癌。
基于实施例1中筛选得到的两个引物探针组合(primer mix-1和primer mix-2)的荧光定量PCR检测结果，步骤S3中判断样品来源是否患有结直肠癌的判断标准如下所示：
表8荧光定量PCR结果判定规则
Figure BDA0002792921270000111
当待检样本的判定结果为待定，该样本需再进行一次荧光定量PCR扩增反应，若荧光定量PCR结果为“内参基因ACTB有扩增信号，Ct值＜40；靶基因均无扩增信号或Ct值≥40”，则判定该样本为“阴性”，出现其他情况则判定为“阳性”。
实施例3试剂盒最低检测限和重复性测试
为检测两组四重引物探针检测组合Primer mix-1和Primer mix-2最低检测限以及重复性，发明人按照一定比例配制阳性质控品/阴性质控品的混合样本，该混合样本作为检测样本。所述比例为阳性质控品：阴性质控品分别为1:0,1:10,1:100,1:1000,0:1，稀释比例分别为100％，10％，1％，0.1％和0％。每个比例均设置三个重复。
按照实施例1中表7所示配制PCR反应体系，使用荧光定量PCR仪对上述甲基化特异性引物和荧光探针的性能进行检测，扩增程序如上述表3所示。荧光定量PCR仪为RocheLightCycler 480荧光定量PCR仪，扩增结果使用Roche LightCycler 480荧光定量系统进行数据分析，检测结果如下表9所示，两组四重引物探针检测组合对靶基因的扩增曲线见图16～图21。
表9最低检测限及重复性检测结果
Figure BDA0002792921270000121
检测结果表明，靶基因在阳性质控品的稀释比例在0.1％以下时，Ct值为“-”，即无PCR扩增信号；当阳性质控品的稀释比例在1％～100％时均有扩增信号，且Ct值随着稀释比例的下降而梯度上升，因此两组四重引物探针检测组合Primer mix-1和Primer mix-2的最低检测限为1％，即最低能检测出1％的甲基化；每个稀释比例均设置三个重复，三个重复之间的Ct值差异均小于0.5个Ct值，说明两组四重引物探针检测组合Primer mix-1和Primermix-2的重复性良好。
实施例4灵敏度和特异性测试(应用实施例)
为检测两组四重引物探针检测组合Primer mix-1和Primer mix-2在实际应用中的灵敏度和特异性，使用临床样本进行检测。本实施例共检测105份粪便样本，其中50份样本来自于已经确诊为结直肠癌的患者(样本编号56-105)，25份样本来自于非结直肠癌的其他癌症患者(样本编号31-55)以及30份样本为正常人群(样本编号1-30)。
检测方法：
(1)使用粪便DNA提取试剂盒QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit，按照说明书流程对105份粪便样本进行DNA提取，再使用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit，按照说明书流程对粪便样本DNA进行亚硫酸氢盐转化。转化后的DNA作为检测样本待用。
(2)使用实施例1中优选的四重引物探针检测组合对转化后的临床DNA样本进行荧光定量PCR检测。
a.将转化后的105个粪便样本DNA加入primer mix-1/primer mix-2和荧光定量PCR反应液中，设置两个重复，得到临床样本的PCR反应体系。
b.将阳性质控品、阴性质控品和无核酸酶水(Nuclease-Free Water，简称NF-水)加入primer mix-1/primer mix-2和荧光定量PCR反应液中，设置两个重复，得到质控品的PCR反应体系。
NF-水作为空白质控。
(3)将配制好的PCR反应体系放入实时荧光定量PCR仪中，按照实施例1中的反应程序进行荧光定量PCR反应。
所使用的荧光定量PCR仪为Roche LightCycler 480荧光定量PCR仪，扩增结果使用Roche LightCycler 480荧光定量系统进行数据分析。
(4)荧光定量PCR扩增反应结果按照实施例2中的荧光定量PCR结果判定规则进行结果判定。
105例临床样本的检测结果如下表10所示。
表10临床样本检测结果
Figure BDA0002792921270000131
Figure BDA0002792921270000141
Figure BDA0002792921270000151
Figure BDA0002792921270000161
上表结果表明，两组四重引物探针检测组合Primer mix-1和Primer mix-2的检测结果合格可信；50例结直肠癌患者样本的判定结果均为阳性，两组四重引物探针检测组合的灵敏性为100％；30例正常人群样本的判定结果均为阴性，25例非结直肠癌的癌症患者样本中有3例的判定结果为阳性，其他22例样本均判定为阴性，两组四重引物探针检测组合的特异性为94.5％。
上述结果说明，本发明实施例1中两组四重引物探针检测组合Primer mix-1和Primer mix-2以及本发明实施例2中试剂盒的最低检测限为1％，即最低能检测出1％的甲基化；且重复性良好。此外，两组四重引物探针检测组合及试剂盒的灵敏度为100％，特异性为94.5％；能显著提高结直肠癌甲基化检测试剂盒的准确性以及应用范围。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州齐凯生物科技有限公司
<120> 一种多位点结直肠癌甲基化检测引物、探针及试剂盒
<130>
<160> 33
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcgcaattcg cgttcggtt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gagccgttat ttcgtcgg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgaacccgg atcgatccgg 20
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<400> 7
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ttcgttcggg agttcgttcc gcgtttt 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
acgtcgttgc tcgttcgtcg atcggta 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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gaaaccgaca cgaataaact c 21
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cgagtcgggt ttcgtgcgtt ttcgt 25
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aacacacgtc gattgaaaca 20
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<400> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aggcgttttt tatcgcgtt 19
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gaagcctccc gtcatactcg 20
<210> 20
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<213> 人工序列
<400> 20
cacacacccg tcttaccca 19
<210> 21
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<400> 21
agcgaaccga cgaatatcgg 20
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
acgcgcgttt attatgcacg gtcccg 26
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<213> 人工序列
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aattacctgc gattatcggc acagt 25
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<212> DNA
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<400> 24
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cgttcgtagg gttacgatcg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
atcggtattt gaatcgtttc actttg 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
aatcgcgtcg aggttact 18
<210> 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
acgcgctatg ttcgcaaatt a 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
tccgcgctca ccgcgatatt c 21
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
taatcgcgtt atcgtcgacg cgtgtatg 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tggacatcga cgacgttcag cgagt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
caccacccaa cacacaataa caaacac 27

Claims (10)

1.一组特异性引物，包括用于扩增NDRG4基因、SDC2基因、PDX1基因、TFPI2基因、BMP3基因和SFRP2基因的启动子区高甲基化区域的特异性引物。
2.根据权利要求1所述的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列如下所示：
用于扩增NDRG4基因的引物：
NDRG-F2：GAGCCGTTATTTCGTCGG(SEQ ID NO.2)；
NDRG-R2：GCGTAACCGAAAATTCTAC(SEQ ID NO.5)；
用于扩增BMP3基因的引物：
BMP-F1：CGTTATCACGAAGTATCACGA(SEQ ID NO.10)；
BMP-R1：GAAACCGACACGAATAAACTC(SEQ ID NO.11)；
用于扩增SDC2基因的引物：
SDC-F2：GAGTAGGGCGGGCGTAAG(SEQ ID NO.14)；
SDC-R1：AACACACGTCGATTGAAACA(SEQ ID NO.15)；
用于扩增TFPI2基因的引物：
TFPI-F2：AGGCGTTTTTTATCGCGTT(SEQ ID NO.18)；
TFPI-R2：CACACACCCGTCTTACCCA(SEQ ID NO.20)；
用于扩增PDX1基因的引物：
PDX-F1：ACGCGCGTTTATTATGCACGGTCCCG(SEQ ID NO.22)；
PDX-R1：AATTACCTGCGATTATCGGCACAGT(SEQ ID NO.23)；
用于扩增SFRP2基因的引物：
SFRP-F1：CGTTCGTAGGGTTACGATCG(SEQ ID NO.25)；
SFRP-R1：ACGCGCTATGTTCGCAAATTA(SEQ ID NO.28)。
3.一组特异性探针，包括靶向NDRG4基因、SDC2基因、PDX1基因、TFPI2基因、BMP3基因和SFRP2基因的启动子区高甲基化区域的特异性探针。
4.根据权利要求3所述的特异性探针，其特征在于，所述特异性探针标记有的荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团优选为FAM、VIC、ROX、CY5中的一种；所述淬灭基团优选为BHQ1、BHQ2中一种。
5.根据权利要求3所述的特异性探针，其特征在于，所述特异性探针的核苷酸序列如下所示：
靶向NDRG4的探针：
NDRG-P2：TTCGTTCGGGAGTTCGTTCCGCGTTTT(SEQ ID NO.8)；
靶向BMP3的探针：
BMP-P1：CGAGTCGGGTTTCGTGCGTTTTCGT(SEQ ID NO.12)；
靶向SDC2的探针：
SDC-P1：CGAGCACCGAGAACTCGCGTTCGCGAG(SEQ ID NO.16)；
靶向TFPI2的探针：
TFPI-P1：AGCGAACCGACGAATATCGG(SEQ ID NO.21)；
靶向PDX1的探针：
PDX-P1：AGCTGAACCGTTCGCAGCCGGGAGTATT(SEQ ID NO.24)；
靶向SFRP2的探针：
SFRP-P1：TAATCGCGTTATCGTCGACGCGTGTATG(SEQ ID NO.30)。
6.一种检测材料，包括权利要求1或2所述的特异性引物和/或权利要求3～5任一项所述的特异性探针。
7.根据权利要求6所述的检测材料，其特征在于，还包括内参基因的检测材料，所述内参基因优选为ACTB基因。
8.一种检测试剂盒，包含权利要求6或7所述的检测材料。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括荧光定量PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品；
所述荧光定量PCR反应液优选包括：10×荧光定量PCR缓冲液，dNTPs，酶，镁离子，甜菜碱；
所述阳性质控品优选为经过亚硫酸氢盐转化处理的甲基化人类基因组；
所述阴性质控品优选为经过亚硫酸氢盐转化处理的非甲基化人类基因组。
10.权利要求6或7所述的检测材料在制备结直肠癌检测制剂中的应用。
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