CN117402973A - 一种用于检测乳腺癌的核酸试剂、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,更具体地,涉及一种用于检测乳腺癌的核酸试剂、试剂盒及应用。本发明提供的试剂盒通过检测乳腺癌生物标志物的甲基化水平,能够有效区分乳腺癌患者和对照组,对不同病理分期的乳腺癌均具有优异的检测效果,显著提高了早期乳腺癌血液样本检测灵敏度,检测准确度高,不易出现假阴性结果,能够用于不同病理分期的乳腺癌的诊断和筛查,尤其适用于早期乳腺癌。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,更具体地,涉及一种用于检测乳腺癌的核酸试剂、试剂盒及应用。
背景技术
目前乳腺癌影像筛查手段主要包括乳腺钼靶X射线检查、乳腺彩超和核磁共振等影像学检查。但乳腺钼靶X射线检查对于致密型乳腺病灶诊断敏感性较低;乳腺彩超阳性预测值较低;核磁共振(MRI)对微小钙化灶不敏感。而且影像学检查通常对检查人员的操作水平和经验依赖程度大。这些影像学检查难以作为大规模筛查手段。
cfDNA(cell-free DNA)是外周血中游离的核酸小片段DNA,源自正常细胞或肿瘤细胞代谢与凋亡,包含体细胞突变和DNA甲基化等遗传信息。通过检测疾病特异性cfDNA片段,掌握疾病的发生、发展的技术,称为液体活检(Liquid Biopsy),与传统的组织活检相比,其有着迅速、便捷、损伤性小等众多优点。
现有技术公开的一些乳腺癌液体活检的试剂盒,通过检测血液样本中生物标志物的甲基化水平诊断乳腺癌的灵敏度、特异性有待提高,尤其是尚缺乏能够用于早期乳腺癌的试剂盒。
发明内容
针对现有技术的缺陷,本发明的目的在于提供了一种用于检测乳腺癌的核酸试剂、试剂盒及应用,以改善现有技术对乳腺癌检测灵敏度和检测特异性欠佳,缺乏能够用于早期乳腺癌检测的试剂盒等技术问题。
为实现上述目的,本发明提供了一种用于检测乳腺癌的核酸试剂,所述核酸试剂包括用于检测第一靶区域和/或第二靶区域中DNA甲基化水平的引物对,以GRCh38.p14为参考基因组,所述第一靶区域为Chr20:38674564-38674765的全长区域或部分区域,所述第二靶区域为Chr10:101284144-101284430的全长区域或部分区域。
优选地,所述第一靶区域包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2中至少一者;所述第二靶区域包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中至少一者。
优选地,所述引物对检测所述第一靶区域和所述第二靶区域。
优选地,所述引物对选自如下(a)-(d)组引物对中的至少一组:
(a)用于检测SEQ ID NO.1区域内甲基化水平的如SEQ ID NO.9~10所示的第一引物对;
(b)用于检测SEQ ID NO.2区域内甲基化水平的如SEQ ID NO.12~13所示的第二引物对;
(c)用于检测SEQ ID NO.3区域内甲基化水平的如SEQ ID NO.15~16所示的第三引物对;
(d)用于检测SEQ ID NO.4区域内甲基化水平的如SEQ ID NO.18~19所示的第四引物对。
优选地,所述核酸试剂还包括TaqMan探针。
优选地,所述引物对和所述TaqMan探针选自如下组合中的至少一组:
SEQ ID NO.9~10所示的第一引物对和SEQ ID NO.11所示的第一探针;
SEQ ID NO.12~13所示的第二引物对和SEQ ID NO.14所示的第二探针;
SEQ ID NO.15~16所示的第三引物对和SEQ ID NO.17所示的第三探针;
SEQ ID NO.18~19所示的第四引物对和SEQ ID NO.20所示的第四探针。
优选地,所述TaqMan探针的5’端包含有荧光报告基团,所述TaqMan探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
本发明还提供了一种用于检测乳腺癌的试剂盒,其包括所述核酸试剂,还包括其他试剂,所述其他试剂包括内参基因的检测引物对和探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、亚硫酸氢盐转化试剂、PCR反应试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
本发明还提供了所述核酸试剂或所述试剂盒在制备乳腺癌诊断产品中的用途,所述乳腺癌诊断产品包括体外血液甲基化检测试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。
优选地,所述乳腺癌包括早期乳腺癌,所述早期乳腺癌包括IA期乳腺癌、IB期乳腺癌、IIA期乳腺癌和IIB-T2期乳腺癌中的至少一种。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,具有以下有益效果:
本发明提供的一种用于检测乳腺癌的核酸试剂和试剂盒,对乳腺癌组织样本、血液样本均具有优异的检测效果,能够有效区分乳腺癌患者和非癌受试者。相较于现有技术,该试剂盒通过检测乳腺癌生物标志物的甲基化水平检测早期乳腺癌血液样本的灵敏度可达90.48%,检测局部晚期、晚期乳腺癌血液样本的灵敏度分别可达93.33%和100.00%,检测乳腺良性肿瘤血液样本的特异性可达99.45%,检测健康人血液样本的特异性可达96.55%,检测准确度高,不易出现假阴性结果,对不同病理分期的乳腺癌均具有优异的检测效果,适用于早期乳腺癌的筛查和诊断。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
术语“诊断”是指确定受试者的健康状态,涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下,术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态。一些实施例中,“检测”乳腺癌是指检测疾病的存在与否,即判断受试者是否患有乳腺癌。
术语“生物标志物”是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标,如蛋白质、DNA或RNA等,具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。筛选可用于疾病筛查、早期诊断的生物标志物可大大提高患者的临床治疗效果。乳腺癌病理类型多样,在临床应用时,高灵敏度、高特异性的生物标志物对于提高乳腺癌的检出率是十分重要的,因而需要探索能满足临床需求的、诊断性能优异的生物标志物,特别是高特异性的生物标志物。
术语“乳腺癌”包括不同病理分期的乳腺癌,主要包括早期乳腺癌、局部晚期乳腺癌、晚期乳腺癌3种病理分期。根据TNM分期系统,其中早期乳腺癌包括0期、IA期、IB期、IIA期、IIB-T2期乳腺癌,局部晚期乳腺癌包括IIB-T3期、IIIA期、IIIB期、IIIC期乳腺癌,晚期乳腺癌为IV期乳腺癌。
术语“受试者”是指是指接受观察、检测或实验的对象。一些实施例中,受试者可以是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于灵长类(包括人和非人灵长类)以及啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)。一些实施例中,哺乳动物可以是人。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式,能够在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数,既代笔定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中,可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下,可根据样本检测的Ct值进行比较;在一些情况下,可计算样本中基因甲基化的比例,即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100%,然后再进行比较;在一些情况下,还需要对各个指标进行统计学上的分析整合,得出最终的判定指标。
术语“甲基化转化试剂”是指包含(在一些实施例中)亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐、重亚硫酸氢盐或其组合的试剂,其可用以区分CpG二核苷酸序列等中的甲基化胞苷和未甲基化胞苷。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中,基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常,用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素,包括温度、引物来源以及所用方法等。例如,对于诊断和预后应用,根据靶序列的复杂度,寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸,但是也可以含有更少的核苷酸。在本发明公开内容中,术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指正向引物和反向引物组成的组。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一,能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后,所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶,而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变,因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物,通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对,从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来,但是qMSP最终的检测指标为荧光信号,因此,在qMSP反应系统中,除加入甲基化检测引物以外,还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比,qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高,更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段,且该技术不需要凝胶电泳检测,操作更加简便。在本申请公开内容中,进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物对,若Ct值满足所述要求(例如在组织样本中Ct≤38),则表明目标序列是甲基化的。
术语“亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)”是通过对基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理,非甲基化的胞嘧啶被脱氨基而转变成尿嘧啶,在随后的PCR反应中尿嘧啶转变成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不能被脱氨基,在反应完成时被保留;然后在非甲基化区域设计引物进行PCR扩增,将扩增得到的PCR产物进行克隆测序,将测得的序列与原始序列比对,统计甲基化位点及数量,并分析甲基化程度。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光报告基团和3’荧光淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时,因为荧光基团附近存在淬灭基团,探针不会发出荧光。在扩增过程中,如果探针与被扩增的链结合,DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针,荧光基团远离淬灭基团,其能量不被吸收,即产生荧光信号。每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步的指数增长的过程。
本发明提供了一种用于检测乳腺癌的核酸试剂,上述核酸试剂包括用于检测第一靶区域和/或第二靶区域中DNA甲基化水平的引物对,以GRCh38.p14为参考基因组,上述第一靶区域为Chr20:38674564-38674765的全长区域或部分区域,上述第二靶区域为Chr10:101284144-101284430的全长区域或部分区域。
一些实施例中,上述Chr20:38674564-38674765的部分区域包括Chr20:38674564-38674748正链和Chr20:38674599-38674765负链;上述Chr10:101284144-101284430的部分区域包括Chr10:101284144-101284349正链和Chr10:101284237-101284430负链。
一些实施例中,上述第一靶区域包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2中至少一者;上述第二靶区域包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中至少一者。
较佳实施例中,上述引物对检测上述第一靶区域和上述第二靶区域。
一些实施例中,上述引物对选自如下(a)-(d)组引物对中的至少一组:
(a)用于检测SEQ ID NO.1区域内甲基化水平的如SEQ ID NO.9~10所示的第一引物对;
(b)用于检测SEQ ID NO.2区域内甲基化水平的如SEQ ID NO.12~13所示的第二引物对;
(c)用于检测SEQ ID NO.3区域内甲基化水平的如SEQ ID NO.15~16所示的第三引物对;
(d)用于检测SEQ ID NO.4区域内甲基化水平的如SEQ ID NO.18~19所示的第四引物对。
实验中发现,将本发明中Chr20:38674564-38674765的部分区域与Chr10:101284144-101284430的部分区域组合作为区域组合物进行甲基化水平的检测时,其检测组织样本的灵敏度相对于以单一靶区域作为生物标志物进行检测时有所提高。相对应地,本发明用于检测乳腺癌的引物对中包括的较佳引物对为用于检测如下任一组合的甲基化水平的引物对:
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的组合;
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4的组合;
SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的组合;
SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的组合。
较佳实施例中,上述引物对为如下的任意一种或多种:第一引物对和第三引物对的组合、第一引物对和第四引物对的组合、第二引物对和第三引物对的组合、第二引物对和第四引物对的组合。尤其是第二引物对和第三引物对的组合,其诊断早期乳腺癌组织样本、早期乳腺癌血液样本的灵敏度和特异性均相较于其他组合更佳。
需要说明的是,若一种引物对与上述引物对(第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对)所示的核苷酸序列具有至少具有85%(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)等以上的序列一致性,且该引物对同样具有一定的乳腺癌诊断功能,尤其是早期乳腺癌诊断功能(特异性或灵敏度与本申请引物对相比,相当或略有下降或略有提高或大幅提高等),则也在本发明的保护范围内。
优选地,上述核酸试剂还包括TaqMan探针。
优选地,上述引物对和上述TaqMan探针选自如下组合中的至少一组:
SEQ ID NO.9~10所示的第一引物对和SEQ ID NO.11所示的第一探针;
SEQ ID NO.12~13所示的第二引物对和SEQ ID NO.14所示的第二探针;
SEQ ID NO.15~16所示的第三引物对和SEQ ID NO.17所示的第三探针;
SEQ ID NO.18~19所示的第四引物对和SEQ ID NO.20所示的第四探针。
本发明还提供了一种用于检测乳腺癌的试剂盒,其包括上述核酸试剂,还包括其他试剂。一些实施例中,上述其他试剂包括内参基因的检测引物对和探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
一些实施例中,内参基因的检测引物对和探针是针对ACTB基因设计的检测引物对。在本发明具体实施例中,ACTB基因的检测引物对和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.21~23所示。可以理解的是,在其他实施例中,还可以选择其他基因作为内参基因,此时,内参引物对对应设计即可。
一些实施例中,上述TaqMan探针和上述内参基因的探针的5’端包含有荧光报告基团,3’端包含有荧光淬灭基团。一些实施例中,上述荧光报告基团选自FAM、ROX、TAMRA、CY5、VIC、TET、JOE和HEX中的一种或多种,上述荧光淬灭基团选自MGB、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的一种或多种。在同一个反应体系中有两个以上探针时,不同探针上连接的荧光基团不同。
一些实施例中,上述甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。一些实施例中,上述甲基化转化试剂可以为亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐。
一些实施例中,上述PCR反应试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种;上述阳性对照是指其中包含甲基化的靶区域,用于监测试剂的检测性能;上述阴性对照是指其中不包含甲基化的靶区域,用于监测实验是否受到污染。
基于本发明公开的内容,本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述第一靶区域、第二靶区域的甲基化水平进行检测,对乳腺癌进行诊断,无论采用何种技术,其都是属于本发明的保护范围。
在可选的实施方案中,上述甲基化水平通过如下至少一种方法进行检测:甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP-PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)、甲基化特异性PCR(qMSP)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、基于限制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、亚硫酸氢盐测序、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP-seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD-PCR)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)或甲基化DNA免疫沉淀-微阵列分析(MeDIP-chip)、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法和基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。
本发明还提供了上述核酸试剂或上述试剂盒在制备乳腺癌诊断产品中的用途,上述乳腺癌诊断产品包括体外血液甲基化检测试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。需要说明的是,本发明提供的乳腺癌检测产品并不限于上述所列举的试剂盒,只要能满足乳腺癌的诊断或辅助诊断的需求的产品均在本发明的保护范围内。
一些实施例中,上述乳腺癌包括早期乳腺癌,上述早期乳腺癌包括IA期乳腺癌、IB期乳腺癌、IIA期乳腺癌和IIB-T2期乳腺癌中的至少一种。
本发明还提供了上述试剂盒用在检测乳腺癌或用在检测患有乳腺癌的风险提高、疑似患有乳腺癌或已经患有乳腺癌的受试者的用途。
本发明还提供了一种通过检测样本中靶区域的甲基化水平进而检测乳腺癌的方法,包括如下步骤:
提取受试者生物样本,采用甲基化转化试剂对其进行转化,然后对转化后的DNA进行纯化。采用上述试剂盒进行qPCR扩增,通过MSP法检测血液样本中靶区域的甲基化水平,进而判断待测生物样本为乳腺癌阴性或阳性。
一些实施例中,上述生物样本包括但不限于分离自受试者的器官、组织、细胞和/或体液的组合物。一些实施例中,体液包括但不限于血液、血浆、血清等,或其组合。一些实施例中,上述生物样本来自受试者血液,特别是包含cfDNA的血液样本。基于此,本发明还提供了一种通过检测血液样本中靶区域的甲基化水平进而检测乳腺癌的方法,包括如下步骤:
提取受试者血液样本(包含cfDNA),采用甲基化转化试剂对其进行转化,然后对转化后的DNA进行纯化。采用上述试剂盒进行qPCR扩增,通过MSP法检测血液样本中靶区域的甲基化水平,进而判断待测血液样本为乳腺癌阴性或阳性。
本发明提供的上述方法能够低侵袭性地进行灵敏度和特异性高的乳腺癌的早期诊断,在乳腺癌早期筛查、疗效判定、辅助诊断、预后监测等领域极具应用价值。
以下结合具体实施例,对上述技术方案详细说明。除非另有说明,以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品,或者可通过本领域已知方法制备。
实施例1
以Chr20:38674564-38674765bp(包括区域1、区域2)、Chr10:101284144-101284430bp(包括区域3、区域4)作为生物标志物,通过亚硫酸氢盐测序法(BSP法)验证上述靶区域在乳腺癌组织样本和非癌样本中的甲基化水平,以明确其是否可作为检测乳腺癌的生物标志物。其中,区域1的物理位置为Chr20:38674564-38674748正链,区域2的物理位置为Chr20:38674599-38674765负链,区域3的物理位置为Chr10:101284144-101284349正链,区域4的物理位置为Chr10:101284237-101284430负链,具体信息见表1、表2。
具体检测方法如下。
1)组织样本DNA的提取、转化和纯化
使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Cat:56404)提取组织样本的DNA,具体操作按照试剂盒说明书进行。组织样本DNA的转化和纯化所用试剂盒均为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号),具体操作步骤如说明书所示。
2)甲基化荧光定量PCR反应
为了保证甲基化荧光定量PCR反应的扩增效率位于95%~105%之间,且没有非特异性扩增和引物二聚体出现,分别以经亚硫酸氢盐转化后Chr20:38674564-38674765bp和Chr10:101284144-101284430bp的序列为模板,设计多对用于甲基化荧光定量PCR反应的引物对,使用SYBR Green PCR体系扩增目的片段,通过熔解曲线和标准曲线分析,筛选到满足上述要求的2对用于扩增Chr20:38674564-38674765bp的部分区域(区域1、区域2)的引物对,和2对用于扩增Chr10:101284144-101284430bp的部分区域(区域3、区域4)的引物对。针对每对引物设计对应的TaqMan检测探针,用于TaqMan PCR反应。筛选的区域1~区域4的引物对、检测探针的核苷酸序列见表3。TaqMan PCR反应体系和反应程序见表4、表5。内参基因ACTB的检测引物对包括正向引物和反向引物,其中正向引物为5’-AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG-3’(SEQ ID NO.21),反向引物为5’-AATAACACCCCCACCCTGC-3’(SEQ ID NO.22),内参基因ACTB的检测探针为5’-GGAGTGGTTTTTGGGTTTG-3’(SEQ IDNO.23)。区域1、2的5’端的荧光报告基团均为VIC,3’端的荧光淬灭基团均为MGB;区域3、4的5’端的荧光报告基团均为ROX,3’端的荧光淬灭基团均为MGB;内参基因ACTB的检测探针5’端的荧光报告基团为FAM,3’端的荧光淬灭基团为BHQ-1。
阴性对照和阳性对照:在进行PCR反应检测样本时,阴性对照和阳性对照也应同时进行检测,阴性对照管的DNA模板为TE缓冲液。阳性对照管的DNA模板的制备方法为:将ACTB基因扩增区域对应的经亚硫酸氢盐完全转化后的序列进行人工合成,并克隆至载体上,形成人工合成质粒;将靶区域对应的完全甲基化且经亚硫酸氢盐转化后的序列进行人工合成,并克隆至载体上,形成人工合成质粒,阳性对照DNA模板为103拷贝/微升的含转化后ACTB的人工合成质粒和103拷贝/微升的含一个靶区域的人工合成质粒,两者1:1等体积混合而成。若同时检测两个区域组合的甲基化水平,则阳性对照DNA模板为103拷贝/微升的含转化后ACTB的人工合成质粒、103拷贝/微升的含一个靶区域的人工合成质粒、103拷贝/微升的含另一个靶区域的人工合成质粒,三者1:1:1等体积混合而成。
Ct值读取:PCR完成后,调整基线,将一次PCR中样本最小Ct值提前1~2个循环前的荧光值设置为基线值,将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处,得到样本各个靶区域的Ct值。
质量控制:阴性对照要无扩增,阳性对照要有明显的指数增长期,且阳性对照各靶区域的Ct值应在26~30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35,阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后,表明本次实验有效,可进行下一步样本结果的判定。否则,当次实验无效,需重新进行检测。
表1区域1~区域4的DNA序列
表2区域1~区域4完全甲基化的靶区域经亚硫酸氢盐转化后的DNA序列
表3区域1~区域4的引物对和检测探针的核苷酸序列
表4TaqMan PCR反应体系
组分 | 规格 | 体积(μL) |
Platinum IIPCR缓冲液 | 5× | 5 |
dNTPs | 各2.5mM | 3 |
每一区域正向引物 | 10μM | 各0.5 |
每一区域反向引物 | 10μM | 各0.5 |
每一区域检测探针 | 10μM | 各0.5 |
ACTB正向引物 | 10μM | 0.5 |
ACTB反向引物 | 10μM | 0.5 |
ACTB检测探针 | 10μM | 0.5 |
PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase | / | 0.5 |
待测样本DNA | / | 5 |
纯化水 | / | 补至25 |
表5TaqMan PCR反应程序
4)PCR结果分析
根据各个靶区域检测的Ct值来判断待测样本的甲基化水平。对于组织样本,若扩增某一区域的Ct值≤38,则认为该样本中此区域为甲基化阳性,若扩增某一区域的Ct值>38,则认为该样本中此区域为甲基化阴性。在检测单一区域时,若待测样本在该区域为甲基化阳性,则该样本为癌症阳性样本,若待测样本在该区域为甲基化阴性,则该样本为癌症阴性样本。在检测多个区域时,若待测样本在组合物中至少一个区域为甲基化阳性,则该样本为癌症阳性样本,仅当待测样本在区域组合物的两个区域都为甲基化阴性,则该样本为癌症阴性样本。
实施例2
发明人发现通过检测乳腺癌患者癌组织样本中Chr20:38674564-38674765bp(包括区域1、区域2)和/或Chr10:101284144-101284430bp(包括区域3、区域4)的甲基化水平,可以有效区分乳腺癌组织样本和癌旁正常组织样本。具体的检测过程如下所示。
组织样本的收集:共收集经病理检测确诊的晚期乳腺癌(IV期)患者癌组织样本10例,局部晚期乳腺癌(包括IIB-T3期、IIIA期、IIIB期、IIIC期)患者癌组织样本44例,早期乳腺癌(包括IA期、IB期、IIA期、IIB-T2期)患者癌组织样本46例以及对应的癌旁正常组织样本共100例。所有样本均为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织样本。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理。
组织样本DNA的提取、转化和纯化、甲基化荧光定量PCR反应同实施例1。利用甲基化荧光定量PCR检测的方法,通过检测区域1~区域4中某一区域的甲基化水平诊断乳腺癌癌组织样本、癌旁正常组织样本的灵敏度和特异性见表6;通过检测区域1~2分别与区域3~4组合的甲基化水平诊断乳腺癌癌组织样本、癌旁组织样本的灵敏度和特异性见表7。
表6检测区域1~区域4中某一区域的甲基化水平诊断组织样本的灵敏度和特异性
表7检测靶区域组合的甲基化水平诊断组织样本的灵敏度和特异性
表6中,通过单独检测区域1~区域4中某一区域的甲基化水平诊断乳腺癌组织样本的总灵敏度范围为84.00%~89.00%,检测癌旁正常组织样本的特异性范围为87.00%~89.00%。具体地,表6中通过检测区域1~区域4中某一区域的甲基化水平诊断早期乳腺癌组织样本的灵敏度范围为80.43%~86.96%,诊断局部晚期、晚期乳腺癌组织样本的灵敏度范围分别为86.36%~90.91%和80.00%~90.00%。
表7中,通过检测区域1~2分别与区域3~4组合的甲基化水平诊断乳腺癌组织样本的总灵敏度范围为89.00%~94.00%,优于单一区域检测;其检测癌旁正常组织样本的特异性范围为86.00%~88.00%,略低于单一区域检测。具体地,其检测早期乳腺癌组织样本的灵敏度大于等于86.96%,优于单一区域检测;检测局部晚期、晚期乳腺癌患者组织样本的灵敏度范围分别为88.64%~95.45%和90.00~100.00%。表7中,通过检测区域2+区域3的区域组合的甲基化水平诊断乳腺癌组织样本的性能优于其它区域组合物,其检测早期、局部晚期、晚期乳腺癌组织样本的灵敏度分别可达91.30%、95.45%、100.00%,检测癌旁正常组织样本的特异性可达88.00%。
实施例3利用甲基化荧光定量PCR法分析区域组合物诊断乳腺癌患者血液样本的性能
通过检测乳腺癌患者的血液样本中Chr6:27558279-27558522bp的任一部分区域(包括区域1、区域2)和Chr6:104953064-104953268bp的任一部分区域(包括区域3、区域4)组合的区域组合物的甲基化水平,可以有效区分乳腺癌患者和健康人,具体的检测过程如下所示。
1)血液样本的收集
共收集经病理检测确诊的早期乳腺癌(包括IA期、IB期、IIA期、IIB-T2期)患者血液样本42例,局部晚期乳腺癌(包括IIB-T3期、IIIA期、IIIB期、IIIC期)患者血液样本30例,晚期乳腺癌(IV期)患者血液样本21例和对照组血液样本共102例(乳腺良性肿瘤患者44例(包括纤维瘤患者10例、乳腺增生患者22例、乳腺囊肿患者12例),健康人58例)。
2)血液样本DNA的提取、纯化和转化
使用QIAamp Circulating Nucleic Acid kit(Qiagen,Valencia,CA,USA)从血浆中提取cfDNA。DNA用Qubit 2.0fluorimeter(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)定量。将基因组DNA进行亚硫酸氢钠化学修饰,将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶同时保持甲基化胞嘧啶不变。采用ZYMO公司提供的EZ DNA Methylation-Gold Kit进行DNA转化及纯化,具体操作参考试剂盒说明书完成。
3)甲基化荧光定量PCR的检测方法同实施例1。
由于单独检测区域1~区域4中某一区域的甲基化水平进而来区分癌组织样本和正常组织样本的效果不及检测区域组合物的效果显著(见表6、表7),因此,在本实施例中,不再单独检测单一区域在血液样本中的甲基化水平,而是检测区域组合物在血液样本中的甲基化水平。
4)甲基化荧光定量PCR结果分析
Ct值的读取、质量控制等同实施例1。PCR结果分析和判读方法:根据靶区域检测的Ct值来判断待测样本的甲基化水平。对于血液样本,若扩增某一区域的Ct值≤45,则认为该样本中此区域为甲基化阳性,若扩增某一区域的Ct值>45,则认为该样本中此区域为甲基化阴性。在检测多个区域时,若待测样本在区域组合物中至少一个区域为甲基化阳性,则该样本为癌症阳性样本,仅当待测样本在构成组合物的两个区域都为甲基化阴性,则该样本为癌症阴性样本。通过检测区域1~2分别与区域3~4组合的甲基化水平诊断血液样本的灵敏度和特异性见表8、表9。
表8检测靶区域组合的甲基化水平诊断乳腺癌血液样本的灵敏度
表9检测靶区域组合的甲基化水平诊断对照组血液样本的特异性
表8中,通过检测靶区域组合的甲基化水平进而诊断乳腺癌患者血液样本的性能优异,其检测乳腺癌患者血液样本的总灵敏度范围为86.02%~93.55%,具体地,其检测早期乳腺癌血液样本的灵敏度范围为85.71%~90.48%,其检测局部晚期、晚期乳腺癌血液样本的灵敏度范围分别为83.33%~93.33%和90.48%~100%。
表9中,通过检测靶区域组合的甲基化水平检测对照组患者血液样本的特异性范围为91.18%~96.08%,其检测乳腺良性肿瘤血液样本的特异性范围为88.64%~95.45%,其检测健康人血液样本的特异性范围为91.38%~96.55%。有趣的是,对比表7、表9发现,通过检测靶区域组合的甲基化水平检测对照组血液样本的特异性明显高于癌旁正常组织样本,这表明本发明提供的乳腺癌检测试剂盒能够用于检测对照组血液样本,具有优异的检测特异性,能够降低假阴性样本的检出,检测准确度高。
综合表8、表9可以看出,通过检测区域2+区域3的区域组合的甲基化水平检测乳腺癌患者血液样本的性能最佳,其检测早期、局部晚期、晚期乳腺癌患者血液样本的灵敏度分别可达90.48%、93.33%、100%;检测对照组患者血液样本的特异性可达96.08%。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于检测乳腺癌的核酸试剂,其特征在于,所述核酸试剂包括用于检测第一靶区域和/或第二靶区域中DNA甲基化水平的引物对,以GRCh38.p14为参考基因组,所述第一靶区域为Chr20:38674564-38674765的全长区域或部分区域,所述第二靶区域为Chr10:101284144-101284430的全长区域或部分区域。
2.根据权利要求1所述的核酸试剂,其特征在于,所述第一靶区域包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2中至少一者;所述第二靶区域包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中至少一者。
3.根据权利要求2所述的核酸试剂,其特征在于,所述引物对检测所述第一靶区域和所述第二靶区域。
4.根据权利要求2或3所述的核酸试剂,其特征在于,所述引物对选自如下(a)-(d)组引物对中的至少一组:
(a)用于检测SEQ ID NO.1区域内甲基化水平的如SEQ ID NO.9~10所示的第一引物对;
(b)用于检测SEQ ID NO.2区域内甲基化水平的如SEQ ID NO.12~13所示的第二引物对;
(c)用于检测SEQ ID NO.3区域内甲基化水平的如SEQ ID NO.15~16所示的第三引物对;
(d)用于检测SEQ ID NO.4区域内甲基化水平的如SEQ ID NO.18~19所示的第四引物对。
5.根据权利要求1至3任一项所述的核酸试剂,其特征在于,还包括TaqMan探针。
6.根据权利要求5所述的核酸试剂,其特征在于,所述引物对和所述TaqMan探针选自如下组合中的至少一组:
SEQ ID NO.9~10所示的第一引物对和SEQ ID NO.11所示的第一探针;
SEQ ID NO.12~13所示的第二引物对和SEQ ID NO.14所示的第二探针;
SEQ ID NO.15~16所示的第三引物对和SEQ ID NO.17所示的第三探针;
SEQ ID NO.18~19所示的第四引物对和SEQ ID NO.20所示的第四探针。
7.根据权利要求5所述的核酸试剂,其特征在于,所述TaqMan探针的5’端包含有荧光报告基团,所述TaqMan探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
8.一种用于检测乳腺癌的试剂盒,其特征在于,其包括权利要求1至7任一项所述的核酸试剂,还包括其他试剂;
所述其他试剂包括内参基因的检测引物对和探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、亚硫酸氢盐转化试剂、PCR反应试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
9.权利要求1至7任一项所述的核酸试剂或权利要求8所述的试剂盒在制备乳腺癌诊断产品中的用途,其特征在于,所述乳腺癌诊断产品包括体外血液甲基化检测试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的用途,其特征在于,所述乳腺癌包括早期乳腺癌,所述早期乳腺癌包括IA期乳腺癌、IB期乳腺癌、IIA期乳腺癌和IIB-T2期乳腺癌中的至少一种。
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