CN116904598A - 一种用于检测原发性肝癌的核酸组合、试剂、试剂盒及应用 - Google Patents

一种用于检测原发性肝癌的核酸组合、试剂、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种用于检测原发性肝癌的核酸组合、试剂、试剂盒及应用。本发明提供的核酸组合、试剂和试剂盒通过检测样本中多核苷酸分子的甲基化水平能够对原发性肝癌进行检测，其对组织、血浆样本均具有优异的检测效果，检测原发性肝癌血浆样本的灵敏度可达87.10％，检测转移性肝癌血浆样本的特异性可达80.77％，能够有效区分原发性肝癌血浆样本和转移性肝癌血浆样本。此外，上述多核苷酸分子在原发性肝癌单癌种的检测中具有较高的特异性，可以用作原发性肝癌特异性标志物，具有检测准确度高等优点。

Description

一种用于检测原发性肝癌的核酸组合、试剂、试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种用于检测原发性肝癌的核酸组合、试剂、试剂盒及应用。
背景技术
肝癌即肝脏恶性肿瘤，可分为原发性和转移性两大类。原发性肝脏恶性肿瘤起源于肝脏的上皮或间叶组织，前者称为原发性肝癌，是我国高发的，危害极大的恶性肿瘤；后者称为肉瘤，与原发性肝癌相比较较为少见。转移性或称继发性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵犯至肝脏。一般多见于胃、胆道、胰腺、结直肠、卵巢、子宫、肺、乳腺等器官恶性肿瘤的肝转移。从病因方面来说，原发性肝癌病人往往有乙型病毒性肝炎、肝硬化病史，而转移性肝癌多继发于体内其他部位，通过淋巴结转移、血行转移等方式转移至肝，此时患者的病情多已进展至晚。由于转移性肝癌和原发性肝癌在发病原因、检测特征及后续治疗等方面具有较大区别，临床诊断肝癌时及时区分原发性肝癌和转移性肝癌，直接关系后续治疗方案的制订。病理检查是鉴别原发性和转移性肝癌的金标准，但病理学检查属于有创检查。因此对于经过影像学检测已具有较明显肝脏占位的患者，有必要开发灵敏、特异的新型原发性肝癌生物标志物和检测技术，从而有效区分原发性肝癌和转移性肝癌、改善肝癌治疗效果、提高患者生存率。
已有一些现有技术公开了用于原发性肝癌检测的生物标志物一定程度上能够区分原发性肝癌患者、肝硬化患者和健康人，但是这些标志物是否是原发性肝癌特异性标志物尚不清楚，其诊断原发性肝癌血浆样本的灵敏度、及其诊断干扰样本和原发性肝癌阴性样本的特异性仍然有待验证。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供了一种用于检测原发性肝癌的核酸组合、试剂、试剂盒及应用，以解决现有技术缺少能够用于检测原发性肝癌的特异性生物标志物，对于原发性肝癌血浆样本检测易出现假阳性结果、准确度低、灵敏度低，以及无法有效区分原发性肝癌和转移性肝癌等的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种检测多核苷酸分子甲基化水平的试剂在制备原发性肝癌检测产品中的应用，所述多核苷酸分子选自如下(a)-(b)中至少一项：
(a)包括SEQ ID NO.1～4任一所示核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸分子；
(b)与(a)具有85％以上序列一致性的多核苷酸分子，其CpG位点与(a)保持一致。
优选地，所述多核苷酸分子选自如下任一组合：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的组合；SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.4的组合；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的组合。
本发明提供了一种用于检测原发性肝癌的核酸组合，所述核酸组合用于检测多核苷酸分子的甲基化水平，所述多核苷酸分子选自如下(a)-(b)中至少一项：
(a)包括SEQ ID NO.1～4任一所示核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸分子；
(b)与(a)具有85％以上序列一致性的多核苷酸分子，其CpG位点与(a)保持一致。
优选地，所述核酸组合用于检测如下任一组合的多核苷酸分子的甲基化水平：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的组合；SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.4的组合；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的组合。
优选地，所述核酸组合包括用于检测所述多核苷酸分子的甲基化水平的引物对，和/或检测探针。
优选地，所述引物对选自如下引物对中的至少一组：
用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的第一引物对、用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的第二引物对、用于检测SEQ ID NO.3区域内的甲基化水平的第三引物对、用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的第四引物对。
进一步优选地，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示；所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.12～13所示；所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.15～16所示；所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18～19所示。
优选地，所述检测探针选自如下检测探针中的至少一种：
用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.11所示；用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.14所示；用于检测SEQID NO.3区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.17所示；用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.20所示。
本发明还提供了一种用于检测原发性肝癌的试剂，其包括所述核酸组合。
本发明还提供了一种用于检测原发性肝癌的试剂盒，其包括所述核酸组合或所述试剂。
优选地，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂、质控品、内参基因的检测引物对、内参基因的检测探针中的一种或多种。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种用于检测原发性肝癌的核酸组合、试剂和试剂盒，通过检测样本中多核苷酸分子的甲基化水平可以对原发性肝癌进行诊断，具有良好的灵敏度和特异性。该试剂盒在组织、血浆样本中均具有优异检测效果，其检测原发性肝癌组织样本的灵敏度可达96.67％，检测转移性肝癌组织样本、癌旁正常组织样本的特异性可达74.65％、93.89％；其检测原发性肝癌血浆样本的灵敏度可达87.10％，检测转移性肝癌血浆样本特异性可达80.77％，能够有效区分原发性肝癌血浆样本和转移性肝癌血浆样本，为原发性肝癌的无创检测以及鉴别诊断提供了一种新的思路。
(2)本发明提供了能够用于原发性肝癌检测的多核苷酸分子，且这些多核苷酸分子仅在原发性肝癌中呈现高甲基化，在转移性肝癌癌种中整体处于低甲基化，说明本发明提供的多核苷酸分子在原发性肝癌单癌种的检测中具有较高的特异性，能够较好区分原发性肝癌与转移性肝癌癌种，能够用作原发性肝癌特异性标志物。本发明提供的试剂盒通过检测样本中原发性肝癌特异性标志物的甲基化水平，对原发性肝癌的检测具有较高的灵敏度和特异性，且检测准确度高，不易出现假阳性结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
术语“诊断”是指确定受试者的健康状态，涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下，术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态，“辅助诊断”用于在患者临床状态确定或验证过程中提供各种信息辅助判断，不作为唯一确定指标。一些实施例中，“检测”肝癌是指检测疾病的存在与否，即判断受试者是否患有肝癌。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“核苷酸序列互补”是指一一对应的碱基互补。例如人基因组中DNA序列包括正义链和与之对应互补的反义链，正义链和反义链具有本领域已知的含义，一般来说，反义链(负链，nonsense strand)为mRNA转录时结合的模板链，而非模板链存储mRNA的编码信息，为正义链(正链，sense strand)。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代笔定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100％，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
术语“原发性肝癌特异性标志物”是指多核苷酸分子在原发性肝癌中呈现高甲基化，在转移性肝癌癌种和健康人中处于低甲基化，即该生物标志物在原发性肝癌单癌种的检测中具有较高的特异性，能够较好区分原发性肝癌与转移性肝癌癌种、健康人。
原发性肝癌主要包括肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)和混合型肝细胞癌-胆管癌(combinedhepatocellular-cholangiocarcinoma，cHCC-CCA)3种病理学类型。本文中的“肝癌”仅指HCC。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本发明公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指上游引物和下游引物组成的组。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对，从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来，但是qMSP最终的检测指标为荧光信号，因此，在qMSP反应系统中，除加入甲基化检测引物以外，还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比，qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高，更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段，且该技术不需要凝胶电泳检测，操作更加简便。在本申请公开内容中，进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物，若Ct值满足所述要求(例如在组织样本中Ct≤38)，则表明目标序列是甲基化的。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
本发明提供了一种检测多核苷酸分子甲基化水平的试剂在制备原发性肝癌检测产品中的应用，上述多核苷酸分子选自如下(a)-(b)中至少一项：
(a)包括SEQ ID NO.1～4任一所示核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸分子；
(b)与(a)具有85％以上序列一致性的多核苷酸分子，其CpG位点与(a)保持一致。
一些实施例中，上述互补序列是与SEQ ID NO.1～4任一所示的核苷酸序列的每个碱基一一对应互补形成的核苷酸序列。
在本申请的一些实施例中，上述试剂所针对的是与SEQ ID NO.1～4任一所示的核苷酸序列、或其互补序列、或前述两者的部分连续区域有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的序列。较佳的实施例中，上述具有序列一致性的序列仍保持与SEQ ID NO.1～4任一所示的核苷酸序列、或其互补序列中的CpG二核苷酸位点不发生变化。
以GRCh38.p14为参考基因组，SEQ ID NO.1～4的信息如下表所示。
多核苷酸分子 染色体位置(GRCh38.p14)
SEQ ID NO.1 Chr2:221571423-221571602正链
SEQ ID NO.2 Chr2:221571427-221571601负链
SEQ ID NO.3 Chr8:105319488-105319665正链
SEQ ID NO.4 Chr8:105319416-105319589负链
一些实施例中，上述多核苷酸分子选自如SEQ ID NO.1～4任一所示的核苷酸序列中的一者或至少两者的组合。
一些实施例中，上述多核苷酸分子选自如下任一组合：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的组合；SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.4的组合；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的组合。
本发明提供了一种用于检测原发性肝癌的核酸组合，上述核酸组合用于检测多核苷酸分子的甲基化水平，上述多核苷酸分子选自如下(a)-(b)中至少一项：
(a)包括SEQ ID NO.1～4任一所示核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸分子；
(b)与(a)具有85％以上序列一致性的多核苷酸分子，其CpG位点与(a)保持一致。
一些实施例中，上述核酸组合用于检测如下任一组合的多核苷酸分子的甲基化水平：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的组合；SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.4的组合；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的组合。
可以理解的是，在检测上述多核苷酸分子的甲基化水平时，可以针对上述任一多核苷酸分子的全长区域进行检测，还可以针对上述任一多核苷酸分子的部分区域进行检测。
一些实施例中，上述核酸组合包括用于检测上述多核苷酸分子的甲基化水平的引物对，和/或检测探针。本申请中，上述引物对和上述检测探针没有特别的限定，本领域技术人员在确定上述核苷酸序列作为目标序列之后，可根据本领域已知的方法和工具设计特异性引物对，只要能够实现检测上述核苷酸序列是否发生甲基化的目的即可。
一些实施例中，上述引物对选自如下引物对中的至少一组：用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的第一引物对；用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的第二引物对；用于检测SEQ ID NO.3区域内的甲基化水平的第三引物对；用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的第四引物对。
较佳实施例中，上述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示；所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.12～13所示；所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.15～16所示；所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18～19所示。
需要说明的是，若一种引物对与上述引物对(第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对)所示的核苷酸序列具有至少具有85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)等以上的序列一致性，且该引物对同样具有一定的原发性肝癌诊断功能(特异性或灵敏度与本申请引物对相比，相当或略有下降或略有提高或大幅提高等)，也在本发明的保护范围内。
一些实施例中，上述检测探针选自如下检测探针中的至少一种：用于检测SEQ IDNO.1区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.11所示；用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.14所示；用于检测SEQ ID NO.3区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.17所示；用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.20所示。可以理解的是，当进行甲基化特异性荧光定量PCR时，检测探针的核苷酸序列不限于上述，还可以根据上述多核苷酸分子进行设计。
一些实施例中，上述核酸组合检测样本中多核苷酸分子的甲基化水平的方法包括但不限于甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP-PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)、甲基化特异性PCR(qMSP)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、基于限制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、亚硫酸氢盐测序、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP-seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD-PCR)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)或甲基化DNA免疫沉淀-微阵列分析(MeDIP-chip)、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法和基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。
本发明还提供了一种用于检测原发性肝癌的试剂，其包括上述核酸组合。
本发明还提供了一种用于检测原发性肝癌的试剂盒，其包括上述核酸组合或上述试剂。
一些实施例中，上述试剂盒还包括核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂、质控品、内参基因的检测引物对、内参基因的检测探针中的一种或多种。
一些实施例中，上述甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，但不会影响甲基化胞嘧啶残基。一些实施例中，上述甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐转化试剂。用亚硫酸氢盐转化试剂处理后，DNA中残留的唯一一种胞嘧啶是甲基化胞嘧啶。一些实施例中，上述PCR反应试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。
一些实施例中，上述内参基因的检测引物对是针对ACTB基因设计的检测引物对。在一个可选地具体示例中，ACTB基因的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21～22所示。可以理解的是，在其他实施例中，还可以选择其他基因作为内参基因，此时，内参基因的检测引物对对应设计即可。
一些实施例中，本发明所用检测探针为荧光探针，可选地，检测探针为TaqMan探针。具体地，上述多核苷酸分子的检测探针和上述内参基因的检测探针均含有荧光基因，其中，荧光基因包括荧光报告基因和荧光淬灭基因。可选地，荧光报告基团位于检测探针的5’端，淬灭基团位于检测探针的3’端。可选地，荧光报告基团选自FAM、ROX、CY5、VIC、TET、JOE和HEX中的一种或多种，荧光淬灭基团选自MGB、BHQ1、BHQ-2和BHQ-3中的一种或多种。在同一个反应体系中有两种以上的检测探针时，不同检测探针上连接的荧光基团不同。可以理解的是，检测探针的荧光基团不限于上述，还可以是其他荧光基团。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒的检测样本包括不限于血浆样本、血清样本、组织样本或口腔、鼻咽等拭子来源的细胞样本。
本发明提供的标志物和肝癌检测产品尤其适合于肝癌的鉴别诊断，包括根据现有的肝癌诊疗指南或诊疗标准已经确诊肝癌的患者，用于鉴别其所患肝癌是原发性肝癌或转移性肝癌，为进一步的临床治疗方案提供参考。例如，根据《中国肿瘤整合诊治指南-肝癌2022版》(Chin J Clin Oncol 2022.Vol.49.No.17)，≤2cm结节且至少两种影像学检查有肝癌的典型表现(MRI/CT/CEUS/EOB-MRI)，或者结节＞2cm且具有至少一种影像学检查有肝癌典型表现，或者无结节但AFP阳性，且至少一种影像学检查有肝癌典型表现。
基于本发明公开的内容，本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述样本中多核苷酸分子的甲基化水平进行检测，对原发性肝癌进行诊断，无论采用何种技术，其都是属于本发明的保护范围。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。
本申请所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。
实施例1检测引物对和检测探针设计
以GRCh38.p14为参考基因组，以Chr2:221571423-221571602正链(区域1、SEQ IDNO.1)、Chr2:221571427-221571601负链(区域2、SEQ ID NO.2)、Chr8:105319488-105319665正链(区域3、SEQ ID NO.3)、Chr8:105319416-105319589负链(区域4、SEQ IDNO.4)为目标区域，以目标区域1～4经亚硫酸氢盐转化后的序列为模板，设计检测引物对和检测探针。目标区域的DNA序列及经亚硫酸氢盐转化后的序列如表1所示，用以扩增不同目标区域的检测引物对、检测探针的序列如表2所示。具体实验步骤包括：
1)样本DNA的提取：
组织样本：使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)从原发性肝癌、转移性肝癌和癌旁肝组织中提取基因组DNA。在DNA提取之前，通过组织病理学评估确认了原发性肝癌组织样本、转移性肝癌组织样本中存在肿瘤细胞，癌旁肝组织样本中未发现肿瘤细胞。
血浆样本：收集抗凝血样本，离心后取上层血浆，用于提取血浆游离DNA。使用QIAamp Circulating Nucleic Acid kit(Qiagen，Valencia，CA，USA)从5mL血浆中提取cfDNA。DNA用Nanodrop 2000超微量分光光度计(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)定量。
2)样本DNA的转化及纯化：
将DNA在98℃下孵育10mim，然后在64℃下用亚硫酸氢钠处理1h；然后将亚硫酸氢盐处理过的DNA添加到Biocomma柱(Biocomma，中国)上，再加入结合液，13000g离心30s后弃上清；在室温下洗涤DNA1次后加入脱硫剂，脱硫15min后离心；洗涤DNA 2次后用40μL TE缓冲液洗脱。洗脱后的DNA立即用于实时荧光定量PCR分析，或保存在-20℃下以供进一步使用。
表1区域1～4的DNA序列及经亚硫酸氢盐转化后的序列
表2检测引物对、检测探针的核苷酸序列
实施例2检测所选区域在原发性肝癌中的特异性
下载TCGA-LIHC甲基化450k芯片数据，保留样本类型为primary和normal，针对上述区域1～4的检测探针，分别计算区域1～4在原发性肝癌和转移性肝癌(共270例血液样本)上的平均甲基化β值，其中原发性肝癌为肝细胞癌(LIHC)，转移性肝癌为结肠癌(COAD)、胰腺腺癌(PAAD)、胃腺癌(STAD)、胆管癌(CHOL)。对于检测探针在不同样本上出现甲基化值为NA的，使用k最近邻算法进行填补(R软件包‘bnstruct’)。取平均甲基化β值(450k芯片数据转化之后生成的一个衡量甲基化程度的值)0.3作为阈值，若目标区域在某个癌症上的平均甲基化β值<0.3，则该目标区域在该癌症上是低甲基化的。区域1～4的检测探针在原发性肝癌和转移性肝癌中的平均甲基化β值如表3所示。
表3区域1～4的检测探针在原发性肝癌和转移性肝癌中的平均甲基化β值
表3中，区域1～4的检测探针在原发性肝癌中的平均甲基化β值均大于0.4，其中区域4的平均甲基化β值高达0.54，区域1～4的检测探针在转移性肝癌中的平均甲基化β值均小于0.3，实验结果表明区域1～4在原发性肝癌中整体呈现高甲基化，在转移性肝癌中整体处于低甲基化。可以看出，区域1～4在原发性肝癌和转移性肝癌中呈现不同的甲基化水平，可以用作原发性肝癌特异性标志物。
实施例3甲基化特异性荧光定量法(qMSP)检测甲基化水平
以GRCh38.p14为参考基因组，以上述4个目标区域中的正/负链DNA分子为模板设计适用于荧光定量PCR扩增的检测引物对和检测探针。
具体的实验步骤包括：
1)DNA样本的提取、转化和纯化同实施例1。
2)甲基化特异性荧光定量PCR
检测引物对和检测探针设计同实施例1。
qPCR扩增：
在对样本进行qMSP分析之前，需验证检测引物对的扩增性能。具体地，准备102拷贝/μL、103拷贝/μL、104拷贝/μL、105拷贝/μL、106拷贝/μL含亚硫酸氢盐转化后的各个序列的质粒，以及按上述梯度稀释的含转化后的内参基因ACTB质粒。内参基因ACTB的检测引物对的上游引物为：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.21)，内参基因ACTB的检测引物对的下游引物为：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.22)，内参基因ACTB的检测探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ ID NO.23)被扩增以构建标准曲线。
表4qMSP反应体系
组分 规格 体积(μL)
Platinum IIPCR缓冲液 5× 5
每一目标区域的上游引物 10μM 分别添加0.5
每一目标区域的下游引物 10μM 分别添加0.5
每一目标区域的检测探针 10μM 分别添加0.5
ACTB的上游引物 10μM 0.5
ACTB的下游引物 10μM 0.5
ACTB的检测探针 10μM 0.5
PlatinumTM II Taq Hot-Start DNA Polymerase / 0.5
待测样本DNA / 5
纯化水 / 补至25
qMSP反应体系如表4所示，在每个反应孔板中同时测试阴性对照和阳性对照。阴性对照管的DNA模板为TE缓冲液。阳性对照管的DNA模板的制备方法为：将ACTB基因扩增区域对应的经亚硫酸氢盐完全转化后的序列进行人工合成，并克隆至载体上，形成人工合成质粒；将经亚硫酸氢盐完全转化后的序列进行人工合成，并分别克隆至载体，形成人工合成质粒。若只检测单一区域的甲基化水平，阳性对照DNA模板为103拷贝/微升的含转化后ACTB的人工合成质粒、103拷贝/微升的含检测区域的人工合成质粒，二者1:1混合而成；若检测区域组合的甲基化水平，则阳性对照DNA模板为103拷贝/微升的含转化后ACTB的人工合成质粒、含各目标区域的人工合成质粒分别为103拷贝/微升，等体积混合。检测探针均为TaqMan探针，单区域检测探针5’端的荧光报告基团分别为ROX，双区域的检测探针5’端的荧光报告基团为ROX、FAM；3’端的荧光淬灭基团均为MGB，ACTB基因的检测探针5’端的荧光报告基团为VIC，3’端的荧光淬灭基团为BHQ-1。qPCR在ABI 7500仪器上进行，扩增条件如下：95℃10min，然后95℃15s和60℃30s共45个循环。
Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1～2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，可以得到样本各个基因的Ct值。
质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照各基因的Ct值应在26～30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35，若阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，则表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
实施例4qMSP法检测待测样本中单个目标区域及双区域组合的甲基化水平诊断原发性肝癌组织样本的性能
1)样本收集
共收集了60例经病理检测确诊为原发性肝癌患者的癌组织样本，收集71例经病理检测确诊为转移性肝癌患者(包括胃癌转移性肝癌30例，结肠癌转移性肝癌21例，胆囊癌转移性肝癌16例，胰腺癌转移性肝癌4例)的癌组织样本，以及上述癌症样本对应的癌旁正常组织样本共131例。所有的样本均为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织样本。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2)组织样本DNA的提取、转化和纯化同实施例1。
3)qMSP结果分析
利用甲基化荧光定量PCR检测的方法同实施例3。根据各个目的区域检测的Ct值来判断待测样本的甲基化水平。对于组织样本，若扩增某一区域的Ct值≤38，则认为该样本中此区域为甲基化阳性；若扩增某一区域的Ct值＞38，则认为该样本中此区域为甲基化阴性。在检测单一目标区域时，若待测样本在该区域为甲基化阳性，则该样本为原发性肝癌阳性样本，若待测样本在该区域为甲基化阴性，则该样本为原发性肝癌阴性样本。在检测目标区域组合时，若待测样本中目标区域组合中任意一个区域为甲基化阳性，则该样本为原发性肝癌阳性样本，仅当待测样本中目标区域组合中的两个区域都为甲基化阴性，则该样本为原发性肝癌阴性样本。
通过检测区域1～区域4的甲基化水平诊断原发性肝癌组织样本的灵敏度、诊断转移性肝癌组织样本、癌旁组织样本的特异性如表5所示。通过检测区域1、2分别与区域3、4组合的甲基化水平诊断原发性肝癌组织样本的灵敏度、诊断转移性肝癌组织样本、癌旁组织样本的特异性如表6所示。
表5检测区域1～4在组织样本中的甲基化状态及检测灵敏度和特异性
表6检测双区域组合在组织样本中的甲基化状态及检测灵敏度和特异性
由表5可以看出，通过qMSP法检测组织样本中目标区域1～4的甲基化水平，可有效区分原发性肝癌患者、转移性肝癌患者和健康人。目标区域1～4单区域检测原发性肝癌患者组织样本的灵敏度范围为86.67％～91.67％，检测转移性肝癌患者组织样本的特异性范围为69.01％～73.24％，检测癌旁正常组织样本的特异性范围为89.31％～93.89％。具体地，区域3检测原发性肝癌患者组织样本的灵敏度为90.00％，检测转移性肝癌患者组织样本的特异性可达73.24％，检测癌旁正常组织样本的特异性可达92.37％。
由表6可以看出，双区域组合进行原发性肝癌组织样本检测时，诊断原发性肝癌的灵敏度为91.67％～96.67％，相比于单区域检测展现出一定程度提升；检测转移性肝癌的特异性在64.79％～74.65％之间；检测癌旁正常组织样本的特异性在87.02％～89.31％之间，处于较高水平。总体来说，双区域组合对于检测原发性肝癌的总体效果相比单区域有一定程度的优化。区域1、区域3作为单区域检测转移性肝癌组织样本、癌旁正常组织样本特异性较高的区域，将区域1和区域3组合检测，发现其检测(组合C)转移性肝癌组织样本、癌旁正常组织样本的特异性仍高于其他组合，其检测原发性肝癌组织样本的灵敏度可达95％，处于较高水平。意外的是，区域1、区域4作为单区域检测原发性肝癌组织样本灵敏度较低的区域，其组合检测(组合D)原发性肝癌组织样本的灵敏度高达96.67％，高于其他组合。
实施例5qMSP法检测待测样本中双区域组合的甲基化水平诊断原发性肝癌血液样本的性能
1)样本收集
共有62名原发性肝癌参与者、52名转移性肝癌参与者(包括胃癌转移性肝癌19例，结肠癌转移性肝癌12例，胆囊癌转移性肝癌11例，胰腺癌转移性肝癌11例)。所有人类样本和临床数据的收集均符合《赫尔辛基宣言》原则，所有参与者均签署书面知情同意书以供其血浆样本使用。血液样本为在所有参与者入组前通过静脉采血采集10mL血液样本。
2)血浆样本DNA的提取、转化和纯化同实施例3。
3)qMSP结果分析
利用甲基化荧光定量PCR检测的方法同实施例1。根据各个目的区域检测的Ct值来判断待测样本的甲基化水平。对于血浆样本，若扩增某一区域的Ct值≤45，则认为该样本中此区域为甲基化阳性，若扩增某一区域的Ct值＞45，则认为该样本中此区域为甲基化阴性。在检测单一区域时，若待测样本在该区域为甲基化阳性，则该样本为癌症阳性样本，若待测样本在该区域为甲基化阴性，则该样本为癌症阴性样本。在检测组合物时，若待测样本在组合物中至少一个区域为甲基化阳性，则该样本为癌症阳性样本，仅当待测样本在构成组合物的两个区域都为甲基化阴性，则该样本为癌症阴性样本。
由实施例2可知，检测双区域组合的甲基化水平诊断原发性肝癌样本的效果较检测单一区域有较明显的提高，所以在血浆样本的检测中，仅展示检测区域1、2分别与区域3、4组合的甲基化水平诊断原发性肝癌血浆样本的灵敏度、诊断转移性肝癌血浆样本、非肝癌血浆样本的特异性，如表7所示。
表7检测双区域组合在血浆样本中的甲基化状态及检测灵敏度和特异性
表7中，双区域组合检测原发性肝癌血浆样本的灵敏度为80.65％～87.10％，检测转移性肝癌血浆样本的特异性在71.16％～80.77％之间。在上述组合中，区域1+区域3检测的效果优于其它双区域组合，其检测原发性肝癌血浆样本的灵敏度高达87.10％，区域1+区域4次之，均大于85％。
综上，在组织样本、血浆样本中，区域1～4可以作为原发性肝癌特异性生物标志物，通过检测区域1～4的甲基化水平能够有效区分原发性肝癌患者和转移性肝癌患者。当进行区域组合检测时，区域1+区域3、区域1+区域4检测原发性肝癌组织样本、原发性肝癌血浆样本的灵敏度均处于较高水平。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测多核苷酸分子甲基化水平的试剂在制备原发性肝癌检测产品中的应用，其特征在于，所述多核苷酸分子选自如下(a)-(b)中至少一项：
(a)包括SEQ ID NO.1～4任一所示核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸分子；
(b)与(a)具有85％以上序列一致性的多核苷酸分子，其CpG位点与(a)保持一致。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多核苷酸分子选自如下任一组合：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4的组合；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的组合。
3.一种用于检测原发性肝癌的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合用于检测多核苷酸分子的甲基化水平，所述多核苷酸分子选自如下(a)-(b)中至少一项：
(a)包括SEQ ID NO.1～4任一所示核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸分子；
(b)与(a)具有85％以上序列一致性的多核苷酸分子，其CpG位点与(a)保持一致。
4.根据权利要求3所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合用于检测如下任一组合的多核苷酸分子的甲基化水平：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4的组合；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的组合。
5.根据权利要求3或4所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括用于检测所述多核苷酸分子的甲基化水平的引物对，和/或检测探针。
6.根据权利要求5所述的核酸组合，其特征在于，所述引物对选自如下引物对中至少一组：
用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的第一引物对、用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的第二引物对、用于检测SEQ ID NO.3区域内的甲基化水平的第三引物对、用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的第四引物对；
所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示；所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.12～13所示；所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15～16所示；所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18～19所示。
7.根据权利要求5所述的核酸组合，其特征在于，所述检测探针选自如下检测探针中的至少一种：
用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.11所示；用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.14所示；用于检测SEQ IDNO.3区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.17所示；用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.20所示。
8.一种用于检测原发性肝癌的试剂，其特征在于，其包括权利要求3至7任一项所述的核酸组合。
9.一种用于检测原发性肝癌的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求3至7任一项所述的核酸组合或权利要求8所述的试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂、质控品、内参基因的检测引物对、内参基因的检测探针中的一种或多种。
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