CN116479129A - 一种肝癌检测的核酸组合、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种肝癌检测的核酸组合、试剂盒及应用。本发明提供的核酸组合和试剂盒通过检测样本中目标区域的甲基化水平，可以对肝癌进行检测或诊断，其中检测肝癌血液样本的灵敏度可达90.9％，检测健康人血液样本的特异性可达91.3％。此外，上述目标区域在肝癌单癌种的检测中具有较高的特异性，能够较好区分肝癌与其他高发癌种，可以用作肝癌特异性标志物。本发明提供的核酸组合和试剂盒对肝癌的检测不仅具有较高的灵敏度和特异性，且检测的准确度高，不易出现假阳性结果。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种肝癌检测的核酸组合、试剂盒及应用。
背景技术
肝癌是我国常见的恶性肿瘤疾病之一，死亡率位居恶性肿瘤第二位。好发于中年男性，肝癌早期一般没有症状或者症状不典型，当患者感受到明显不适或临床症状非常明显的时候，病情大多进入中晚期，而晚期肝癌治疗并不理想，生存时间往往只有半年到一年半。因此建立肝癌预警和早期筛查的方法，对肝癌的防治非常重要，早发现、早诊断、早治疗、早手术是防控肝癌的有效手段。
目前肝癌的诊断技术有：
1)甲胎蛋白检测：一般在原发性肝癌当中表现出升高，但肝炎病变或者其他的肿瘤的发生也有可能导致其升高，特异性不高；
2)影像学技术：MRI检查、B超检查、CT检查，但对较小的肿瘤不够灵敏，无法进行明确诊断；
3)肝穿刺活检：在超声或CT引导下的肝穿刺活检是目前确诊肝癌最可靠的方法，但该方法属于有创性检查，还存在一定的假阴性率，对需要长期跟踪观察的患者，会造成身体不适，且经济负担较重。
癌症患者血液中的循环游离DNA(cfDNA)含量高于健康个体的血液样本，肿瘤来源的cfDNA，称为循环肿瘤DNA(ctDNA)，ctDNA中含有肿瘤特异性的遗传改变和表观遗传学改变，可以用作癌症检测的标志物。由于血液中的ctDNA来源于全身各个组织，很多标志物在多种类型的癌症中均会出现甲基化异常，这可能导致癌症检测结果假阳性，因此有必要开发灵敏、具有肝癌特异性的新型肝癌标志物和检测技术，提高肝癌早癌检出率、改善肝癌治疗效果、降低肝癌死亡率。
现有技术CN114164275A公开的一些用于肝癌检测的血液标志物一定程度上能够区分肝癌患者或非肝癌受试者，但是这些标志物是否是肝癌特异性标志物尚不清楚，其诊断肝癌的灵敏度、及其诊断干扰样本和肝癌阴性样本的特异性仍然有待验证。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供了一种肝癌检测的核酸组合、试剂盒及应用，以解决现有技术缺少能够用于肝癌检测的肝癌特异性标志物，对于肝癌检测易出现假阳性结果、准确度低等的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种肝癌检测的核酸组合，所述核酸组合用于检测样本中目标区域的甲基化水平，其中，所述目标区域选自如下至少一种区域的全长或部分区域：区域Ⅰ、区域Ⅱ、区域Ⅲ和区域Ⅳ；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述区域Ⅰ选自Chr1:115839038-115839352，所述区域Ⅱ选自Chr1:154567661-154567844，所述区域Ⅲ选自Chr1:155194367-155194548，所述区域Ⅳ选自Chr1:171251741-171251928。
优选地，所述目标区域选自如SEQ ID NO.1-5所示核苷酸序列中的至少一个。
进一步优选地，所述目标区域选自如下任一组合：
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5中的任一者与SEQ ID NO.2的组合；
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5中的任一者与SEQ ID NO.3的组合；
SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.4的组合；
SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.5的组合；
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.2的组合；
SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.2的组合；
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.3的组合。
优选地，所述核酸组合包括用于检测所述目标区域的甲基化水平的引物对，所述核酸组合选自如下引物对中的至少一种：
用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的第一引物对、用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的第二引物对、用于检测SEQ ID NO.3区域内的甲基化水平的第三引物对、用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的第四引物对、用于检测SEQ ID NO.5区域内的甲基化水平的第五引物对。
进一步优选地，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～12所示；所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.14～15所示；所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.17～18所示；所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.20～21所示；所述第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.23～24所示。
优选地，所述核酸组合还包括与所述引物对对应的检测探针，所述核酸组合选自如下检测探针中的至少一种：
用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.13所示；用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.16所示；用于检测SEQID NO.3区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.19所示；用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.22所示；用于检测SEQ ID NO.5区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.25所示。
进一步优选地，所述检测探针的5’端含有荧光报告基因，3’端含有荧光淬灭基团。
本发明还提供了一种肝癌检测的试剂盒，包括所述的核酸组合。
优选地，还包括核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂和质控品中的一种或多种。
本发明还提供了所述的核酸组合或所述的试剂盒在制备肝癌诊断产品中的应用。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种肝癌检测的核酸组合和试剂盒，通过检测样本中目标区域的甲基化水平可以对肝癌进行检测或诊断，具有良好的灵敏度和特异性。该试剂盒在血液样本中仍具有优异检测效果，为肝癌的无创检测以及早期筛查提供了一种新的思路。本发明提供的试剂盒检测肝癌患者血液样本的灵敏度可达90.9％，检测健康人血液样本的特异性可达91.3％。
(2)本发明提供了一些能够用于肝癌检测的生物标志物，且这些生物标志物仅在肝癌中呈现高甲基化，在其它常见癌种中几乎整体处于低甲基化，说明本发明提供的生物标志物在肝癌单癌种的检测中具有较高的特异性，能够较好区分肝癌与其他高发癌种，可以用作肝癌特异性标志物。本发明提供的试剂盒通过检测样本中肝癌特异性标志物的甲基化水平，对肝癌的检测具有较高的灵敏度和特异性，且肝癌检测的准确度高，不易出现假阳性结果。
附图说明
图1为区域1～5单区域诊断肝癌血液样本的ROC曲线，内容(a)为区域1诊断肝癌血液样本的ROC曲线，内容(b)为区域2诊断肝癌血液样本的ROC曲线，内容(c)为区域3诊断肝癌血液样本的ROC曲线，内容(d)为区域4诊断肝癌血液样本的ROC曲线，内容(e)为区域5诊断肝癌血液样本的ROC曲线。
图2为组合1(区域1+2)诊断肝癌血液样本的ROC曲线。
图3为组合2(区域1+3)诊断肝癌血液样本的ROC曲线。
图4为组合3(区域1+4)诊断肝癌血液样本的ROC曲线。
图5为组合4(区域1+5)诊断肝癌血液样本的ROC曲线。
图6为组合5(区域2+3)诊断肝癌血液样本的ROC曲线。
图7为组合6(区域2+4)诊断肝癌血液样本的ROC曲线。
图8为组合7(区域2+5)诊断肝癌血液样本的ROC曲线。
图9为组合8(区域3+4)诊断肝癌血液样本的ROC曲线。
图10为组合9(区域3+5)诊断肝癌血液样本的ROC曲线。
图11为组合10(区域4+5)诊断肝癌血液样本的ROC曲线。
图12为组合11(区域1+3+4)诊断肝癌血液样本的ROC曲线。
图13为组合12(区域1+2+5)诊断肝癌血液样本的ROC曲线。
图14为组合13(区域2+3+5)诊断肝癌血液样本的ROC曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
术语“诊断”是指确定受试者的健康状态，涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下，术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态，“辅助诊断”用于在患者临床状态确定或验证过程中提供各种信息辅助判断，不作为唯一确定指标。一些实施例中，“检测”肝癌是指检测疾病的存在与否，即判断受试者是否患有肝癌。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代笔定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100％，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
术语“生物标志物”是指一种可在样品中检测到的指示物。生物标志物可用作个体应答或受益于治疗的可能性的指示物和/或用作以某些分子、病理学、组织学和/或临床表现为特征的疾病或疾患(例如，癌症)特定亚型的指示物。在一些实施例中，生物标记物为基因。生物标志物包括但不限于多核苷酸(例如DNA和/或RNA)、多核苷酸拷贝数改变(例如，DNA拷贝数)、多肽、多肽和多核苷酸修饰(例如，翻译后修饰)、碳水化合物和/或基于糖脂的分子标记。
术语“肝癌特异性标志物”是指生物标志物在肝癌中呈现高甲基化，在其它高发癌种和健康人中处于低甲基化，即该生物标志物在肝癌单癌种的检测中具有较高的特异性，能够较好区分肝癌与其他高发癌种、健康人。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本发明公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指上游引物和下游引物组成的组。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对，从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来，但是qMSP最终的检测指标为荧光信号，因此，在qMSP反应系统中，除加入甲基化检测引物以外，还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比，qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高，更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段，且该技术不需要凝胶电泳检测，操作更加简便。在本申请公开内容中，进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物，若Ct值满足所述要求(例如在组织样本中Ct≤35)，则表明目标序列是甲基化的。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
术语“AUC”是“曲线下面积”的缩写。具体地，是指接受者操作特征(ROC)曲线下面积。ROC曲线是诊断测试的不同可能切割点的真阳性率相比于假阳性率的图。其取决于所选择切割点的灵敏度与特异性之间的权衡(灵敏度的任何增加将伴随着特异性的降低)。ROC曲线下面积(AUC)是诊断测试准确度的度量(面积越大越好；最佳值是1；随机测试将具有位于对角线上的ROC曲线，面积为0.5)。
本发明提供了一种肝癌检测的核酸组合，所述核酸组合用于检测样本中目标区域的甲基化水平，其中，所述目标区域选自如下至少一种区域的全长或部分区域：区域Ⅰ、区域Ⅱ、区域Ⅲ和区域Ⅳ；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述区域Ⅰ选自Chr1:115839038-115839352，所述区域Ⅱ选自Chr1:154567661-154567844，所述区域Ⅲ选自Chr1:155194367-155194548，所述区域Ⅳ选自Chr1:171251741-171251928。
一些实施例中，所述区域Ⅰ的部分区域选自区域1或区域2，其中所述区域1选自Chr1:115839038-115839225正链，所述区域2选自Chr1:115839144-115839352正链。
以GRCh38.p14为参考基因组，所述目标区域选自如下至少一个区域：区域1、区域2、区域3、区域4和区域5；
以GRCh38.p14为参考基因组，区域1～5的信息如下表所示。
| 目标区域 | 染色体位置(GRCh38.p14) | 核苷酸序列 |
| 区域1 | Chr1:115839038-115839225正链 | SEQ ID NO.1 |
| 区域2 | Chr1:115839144-115839352正链 | SEQ ID NO.2 |
| 区域3 | Chr1:154567661-154567844负链 | SEQ ID NO.3 |
| 区域4 | Chr1:155194367-155194548正链 | SEQ ID NO.4 |
| 区域5 | Chr1:171251741-171251928正链 | SEQ ID NO.5 |
发明人发现：区域1～5均能对肝癌样本和正常样本实现较好区分，进一步实验发现，将本发明中所述区域进行组合，检测区域组合的甲基化水平时，一些区域组合检测肝癌样本的灵敏度和特异性相对于单一区域进行检测时有所提高。
较佳的目标区域选自如下任一组合：区域1、区域3或区域5中的任一区域与区域2的组合；区域1、区域4或区域5中的任一区域与区域3的组合；区域1或区域2与区域4的组合；区域1或区域4与区域5的组合；区域1和区域5与区域2的组合；区域3和区域5与区域2的组合；区域1和区域4与区域3的组合。
一些实施例中，较佳的目标区域选自如下任一组合：
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5中的任一者与SEQ ID NO.2的组合；
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5中的任一者与SEQ ID NO.3的组合；
SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.4的组合；
SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.5的组合；
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.2的组合；
SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.2的组合；
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.3的组合。
可以理解的是，在检测目标区域的甲基化水平时，可以针对上述任一目标区域的全区域进行检测，还可以针对上述任一目标区域的部分区域进行检测。
一些实施例中，上述目标区域来源于ctDNA。ctDNA是一类来源于凋亡或坏死的肿瘤细胞并释放入血的血浆游离DNA(cfDNA)，其包含多种肿瘤特异性的信息：如肿瘤基因的突变及拷贝数变化，肿瘤DNA的甲基化改变的信息等。在一些实施例中，上述目标区域来自cfDNA。
一些实施例中，上述核酸组合包括用于检测所述目标区域的甲基化水平的引物对。本申请中，上述引物对没有特别的限定，本领域技术人员在确定上述核苷酸序列作为目标序列之后，可根据本领域已知的方法和工具设计特异性引物对，只要可以实现检测上述核苷酸序列是否发生甲基化的目的即可。
可选地，上述核酸组合包括如下引物对中的至少一组：用于检测Chr1:115839038-115839225正链区域内的甲基化水平的第一引物对、用于检测Chr1:115839144-115839352正链区域内的甲基化水平的第二引物对、用于检测Chr1:154567661-154567844负链区域内的甲基化水平的第三引物对、用于检测Chr1:155194367-155194548正链区域内的甲基化水平的第四引物对和用于检测Chr1:171251741-171251928正链区域内的甲基化水平的第五引物对。
可选地，上述核酸组合包括如下引物对中的至少一组：用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的第一引物对、用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的第二引物对、用于检测SEQ ID NO.3区域内的甲基化水平的第三引物对、用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的第四引物对、用于检测SEQ ID NO.5区域内的甲基化水平的第五引物对。
可选地，第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～12所示；第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.14～15所示；第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.17～18所示；第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.20～21所示；第五引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.23～24所示。
需要说明的是，若一种引物对与上述引物对(第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对)所示的核苷酸序列具有至少具有85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)等以上的序列一致性，且该引物对同样具有一定的肝癌诊断功能(特异性或灵敏度与本申请引物对相比，相当或略有下降或略有提高或大幅提高等)，也在本发明的保护范围内。
一些实施例中，上述核酸组合还包括与检测引物对对应的检测探针，可选地，上述核酸组合选自如下检测探针中的至少一种：用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.13所示；用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.16所示；用于检测SEQ ID NO.3区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ IDNO.19所示；用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.22所示；用于检测SEQ ID NO.5区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.25所示。可以理解的是，当进行甲基化特异性荧光定量PCR时，检测探针的核苷酸序列不限于上述，还可以根据上述目标区域进行设计。
在一些实施例中，上述核酸组合还包括内参引物对和与内参引物对对应的检测探针。可选地，内参引物对是针对ACTB基因设计的检测引物对。在一个可选地具体示例中，ACTB基因的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.26～27所示。可以理解的是，在其他实施例中，还可以选择其他基因作为内参基因，此时，内参引物对对应设计即可。
一些实施例中，本发明所用检测探针为荧光探针，可选地，检测探针为TaqMan探针。具体地，上述目标区域的检测探针和上述内参引物对对应的检测探针均含有荧光基因，其中，荧光基因包括荧光报告基因和荧光淬灭基因。可选地，荧光报告基团位于检测探针的5’端，淬灭基团位于检测探针的3’端。可选地，荧光报告基团选自FAM、ROX、CY5、VIC、TET、JOE和HEX中的一种或多种，荧光淬灭基团选自MGB、BHQ1、BHQ-2和BHQ-3中的一种或多种。在同一个反应体系中有两种以上的检测探针时，不同检测探针上连接的荧光基团不同。可以理解的是，检测探针的荧光基团不限于上述，还可以是其他荧光基团。
一些实施例中，上述核酸组合可以通过如下至少一种的方法检测样本中目标区域的甲基化水平：甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。
本发明还提供了一种肝癌检测的试剂盒，该试剂盒包括上述用于检测样本中目标区域的甲基化水平的核酸组合。
一些实施例中，上述试剂盒还包括核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂和质控品中的一种或多种。甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。一些实施例中，甲基化转化试剂为亚硫酸盐转化试剂或酶法转化试剂。
一些实施例中，PCR反应试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。一些实施例中，质控品包括阳性参考品和阴性参考品。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒的检测样本包括不限于血浆样本、血清样本、组织样本或口腔、鼻咽等拭子来源的细胞样本。
本发明还提供了一种通过检测样本中目标区域的甲基化水平来诊断肝癌的方法，包括如下步骤：提取受试者的血液样本DNA并用亚硫酸氢盐转化处理，以经转化和纯化的DNA为模板，加入用于检测肝癌的目标区域的甲基化水平的引物对和与引物对对应的检测探针，以及试剂盒其他组分，进行qPCR反应，获得样本中扩增目标区域的Ct值，计算样本中扩增目标区域的Ct值与扩增内参基因的Ct值的差值(ΔCt)，将ΔCt与截断值进行比较，进而判断待测样本是否为肝癌阳性样本(若ΔCt值大于截断值，则该样本为肝癌阴性样本，若ΔCt小于等于截断值，则该样本为肝癌阳性样本)。
可以理解的是，在其他实施例中，上述试剂盒检测样本中目标区域的甲基化水平的方法不限于上述qMSP法，还可以是其他方法。例如亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组亚硫酸氢盐测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法或甲基化敏感性限制性内切酶法。
基于本发明公开的内容，本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述样本中目标区域的甲基化水平进行检测，对肝癌进行诊断，无论采用何种技术，其都是属于本发明的保护范围。
本发明还提供了上述的核酸组成或试剂盒在制备肝癌诊断产品中的应用。肝癌诊断产品可以为试剂、试剂盒、芯片和测序文库等中的一种或多种。可选地，所述试剂可以是冻干粉状、溶液、悬浮液、乳液等产品形态。可选地，所述芯片可以是但不限于甲基化芯片，所述甲基化芯片具有与甲基化区域特异性结合的探针。
本发明提供了一些能够用于检测肝癌的生物标志物，且上述生物标志物仅在肝癌中呈现高甲基化，在其它常见癌种中几乎整体处于低甲基化，说明上述生物标志物在肝癌单癌种的检测中具有较高的特异性，能够较好区分肝癌与其他高发癌种，可以用作肝癌特异性标志物。本发明提供的试剂盒通过检测样本中肝癌特异性标志物的甲基化水平，能够对肝癌进行较高的灵敏度和特异性检测，并且肝癌检测的准确度高，不易出现假阳性结果。具体地，本发明提供的试剂盒检测肝癌患者血液样本的灵敏度可达90.9％，检测健康人血液样本的特异性可达91.3％。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。
本申请所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。
实施例1甲基化引物对和检测探针设计
在实施例1中，发明人以Chr1:115839038-115839225(区域1)、Chr1:115839144-115839352正链(区域2)、Chr1:154567661-154567844负链(区域3)、Chr1:155194367-155194548正链(区域4)、Chr1:171251741-171251928正链(区域5)所示区域作为目标区域，分别以区域1～5经亚硫酸氢盐转化后的序列为模板，设计甲基化引物对和检测探针。目标区域的DNA序列及经亚硫酸氢盐转化后的序列如表1所示，用以扩增不同目标区域的甲基化引物对、检测探针的序列以及可检测的甲基化的胞嘧啶位点如表2所示。具体实验步骤包括：
1)样本DNA的提取：
收集抗凝血样本，离心后取上层血浆，用于提取血浆游离DNA。使用QIAampCirculating Nucleic Acid kit(Qiagen，Valencia，CA，USA)从8mL血浆中提取cfDNA。DNA用Nanodrop 2000超微量分光光度计(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)定量。
2)DNA的转化及纯化：
将DNA在98℃下孵育10分钟，然后在64℃下用亚硫酸氢钠处理1小时；然后将亚硫酸氢盐处理过的DNA添加到Biocomma柱(Biocomma，中国)上，再加入结合液，13000g离心30s后弃上清；在室温下洗涤DNA 1次后加入脱硫剂，脱硫15min后离心；洗涤DNA 2次后用40μLTE缓冲液洗脱。洗脱后的DNA立即用于实时荧光定量PCR分析，或保存在-20℃下以供进一步使用。
表1目标区域的DNA序列及经亚硫酸氢盐转化后的序列
表2检测引物对、检测探针的核苷酸序列及可检测的甲基化的胞嘧啶位点
实施例2检测所选区域在肝癌单癌种中的特异性
血液中ctDNA的来源比较复杂，除了有肝癌组织释放的外，还有其他器官或组织释放，因此良好的血液标记物还要求是肝癌特异性的，否则无法区分ctDNA是来自肝癌组织还是其他器官/组织释放。
下载TCGA-LIHC甲基化450k芯片数据，保留样本类型为primary和normal，针对上述区域1～5的检测探针，分别计算区域1～5在13个癌症类型(共310例血液样本)上的平均甲基化β值。对于探针在不同样本上出现甲基化值为NA的，使用k最近邻算法进行填补(R软件包‘bnstruct’)。取平均甲基化β值(450k芯片数据转化之后生成的一个衡量甲基化程度的值)0.3作为阈值，若目标区域在某个癌症上的平均β值<0.3，则该目标区域在该癌症上是低甲基化的。所选13个癌症包括：肝细胞癌(LIHC)、膀胱癌(BLCA)、乳腺癌(BRCA)、宫颈鳞癌(CESC)、胆管癌(CHOL)、结肠癌(COAD)、食管癌(ESCA)、头颈鳞状细胞癌(HNSC)、肺腺癌(LUAD)、前列腺癌(PRAD)、甲状腺癌(THCA)、子宫内膜癌(UCEC)、胰腺癌(PAAD)。区域1～5的检测探针分别在13个癌症类型中的平均甲基化β值如表3所示。
表3区域1～5的检测探针分别在13个癌症类型中的平均甲基化β值
| 癌种 | 区域1 | 区域2 | 区域3 | 区域4 | 区域5 |
| LIHC | 0.401500016 | 0.527715753 | 0.412439377 | 0.464574596 | 0.454257236 |
| BLCA | 0.268641076 | 0.245933905 | 0.197080081 | 0.202347898 | 0.261161682 |
| BRCA | 0.30996363 | 0.267377307 | 0.265500269 | 0.208520414 | 0.253033238 |
| CESC | 0.257399245 | 0.259450239 | 0.136482013 | 0.244038254 | 0.202147561 |
| CHOL | 0.222067046 | 0.29787748 | 0.236662201 | 0.285311816 | 0.237911828 |
| COAD | 0.160268628 | 0.235100298 | 0.297490492 | 0.273126967 | 0.254617618 |
| ESCA | 0.253148604 | 0.237420497 | 0.200711319 | 0.221988568 | 0.243788634 |
| HNSC | 0.297045744 | 0.257178696 | 0.261398981 | 0.100290249 | 0.291608963 |
| LUAD | 0.295820066 | -0.200078685 | 0.293161684 | 0.138220875 | 0.207766932 |
| PRAD | 0.130420015 | 0.271512544 | 0.207379425 | 0.267545283 | 0.28547366 |
| THCA | 0.22287199 | 0.209154392 | 0.277217757 | 0.264574596 | 0.303937252 |
| UCEC | 0.112404918 | 0.296206883 | 0.163362426 | 0.102347898 | 0.255240477 |
| PAAD | 0.139598731 | 0.26490508 | 0.226310068 | 0.208520414 | 0.19321152 |
表3中，区域1～5的检测探针在肝癌中的平均甲基化β值均大于0.3，在其他12个癌种中的大多数平均甲基化β值均小于0.3，其中区域2～4在其他12种癌种的平均甲基化β值均小于0.3，实验结果表明区域1～5在肝癌中呈现高甲基化，在其他12个癌种中几乎整体处于低甲基化，尤其是区域2～4，在其他12个癌种中全部处于低甲基化。可以看出，目标区域(区域1～5)在肝癌单癌种的检测中具有较高的特异性，能够较好区分肝癌与其他高发癌种，可以用作肝癌特异性标志物。
实施例3甲基化特异性荧光定量法(qMSP)检测甲基化水平
以GRCh38.p14为参考基因组，以所述5个目标区域中的正/负链DNA分子为模板设计适用于荧光定量PCR扩增的甲基化引物对和检测探针。具体的实验步骤包括：
1)DNA样本的提取转化和纯化同实施例1。
2)甲基化特异性荧光定量PCR
甲基化检测引物对和检测探针设计如实施例1。
qPCR扩增：
在对样本进行qMSP分析之前，需验证甲基化引物的扩增性能。具体地，102拷贝/μL、103拷贝/μL、104拷贝/μL、105拷贝/μL、106拷贝/μL含亚硫酸氢盐转化后的各个目标区域的质粒，以及按上述梯度稀释的含转化后的内参基因ACTB质粒。内参基因ACTB的上游扩增引物为：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.26)，下游扩增引物为：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.27)，检测探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ IDNO.28)被扩增以构建标准曲线，并计算各个目标区域的扩增效率，发现表2提供的检测引物的扩增效率均处于90％～110％之间。目标区域检测探针均为TaqMan探针，单个目标区域的检测探针5’端的荧光报告基团为FAM，3’端的荧光淬灭基团为MGB；2个目标区域的检测探针的5’端荧光基团分别为FAM和ROX，3’端荧光淬灭基团为BHQ-1和MGB；3个目标区域的检测探针的5’端荧光基团分别为FAM、ROX和VIC，3’端荧光淬灭基团为BHQ-1、MGB和BHQ-2；ACTB基因的检测探针5’端的荧光报告基团为VIC，3’端的荧光淬灭基团为BHQ-1。
qPCR反应溶液为25μL体积，使用的酶为高亲和力Hotstart Taq聚合酶。加入5μL模板DNA，在每个反应孔板中同时测试阴性对照和阳性对照。阴性对照管的DNA模板为TE缓冲液。阳性对照管的DNA模板为含ACTB(转化后序列)和目标区域(转化后序列)的人工合成的质粒。阳性对照管的DNA模板的制备方法为：将ACTB基因扩增区域对应的经亚硫酸氢盐完全转化后的序列进行人工合成，并克隆至载体上，形成人工合成质粒；将经亚硫酸氢盐完全转化后的目标区域进行人工合成，并分别克隆至载体，形成人工合成质粒。若只检测单一区域的甲基化水平，阳性对照DNA模板为103拷贝/微升的含转化后ACTB的人工合成质粒、103拷贝/微升的含检测区域的人工合成质粒，二者1:1混合而成；若检测组合物的甲基化水平，则阳性对照DNA模板为103拷贝/微升的含转化后ACTB的人工合成质粒、含各目的区域的人工合成质粒分别为103拷贝/微升，等体积混合。qPCR在ABI 7500仪器上进行，扩增条件如下：95℃10min，然后95℃15s和60℃30s，共45个循环。
Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，可以得到样本各个基因的Ct值。
质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照各基因的Ct值应在26-30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
3)qMSP结果分析：
定义ΔCt＝Ct(目标区域)-Ct(ACTB)，计算所有样本中扩增各个目标区域的ΔCt值，然后使用IBM SPSS 20.0软件进行受试者操作曲线特征(ROC)分析。根据ROC分析结果，选择约登指数(灵敏度+特异性-1)最大时的ΔCt为截断值，若待测样本的ΔCt值小于等于截断值，则该样本为甲基化阳性，该样本为肝癌阳性样本；若待测样本的ΔCt值大于截断值，则该样本为甲基化阴性，该样本为肝癌阴性样本。
实施例4qMSP法检测待测样本中单个目标区域的甲基化水平诊断肝癌血液样本的性能
1)样本收集
收集38例经组织活检确诊为肝癌的患者的血液样本，收集健康人的血液样本41例作为对照，每份血样样本的体积大于8mL。所有血液样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2)血液样本中游离DNA的提取、转化和纯化同实施例1。
3)qMSP检测及结果分析
采用实施例1中提供的引物对和探针分别扩增区域1～5，根据得到的ΔCt值进行ROC分析，ΔCt值为目标基因与内参基因ACTB的Ct值之差。具体地，将肝癌血液样本的状态变量定为“1”，将健康人血液样本的状态变量定为“0”，点击“分析”-“ROC曲线图”，分别指定检验变量和状态变量的值，将状态变量的值定为1，并选择“较小的检验结果表示更明确的检验”，得出检验肝癌的ROC分析结果，选择约登指数(灵敏度+特异性-1)最大时的ΔCt为截断值，并得到平均AUC值、灵敏度和特异性数值，结果如表4所示，目标区域1、2、3、4、5检测肝癌血液样本的ROC曲线分别如图1内容(a)、图1内容(b)、图1内容(c)、图1内容(d)、图1内容(e)所示。
表4区域1～5检测肝癌血液样本的性能
| 目标区域 | 灵敏度(％) | 特异性(％) | AUC值 | 截断值(概率值) |
| 区域1 | 75.0 | 86.4 | 0.836 | 17.99 |
| 区域2 | 78.9 | 91.3 | 0.879 | 18.07 |
| 区域3 | 83.3 | 88.9 | 0.894 | 17.98 |
| 区域4 | 80.0 | 90.9 | 0.816 | 17.92 |
| 区域5 | 71.4 | 87.0 | 0.805 | 17.92 |
由表4可以看出，各个区域检测肝癌血液样本的AUC值范围为0.805～0.894，表明各区域对于肝癌均有较好的检出效果，其中区域3检测肝癌血液样本的AUC值高达0.894，诊断性能最佳。另外，区域3与区域4检测肝癌血液样本的灵敏度均大于等于80％，检测灵敏度较好。同时，所有区域对于健康人血液样本的检测特异性较好，各区域的检测特异性均大于等于86.4％，其中，区域2、区域4对于健康人血液样本的检测特异性相对较优，检测特异性均大于90％。
实施例5qMSP法检测待测样本中多个目标区域的甲基化水平联合诊断肝癌血液样本的性能
样本收集同实施例4。
血液样本中游离DNA的提取、转化和纯化同实施例1。
在本实施例中，使用Logistic回归模型分析了来自多个区域的联合诊断的效果。
当使用不同的方式进行组合时，所使用的计算方程不同，具体如表5所示。根据上述方程，ΔCt值为目标基因与内参基因ACTB的Ct值之差，计算多区域联合诊断样本的概率值P，若P值小于截断值，则表明此样本为健康人样本，若P值大于等于截断值，则表明此样本为肝癌阳性样本。具体的分析方法为：首先对多个区域的ΔCt值进行二元Logistic分析，得出一个概率值，再以概率值为检验变量进行ROC分析，软件设置过程同上述单一检测区域的分析过程。
在本实施例中，我们将表3中所示5个区域中任意两个区域或三个区域进行组合，并进行了联合诊断的分析，本发明选取了13种组合方式进行展示和分析，组合1～13诊断肝癌血液样本的性能如表6和图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11、图12、图13和图14所示。
表5多区域联合诊断肝癌计算方程式
| 组合 | 多区域联合诊断计算方程式 |
| 1 | ln(P/(1-P))＝1.647*ΔCt(区域1)+0.607*ΔCt(区域2)-29.601 |
| 2 | ln(P/(1-P))＝1.631*ΔCt(区域1)+0.696*ΔCt(区域3)-30.941 |
| 3 | ln(P/(1-P))＝1.100*ΔCt(区域1)+0.590*ΔCt(区域4)-18.920 |
| 4 | ln(P/(1-P))＝1.147*ΔCt(区域1)+0.452*ΔCt(区域5)-20.423 |
| 5 | ln(P/(1-P))＝2.483*ΔCt(区域2)+0.850*ΔCt(区域3)-45.875 |
| 6 | ln(P/(1-P))＝1.717*ΔCt(区域2)+0.656*ΔCt(区域4)-31.032 |
| 7 | ln(P/(1-P))＝3.865*ΔCt(区域2)+2.292*ΔCt(区域5)-67.098 |
| 8 | ln(P/(1-P))＝3.005*ΔCt(区域3)+1.148*ΔCt(区域4)-54.344 |
| 9 | ln(P/(1-P))＝1.591*ΔCt(区域3)+0.530*ΔCt(区域5)-28.905 |
| 10 | ln(P/(1-P))＝1.835*ΔCt(区域4)+0.742*ΔCt(区域5)-32.568 |
| 11 | ln(P/(1-P))＝(-1.022)*ΔCt(区域1)-2.156*ΔCt(区域3)-0.609*ΔCt(区域4)+66.514 |
| 12 | ln(P/(1-P))＝(-0.668)*ΔCt(区域1)-1.832*ΔCt(区域2)-0.996*ΔCt(区域5)+63.176 |
| 13 | ln(P/(1-P))＝(-0.797)*ΔCt(区域2)-1.120*ΔCt(区域3)-1.518*ΔCt(区域5)+63.176 |
表6多个区域联合诊断肝癌血液样本的性能
| 组合 | 目标区域 | 灵敏度(％) | 特异性(％) | AUC值 | 截断值(概率值) |
| 1 | 区域1+2 | 79.5 | 85.1 | 0.879 | 0.54 |
| 2 | 区域1+3 | 85.0 | 85.3 | 0.836 | 0.17 |
| 3 | 区域1+4 | 82.1 | 86.2 | 0.816 | 0.69 |
| 4 | 区域1+5 | 75.0 | 86.4 | 0.830 | 0.98 |
| 5 | 区域2+3 | 84.0 | 83.9 | 0.816 | 0.58 |
| 6 | 区域2+4 | 83.9 | 89.5 | 0.879 | 0.50 |
| 7 | 区域2+5 | 79.2 | 85.3 | 0.805 | 0.89 |
| 8 | 区域3+4 | 83.3 | 88.9 | 0.894 | 0.43 |
| 9 | 区域3+5 | 89.1 | 87.0 | 0.887 | 0.79 |
| 10 | 区域4+5 | 80.0 | 83.0 | 0.816 | 0.58 |
| 11 | 区域1+3+4 | 90.9 | 76.7 | 0.747 | 0.97 |
| 12 | 区域1+2+5 | 85.7 | 79.6 | 0.714 | 0.90 |
| 13 | 区域2+3+5 | 86.7 | 77.4 | 0.733 | 0.93 |
表6中，组合1～10为双区域组合对应的诊断肝癌血液样本的结果，其中，所有双区域组合诊断肝癌的AUC值均大于等于0.805，表明以上双区域组合对肝癌的检出具有较好的准确度。双区域组合进行肝癌血液样本检测时，其诊断肝癌的检测灵敏度为75.0％～89.1％，相比于单区域检测展现出一定程度提升；检测健康人血液样本的检测特异性的范围也在83.0％～88.9％之间，处于较高水平。总体来说，双区域组合对于检测肝癌的总体效果相比单区域有了一定程度的优化。
由表3可知，区域3检测肝癌血液样本的灵敏度最高，为83.3％，区域4次之，为80.0％，区域5的检测灵敏度最低，为71.4％。将区域3分别与区域4、区域5组合检测肝癌血液样本，由表6可以看出，区域3+4组合检测肝癌血液样本的灵敏度为83.3％，检测健康人血液样本的特异性为88.9％，均处于较高水平，且组合的AUC值最高，为0.894，其中检测灵敏度略高于区域4(灵敏度为80.0％)，与区域3(灵敏度为83.3％)持平，检测健康人血液样本的特异性与单区域检测基本处于相同的水平。意外的是，区域3+5组合检测肝癌血液样本的灵敏度最高，甚至优于区域3+4组合，具体地，区域3+5组合检测肝癌血液样本的灵敏度为89.1％，显著优于区域3(检测灵敏度为83.3％)和区域5(检测灵敏度为71.4％)的单区域的检测灵敏度，区域3+5组合检测健康人血液样本的特异性为87.0％，与单区域检测基本处于相同的水平。由此可以看出，将两个单区域检测灵敏度均较高的区域进行组合检测时，其联合诊断的灵敏度相较于单区域检测有一定的提高或持平，而将单区域检测灵敏度较高的区域(灵敏度>80％)与检测灵敏度略低的区域(80％<灵敏度)进行组合检测时，反而使得联合诊断的灵敏度相较于单区域检测有显著的提高。
由表3可知，区域2、区域4检测肝癌血液样本的特异性较高，均高于90.0％。将区域2与区域4组合检测肝癌血液样本，由表6可以看出，区域2+4组合检测肝癌血液样本的灵敏度为83.9％，显著高于区域4(灵敏度为80.0％)和区域2(灵敏度为78.9％)，区域2+4组合检测健康人血液样本的特异性为89.5％，高于其它双区域组合检测的特异性，与单区域检测特异性相比仅有小幅度降低。由此可以看出，将两个单区域检测特异性均较高的区域进行组合检测时，并未使联合诊断的特异性相较于单区域检测有一定的提高，反而使得联合诊断的灵敏度相较于单区域检测有显著的提高。
表6中，组合11～13为三区域组合对应的诊断肝癌血液样本的结果，其中，区域1+3+4的组合方式对于肝癌血液样本的检测灵敏度达到了90.9％，在所有检测方式(包括单区域、双区域、三区域检测)中检测肝癌血液样本的灵敏度最高。同时，区域1+2+5及区域2+3+5的检测灵敏度分别为85.7％及86.7％，与单区域、双区域检测相比，其检测灵敏度均处于较高水平。但是，三区域联合检测对于健康人血液样本的检测特异性有一定程度的降低，其检测特异性处于76.7％～79.6％之间。
综上，在血液样本中，区域1～5可以作为肝癌特异性标志物，其中通过检测区域2、3、4的甲基化检测肝癌血液样本的灵敏度和检测健康人血液样本的特异性较优。当进行区域组合检测时，区域3+4、区域3+5、区域2+4组合检测的AUC值均高于0.879，且检测肝癌血液样本的灵敏度及检测健康人血液样本的特异性均处于较高水平，诊断肝癌的效果较优。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种肝癌检测的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合用于检测样本中目标区域的甲基化水平，其中，所述目标区域选自如下至少一种区域的全长或部分区域：区域Ⅰ、区域Ⅱ、区域Ⅲ和区域Ⅳ；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述区域Ⅰ选自Chr1:115839038-115839352，所述区域Ⅱ选自Chr1:154567661-154567844，所述区域Ⅲ选自Chr1:155194367-155194548，所述区域Ⅳ选自Chr1:171251741-171251928。
2.如权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，所述目标区域选自如SEQ ID NO.1-5所示核苷酸序列中的至少一个。
3.如权利要求2所述的核酸组合，其特征在于，所述目标区域选自如下任一组合：
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5中的任一者与SEQ ID NO.2的组合；
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5中的任一者与SEQ ID NO.3的组合；
SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.4的组合；
SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.5的组合；
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.2的组合；
SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.2的组合；
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.3的组合。
4.如权利要求2至3任一项所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括用于检测所述目标区域的甲基化水平的引物对，所述核酸组合选自如下引物对中的至少一种：
用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的第一引物对、用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的第二引物对、用于检测SEQ ID NO.3区域内的甲基化水平的第三引物对、用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的第四引物对、用于检测SEQ ID NO.5区域内的甲基化水平的第五引物对。
5.如权利要求4所述的核酸组合，其特征在于，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.11～12所示；所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.14～15所示；所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.17～18所示；所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.20～21所示；所述第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.23～24所示。
6.如权利要求4任一项所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合还包括与所述引物对对应的检测探针，所述核酸组合选自如下检测探针中的至少一种：
用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.13所示；用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.16所示；用于检测SEQ IDNO.3区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.19所示；用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.22所示；用于检测SEQ ID NO.5区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.25所示。
7.如权利要求6所述的核酸组合，其特征在于，所述检测探针的5’端含有荧光报告基因，3’端含有荧光淬灭基团。
8.一种肝癌检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至7任一项所述的核酸组合。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂和质控品中的一种或多种。
10.如权利要求1至7任一项所述的核酸组合或如权利要求8或9所述的试剂盒在制备肝癌诊断产品中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202310399200.8A CN116479129A (zh) | 2023-04-13 | 2023-04-13 | 一种肝癌检测的核酸组合、试剂盒及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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