CN116004831A - 一种用于膀胱癌的诊断或辅助诊断的试剂及检测试剂盒 - Google Patents
一种用于膀胱癌的诊断或辅助诊断的试剂及检测试剂盒 Download PDFInfo
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物医学领域,更具体地,涉及一种用于膀胱癌诊断或辅助诊断的试剂及检测试剂盒。本发明提供的膀胱癌检测试剂盒,通过检测特定分子标记物目标区域的甲基化水平,可有效区分膀胱癌患者和健康人,其诊断非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)患者尿液样本的灵敏度可达75%,其诊断肌层浸润性膀胱癌(MIBC)患者尿液样本的灵敏度可达93.75%,其检测泌尿系统良性疾病患者尿液样本的特异性为88.33%,其检测健康人尿液样本的特异性为100%。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域,更具体地,涉及一种用于膀胱癌的诊断或辅助诊断的试剂及检测试剂盒。
背景技术
膀胱癌是来源于膀胱壁上皮组织和间质组织的恶性肿瘤,其主要组织类型包括尿路上皮癌、鳞状细胞癌和腺细胞癌,其中尿路上皮癌是最常见的组织类型,占所有膀胱癌的90%以上。作为泌尿系统肿瘤中发病率最高的恶性肿瘤之一,膀胱癌的发病率在全球所有恶性肿瘤中居于第九位,其在中国男性恶性肿瘤中居于第七位。与往年相比,中国的膀胱癌总体发病率呈现出上升的趋势。初次确诊的患者中约有75%为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC),可经尿道膀胱肿瘤电切术治疗,而确诊的肌层浸润性膀胱癌(MIBC)患者则需进行全膀胱切除术、尿流改道术及其他辅助治疗。膀胱癌的复发率很高,其术后复查、复发治疗的医疗费用巨大,这使其成为治疗费用最高的肿瘤。如果能对膀胱癌患者进行早期诊断和早期治疗,则能显著改善患者预后,使其5年生存率达到90%以上。
目前膀胱癌的诊断以膀胱镜检查和尿液脱落细胞学检查为主。膀胱镜检查的过程为:将膀胱内窥镜经尿道插入膀胱,医师通过肉眼观察,发现形态可疑的病变并用活检钳夹取组织样本以便于病理分析。虽然膀胱镜检查及病理活检是诊断膀胱癌的金标准,但是其作为一项有创操作,可能会造成患者尿道、膀胱黏膜的破损和出血、尿路感染等病症,且检查过程十分痛苦,患者依从性不高。尿液脱落细胞学检查是无创的,且诊断特异性较高,但是其诊断低级别膀胱癌的灵敏度低于20%,其诊断灵敏度有待提高。其它一些基于尿液标记物的检测,如核基质蛋白22(Nuclear matrix protein 22,NMP22)、膀胱肿瘤抗原(Bladder tumor antigen,BTA)等,虽然具有一定的诊断学价值,但是其易出现假阳性结果,不能良好区分泌尿系统良性疾病患者和膀胱癌患者。因而,仍然需要无创的、高灵敏度、高特异性的标记物用于膀胱癌的早期诊断和辅助诊断。
DNA甲基化主要是指DNA中的胞嘧啶碱基在甲基转移酶的作用下,以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体,在其第5位碳原子上共价结合一个甲基基团的过程。DNA甲基化模式的改变与癌症的发生和发展密切相关,癌细胞展现出两种不同的甲基化模式,如癌细胞中某些基因CpG岛的甲基化水平显著提高,而全基因组DNA甲基化水平则降低。现有技术认为一些甲基化分子标记物能够一定程度区分膀胱癌患者或非膀胱癌受试者,但是这些甲基化分子标记物诊断早期膀胱癌的灵敏度、及其诊断干扰样本和膀胱癌阴性样本的特异性仍然有待验证,且需要进一步提高,以达到无创诊断的目的。
发明内容
针对现有技术的缺陷,本发明的目的在于提供一种用于膀胱癌的诊断或辅助诊断的试剂及检测试剂盒,以解决现有技术对于膀胱癌诊断的有创性、灵敏度低(尤其是早期膀胱癌诊断灵敏度低)、易出现假阳性结果、准确度低等的技术问题。
为实现上述目的,本发明提供了一种用于膀胱癌诊断或辅助诊断的试剂,包括用于检测生物样本中目标区域甲基化水平的试剂,所述目标区域选自如下至少一种区域中的全长区域或部分区域:区域1、区域2和区域3;
以GRCh38为参考基因组,所述区域1选自Chr2:70888818-70889103负链,区域2选自Chr5:135038904-135039319正链,区域3选自Chr7:156616479-156616686负链。
优选地,所述部分区域包括如下至少一种所述区域的子区域:
所述区域1的子区域包括子区域1-1、子区域1-2和子区域1-3,所述子区域1-1选自Chr2:70888818-70888907,所述子区域1-2选自Chr2:70888900-70889009,所述子区域1-3选自Chr2:70889006-70889103;
所述区域2的子区域包括子区域2-1、子区域2-2和子区域2-3,所述子区域2-1选自Chr5:135038904-135038999,所述子区域2-2选自Chr5:135038986-135039125,所述子区域2-3选自Chr5:135039176-135039319;
所述区域3的子区域包括子区域3-1和子区域3-2,所述子区域3-1选自Chr7:156616479-156616568,所述子区域3-2选自Chr7:156616572-156616686。
优选地,所述试剂包括引物对。
进一步优选地,所述试剂还包括与所述引物对对应的检测探针。
优选地,所述引物对包括以下引物对中的至少一组:用于检测Chr2:70888818-70888907区域内全长或部分区域的甲基化水平的第一引物对、用于检测Chr2:70888900-70889009区域内全长或部分区域的甲基化水平的第二引物对、用于检测Chr2:70889006-70889103区域内全长或部分区域的甲基化水平的第三引物对、用于检测Chr5:135038904-135038999区域内全长或部分区域的甲基化水平的第四引物对、用于检测Chr5:135038986-135039125区域内全长或部分区域的甲基化水平的第五引物对、用于检测Chr5:135039176-135039319区域内全长或部分区域的甲基化水平的第六引物对、用于检测Chr7:156616479-156616568区域内全长或部分区域的甲基化水平的第七引物对、用于检测Chr7:156616572-156616686区域内全长或部分区域的甲基化水平的第八引物对。
优选地,所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.10~11所示、如SEQ IDNO.12~13所示或如SEQ ID NO.14~15所示;
和/或,所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.16~17所示、如SEQ ID NO.18~19所示或如SEQ ID NO.20~21所示;
和/或,所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.22~23所示、如SEQ ID NO.24~25所示或如SEQ ID NO.26~27所示;
和/或,所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.28~29所示或如SEQ IDNO.30~31所示;
和/或,所述第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.32~33所示、如SEQ ID NO.34~35所示或如SEQ ID NO.36~37所示;
和/或,所述第六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.38~39所示、如SEQ ID NO.40~41所示或如SEQ ID NO.42~43所示;
和/或,所述第七引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.44~45所示或如SEQ IDNO.46~47所示;
和/或,所述第八引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.48~49所示或如SEQ IDNO.50~51所示。
进一步优选地,所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.12~13所示;和/或,所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18~19所示;和/或,所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.24~25所示;和/或,所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.28~29所示;和/或,所述第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.34~35所示;和/或,所述第六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.40~41所示;和/或,所述第七引物对的核苷酸序列如SEQID NO.46~47所示;和/或,所述第八引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.50~51所示。
优选地,所述试剂还包括与所述引物对对应的检测探针,其中:
与序列如SEQ ID NO.10~11所示、如SEQ ID NO.12~13所示或如SEQ ID NO.14~15所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示;和/或,与序列如SEQIDNO.16~17所示、如SEQ ID NO.18~19所示或如SEQ ID NO.20~21所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.53所示;和/或,与序列如SEQ ID NO.22~23所示、如SEQ ID NO.24~25所示或如SEQ ID NO.26~27所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示;和/或,与序列如SEQ ID NO.28~29所示或如SEQ ID NO.30~31所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.55所示;和/或,与序列如SEQIDNO.32~33所示、如SEQ ID NO.34~35所示或如SEQ ID NO.36~37所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.56所示;和/或,与序列如SEQ ID NO.38~39所示、如SEQ ID NO.40~41所示或如SEQ ID NO.42~43所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.57所示;和/或,与序列如SEQ ID NO.44~45所示或如SEQ ID NO.46~47所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.58所示;和/或,与序列如SEQIDNO.48~49所示或如SEQ ID NO.50~51所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.59所示。
优选地,所述试剂能够检测如下至少一种所述子区域的至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化:
所述子区域1-1的Chr2:70888907、Chr2:70888901、Chr2:70888895、Chr2:70888893、Chr2:70888871、Chr2:70888865、Chr2:70888858、Chr2:70888856、Chr2:70888839、Chr2:70888833和Chr2:70888819中至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化;
所述子区域1-2的Chr2:70889008、Chr2:70889001、Chr2:70888990、Chr2:70888988、Chr2:70888938、Chr2:70888925、Chr2:70888918、Chr2:70888907和Chr2:70888901中至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化;
所述子区域1-3的Chr2:70889097、Chr2:70889086、Chr2:70889059、Chr2:70889045、Chr2:70889023、Chr2:70889012和Chr2:70889008中至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化;
所述子区域2-1的Chr5:135038908、Chr5:135038918、Chr5:135038921、Chr5:135038954、Chr5:135038958、Chr5:135038963、Chr5:135038966、Chr5:135038981和Chr5:135038986中至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化;
所述子区域2-2的Chr5:135038986、Chr5:135039001、Chr5:135039003、Chr5:135039011、Chr5:135039028、Chr5:135039102、Chr5:135039110和Chr5:135039122中至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化;
所述子区域2-3的Chr5:135039178、Chr5:135039183、Chr5:135039193、Chr5:135039257、Chr5:135039270、Chr5:135039301、Chr5:135039308和Chr5:135039316中至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化;
所述子区域3-1的Chr7:156616568、Chr7:156616558、Chr7:156616554、Chr7:156616527、Chr7:156616522、Chr7:156616508、Chr7:156616499、Chr7:156616493和Chr7:156616481中至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化;
所述子区域3-2的Chr7:156616666、Chr7:156616640、Chr7:156616633、Chr7:156616594和Chr7:156616573中至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化。
按照本发明的另一个方面,提供了一种用于膀胱癌诊断或辅助诊断的检测试剂盒,包括所述的试剂。
优选地,所述的试剂盒还包括PCR反应试剂、甲基化转化试剂、DNA提取试剂、DNA纯化试剂和质控品中的一种或多种。
按照本发明的另一个方面,提供了一种所述的试剂或所述的试剂盒在制备膀胱癌诊断或辅助诊断产品中的应用。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,具有以下有益效果:
(1)本发明提供的一种用于膀胱癌诊断或辅助诊断的试剂,通过检测生物样本中分子标记物的目标区域的甲基化水平可以用于诊断或辅助诊断膀胱癌,从而有效区分膀胱癌患者和健康人,适用于诊断不同病理分期的膀胱癌,包括非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC),具有较高的诊断灵敏性和特异性。
(2)本发明提供的检测试剂和检测试剂盒,通过检测样本中分子标记物的目标区域的甲基化水平,可有效区分膀胱癌患者和健康人,其诊断非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)患者尿液样本的灵敏度可达75%,其诊断肌层浸润性膀胱癌(MIBC)患者尿液样本的灵敏度可达93.75%,其检测泌尿系统良性疾病患者尿液样本的特异性为88.33%,其检测健康人尿液样本的特异性为100%。
(3)本发明提供的用于诊断或辅助诊断膀胱癌的甲基化标志物选自区域1、区域2、区域3中的一个或者多个子区域的组合,实验结果显示,各个子区域对不同病理分期的膀胱癌患者尿液样本均具有一定的检出率,而通过检测多个子区域组合的甲基化水平,其诊断膀胱癌尿液样本的灵敏度会显著提高,而特异性无明显降低。
附图说明
图1为各子区域诊断膀胱癌和非癌受试者尿液样本的ROC曲线。
图2为两个子区域组合诊断膀胱癌和非癌受试者尿液样本的ROC曲线。
图3为三个子区域组合诊断膀胱癌和非癌受试者尿液样本的ROC曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
除非另外说明或存在矛盾之处,本文中使用的术语或短语具有以下含义:
术语“及/或”或“和/或”均是指包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
术语“多个”指两个以上;“多种”指两种以上;“以上”与数字结合表示数量时包括本数,例如“两个以上”包括两个。
术语“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子,优选多于三个,并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素,而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生,包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式,能够在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数,既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中,可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下,可根据样本检测的Ct值进行比较;在一些情况下,可计算样本中基因甲基化的比例,即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100%,然后再进行比较;在一些情况下,还需要对各个指标进行统计学上的分析整合,得出最终的判定指标。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中,基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常,用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素,包括温度、引物来源以及所用方法等。例如,对于诊断和预后应用,根据靶序列的复杂度,寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸,但是也可以含有更少的核苷酸。在本公开内容中,术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一,能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后,所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶,而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变,因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物,通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。在本公开内容中,进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物,若Ct值满足所述要求(例如在组织样本中Ct≤38),则表明目标序列是甲基化的。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(QMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对,从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来,但是q-MSP最终的检测指标为荧光信号,因此,在q-MSP反应系统中,除加入甲基化检测引物以外,还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比,q-MSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高,更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段,且该技术不需要凝胶电泳检测,操作更加简便。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时,因为荧光基团附近存在淬灭基团,探针不会发出荧光。在扩增过程中,如果探针与被扩增的链结合,DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针,荧光基团远离淬灭基团,其能量不被吸收,即产生荧光信号。每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步的指数增长的过程。
术语“AUC”是“曲线下面积”的缩写。具体地,其是指接受者操作特征(ROC)曲线下面积。ROC曲线是诊断测试的不同可能切割点的真阳性率相比于假阳性率的图。其取决于所选择切割点的灵敏度与特异性之间的权衡(灵敏度的任何增加将伴随着特异性的降低)。ROC曲线下面积(AUC)是诊断测试准确度的度量(面积越大越好;最佳值是1;随机测试将具有位于对角线上的ROC曲线,面积为0.5)。
成年人每天大约有1011个细胞会发生凋亡,细胞凋亡后释放的DNA大部分会被降解,可也有少部分的DNA能够避开吞噬等作用,出现在如尿液等体液中。除了凋亡细胞的DNA,尿液中还存在大量从泌尿系统脱落而未发生降解的细胞,这些细胞也是尿液DNA的重要来源,据统计,人体泌尿系统每天约释放2000-7000个细胞到尿液中。因此尿液样本中既含有游离的DNA,也含有脱落细胞的基因组DNA。对于膀胱癌患者而言,其尿液中除了含有大量的正常DNA以外,还含有一定量的发生癌变的细胞所携带的遗传信息。考虑到一些甲基化的分子标记物在正常人和癌症患者中展示出巨大的差异,且尿液具有易获取、无创伤、可重复取样等优点,因此发明人提供了以尿液为样本,通过检测样本中分子标记物的甲基化水平来诊断或辅助诊断膀胱癌的方法,及基于上述方法制备的用于膀胱癌诊断的试剂及试剂盒。
本发明提供的一种用于膀胱癌的诊断或辅助诊断的试剂,包括用于检测生物样本中目标区域甲基化水平的试剂,所述目标区域(也称甲基化分子标记物)选自如下至少一种区域中的全长区域或部分区域:区域1、区域2和区域3。以GRch38.p14为参考基因组,区域1选自Chr2:70888818-70889103负链,区域2选自Chr5:135038904-135039319正链,区域3选自Chr7:156616479-156616686负链。
本申请的发明人发现,膀胱癌与上述分子标记物的DNA甲基化水平相关,并且上述分子标记物在膀胱癌样本中的甲基化水平显著高于正常样本。以位于Chr2:70888818-70889103的负链DNA区域(区域1)、位于Chr5:135038904-135039319的正链DNA区域(区域2)和位于Chr7:156616479-156616686的负链DNA区域(区域3)作为分子标记物(以GRCh38.p14为参考基因组),通过检测区域1、区域2、区域3中至少一个区域的全长区域或部分区域的甲基化水平,可以有效区分膀胱癌患者和健康人,可以为受试者(对象)是否存在膀胱癌的风险、或者是否已经发生膀胱癌病变提供参考,为膀胱癌诊断或辅助诊断提供参考。
一些实施例中,本发明试剂能够特异性检测生物样本中如下至少一种区域的子区域的甲基化水平,即甲基化标记物包括区域1的子区域序列、区域2的子区域序列、区域3的子区域序列中的一个或者多个;以GRch38.p14为参考基因组,
区域1的子区域包括子区域1-1、子区域1-2和子区域1-3,其中子区域1-1选自Chr2:70888818-70888907,子区域1-2选自Chr2:70888900-70889009,子区域1-3选自Chr2:70889006-70889103。
区域2的子区域包括子区域2-1、子区域2-2和子区域2-3,其中子区域2-1选自Chr5:135038904-135038999,子区域2-2选自Chr5:135038986-135039125,子区域2-3选自Chr5:135039176-135039319。
区域3的子区域包括子区域3-1和子区域3-2,其中子区域3-1选自Chr7:156616479-156616568,子区域3-2选自Chr7:156616572-156616686。
一些实施例中,区域1对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1,子区域1-1对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.63,子区域1-2对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.64,子区域1-3对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.65。区域2对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.2,子区域2-1对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.66,子区域2-2对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.67,子区域2-3对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.68。区域3对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.3,子区域3-1对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.69,子区域3-2对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.70。
本发明提供的一种用于膀胱癌的诊断或辅助诊断的试剂,包括用于检测上述分子标记物的目标区域和/或子区域的甲基化水平的引物对,以及所述引物对对应的检测探针。
一些实施例中,所述膀胱癌检测试剂包括用于检测所述区域1、所述区域2、所述区域3中的一个或者多个的引物对,以及所述引物对对应的检测探针;和/或包括用于检测所述区域1的子区域、所述区域2的子区域、所述区域3的子区域中的一个或者多个的引物对,以及所述引物对对应的检测探针。
一些实施例中,所述引物对包括以下引物对中的至少一组:用于检测Chr2:70888818-70888907区域内全长或部分区域的甲基化水平的第一引物对、用于检测Chr2:70888900-70889009区域内全长或部分区域的甲基化水平的第二引物对、用于检测Chr2:70889006-70889103区域内全长或部分区域的甲基化水平的第三引物对、用于检测Chr5:135038904-135038999区域内全长或部分区域的甲基化水平的第四引物对、用于检测Chr5:135038986-135039125区域内全长或部分区域的甲基化水平的第五引物对、用于检测Chr5:135039176-135039319区域内全长或部分区域的甲基化水平的第六引物对、用于检测Chr7:156616479-156616568区域内全长或部分区域的甲基化水平的第七引物对、用于检测Chr7:156616572-156616686区域内全长或部分区域的甲基化水平的第八引物对。
一些实施例中,所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.10~11所示、如SEQIDNO.12~13所示或如SEQ ID NO.14~15所示;和/或,所述第二引物对的核苷酸序列如SEQID NO.16~17所示、如SEQ ID NO.18~19所示或如SEQ ID NO.20~21所示;和/或,所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.22~23所示、如SEQ ID NO.24~25所示或如SEQIDNO.26~27所示;和/或,所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.28~29所示或如SEQID NO.30~31所示;和/或,所述第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.32~33所示、如SEQID NO.34~35所示或如SEQ ID NO.36~37所示;和/或,所述第六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.38~39所示、如SEQ ID NO.40~41所示或如SEQ ID NO.42~43所示;和/或,所述第七引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.44~45所示或如SEQ ID NO.46~47所示;和/或,所述第八引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.48~49所示或如SEQ ID NO.50~51所示。
较佳实施例中,所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.12~13所示;和/或,所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18~19所示;和/或,所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.24~25所示;和/或,所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.28~29所示;和/或,所述第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.34~35所示;和/或,所述第六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.40~41所示;和/或,所述第七引物对的核苷酸序列如SEQID NO.46~47所示;和/或,所述第八引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.50~51所示。
一些实施例中,所述试剂还包括与所述引物对对应的检测探针,其中:与序列如SEQ IDNO.10~11所示、如SEQ ID NO.12~13所示或如SEQ ID NO.14~15所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示;和/或,与序列如SEQ ID NO.16~17所示、如SEQ ID NO.18~19所示或如SEQ ID NO.20~21所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.53所示;和/或,与序列如SEQ ID NO.22~23所示、如SEQ ID NO.24~25所示或如SEQ ID NO.26~27所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.54所示;和/或,与序列如SEQ ID NO.28~29所示或如SEQ ID NO.30~31所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.55所示;和/或,与序列如SEQ ID NO.32~33所示、如SEQ ID NO.34~35所示或如SEQ ID NO.36~37所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.56所示;和/或,与序列如SEQ ID NO.38~39所示、如SEQ ID NO.40~41所示或如SEQ ID NO.42~43所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.57所示;和/或,与序列如SEQ ID NO.44~45所示或如SEQ ID NO.46~47所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.58所示;和/或,与序列如SEQ ID NO.48~49所示或如SEQ ID NO.50~51所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.59所示。
一些实施例中,本发明所述膀胱癌检测试剂用于检测子区域1-1的Chr2:70888907、Chr2:70888901、Chr2:70888895、Chr2:70888893、Chr2:70888871、Chr2:70888865、Chr2:70888858、Chr2:70888856、Chr2:70888839、Chr2:70888833和Chr2:70888819至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化。
一些实施例中,本发明所述膀胱癌检测试剂用于检测子区域1-2的Chr2:70889008、Chr2:70889001、Chr2:70888990、Chr2:70888988、Chr2:70888938、Chr2:70888925、Chr2:70888918、Chr2:70888907和Chr2:70888901至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化。
一些实施例中,本发明所述膀胱癌检测试剂用于检测子区域1-3的Chr2:70889097、Chr2:70889086、Chr2:70889059、Chr2:70889045、Chr2:70889023、Chr2:70889012和Chr2:70889008至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化。
一些实施例中,本发明所述膀胱癌检测试剂用于检测子区域2-1的Chr5:135038908、Chr5:135038918、Chr5:135038921、Chr5:135038954、Chr5:135038958、Chr5:135038963、Chr5:135038966、Chr5:135038981和Chr5:135038986至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化。
一些实施例中,本发明所述膀胱癌检测试剂用于检测子区域2-2的Chr5:135038986、Chr5:135039001、Chr5:135039003、Chr5:135039011、Chr5:135039028、Chr5:135039102、Chr5:135039110和Chr5:135039122至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化。
一些实施例中,本发明所述膀胱癌检测试剂用于检测子区域2-3的Chr5:135039178、Chr5:135039183、Chr5:135039193、Chr5:135039257、Chr5:135039270、Chr5:135039301、Chr5:135039308和Chr5:135039316至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化。
一些实施例中,本发明所述膀胱癌检测试剂用于检测子区域3-1的Chr7:156616568、Chr7:156616558、Chr7:156616554、Chr7:156616527、Chr7:156616522、Chr7:156616508、Chr7:156616499、Chr7:156616493和Chr7:156616481至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化。
一些实施例中,本发明所述膀胱癌检测试剂用于检测子区域3-2的Chr7:156616666、Chr7:156616640、Chr7:156616633、Chr7:156616594和Chr7:156616573至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化。
一些实施例中,本发明所述用于膀胱癌的诊断或辅助诊断的试剂可以制备为如下检测产品中的至少一种:试剂、试剂盒、芯片和测序文库。可选地,所述试剂可以是冻干粉状、溶液、悬浮液、乳液等产品形态。
一些实施例中,所述甲基化水平通过如下至少一种的方法进行检测:甲基化特异性PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化特异性微阵列法、甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化特异性荧光定量PCR法。
本发明还提供了一种用于膀胱癌的诊断或辅助诊断的检测试剂盒,其包括上述检测试剂。一些实施例中,所述检测试剂盒还包括检测内参基因ATCB的检测引物对以及所述内参基因ATCB的检测引物对对应的检测探针。
一些实施例中,所述检测探针和所述内参基因ATCB的检测引物对对应的检测探针均含有荧光报告基因和荧光淬灭基因,其中检测探针的5’端包含有荧光报告基团,所述荧光报告基团包括FAM、ROX、CY5、VIC中的任意一种;检测探针的3’端包含有荧光淬灭基团,所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ-2、BHQ-3中的任意一种。
一些实施例中,所述检测试剂盒还包括扩增试剂(PCR反应试剂)、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的甲基化转化试剂、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、质控品、阳性对照和阴性对照中的一种或多种。
一些实施例中,所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。
一些实施例中,所述将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂为亚硫酸氢盐。
本发明还提供了一种通过检测样本中分子标记物的目标区域的甲基化水平来诊断或辅助诊断膀胱癌的方法,包括如下步骤:1)提取受试者的尿液DNA并用亚硫酸氢盐处理;2)以经转化和纯化的尿液DNA为模板,加入用于检测膀胱癌的分子标记物甲基化水平的引物对和所述引物对对应的检测探针,以及其他组分,进行PCR反应,获得尿液样本中扩增分子标记物的Ct值;3)根据尿液样本中扩增分子标记物的Ct值与扩增内参基因的Ct值的差值(ΔCt)判断该样本是否为膀胱癌阳性样本,具体的判断标准如下所示:
A.当分子标记物为区域1、区域2和区域3中任意一个区域的子区域时,若待测样本的ΔCt值小于等于截断值,则该样本为膀胱癌阳性样本,若待测样本的ΔCt值大于截断值,则该样本为非膀胱癌阳性样本,各个子区域的截断值如表8所示;
B.当分子标记物为区域1、区域2和区域3中任意两个区域的子区域的组合时,根据本发明实施例3中提供的诊断模型来判断待测样本是否为膀胱癌阳性样本,具体地,将待测样本中扩增各个子区域的ΔCt值带入公式②、③或④中,进而根据公式①计算预测概率P值,通过比较预测概率P值与截断值的大小判断待测样本的阴、阳性,任意两个子区域组合的诊断模型的截断值如表10所示;
C.当分子标记物为区域1、区域2和区域3中三个区域的子区域的组合时,根据本发明实施例4中提供的诊断模型来判断待测样本是否为膀胱癌阳性样本,具体地,将待测样本中扩增各个子区域的ΔCt值带入公式⑤中,进而根据公式①计算预测概率P值,通过比较预测概率P值与截断值的大小判断待测样本的阴、阳性,三个子区域组合的诊断模型的截断值如表12所示。
本发明还提供了所述膀胱癌分子标记物的目标区域和/或子区域、所述膀胱癌检测试剂以及所述膀胱癌检测试剂盒在制备膀胱癌检测产品中的应用。
本发明提供了可以用于检测膀胱癌的分子标记物,并进一步提供了通过检测样本中分子标记物的甲基化水平诊断或辅助诊断膀胱癌的方法,及基于上述方法制备的用于膀胱癌诊断的检测试剂、检测试剂盒。本发明提供的膀胱癌检测试剂及检测试剂盒能够用于膀胱癌的检测,适用于不同病理分期的膀胱癌的诊断及辅助诊断,例如非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC),本申请的膀胱癌检测试剂盒可有效区分膀胱癌患者和健康人,其诊断非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)患者尿液样本的灵敏度可达75%,其诊断肌层浸润性膀胱癌(MIBC)患者尿液样本的灵敏度可达93.75%,其检测泌尿系统良性疾病患者尿液样本的特异性为88.33%,其检测健康人尿液样本的特异性为100%。需要说明的是,基于人类疾病诊断的复杂性,本发明所述的膀胱癌检测试剂盒所获得的结果仅作为膀胱癌诊断的中间结果或提示患者患有膀胱癌的可能性或风险,还需结合个体的临床表现及其他生理指标最终得出是否罹患膀胱癌的结论。
以下结合具体实施例,对上述技术方案详细说明。
实施例1
筛选甲基化检测引物对和探针
甲基化特异性荧光定量PCR技术(QMSP)通过荧光标记的寡核苷酸探针或嵌入式染料等方法并结合相应的荧光定量PCR仪器获得反应PCR扩增的动力学曲线,通过Ct值(产物的荧光值达到设定阈值所需要的反应循环数)即可获得初始甲基化模板的相对或绝对数量信息,该方法结果准确、操作简单、快速、且可一次性处理大批量的样本,已成为DNA甲基化检测的主流方法。本实施例以位于Chr2:70888818-70889103的负链DNA区域(区域1、SEQ IDNO.1)、位于Chr5:135038904-135039319的正链DNA区域(区域2、SEQ ID NO.2)和位于Chr7:156616479-156616686的负链DNA区域(区域3、SEQ ID NO.3)作为分子标记物(以GRCh38.p14为参考基因组),提供了基于荧光染料法进行QMSP引物筛选及基于荧光探针法进行QMSP检测待测样本中所述DNA区域甲基化水平的方法。
以位于Chr2:70888818-70889103的负链DNA区域(区域1、SEQ ID NO.1)、位于Chr5:135038904-135039319的正链DNA区域(区域2、SEQ ID NO.2)和位于Chr7:156616479-156616686的负链DNA区域(区域3、SEQ ID NO.3)作为原始DNA序列,分别获得SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3对应的完全甲基化且经亚硫酸氢盐转化后的序列SEQ ID NO.4~6和完全未甲基化且经亚硫酸氢盐转化后的序列SEQ ID NO.7~9。经亚硫酸氢盐处理后,未甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,通过随后的PCR,将尿嘧啶转化为胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则保持不变。将SEQ ID NO.4~9所示的DNA序列分别人工合成,并构建至pMD-18T质粒载体上。
分别以SEQ ID NO.4~6为模板,设计甲基化检测引物对。甲基化特异性PCR的引物设计与普通PCR引物设计不同,其上、下游引物中分别至少包含一个CpG位点,CpG位点越多则引物的特异性越高,为了避免非特异性扩增,其3’端至少有一个CpG位点,且引物的扩增依赖于模板的甲基化水平。同时,甲基化特异性PCR的引物设计也需要满足普通引物设计的原则,如1)引物的长度一般为15~30bp;2)引物中GC碱基含量在40%~60%之间;3)引物具有特异性;4)尽量避免引物3’端出现3个以上的相同碱基;5)引物二聚体及发卡结构的能值尽量不超过4.5kcal/mol。根据上述要求设计的针对SEQ ID NO.4~6的甲基化检测引物对的序列如表1所示。此外,考虑到尿液样本中游离DNA片段通常小于150bp,为了能够尽可能多地检测尿液中的目标分子,同时提高PCR扩增的效率,将区域1、区域2和区域3分别分为若干个子区域进行检测,每个子区域的片段长度均小于150bp。对于区域1(SEQ ID NO.1)的子区域1-1(SEQ ID NO.63)、子区域1-2(SEQ ID NO.64)和子区域1-3(SEQ ID NO.65),分别设计3对甲基化检测引物对;对于区域2(SEQ ID NO.2)的子区域2-1(SEQ ID NO.66),设计2对甲基化检测引物对,对于子区域2-2(SEQ ID NO.67)和子区域2-3(SEQ ID NO.68),分别设计3对甲基化检测引物对;对于区域3(SEQ ID NO.3)的子区域3-1(SEQ ID NO.69)和子区域3-2(SEQ ID NO.70),分别设计2对甲基化检测引物对,具体如表1所示。
表1区域1~3特异性的甲基化检测引物对和检测探针的核苷酸序列
将表1中的引物对分别人工合成,并稀释至合适的浓度备用。以构建的含有经亚硫酸氢盐转化后的目标区域的质粒载体作为模板,使用SYBR Green体系进行荧光定量PCR反应。具体地,在分析序列如SEQ ID NO.10~11所示的甲基化引物对的性能时,在PCR反应管中加入稀释好的如SEQ ID NO.10~11所示的甲基化引物对,并以含SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.7的质粒载体作为模板,每种模板浓度均为103copies/μL,二者等体积混合均匀,再加入SYBR Green PCR mix,即可进行扩增反应,PCR配置体系如表2所示,反应程序如表3所示。根据熔解曲线分析针对每个子区域的甲基化引物对的扩增特异性,当熔解曲线仅展示出一个峰时,表明扩增产物是单一的。此外,将各个子区域的DNA序列(完全甲基化且经亚硫酸氢盐转化的序列)分别人工合成,并构建至pMD18T质粒载体上,再依次将质粒载体稀释至106、105、104、103、102、101、0copies/μL,以稀释好的质粒作为标准品,进行PCR扩增,根据得到的Ct值以及质粒载体浓度的对数值绘制标准曲线,并计算每对甲基化引物对扩增子区域的扩增效率。
要求甲基化引物对仅扩增含转化后的甲基化序列的质粒模板,而不扩增含转化后的未甲基化序列的质粒模板,且每对甲基化引物对扩增目标区域的扩增效率大于等于90%而小于等于110%。经过筛选,最佳的扩增各个子区域的甲基化引物对如表4所示。
表2 SYBR Green PCR体系配置
2×SYBR Green PCR mix | 12.5μL |
上游引物 | 1μL |
下游引物 | 1μL |
模板 | 5μL |
超纯水 | 补足25μL |
表3 SYBR Green PCR反应程序
表4 最佳的甲基化检测引物对
随后,设计用于QMSP检测且与每对甲基化检测引物对相匹配的TaqMan检测探针。TaqMan探针5’端连接有荧光基团,如FAM、ROX、CY5、VIC等,其3’端连接有荧光淬灭基团,如BHQ、BHQ1等。在PCR过程中,TaqMan检测探针与待检测的模板特异性结合,若甲基化引物对进行延伸时,具有5’-3’外切酶活性的Taq酶可以切下探针5’端的荧光基团,此时3’端淬灭基团失去了对荧光基团的淬灭作用,荧光基团发出荧光,测定每个循环中报告的荧光强度即可得到该区域特定位点的甲基化水平。检测各个子区域的荧光探针其5’端荧光报告基因均为FAM,其3’端荧光淬灭基团均为MGB,将设计的荧光探针人工合成,并在TaqMan PCR体系中分析甲基化检测引物与检测探针联用的效果。要求针对目标区域的扩增曲线呈S型,未加入模板的阴性对照管无扩增,而加入含103copies/μL的目标区域的质粒载体时,Ct值小于30。最终得到的用于TaqMan PCR体系的甲基化检测引物对和检测探针的序列如表4所示,表4中的甲基化检测引物对和检测探针可检测的甲基化胞嘧啶位点如表5所示。
表5最佳甲基化检测引物对和检测探针可识别的甲基化胞嘧啶位点
表6TaqMan PCR扩增体系
表7QMSP反应程序
培养并收获膀胱移行癌细胞5637、T24,以及人永生化的膀胱正常上皮细胞SV-HUC-1,使用PBS洗涤后,加入蛋白酶K,使用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取培养细胞的基因组DNA备用。使用天根DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(DP215)进行DNA的转化和纯化。随后以回收的基因组DNA为模板,使用表4中提供的甲基化检测引物对和探针进行QMSP反应,具体的PCR反应体系如表6所示,PCR反应程序如表7所示。除检测目标区域以外,还需在扩增体系中加入内参基因ACTB的扩增引物对和检测探针,用以监测样本质量,扩增ACTB基因的上游引物、下游引物及检测探针的序列分别为5’-AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG-3’(SEQ ID NO.60)、5’-AATAACACCCCCACCCTGC-3’(SEQ IDNO.61)、5’-GGAGTGGTTTTTGGGTTTG-3’(SEQ ID NO.62)。ACTB基因检测探针5’端的荧光基团为ROX,其3’端的荧光淬灭基团均为BHQ。经QMSP实验发现,当以转化后的两种膀胱癌细胞系的基因组DNA为模板时,表4中的甲基化检测引物对和探针扩增各个子目标区域的Ct值都低于34;当以转化后的膀胱正常上皮细胞系的基因组DNA为模板时,表4中的甲基化检测引物对和探针扩增各个子目标区域的Ct值都高于38;以上结果表明表4中各个子区域在膀胱癌细胞系的甲基化水平高于其在膀胱正常上皮细胞系的甲基化水平。
实施例2
QMSP法检测目标区域的甲基化水平诊断膀胱癌患者尿液样本的性能
1.样本收集
本实施例收集了160例经病理检测确诊的膀胱癌患者及108例常规体检的健康人的尿液样本。160例膀胱癌患者中,非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)患者(包括Tis期、Ta期、T1期)有64例,肌层浸润性膀胱癌(MIBC)患者(包括T2期、T3期和T4期)有96例。此外,还收集了常见的泌尿系统良性疾病(包括腺性膀胱炎、泌尿道感染、前列腺增生、肾结石、肾积水等)患者的尿液样本60例,收集到的每份尿液样本的体积大于50mL。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理。
2.样本DNA提取
使用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20210740号)进行尿液样本DNA的提取,具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.尿液样本DNA的转化和纯化:
使用武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)进行尿液样本DNA的转化和纯化,具体操作步骤见试剂盒说明书。
4.QMSP
以经过亚硫酸氢盐转化和纯化的尿液样本DNA为模板,分别加入表4中提供的某一子区域特异性的甲基化检测引物对和检测探针,同时加入内参基因ACTB的检测引物对和检测探针,再按照表6加入QMSP的必要成分配置扩增体系。此时,还需设置阳性对照和阴性对照。阴性对照的扩增体系与实验管类似,只是模板为等体积的超纯水;阳性对照的扩增体系也与实验管类似,但是模板为103copies/μL含待测目标区域(转化后序列)的质粒和103copies/μL含转化后ACTB序列的质粒等体积混合而成。随后在荧光定量PCR仪器上按照表7设置的程序进行反应。反应结束后,查看待测样本中针对各个子区域及ACTB的扩增曲线,并导出每个样本相应的Ct值。进一步根据质量控制的要求剔除检测不成功的样本,读取合格样本的Ct值。所述质量控制的标准为:1)阴性对照管不起线,无扩增;2)阳性对照管扩增曲线呈S型,且所有基因的Ct值在25-30之间;3)实验管内参基因的Ct值小于等于33。若不满足上述质量控制要求,则此样本需重新检测。
5.结果分析
对于每一待测尿液样本,计算引物对和探针扩增某一子区域的Ct值与扩增ACTB基因的Ct值的差值,即ΔCt值,ΔCt=Ct子目标区域-CtACTB。利用SPSS软件,根据ΔCt值对膀胱癌患者和非癌受试者的尿液样本进行ROC(Receiver operating characteristic curve,受试者操作特征曲线)分析,记录约登指数(Youden’s index,其值为灵敏度和特异性之和减去1)最大时的灵敏度、特异性、截断值和AUC值。各个子区域诊断膀胱癌和非癌尿液样本的ROC曲线如图1所示。利用各个子区域的甲基化水平诊断膀胱癌患者尿液样本的性能如表8所示。
表8每个子区域诊断膀胱癌尿液样本的性能
从表8可以看出,通过检测区域1至3中各个子区域的甲基化水平,可以有效区分膀胱癌患者和非癌受试者。各个子区域的诊断性能良好,其AUC值最大可达0.866,最小为0.737;其检测膀胱癌患者尿液样本的灵敏度范围为60.6%~77.5%;其检测非癌受试者尿液样本的特异性范围为88.7%~97.0%。具体的,子区域2-3的诊断性能最佳,其AUC值为0.866,其检测膀胱癌患者尿液样本的灵敏度为76.3%;其检测非癌受试者尿液样本的特异性为95.8%。
根据表8中的截断值进一步分析通过检测各个子区域的甲基化水平诊断非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)患者和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)患者尿液样本的灵敏度,以及其诊断健康人和泌尿系统良性疾病患者尿液样本的特异性。具体的,在一个待测样本中,若针对某一子区域的ΔCt值大于截断值,则该样本为非膀胱癌样本,若针对某一子区域的ΔCt值小于等于截断值,则该样本为膀胱癌阳性样本。灵敏度为病理阳性的样本中该判断方法诊断为阳性的比例,特异性为病理阴性的样本中该判断方法诊断为阴性的比例,诊断结果如表9所示。
表9每个子区域诊断不同病理分期膀胱癌尿液样本的性能
由表9可以看出,各个子区域对不同病理分期的膀胱癌患者尿液样本也具有一定的检出率。总体看来,其检测早期膀胱癌(NMIBC)患者尿液样本的灵敏度范围为48.44%~65.63%;其检测中晚期膀胱癌(MIBC)患者尿液样本的灵敏度范围为68.75%~86.46%;其检测健康人尿液样本的特异性范围为96.30%~100%;其检测泌尿系统良性疾病患者尿液样本的特异性范围为76.67%~91.67%。具体来看,子区域2-2和2-3对各种样本的检测效果均较好,且二者检测效果不相上下。
实施例3
QMSP法检测区域组合的甲基化水平诊断膀胱癌患者尿液样本的性能
为进一步提高试剂盒诊断膀胱癌的性能,尤其是提高其对早期膀胱癌的检出率,本实施例分析了同时检测两个区域组合的甲基化水平进而诊断膀胱癌的性能。整理各个样本中待分析的子区域的ΔCt值及对应的样本状态(癌症阳性或阴性),使用二元logistic回归的方法构建诊断模型,并写出预测概率的方程。分别选择一个诊断性能最佳的子区域代表区域1(SEQ ID NO.1)、区域2(SEQ ID NO.2)和区域3(SEQ ID NO.3),如选择1-1(SEQ IDNO.63)代表区域1,选择2-3(SEQ ID NO.68)代表区域2,选择3-2(SEQ ID NO.70)代表区域3。两个子区域组合诊断膀胱癌和非癌尿液样本的ROC曲线如图2所示。分析三个子区域中任意二者组合诊断膀胱癌患者尿液样本的性能,结果如表10所示。
表10 两个子区域组合诊断膀胱癌尿液样本的性能
组合 | 子区域组合 | 灵敏度 | 特异性 | AUC值 | 95%置信区间 | 截断值 |
1 | 1-1+2-3 | 80.6% | 95.2% | 0.888 | 0.848~0.927 | 0.276 |
2 | 1-1+3-2 | 80.6% | 95.23% | 0.882 | 0.841~0.922 | 0.280 |
3 | 2-3+3-2 | 86.3% | 95.8% | 0.913 | 0.878~0.948 | 0.182 |
预测概率P的公式:公式①
组合1:公式②
f(x)=-0.314×ΔCtS4-1-0.458×ΔCtS5-3+10.152
组合2:公式③
f(x)=-0.382×ΔCtS4-1-0.309×ΔCtS6-2+9.008
组合3:公式④
f(x)=-0.527×ΔCtS5-3-0.362×ΔCtS6-2+11.832
利用上述诊断模型诊断待测样本的方法如下所示:
使用组合1的甲基化水平诊断待测样本时,计算待测样本作为模板时,扩增组合1中2个子区域组合的ΔCt值,根据公式①和公式②计算预测概率P值,比较P值与截断值0.276的大小,若P值大于等于0.276,则待测样本为膀胱癌阳性样本,若P值小于0.276,则待测样本为非膀胱癌样本。
使用组合2的甲基化水平诊断待测样本时,计算待测样本作为模板时,扩增组合2中2个子区域组合的ΔCt值,根据公式①和公式③计算预测概率P值,比较P值与截断值0.280的大小,若P值大于等于0.280,则待测样本为膀胱癌阳性样本,若P值小于0.280,则待测样本为非膀胱癌样本。
使用组合3的甲基化水平诊断待测样本时,计算待测样本作为模板时,扩增组合3中2个子区域组合的ΔCt值,根据公式①和公式④计算预测概率P值,比较P值与截断值0.182的大小,若P值大于等于0.182,则待测样本为膀胱癌阳性样本,若P值小于0.182,则待测样本为非膀胱癌样本。
由表10可以看出,通过检测三个子区域中任意两个子区域组合的甲基化水平诊断膀胱癌患者尿液样本的性能优于单个子区域的诊断性能。表10中的3种组合方式其AUC值均大于0.88,展示出优异的诊断效果,具体的,其诊断膀胱癌患者尿液样本的灵敏度均高于80%,其诊断非癌受试者尿液样本的特异性均高于95%。另外,组合3的诊断效果最佳,其诊断的灵敏度和特异性高于其它两种组合方式。
另外,任意两个子区域组合的甲基化水平诊断不同病理分期膀胱癌患者尿液样本的性能如表11所示。
表11 两个子区域组合诊断不同病理分期膀胱癌尿液样本的性能
由表11可以看出,任意两个子区域组合的甲基化水平诊断早期膀胱癌(NMIBC)患者尿液样本的灵敏度比单个子区域的诊断性能有较大的提升,均不低于68%;其诊断中晚期膀胱癌(MIBC)患者尿液样本的灵敏度不低于86%;其检测健康人尿液样本的特异性均达到100%;其检测泌尿系统良性疾病患者尿液样本的特异性不低于86%。同样的,组合3的诊断效果最佳。
实施例4QMSP法检测区域组合的甲基化水平诊断膀胱癌患者尿液样本的性能
本实施例分析了同时检测三个区域的甲基化水平进而诊断膀胱癌的性能。整理各个样本中待分析的子区域1-1(SEQ ID NO.63)、2-3(SEQ ID NO.68)和3-2(SEQ ID NO.70)的ΔCt值及对应的样本病理状态(癌症阳性或阴性),使用二元logistic回归的方法构建诊断模型,并写出预测概率的方程。三个子区域组合诊断膀胱癌和非癌尿液样本的ROC曲线如图3所示,同时检测3个子区域组合的甲基化水平诊断膀胱癌尿液样本的灵敏度、特异性及诊断的截断值如表12所示。
表12 三个子区域组合诊断膀胱癌尿液样本的性能
组合 | 子区域组合 | 灵敏度 | 特异性 | AUC值 | 95%置信区间 | 截断值 |
4 | 1-1+2-3+3-2 | 87.6% | 95.8% | 0.914 | 0.876~0.947 | 0.236 |
组合4:公式⑤
f(x)=-0.195×ΔCtS4-1-0.388×ΔCtS5-3-0.264×ΔCtS6-2+11.113
利用上述诊断模型诊断待测样本的方法如下所示:
使用组合4的甲基化水平诊断待测样本时,计算待测样本作为模板时,扩增组合4中3个子区域组合的ΔCt值,根据公式①和公式⑤计算预测概率P值,比较P值与截断值0.236的大小,若P值大于等于0.236,则待测样本为膀胱癌阳性样本,若P值小于0.236,则待测样本为非膀胱癌样本。
由表12可以看出,通过检测三个子区域组合的甲基化水平诊断膀胱癌患者尿液样本的性能优于单个子区域的诊断性能,但是其与检测两个子区域组合的诊断性能相差不多。该诊断方法检测膀胱癌患者尿液样本的灵敏度为87.6%,其检测非癌受试者尿液样本的特异性为95.8%。通过上述方法,计算得出检测三个子区域组合的甲基化水平诊断早期膀胱癌(NMIBC)患者尿液样本的灵敏度为78.13%,其诊断中晚期膀胱癌(MIBC)患者尿液样本的灵敏度为89.58%,其诊断健康人尿液样本的特异性为100%,其诊断泌尿系统良性疾病患者尿液样本的特异性为86.67%。
综上,通过诊断多个子区域组合的甲基化水平,可以显著提高诊断膀胱癌尿液样本的性能,但是子区域的数量并不是越多越好,如本发明中检测两个子区域的甲基化水平的诊断效果与检测三个子区域类似,考虑操作的简便性、性价比等因素,检测组合3中2-3和3-2的甲基化水平来诊断膀胱癌可获得较大收益。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于膀胱癌诊断或辅助诊断的试剂,其特征在于,包括用于检测生物样本中目标区域甲基化水平的试剂,所述目标区域选自如下至少一种区域中的全长区域或部分区域:区域1、区域2和区域3;
以GRCh38为参考基因组,所述区域1选自Chr2:70888818-70889103负链,区域2选自Chr5:135038904-135039319正链,区域3选自Chr7:156616479-156616686负链。
2.如权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述部分区域包括如下至少一种所述区域的子区域:
所述区域1的子区域包括子区域1-1、子区域1-2和子区域1-3,所述子区域1-1选自Chr2:70888818-70888907,所述子区域1-2选自Chr2:70888900-70889009,所述子区域1-3选自Chr2:70889006-70889103;
所述区域2的子区域包括子区域2-1、子区域2-2和子区域2-3,所述子区域2-1选自Chr5:135038904-135038999,所述子区域2-2选自Chr5:135038986-135039125,所述子区域2-3选自Chr5:135039176-135039319;
所述区域3的子区域包括子区域3-1和子区域3-2,所述子区域3-1选自Chr7:156616479-156616568,所述子区域3-2选自Chr7:156616572-156616686。
3.如权利要求1或2所述的试剂,其特征在于,所述试剂包括引物对;可选地,所述试剂还包括与所述引物对对应的检测探针。
4.如权利要求3所述的试剂,其特征在于,所述引物对包括以下引物对中的至少一组:
用于检测Chr2:70888818-70888907区域内全长或部分区域的甲基化水平的第一引物对、用于检测Chr2:70888900-70889009区域内全长或部分区域的甲基化水平的第二引物对、用于检测Chr2:70889006-70889103区域内全长或部分区域的甲基化水平的第三引物对、用于检测Chr5:135038904-135038999区域内全长或部分区域的甲基化水平的第四引物对、用于检测Chr5:135038986-135039125区域内全长或部分区域的甲基化水平的第五引物对、用于检测Chr5:135039176-135039319区域内全长或部分区域的甲基化水平的第六引物对、用于检测Chr7:156616479-156616568区域内全长或部分区域的甲基化水平的第七引物对、用于检测Chr7:156616572-156616686区域内全长或部分区域的甲基化水平的第八引物对。
5.如权利要求4所述的试剂,其特征在于,所述第一引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.10~11所示、如SEQ ID NO.12~13所示或如SEQ ID NO.14~15所示;
和/或,所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.16~17所示、如SEQ ID NO.18~19所示或如SEQ ID NO.20~21所示;
和/或,所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.22~23所示、如SEQ ID NO.24~25所示或如SEQ ID NO.26~27所示;
和/或,所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.28~29所示或如SEQ ID NO.30~31所示;
和/或,所述第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.32~33所示、如SEQ ID NO.34~35所示或如SEQ ID NO.36~37所示;
和/或,所述第六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.38~39所示、如SEQ ID NO.40~41所示或如SEQ ID NO.42~43所示;
和/或,所述第七引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.44~45所示或如SEQ ID NO.46~47所示;
和/或,所述第八引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.48~49所示或如SEQ ID NO.50~51所示;
优选地,所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.12~13所示;和/或,所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18~19所示;和/或,所述第三引物对的核苷酸序列如SEQID NO.24~25所示;和/或,所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.28~29所示;和/或,所述第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.34~35所示;和/或,所述第六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.40~41所示;和/或,所述第七引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.46~47所示;和/或,所述第八引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.50~51所示。
6.如权利要求5所述的试剂,其特征在于,所述试剂还包括与所述引物对对应的检测探针,其中:
与序列如SEQ ID NO.10~11所示、如SEQ ID NO.12~13所示或如SEQ ID NO.14~15所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示;和/或,与序列如SEQ IDNO.16~17所示、如SEQ ID NO.18~19所示或如SEQ ID NO.20~21所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.53所示;和/或,与序列如SEQ ID NO.22~23所示、如SEQID NO.24~25所示或如SEQ ID NO.26~27所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示;和/或,与序列如SEQ ID NO.28~29所示或如SEQ IDNO.30~31所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.55所示;和/或,与序列如SEQ ID NO.32~33所示、如SEQ ID NO.34~35所示或如SEQ ID NO.36~37所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.56所示;和/或,与序列如SEQ IDNO.38~39所示、如SEQ IDNO.40~41所示或如SEQ ID NO.42~43所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQID NO.57所示;和/或,与序列如SEQ ID NO.44~45所示或如SEQ ID NO.46~47所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.58所示;和/或,与序列如SEQ ID NO.48~49所示或如SEQ ID NO.50~51所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.59所示。
7.如权利要求1或2所述的试剂,其特征在于,所述试剂能够检测如下至少一种所述子区域的至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化:
所述子区域1-1的Chr2:70888907、Chr2:70888901、Chr2:70888895、Chr2:70888893、Chr2:70888871、Chr2:70888865、Chr2:70888858、Chr2:70888856、Chr2:70888839、Chr2:70888833和Chr2:70888819中至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化;
所述子区域1-2的Chr2:70889008、Chr2:70889001、Chr2:70888990、Chr2:70888988、Chr2:70888938、Chr2:70888925、Chr2:70888918、Chr2:70888907和Chr2:70888901中至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化;
所述子区域1-3的Chr2:70889097、Chr2:70889086、Chr2:70889059、Chr2:70889045、Chr2:70889023、Chr2:70889012和Chr2:70889008中至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化;
所述子区域2-1的Chr5:135038908、Chr5:135038918、Chr5:135038921、Chr5:135038954、Chr5:135038958、Chr5:135038963、Chr5:135038966、Chr5:135038981和Chr5:135038986中至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化;
所述子区域2-2的Chr5:135038986、Chr5:135039001、Chr5:135039003、Chr5:135039011、Chr5:135039028、Chr5:135039102、Chr5:135039110和Chr5:135039122中至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化;
所述子区域2-3的Chr5:135039178、Chr5:135039183、Chr5:135039193、Chr5:135039257、Chr5:135039270、Chr5:135039301、Chr5:135039308和Chr5:135039316中至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化;
所述子区域3-1的Chr7:156616568、Chr7:156616558、Chr7:156616554、Chr7:156616527、Chr7:156616522、Chr7:156616508、Chr7:156616499、Chr7:156616493和Chr7:156616481中至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化;
所述子区域3-2的Chr7:156616666、Chr7:156616640、Chr7:156616633、Chr7:156616594和Chr7:156616573中至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化。
8.一种用于膀胱癌诊断或辅助诊断的检测试剂盒,其特征在于,包括如权利要求1至7任一项所述的试剂。
9.如权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,还包括PCR反应试剂、甲基化转化试剂、DNA提取试剂、DNA纯化试剂和质控品中的一种或多种。
10.如权利要求1至7任一项所述的试剂或如权利要求8或9所述的试剂盒在制备膀胱癌诊断或辅助诊断产品中的应用。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117757947A (zh) * | 2024-02-21 | 2024-03-26 | 上海金翌生物科技有限公司 | 用于检测膀胱癌生物标志物甲基化水平的引物组、探针组、试剂盒及方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100280134A1 (en) * | 2007-09-17 | 2010-11-04 | Oncomethylome Sciences Sa | Markers for Bladder Cancer Detection |
CN102311953A (zh) * | 2011-09-23 | 2012-01-11 | 上海市肿瘤研究所 | 尿液诊断膀胱癌的方法和试剂盒 |
CN114891886A (zh) * | 2022-05-12 | 2022-08-12 | 武汉艾米森生命科技有限公司 | 用于诊断膀胱癌的核酸产品、试剂盒及应用 |
-
2023
- 2023-01-05 CN CN202310014467.0A patent/CN116004831A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100280134A1 (en) * | 2007-09-17 | 2010-11-04 | Oncomethylome Sciences Sa | Markers for Bladder Cancer Detection |
CN102311953A (zh) * | 2011-09-23 | 2012-01-11 | 上海市肿瘤研究所 | 尿液诊断膀胱癌的方法和试剂盒 |
CN114891886A (zh) * | 2022-05-12 | 2022-08-12 | 武汉艾米森生命科技有限公司 | 用于诊断膀胱癌的核酸产品、试剂盒及应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
QIXUN FANG, ET AL.: "Improved urine DNA methylation panel for early bladder cancer detection.", BMC CANCER., vol. 22, no. 1, 3 March 2022 (2022-03-03), pages 1 - 10 * |
YU XIAO, ET AL.: "Non-invasive diagnosis and surveillance of bladder cancer witn driver and passenger DNA methylation in a prospective cohort study.", CLIN TRANSL MED., vol. 12, no. 8, 15 August 2022 (2022-08-15), pages 1 - 22 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117757947A (zh) * | 2024-02-21 | 2024-03-26 | 上海金翌生物科技有限公司 | 用于检测膀胱癌生物标志物甲基化水平的引物组、探针组、试剂盒及方法 |
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