CN117904301A - 用于检测utp3和znf318基因启动子甲基化诊断食管癌的引物探针组合物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物医学技术领域的一种用于检测UTP3和ZNF318基因启动子甲基化诊断食管癌的引物探针组合物及试剂盒。所述引物探针组合物用于同时检测UTP3和ZNF318基因启动子中目标区域的甲基化水平；以GRCh38.p14为参考基因组，UTP3基因启动子中的目标区域选自Chr4:70687846‑70688477区域及其互补序列，和Chr4:70687846‑70688477区域中的部分区域及其互补序列中的至少一个；ZNF318基因启动子中的目标区域选自Chr6:43370021‑43369479区域及其互补序列，和Chr6:43370021‑43369479区域中的部分区域及其互补序列中的至少一个。利用该引物探针组合物构建的甲基化多重PCR体系，能够实现对UTP3和ZNF318基因启动子甲基化水平的同时检测，且检测结果具有良好的灵敏度和特异性，能够用于食管癌患者的早期诊断及辅助诊断。
Description
技术领域
本申请涉及生物医学技术领域，尤其是涉及一种用于检测UTP3和ZNF318基因启动子甲基化诊断食管癌的引物探针组合物及试剂盒。
背景技术
食管癌是一种常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。食管癌的病死率接近80％，是一种恶性程度很高的癌症。导致食管癌高死亡率的重要因素是早期食管癌的确诊率低。早期食管癌的治愈率远高于中晚期，但是由于早期食管癌缺乏明显和特异的症状，绝大部分患者确诊时已经发展进入中晚期。临床研究发现，癌症从病灶开始形成到患者出现临床症状的过程平均需要数年时间；这为发现早期食管癌、提高早期食管癌的确诊率提供了一个有效的窗口期。充分利用这个窗口期，有望提高食管癌治疗效果、降低食道癌死亡率。
目前临床上应用于食管癌诊断的技术在早期食道癌的检测和筛查方面的应用有限，主要因为：(1)组织活检侵入性强，不适于早癌筛查；(2)影像学检测技术(如：食管造影检查和内镜检查)在设备成本、操作技术和侵入性等方面上的限制，也难以作为癌症筛查技术而大范围推广；(3)传统血清肿瘤标识物(如：AFP、CEA、CA125、和CA199等)对食管癌检测的灵敏度较低，无法充分满足早癌筛查的要求。
近年的研究显示表观遗传学在癌症的发生、发展中起着重要作用。作为表观遗传学的一种重要机制，多种癌症的DNA甲基化调控得到了深入研究。研究数据显示：基因甲基化的调控与染色质结构和基因表达调控等生物学机制相关；细胞基因甲基化的变化发生在肿瘤形成的早期，并贯穿癌症的发生和发展过程；抑癌基因的甲基化是癌前病变组织转化为恶性肿瘤细胞的重要分子机制。但是目前缺乏针对食管癌甲基化基因检测的检测技术、方法和产品。因此，当前对用于食管癌检测的敏感性高和特异性高的甲基化基因标记物存在迫切需求。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本申请提供一种用于检测UTP3和ZNF318基因启动子甲基化诊断食管癌的引物探针组合物，利用引物探针组合物或包括该引物探针组合物的试剂盒可同时对待测样本的UTP3和ZNF318基因启动子中目标区域的DNA甲基化水平进行多重检测，且检测结果具有良好的灵敏度和特异性，根据检测结果即可对待测样本是否患有食管癌进行准确判断，提高了早期食管癌的诊断率，且检测方法简单、高效。
为此，本申请第一方面提供了一种用于检测UTP3和ZNF318基因启动子甲基化诊断食管癌的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物用于同时检测UTP3和ZNF318基因启动子中目标区域的甲基化水平；以GRCh38.p14为参考基因组，UTP3基因启动子中的目标区域选自Chr4:70687846-70688477区域及其互补序列，和Chr4:70687846-70688477区域中的部分区域及其互补序列中的至少一个；ZNF318基因启动子中的目标区域选自Chr6:43370021-43369479区域及其互补序列，和Chr6:43370021-43369479区域中的部分区域及其互补序列中的至少一个。
本申请的发明人通过分别对UTP3和ZNF318基因启动子的DNA序列进行分析，最终获得了UTP3和ZNF318基因启动子中的目标区域。通过对目标区域设计甲基化特异性PCR扩增引物以及匹配的Taqman MGB甲基化特异性探针，构建了UTP3和ZNF318基因启动子甲基化检测的引物探针组合物，利用该引物探针组合物可同时对待测样本的UTP3和ZNF318基因启动子中目标区域的DNA甲基化水平进行多重检测，进而用于食管癌患者的早期诊断及辅助诊断，尤其适用于食管鳞状细胞癌的检测诊断/辅助诊断，可用于不同分期食管癌患者，且检测结果具有良好的灵敏度和特异性，对于食管癌早期诊断及改善患者预后具有重要意义。
在一些实施方式中，所述UTP3基因启动子中的目标区域选自如下所示的区域1至区域3中的至少一个；
区域1为Chr4:70687846-70688040，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
区域2为Chr4:70688106-70688300，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
区域3为Chr4:70688301-70688477，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
所述ZNF318基因启动子中的目标区域选自如下所示的区域4和/或区域5；
区域4为Chr6:43370021-43369749，其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；
区域5为Chr6:43369748-43369479，其核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。
本申请的发明人通过进一步筛选优化最终将UTP3基因启动子的目标区域优化为区域1至区域3中的至少一个，将ZNF318基因启动子的目标区域优化为区域4和/或区域5。通过对区域1至区域3中任一区域中的CpG二核苷酸位点以及区域4和区域5中任一区域中的CpG二核苷酸位点是否发生甲基化进行同时检测，即可对待测样本是否患有食管癌作出精准判定。本申请中的上述区域1至区域3均为正链DNA序列，且均属于Chr4:70687846-70688477区域中的部分区域；上述区域4和区域5均为负链DNA序列，其中区域5属于Chr6:43370021-43369479区域中的部分区域。
在一些实施方式中，所述引物探针组合物包括用于分别检测所述区域1至区域3的引物探针组1至引物探针组3中的至少一组，以及用于分别检测所述区域4和/或区域5的引物探针组4和/或引物探针组5；其中，引物探针组1至引物探针组5中均分别包括一对上、下游引物和一条检测探针，引物探针组1中上、下游引物和检测探针的核苷酸序列分别如SEQID NO:2-5所示，引物探针组2中上、下游引物和检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6-8所示，引物探针组3中上、下游引物和检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:10-12所示，引物探针组4中上、下游引物和检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:14-16所示，引物探针组5中上、下游引物和检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:18-20所示。
本申请的引物探针组合物包括至少一组用于对UTP3基因启动子的目标区域的甲基化水平进行检测的引物探针组和至少一组用于对ZNF318基因启动子的目标区域的甲基化水平进行检测的引物探针组，检测过程中通过将该引物探针组合物添加到PCR反应体系中，即可同时对对待测样本的UTP3和ZNF318基因启动子中目标区域的DNA甲基化水平进行多重检测。具体地，本申请通过对上述区域1至区域5序列中胞嘧啶甲基化位点进行分析，并根据上述区域中的甲基化位点设计了针对各区域的甲基化特异性PCR扩增上、下游引物以及匹配的Taqman MGB甲基化特异性探针，利用所设计的引物探针组合物能够对UTP3和ZNF318基因启动子的甲基化水平进行准确检测，检测结果准确可靠，适用于食管癌、尤其是食管鳞癌的辅助诊断，有利于食管鳞癌的早诊早治，降低患者痛苦和检测费用。
在一些实施方式中，所述引物探针组合物包括用于检测所述区域2的引物探针组2和用于检测所述区域5的引物探针组5。
本申请的发明人通过对检测UTP3基因启动子的目标区域的甲基化水平的引物探针组以及检测ZNF318基因启动子的目标区域的甲基化水平的引物探针组进行组合分析，发现引物探针组合2+引物探针组合5的组合对待测样本是否患有食管癌的诊断效果最佳，利用该组合的引物探针组合物进行检测后的检测结果具有更高的灵敏度和特异性，对于不同分期食管癌的检测灵敏度均在84％以上，对于进展期食管癌的检测灵敏度达96％以上，可以对早期食管鳞癌进行有效诊断，对食管癌的早筛早干预有重大意义。
在一些实施方式中，所述引物探针组合物中还包括针对β-Actin内参基因的引物探针组；所述β-Actin内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示，所述针对β-Actin内参基因的引物探针组中的上、下游引物和检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:22-24所示。
本申请还设计了针对内参基团的上、下游引物和检测探针，在对待测样本进行检测时同时加入上述针对内参基团的上、下游引物和检测探针可以监测采样情况以及监测反应体系中是否存在PCR抑制物及反应系统(试剂、PCR程序、荧光收集等)是否正常，以确保检测过程的准确性。
在一些实施方式中，所述引物探针组1至引物探针组3中的检测探针的5’端均标记有FAM荧光报告基团，3’端均标记有MGB荧光淬灭基团；所述引物探针组4和引物探针组5中的检测探针的5’端均标记有VIC荧光报告基团，3’端均标记有MGB荧光淬灭基团；所述针对β-Actin内参基因的引物探针组中的检测探针的5’端标记有ROX荧光报告基团，3’端标记有MGB荧光淬灭基团。
本申请中的检测探针的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有荧光淬灭基团，且当检测探针完整的时候，荧光报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收。本申请中检测UTP3基因启动子目标区域的检测探针，检测ZNF318基因启动子目标区域的检测探针，以及检测β-Actin内参基因的检测探针上所标记的荧光报告基团互不相同，以便根据不同荧光通道中获得的扩增曲线的CT值对检测结果进行判定。需要注意的是，本申请所述检测探针上所标记的荧光报告基团不限于此，只要能保证检测UTP3基因启动子目标区域的检测探针，检测ZNF318基因启动子目标区域的检测探针，以及检测β-Actin内参基因的检测探针上所标记的荧光报告基团互不相同即可。
本申请中，利用所述引物探针组合物同时对待测样本的UTP3和ZNF318基因启动子中目标区域的DNA甲基化水平进行多重检测的方法为甲基化特异性多重PCR，该该方法首先用亚硫酸氢盐处理待测样本的DNA片段，然后利用特异性的引物探针组合物开展实时定量PCR，随着两个目标序列甲基化状态的不同，针对各目标序列的检测探针只能与亚硫酸氢盐转化的甲基化DNA序列或者亚硫酸氢盐转化的未甲基化的DNA序列中的一种进行杂交，如果检测探针能与DNA杂交则释放出荧光信号，信号强度与PCR产物的量成正比，据此可获得待测样本中UTP3和ZNF318基因启动子的甲基化程度。这种方法最大的优势在于其高通量和高敏感性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。
本申请第二方面提供了一种用于检测UTP3和ZNF318基因启动子甲基化诊断食管癌的试剂盒，所述试剂盒中包括如本申请第一方面所述的引物探针组合物和包含dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+的PCR反应试剂。
本申请中，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶，所述PCR反应试剂还可以包括扩增缓冲液。在一些具体实施方式中，所述PCR反应试剂为2×Robustart Premix OmniⅢ(ProbeqPCR)。
在一些实施方式中，所述引物探针组合物中包括引物探针组1、引物探针组5和针对β-Actin内参基因的引物探针组。
本申请的发明人通过筛选优化，当试剂盒中的以引物探针组合物为引物探针组1、引物探针组5和针对β-Actin内参基因的引物探针组的组合时，能使该试剂盒对待测样本是否患有食管癌的诊断效果最佳，检测结果具有更高的灵敏度和特异性。
在一些实施方式中，所述试剂盒中还包括阳性质控品和阴性质控品；所述阳性质控品为含有完全甲基化的UTP3基因启动子的目标区域的质粒和含有完全甲基化的ZNF318基因启动子的目标区域的质粒，所述阴性质控品为人非甲基化全基因组DNA。
本申请通过在试剂盒内设置阳性质控品和阴性质控品，在对待测样本进行检测时，同时对阳性质控品和阴性质控品进行分别检测，以对检测结果进行质量控制，确保检测过程的有效性，进一步提高检测结果的准确性。
在一些实施方式中，采用所述试剂盒对待测样本进行检测后，若待测样本的UTP3基因启动子的目标区域和ZNF318基因启动子的目标区域中的至少一个判定为甲基化阳性，则待测样本为食管癌阳性样本；若待测样本的UTP3基因启动子的目标区域和ZNF318基因启动子的目标区域均判定为甲基化阴性，则待测样本为食管癌阴性样本。
本申请中，待测样本的UTP3基因启动子的目标区域和ZNF318基因启动子的目标区域甲基化阳性的判定标准通过相应荧光通道获得的扩增曲线的Ct值来判定。对于组织样本，若扩增某一目标区域的Ct值≤36.5，则认为该样本中此目标区域为甲基化阳性，若扩增某一目标区域的Ct值＞36.5，则认为该样本中此目标区域为甲基化阴性。对于血液样本，若扩增某一目标区域的Ct值≤38.0，则认为该样本中此目标区域为甲基化阳性，若扩增某一目标区域的Ct值＞38.0，则认为该样本中此目标区域为甲基化阴性。
本申请中，利用所述试剂盒采用甲基化特异性多重PCR方法对待测样本进行检测的具体步骤如下：
S1，提取待测样本的DNA模板，对并所述DNA模板进行亚硫酸盐转化，获得亚硫酸盐转化后的DNA模板；
S2，将所述亚硫酸盐转化后的DNA模板、所述的引物探针组合物和PCR反应试剂混合后，形成多重PCR反应体系；
S3，对所述反应体系进行实时荧光定量PCR扩增，得到不同荧光通道的扩增曲线；
S4，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断。
本申请中，所述反应体系中各引物的终浓度均为0.3～0.5μM，各检测探针的终浓度均为0.1～0.3μM。通过将反应体系内上、下游引物和检测探针的浓度控制在上述范围内，使得所述方法的检测效果最好，反应效率最高；反应体系内上、下游引物和检测探针的浓度过高或高低均会降低检测效果。
本申请中，所述试剂盒所检测的待测样本选自血液样本、组织样本和食管来源的细胞样本中的任意一种，所检测的食管癌为食管鳞癌。
本申请的待测样本除了组织样本和食管来源的细胞样本外，还可以为血液样本，采用血液样本可简化取样环节，减小取样创伤，可大大提高食管癌检测诊断试剂的可及性。同时针对不同的待测样本可以选择对应的DNA提取试剂盒进行模板DNA的提取。
本申请的有益技术效果为：利用本申请所提供的引物探针组合物或者包括该引物探针组合物的试剂盒能够构建甲基化多重PCR体系，能够同时对待测样本的UTP3和ZNF318基因启动子中目标区域的DNA甲基化水平进行多重检测，进而用于食管癌患者的早期诊断及辅助诊断，尤其适用于食管鳞状细胞癌的检测诊断/辅助诊断，可用于不同分期食管癌患者，且检测结果具有良好的灵敏度和特异性，提高了早期食管癌的诊断率，利于食管癌的早诊早治，降低患者痛苦和检测费用。同时检测方法便捷、快速、无创，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为采用引物探针组2和引物探针组5的组合对进展期食管癌组织样本中甲基化位点进行检测的阳性结果示意图。
图2为采用引物探针组2和引物探针组5的组合对癌旁组织样本中甲基化位点进行检测的阴性结果示意图。
图3为采用引物探针组2和引物探针组5的组合对进展期食管癌血液样本中甲基化位点进行检测的阳性结果示意图。
图4为采用引物探针组2和引物探针组5的组合对正常人血液样本中甲基化位点进行检测的阴性结果示意图。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本申请，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：引物探针组合物的设计与合成
本申请的发明人通过分别对UTP3和ZNF318基因启动子的DNA序列进行分析，获得了UTP3和ZNF318基因启动子中的目标区域。UTP3基因启动子中的目标区域(以GRCh38.p14为参考基因组)为：Chr4:70687846-70688477区域及其互补序列，和Chr4:70687846-70688477区域中的部分区域及其互补序列；ZNF318基因启动子中的目标区域(以GRCh38.p14为参考基因组)为：Chr6:43370021-43369479区域及其互补序列，和Chr6:43370021-43369479区域中的部分区域及其互补序列。通过对上述目标区域进一步筛选优化，最终将UTP3基因启动子中的目标区域优化定义为区域1至区域3中的至少一种，将ZNF318基因启动子中的目标区域优化定义为区域4和/或区域5。其中，区域1为Chr4:70687846-70688040(正链)，其核苷酸序列如表1中SEQ ID NO:1所示；区域2为Chr4:70688106-70688300(正链)，其核苷酸序列如表1中SEQ ID NO:5所示；区域3为Chr4:70688301-70688477(正链)，其核苷酸序列如表1中SEQ ID NO:9所示；区域4为Chr6:43370021-43369749(负链)，其核苷酸序列如表1中SEQ ID NO:13所示；区域5为Chr6:43369748-43369479(负链)，其核苷酸序列如表1中SEQ ID NO:17所示。
通过对上述区域1至区域5序列中胞嘧啶甲基化位点进行分析，设计针对各区域的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括用于分别检测所述区域1至区域3的引物探针组1至引物探针组3中的至少一组，以及用于分别检测所述区域4和/或区域5的引物探针组4和/或引物探针组5。其中，针对区域1的引物探针组1中上、下游引物和检测探针的核苷酸序列分别如表1中SEQ ID NO:2-5所示，针对区域2的引物探针组2中上、下游引物和检测探针的核苷酸序列分别如表1中SEQ ID NO:6-8所示，针对区域3的引物探针组3中上、下游引物和检测探针的核苷酸序列分别如表1中SEQ ID NO:10-12所示，针对区域4的引物探针组4中上、下游引物和检测探针的核苷酸序列分别如表1中SEQ ID NO:14-16所示，针对区域5的引物探针组5中上、下游引物和检测探针的核苷酸序列分别如表1中SEQ ID NO:18-20所示。
选择β-actin基因为内参基因，具体核苷酸序列如表1中SEQ ID NO:6所示，通过对β-actin基因进行序列分析，设计针对择β-actin内参基因的上、下游引物和检测探针，具体核苷酸序列如表1中SEQ ID NO:22-24所示。
表1：目标序列、上下游引物以及检测探针的核苷酸序列
实施例2：食管癌检测方法的建立
1.待测样本模板DNA的提取
当所用待测样本是食管组织样本时，采用天根生化科技(北京)有限公司的石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(DP340)提取组织DNA，具体操作参见试剂盒说明书。
当所用待测样本是血液样本时，采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA的提取，具体操作参见试剂盒说明书。
2.DNA模板的亚硫酸盐转化所用核酸转化试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(离心柱型)(DP215)，具体实验操作参见试剂盒说明书。
3.PCR反应
以亚硫酸氢盐转化后的待测样本DNA为模板，同时使用检测UTP3基因启动子的一组引物探针组、检测ZNF318基因启动子的一组引物探针组(参见表1)，按照表2的配方配制PCR反应体系，采用2×Robustart Premix OmniⅢ(Probe qPCR)反应试剂进行甲基化定量PCR反应，PCR反应条件如表3所示。因此，每个PCR反应可同时检测UTP3基因启动子、ZNF318基因启动子在某一待测样本中的甲基化水平。此外，PCR反应体系中还需要加入针对β-actin内参基因的引物探针组来扩增β-actin的基因序列，从而用来监控反应体系中是否存在PCR抑制物及反应系统(试剂、PCR程序、荧光收集等)是否正常。
用于检测UTP3基因启动子甲基化水平的引物探针组有引物探针合1、引物探针组2和引物探针组3；用于检测ZNF318基因启动子甲基化水平的引物探针组包括引物探针组4和引物探针组5。在检测某一待测样本时，分别从引物探针组1-3中挑选任意一种，从引物探针组4 -5中挑选任意一种，并尝试6种引物探针组的所有组合方式(如表4所示)，用于同时检UTP3基因和ZNF318基因启动子在该样本上的甲基化水平，并分析比较不同的引物探针组合的诊断性能。
表2：PCR反应体系
上述反应体系内，每条引物的终浓度均为0.4μM，每条检测探针的终浓度均为0.2μM。
表3：PCR反应条件
表4：UTP3基因启动子和ZNF318基因启动子的引物探针组的组合方式
| 组合方式 | UTP3基因启动子 | ZNF318基因启动子 |
| A | 引物探针组合1 | 引物探针组合4 |
| B | 引物探针组合2 | 引物探针组合4 |
| C | 引物探针组合3 | 引物探针组合4 |
| D | 引物探针组合1 | 引物探针组合5 |
| E | 引物探针组合2 | 引物探针组合5 |
| F | 引物探针组合3 | 引物探针组合5 |
4.试验结果读取
使用仪器配套软件对数据进行读取、分析。SLAN-96P机型结果读取：
(1)PCR扩增程序结束后，在菜单栏点击“常用选项”-扩增曲线-绝对荧光值法-页面下方的确定-菜单栏“分析”；
(2)基线设置：反应结束后，手动调整基线10-22个循环；
(3)荧光阈值设置：根据扩增曲线，划定合适的荧光阈值。β-actin阈值设定原则以阈值线处于阳性对照的指数扩增期的初始阶段拐点处为准；检测组合方式A～F任一区域在样本中的甲基化状态的阈值设定原则以阈值线超过阴性对照的最高点，且处于阳性对照的指数扩增期的初始阶段拐点处为准；
(4)Ct值确定：设定基线及荧光阈值后，阈值线与扩增曲线的交点为Ct值。
5.质量控制：
阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照的Ct值应在26-30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤30.0，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
6.PCR结果分析和判读根据检测后UTP3基因启动子、ZNF318基因启动子的扩增曲线Ct值来判断待测样本的甲基化水平。对于组织样本，若扩增某一目标区域的Ct值≤36.5，则认为该样本中此目标区域为甲基化阳性，若扩增某一目标区域的Ct值＞36.5，则认为该样本中此目标区域为甲基化阴性。对于血液样本，若扩增某一目标区域的Ct值≤38.0，则认为该样本中此目标区域为甲基化阳性，若扩增某一目标区域的Ct值＞38.0，则认为该样本中此目标区域为甲基化阴性。若待测样本的UTP3基因启动子的目标区域和ZNF318基因启动子的目标区域中的至少一个判定为甲基化阳性，则待测样本为食管癌阳性样本；若待测样本的UTP3基因启动子的目标区域和ZNF318基因启动子的目标区域均判定为甲基化阴性，则待测样本为食管癌阴性样本。
实施例3：检测UTP3基因启动子和ZNF318基因启动子甲基化的引物探针组的组合筛选
1.食管组织样本的检测
收集安阳某肿瘤医院临床病理确诊为高级别瘤变的食管癌鳞组织50例、进展期食管鳞癌组织60例、早期食管鳞癌组织50例及癌旁组织80例，所有样本为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织，样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有患者均签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理，食管癌患者均为食管鳞癌。分别采用实施例1中设计的引物探针组，按照实施例2中所建立的检测方法和表4中引物探针组的组合方式对待测样本进行甲基化特异性PCR检测，甲基化特异性PCR检测结果与同病理结果进行对比，并计算采用不同引物探针组的组合进行检测的检测结果的灵敏度和特异性(灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化检测为阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化检测为阴性的比例)，检测结果如表5所示。其中，采用引物探针组2和引物探针组5的组合对进展期食管癌组织样本中甲基化位点进行检测的阳性结果示意图如图1所示；采用引物探针组2和引物探针组5的组合对癌旁组织样本中甲基化位点进行检测的阴性结果示意图如图2所示。
表5：不同引物探针组的组合方式对组织样本的检测灵敏度和特异性
由表5可以看出，采用本申请中不同的组合方式来检测食管癌组织样本，其对高级别瘤变食管鳞癌、早期食管鳞癌和进展期食管鳞癌都有较高的检出率，对于高级别瘤变食管鳞癌的检测灵敏度达到70％及以上，对于早期食管鳞癌的检测灵敏度达到75％以上，对于进展期食管鳞癌的检测灵敏度达到85％以上，对于食管鳞癌癌旁正常组织中的检测特异性均高于80％。其中，采用组合方式E(引物探针组2+引物探针组5)进行检测的诊断效果最佳，其对于高级别瘤变食管鳞癌的检测灵敏度可以达到84.00％，对于早期食管癌的检测灵敏度可以达到94.00％，对于进展期食管鳞癌的检测灵敏度可以达到96.67％，该引物探针组是所有组合方式中检出率最高的一种，特异性达100.00％。
以上结果表明，利用组合方式E(引物探针组2+引物探针组5)中的引物探针组来检测组织样本中UTP3基因启动子和ZNF318基因启动子的甲基化水平，能够对早期食管鳞癌进行有效诊断。
2.血液样本的检测
收集安阳某肿瘤医院临床病理确诊为高级别瘤变的食管鳞癌血液样本60例、进展期食管鳞癌血液样本80例、早期食管鳞癌血液样本60例及正常人血液样本100例，样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有患者均签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。食管癌患者均为食管鳞癌。分别采用实施例1中设计的引物探针组，按照实施例2中所建立的检测方法和表4中引物探针组的组合方式对待测样本进行甲基化特异性PCR检测，甲基化特异性PCR检测结果与同病理结果进行对比，并计算采用不同引物探针组的组合进行检测的检测结果的灵敏度和特异性(灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化检测为阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化检测为阴性的比例)，检测结果如表6所示。其中，采用引物探针组2和引物探针组5的组合对进展期食管癌血液样本中甲基化位点进行检测的阳性结果示意图如图3所示；采用引物探针组2和引物探针组5的组合对正常人血液样本中甲基化位点进行检测的阴性结果示意图如图4所示。
表6：不同引物探针组的组合方式对血液样本的检测灵敏度和特异性
由表6可以看出，采用本申请中不同的组合方式来检测血液样本，其对高级别瘤变食管鳞癌、早期食管鳞癌和进展期食管鳞癌都有较高的检出率，对于高级别瘤变食管鳞癌的检测灵敏度达到75％及以上，对于早期食管鳞癌的检测灵敏度达到83％以上，对于进展期食管鳞癌的检测灵敏度达到85％及以上，对于正常人血液的检测特异性均高于80％。其中，采用组合方式E(引物探针组2+引物探针组5)进行检测的诊断效果最佳，其对于高级别瘤变食管鳞癌的检测灵敏度可以达到86.67％，对于早期食管癌的检测灵敏度可以达到95.00％，对于进展期食管鳞癌的检测灵敏度可以达到97.50％，该引物探针组是所有组合方式中检出率最高的一种，特异性达99.00％。
以上结果表明，利用组合方式E(引物探针组2+引物探针组5)中的引物探针组来检测血液样本中UTP3基因启动子和ZNF318基因启动子的甲基化水平，能够对早期食管鳞癌进行有效诊断。
利用组合方式E(引物探针组合2+引物探针组合5)中的引物及探针组合来检测血液样本中UTP3基因和ZNF318基因的甲基化水平，可以对早期食管鳞癌进行有效诊断。同时采用血液样本可简化取样环节，减小取样创伤，可大大提高食管癌检测诊断试剂的可及性。
实施例4：检测UTP3和ZNF318基因启动子甲基化诊断血液样本食管癌的试剂盒
1.试剂盒中引物探针组合物
试剂盒中的引物探针组合物包括实施例中的用于检测UTP3基因启动子中区域2的引物探针组2、用于ZNF318基因启动子中区域5的引物探针组5和针对β-actin内参基因的引物探针组。
2.试剂盒组成成分
试剂盒组成成分具体如表7所示。
表7：试剂盒组成成分
3.试剂盒PCR反应体系的配制
试剂盒PCR反应体系的配制如表8所示。
表8：试剂盒PCR反应体系的配制
| 试剂盒成分 | 用量/人份(μL) |
| PCR反应液 | 23 |
| 亚硫酸盐转化后的DNA模板 | 2 |
试剂盒PCR反应液中各主要成分的体积含量同表2，反应体系内每条引物的终浓度均为0.4μM，每条检测探针的终浓度均为0.2μM。
4.PCR扩增
(1)针对各靶基因检测所选用的荧光通道设置如表9所示。
表9：各靶基因检测荧光通道
(2)按照表10设置PCR扩增程序并运行。
表10：PCR扩增程序
5.质量控制
本试剂盒中阴性对照(阴性质控品)、阳性对照(阳性质控品)检测后各荧光通道检测信号Ct值应符合表11要求。
表11：阴性对照、阳性对照检测信号Ct值要求
6.检测结果判定
阴性对照、阳性对照和内控合格之后，则可按照表12和表13对待测样本检测结果进行判定。
表12：基因检测结果判定
表13：血液样本检测结果判定
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改，以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (10)
1.一种用于检测UTP3和ZNF318基因启动子甲基化诊断食管癌的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物用于同时检测UTP3和ZNF318基因启动子中目标区域的甲基化水平；以GRCh38. p14为参考基因组，UTP3基因启动子中的目标区域选自Chr4:70687846-70688477区域及其互补序列，和Chr4:70687846-70688477区域中的部分区域及其互补序列中的至少一个；ZNF318基因启动子中的目标区域选自Chr6:43370021-43369479区域及其互补序列，和Chr6:43370021-43369479区域中的部分区域及其互补序列中的至少一个。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述UTP3基因启动子中的目标区域选自如下所示的区域1至区域3中的至少一个；
区域1为Chr4:70687846-70688040，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
区域2为Chr4:70688106-70688300，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
区域3为Chr4:70688301-70688477，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
所述ZNF318基因启动子中的目标区域选自如下所示的区域4和/或区域5；
区域4为Chr6:43370021-43369749，其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；
区域5为Chr6:43369748-43369479，其核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。
3. 根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括用于分别检测所述区域1至区域3的引物探针组1至引物探针组3中的至少一组，以及用于分别检测所述区域4和/或区域5的引物探针组4和/或引物探针组5；其中，引物探针组1至引物探针组5中均分别包括一对上、下游引物和一条检测探针，引物探针组1中上、下游引物和检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2-5所示，引物探针组2中上、下游引物和检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6-8所示，引物探针组3中上、下游引物和检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:10-12所示，引物探针组4中上、下游引物和检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:14-16所示，引物探针组5中上、下游引物和检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:18-20所示。
4.根据权利要求3所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括用于检测所述区域2的引物探针组2和用于检测所述区域5的引物探针组5。
5. 根据权利要求1-4中任意一项所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物中还包括针对β-Actin内参基因的引物探针组；所述β-Actin内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示，所述针对β-Actin内参基因的引物探针组中的上、下游引物和检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:22-24所示。
6.根据权利要求5所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组1至引物探针组3中的检测探针的5’端均标记有FAM荧光报告基团，3’端均标记有MGB荧光淬灭基团；所述引物探针组4和引物探针组5中的检测探针的5’端均标记有VIC荧光报告基团，3’端均标记有MGB荧光淬灭基团；所述针对β-Actin内参基因的引物探针组中的检测探针的5’端标记有ROX荧光报告基团，3’端标记有MGB荧光淬灭基团。
7.一种用于检测UTP3和ZNF318基因启动子甲基化诊断食管癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如权利要求1-5中任意一项所述的引物探针组合物和包含dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+的PCR反应试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针组合物中包括引物探针组1、引物探针组5和针对β-Actin内参基因的引物探针组。
9. 根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性质控品和阴性质控品；所述阳性质控品为含有完全甲基化的UTP3基因启动子的目标区域的质粒和含有完全甲基化的ZNF318基因启动子的目标区域的质粒，所述阴性质控品为人非甲基化全基因组 DNA。
10.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，采用所述试剂盒对待测样本进行检测后，若待测样本的UTP3基因启动子的目标区域和ZNF318基因启动子的目标区域中的至少一个判定为甲基化阳性，则待测样本为食管癌阳性样本；若待测样本的UTP3基因启动子的目标区域和ZNF318基因启动子的目标区域均判定为甲基化阴性，则待测样本为食管癌阴性样本。
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