CN117821594A - 一种用于检测食管癌的引物探针组合物、试剂盒和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物医药技术领域的一种用于检测食管癌的引物探针组合物、试剂盒和应用。所述引物探针组合物用于检测RNF31基因启动子中目标区域的DNA甲基化水平；以GRCh38.p14为参考基因组，所述目标区域选自Chr14:24147140‑24148147区域及其互补序列，和Chr14:24147140‑24148147区域中的部分区域及其互补序列中的至少一个。利用该引物探针组合物或者包括该引物探针组合物的试剂盒能够对RNF31基因启动子中目标区域的甲基化位点进行特异性检测，且检测结果具有较高的特异性和灵敏度，检测结果准确可靠，可用于食管癌患者的早期诊断及辅助诊断。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种用于检测食管癌的引物探针组合物、试剂盒和应用。
背景技术
食管癌是一种全球范围内常见的恶性肿瘤，每年导致超过40万人死亡。食管癌分为两种主要的组织病理学亚型：食管鳞状细胞癌(鳞癌)和食管腺癌，二者具有不同的起源细胞、流行病学和肿瘤分子生物学。食管鳞状细胞癌主要来源于食道的鳞状上皮细胞，食管腺癌起源于胃食管交界处的腺细胞，并与食管下段胃酸反流有关。二者的流行病学特征也不同，全球约有79％的食管鳞状细胞癌病例发生在东南亚和中亚，也存在于非洲东南部和南美洲，食管腺癌主要流行与欧洲、北美和大洋洲。食管鳞状上皮内瘤变与食管鳞癌的发生密切相关，属于鳞癌的癌前病变，Barrett食管相关异性增生则是腺癌的癌前病变。
目前，超过90％的食管癌患者确诊时已发展至中晚期，总体5年生存率不到20％，而仅累及粘膜层和粘膜下浅层的早期食管癌通常可经内镜下微创治疗根治，患者的5年生存率可＞95％。因此，癌症的早期发现、早期诊断和早期治疗是降低死亡率、提高生存率的主要策略。内镜和活检病理检查是目前诊断早期食管癌的金标准，但内镜检查需要做镜前准备，且操作复杂，需要专业的技术人员，有侵入性，可能会使用到麻醉剂，因此不适合大规模人群筛查，食管癌检测亟需无创检测方法。
表观遗传改变，比如DNA甲基化和组蛋白修饰是癌症发生和致病过程中的事件。DNA甲基化是指在不改变核苷酸序列的情况下，在CpG二核苷酸的胞嘧啶碱基第5位碳上加入一个甲基基团。基因启动子区域的异常甲基化可以通过抑制基因转录来沉默基因表达。研究表明，异常的DNA甲基化，尤其是抑癌基因的甲基化与食管癌的发生和发展有密切的关系，因此，可以通过检测DNA甲基化状态的改变来实现食管癌的早期诊断。DNA甲基化作为非侵入性诊断的生物标志物，具有广泛的临床应用前景。
人体血液中存在循环游离DNA(cfDNA)，血液中cfDNA来源于凋亡、坏死的细胞或外泌体分泌等，研究发现，癌症患者血液样本中的cfDNA含量高于健康个体的血液样本，肿瘤来源的cfDNA，称为循环肿瘤DNA(ctDNA)，ctDNA中含有肿瘤特异性的遗传改变和表观遗传学改变，可以用作癌症检测的标志物。其中，DNA甲基化水平异常是癌症发生的早期事件，可以用于早期食管癌检测。但由于cfDNA在血液中具有含量少、提取困难、存在周期短等缺点，且血液中的cfDNA来源于全身各个组织，很多标记物在多种类型的癌症中均会出现甲基化异常，因此寻求肿瘤特异性的甲基化标记物充满挑战，目前尚缺乏有效的可用于食管癌检测的血液甲基化标志物及灵敏度特异性满足需求的食管癌诊断试剂盒。
中国专利CN110551822B公开了一种食管癌细胞系迁移表型的分子标志物及其应用。该专利首次发现了RNF31基因表达与食管癌细胞系迁移能力相关，通过检测受试食管癌细胞系中RNF31的表达，可以判断受试食管癌细胞系迁移能力的强弱，利用western blot和q-PCR技术检测siRNA沉默效率，根据对受试食管癌细胞系RNF31蛋白和mRNA含量的检测即可快速判断食管癌的迁移表型，但是该专利既没有明确提示RNF31基因可以用于食管鳞癌的早期诊断标志物，也没有给出如何获得具有足够灵敏度和特异性的检测RNF31基因启动子甲基化水平的试剂盒及其应用。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本申请提供一种用于检测食管癌的引物探针组合物，利用包括该引物探针组合物的试剂盒可对待测样本的RNF31基因启动子中目标区域的DNA甲基化水平进行检测，根据检测结果即可对待测样本是否患有食管癌进行早期诊断，检测方法简单、高效，可用于不同分期的食管癌患者，且检测结果具有良好的灵敏度和特异性。
为此，本申请第一方面提供了一种用于检测食管癌的引物探针组合物，所述引物探针组合物用于检测RNF31基因启动子中目标区域的DNA甲基化水平；以GRCh38.p14为参考基因组，所述目标区域选自Chr14:24147140-24148147区域及其互补序列，和Chr14:24147140-24148147区域中的部分区域及其互补序列中的至少一个。
本申请通过TCGA数据库检索到食管癌相关基因RNF31，对该基因启动子区域进行肿瘤样本及正常组织样本的二代测序，对RNF31基因二代测序结果进行分析后，获得了RNF31基因启动子中的目标区域。通过对目标区域设计甲基化特异性PCR扩增引物以及匹配的Taqman MGB甲基化特异性探针，构建了RNF31基因启动子甲基化检测引物探针组合物，利用该引物探针组合物可用于食管癌患者的早期诊断及辅助诊断，尤其适用于食管鳞状细胞癌的检测诊断/辅助诊断，可用于不同分期食管癌患者，且检测结果具有良好的灵敏度和特异性，对于食管癌早期诊断及改善患者预后具有重要意义。
在一些实施方式中，所述目标区域选自如下所示的区域1至区域4中的至少一个：区域1为Chr14:24147140-24147369，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
区域2为Chr14:24147703-24147481，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
区域3为Chr14:24147716-24147921，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
区域4为Chr14:24147930-24148147，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本申请的发明人通过进一步筛选优化最终将目标区域优化为区域1至区域4中的至少一个，通过对上述任一区域中的CpG二核苷酸位点是否发生甲基化进行检测，即可对待测样本作出精准判定。本申请中的上述区域1、区域3和区域4均为正链DNA序列，且均属于Chr14:24147140-24148147区域中的部分区域；上述区域2为负链DNA序列，属于Chr14:24147140-24148147区域中的部分区域的互补序列。
在一些实施方式中，所述引物探针组合物包括用于分别检测所述区域1至区域4的引物探针组1至引物探针组4中的至少一组；其中引物探针组1中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6-7所示，检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；引物探针组2中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9-10所示，检测探针的核苷酸序列如SEQID NO:11所示；引物探针组3中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12-13所示，检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；引物探针组4中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:15-16所示，检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。
本申请的发明人通过对上述区域1至区域4序列中胞嘧啶甲基化位点进行分析，并根据上述区域中的甲基化位点设计了针对各区域的甲基化特异性PCR扩增上、下游引物以及匹配的Taqman MGB甲基化特异性探针。利用该引物探针组合物或包括该引物探针组合物的试剂盒可对区域1至区域4中的至少一个目标区域中的甲基化位点进行检测，且检测结果具有较高的特异性和灵敏性，检测结果准确可靠，尤其是针对区域2和区域3的引物探针组，检测结果具有更高的特异性和灵敏性，灵敏度均在80％以上，对于进展期食管癌的检测灵敏度达95％及以上，可用于早期高危病变的筛查和辅助诊断，对食管癌的早筛早干预有重大意义。
本申请中，术语“引物”表示这样的寡核苷酸：其能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成，即例如寡核苷酸的3’-末端提供游离3’-OH基团，可以通过模板依赖性DNA聚合酶将更多的“核苷酸”连接至所述3’-OH基团，建立3’至5’磷酸二酯键，由此使用脱氧核苷三磷酸，并且由此释放焦磷酸。
本申请中，术语“上游引物”，是沿着负链进行不间断延长的寡核苷酸；术语“下游引物”，是沿着正链进行不间断延长的寡核苷酸。应理解，当正链和负链的指定发生互换时，对应的上游引物和下游引物的命名也可随之互换。也即，本申请中的上游引物和下游引物是相对而言的。
本申请中的检测探针的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有荧光淬灭基团，且当检测探针完整的时候，荧光报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收。所述荧光报告基团例如可以选自FAM、JOE、VIC、HEX、ROX、TEXAS RED和CY5中的任意一种，所述荧光淬灭基团例如可以选自MGB、BHQ1和BHQ2中的任意一种。在一些具体实施例中，针对上述区域1至区域4的检测探针的5’端所标记的荧光报告基团均为FAM，3’端所标记的荧光淬灭基团均为MGB。
在一些实施方式中，所述引物探针组1所检测的区域1中胞嘧啶甲基化位点选自Chr14:24147370、Chr14:24147375、Chr14:24147380、Chr14:24147413、Chr14:24147415、Chr14:24147421、Chr14:24147429、Chr14:24147459和Chr14:24147469中的至少一个；
所述引物针探针组2所检测的区域2中胞嘧啶甲基化位点选自Chr14:24147672、Chr14:24147669、Chr14:24147665、Chr14:24147655、Chr14:24147652、Chr14:24147650、Chr14:24147643、Chr14:24147641、Chr14:24147639、Chr14:24147634、Chr14:24147630、Chr14:24147627、Chr14:24147618和Chr14:24147607中的至少一个；
所述引物针探针组3所检测的区域3中胞嘧啶甲基化位点选自Chr14:24147827、Chr14:24147834、Chr14:24147838、Chr14:24147855、Chr14:24147858、Chr14:24147862、Chr14:24147871、Chr14:24147879、Chr14:24147900和Chr14:24147906中的至少一个；
所述引物针探针组4所检测的区域4中胞嘧啶甲基化位点选自Chr14:24148029、Chr14:24148033、Chr14:24148054、Chr14:24148060、Chr14:24148069、Chr14:24148099和Chr14:24148106中的至少一个。
本申请所提供的引物探针组合物可用于对上述胞嘧啶甲基化位点至少一个进行检测，为食管癌患者的诊断及辅助诊断提供参考。上述胞嘧啶甲基化位点可作为新的食管癌检测生物标志物，用于不同分期食管鳞癌患者的检测诊断，具有良好的灵敏度和特异性，对于食管癌非介入性检测、早期筛查及改善患者预后具有重要意义。
在一些实施方式中，所述引物探针组合物中还包括针对β-Actin内参基因的引物探针组；所述β-Actin内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述针对β-Actin内参基因的引物探针组中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:18-19所示，检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
本申请还设计了针对内参基团的上、下游引物和检测探针，在对待测样本进行检测时同时加入上述针对内参基团的上、下游引物和检测探针可以监测采样情况以及监测全流程的检测过程，以确保检测过程的准确性。需要注意的是，本申请中针对内参基团的检测探针的5’端也标记有荧光报告基团，3’端也标记有荧光淬灭基团，但是所标记的荧光报告基团和荧光淬灭基团应与针对目标区域的检测探针上所标记的荧光报告基团和荧光淬灭基团不同。在一些具体实施例中，针对内参基团的检测探针的5’端所标记的荧光报告基团为ROX，3’端所标记的荧光淬灭基团为BHQ2。
本申请中，利用所提供的引物探针组合物对RNF31基因启动子中目标区域的DNA甲基化水平进行检测的方法灵活多样，例如检测方法可以为甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。在一些具体实施例中，所述方法为甲基化特异性PCR，该方法首先用亚硫酸氢盐处理待测样本的DNA片段，然后利用特异性的引物探针组合物开展实时定量PCR，随着目标序列甲基化状态的不同，检测探针只能与亚硫酸氢盐转化的甲基化DNA序列或者亚硫酸氢盐转化的未甲化的DNA序列中的一种进行杂交，如果检测探针能与DNA杂交则释放出荧光信号，信号强度与PCR产物的量成正比，据此可计算出待测样本的的甲基化程度。这种方法最大的优势在于其高通量和高敏感性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。
本申请第二方面提供了一种用于检测食管癌的试剂盒，所述试剂盒中包括如本申请第一方面所述的引物探针组合物。
在一些实施方式中，所述试剂盒中还包括PCR反应试剂。
本申请中，所述PCR反应试剂中包括PCR反应所需的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)、dNTPs和Mg2+等成分。在一些具体实施例中，所述PCR反应试剂为2×Robustart Premix OmniⅢ(Probe qPCR)。
本申请所述试剂盒中还可以进一步包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照可以为含有甲基化的目标序列的人工合成质粒，所述阴性对照可以为纯化水。
本申请中，利用所述试剂盒采用甲基化特异性PCR方法对待测样本进行检测的具体步骤如下：
S1，提取待测样本的DNA模板，对并所述DNA模板进行亚硫酸盐转化，获得亚硫酸盐转化后的DNA模板；
S2，将所述亚硫酸盐转化后的DNA模板、所述的引物探针组合物和PCR反应试剂混合物，形成反应体系；
S3，对所述反应体系进行实时荧光定量PCR扩增，得到扩增曲线；
S4，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断。
本申请中，所述反应体系中各引物的终浓度均为0.3～0.5μM，各检测探针的终浓度均为0.3～0.5μM。通过将反应体系内上、下游引物和检测探针的浓度控制在上述范围内，使得所述方法的检测效果最好，反应效率最高；反应体系内上、下游引物和检测探针的浓度过高或高低均会降低检测效果。
本申请中对待测样本进行判断的方式为：在相同的实验条件下，对不同的待测样本检测同一基因的甲基化时，Ct值越小，表明该基因在该样本中的甲基化水平越高；若某一检测区域在待测样本上的Ct值≤38，则判定该样本在这一检测区域为甲基化阳性，即该样本为食管癌阳性样本，若某一检测区域在待测样本上的Ct值>38，则判定该样本在这一检测区域为甲基化阴性，即该样本为食管癌阴性样本。
本申请第三方面提供了一种如本申请第一方面所述的引物探针组合物或者第二方面所述的试剂盒在制备用于诊断或辅助诊断待测样本是否为食管癌样本或食管癌的癌前病变样本的检测产品中的应用。
本申请所提供的引物探针组合物或者包括该引物探针组合物的试剂盒，以RNF31基因作为目标基因，通过检测RNF31基因启动子中CpG二核苷酸位点是否发生甲基化，为食管癌患者的诊断及辅助诊断提供参考，且可用于不同分期食管癌患者，检测结果具有良好的灵敏度和特异性，因此能较好的应用于诊断或辅助诊断待测样本是否为食管癌样本或食管癌的癌前病变样本的检测产品中，对于食管癌非介入性检测、早期筛查及改善患者预后具有重要意义。
在一些实施方式中，所述待测样本选自血液样本、组织样本和食管来源的细胞样本中的任意一种。
本申请的检测样本除了组织样本和食管来源的细胞样本外，还可以为血液样本，采用血液样本可简化取样环节，减小取样创伤，可大大提高食管癌检测诊断试剂的可及性。同时针对不同的待测样本可以选择对应的DNA提取试剂盒进行模板DNA的提取。
在一些实施方式中，所述食管癌为食管鳞癌。
本申请的有益技术效果：本申请所提供的引物探针组合物或者包括该引物探针组合物的试剂盒能够对RNF31基因启动子中目标区域的甲基化位点进行特异性检测，且检测结果具有较高的特异性和灵敏度，检测结果准确可靠，可用于食管癌患者的早期诊断及辅助诊断，尤其适用于食管鳞状细胞癌的检测诊断/辅助诊断，同时可用于不同分期食管癌患者，对于食管癌的非介入性检测、早期诊断筛查及改善患者预后具有重要意义。
附图说明
图1为采用引物探针组1对进展期食管癌样本中区域1的甲基化位点进行检测的阳性结果示意图。
图2为采用引物探针组1对癌旁组织样本中区域1的甲基化位点进行检测的阴性结果示意图。
图3为对区域1进行检测时β-actin内参基因的质控检测结果示意图。
图4为采用引物探针组2对进展期食管癌样本中区域2的甲基化位点进行检测的阳性结果示意图。
图5为采用引物探针组2对癌旁组织样本中区域2的甲基化位点进行检测的阴性结果示意图。
图6为对区域2进行检测时β-actin内参基因的质控检测结果示意图。
图7为采用引物探针组3对进展期食管癌样本中区域3的甲基化位点进行检测的阳性结果示意图。
图8为采用引物探针组3对癌旁组织样本中区域3的甲基化位点进行检测的阴性结果示意图。
图9为对区域3进行检测时β-actin内参基因的质控检测结果示意图。
图10为采用引物探针组4对进展期食管癌样本中区域4的甲基化位点进行检测的阳性结果示意图。
图11为采用引物探针组4对癌旁组织样本中区域4的甲基化位点进行检测的阴性结果示意图。
图12为对区域4进行检测时β-actin内参基因的质控检测结果示意图。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本申请，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：引物探针组合物的设计与合成
本申请通过TCGA数据库检索到食管癌相关基因RNF31，对该基因启动子区域进行肿瘤样本及正常组织样本的二代测序，对RNF31基因二代测序结果进行分析，获得了RNF31基因启动子中的目标区域(GRCh38.p14为参考基因组)为：Chr14:24147140-24148147区域、Chr14:24147140-24148147区域的互补序列、Chr14:24147140-24148147区域中的部分区域和Chr14:24147140-24148147区域中的部分区域的互补序列；通过对上述目标区域进一步筛选优化，最终将目标区域优化定义为区域1至区域4中的至少一种，其中区域1至区域4的核苷酸序列具体分别如表1中SEQ ID NO:1-4所示。
通过对上述区域1至区域4序列中胞嘧啶甲基化位点进行分析，设计针对目标区域的引物探针组合物，引物探针组合物包括用于分别检测区域1至区域4的引物探针组1至引物探针组4中的至少一组。具体地，针对区域1的引物探针组1中的上、下游引物和检测探针的核苷酸序列具体分别如表1中SEQ ID NO:6-8所示，针对区域2的引物探针组2中的上、下游引物和检测探针的核苷酸序列具体分别如表1中SEQ ID NO:9-11所示，针对区域3的引物探针组3中的上、下游引物和检测探针的核苷酸序列具体分别如表1中SEQ ID NO:12-14所示，针对区域4的引物探针组4中的上、下游引物和检测探针的核苷酸序列具体分别如表1中SEQ ID NO:15-17所示，所设计的检测探针的5’端均标记FAM荧光报告基团，3’端均标记MGB荧光淬灭基团。其中，引物探针组1所检测的区域1中胞嘧啶甲基化位点选自Chr14:24147370、Chr14:24147375、Chr14:24147380、Chr14:24147413、Chr14:24147415、Chr14:24147421、Chr14:24147429、Chr14:24147459和Chr14:24147469中的至少一个；引物针组2所检测的区域2中胞嘧啶甲基化位点选自Chr14:24147672、Chr14:24147669、Chr14:24147665、Chr14:24147655、Chr14:24147652、Chr14:24147650、Chr14:24147643、Chr14:24147641、Chr14:24147639、Chr14:24147634、Chr14:24147630、Chr14:24147627、Chr14:24147618和Chr14:24147607中的至少一个；引物针组3所检测的区域3中胞嘧啶甲基化位点选自Chr14:24147827、Chr14:24147834、Chr14:24147838、Chr14:24147855、Chr14:24147858、Chr14:24147862、Chr14:24147871、Chr14:24147879、Chr14:24147900和Chr14:24147906中的至少一个；引物针组4所检测的区域4中胞嘧啶甲基化位点选自Chr14:24148029、Chr14:24148033、Chr14:24148054、Chr14:24148060、Chr14:24148069、Chr14:24148099和Chr14:24148106中的至少一个。
选择β-actin基因为内参基因，具体核苷酸序列如表1中SEQ ID NO:5所示，通过对β-actin基因进行序列分析，设计针对择β-actin内参基因的上、下游引物和检测探针，具体核苷酸序列如表1中SEQ ID NO:18-20所示，其中检测探针的5’端标记ROX荧光报告基团，3’端均标记BHQ2荧光淬灭基团。
表1：目标序列、上下游引物以及检测探针的核苷酸序列
实施例2：食管癌检测方法的建立
1.待测样本模板DNA的提取
当所用待测样本是食管组织样本时，采用天根生化科技(北京)有限公司的石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(DP340)提取组织DNA，具体操作参见试剂盒说明书。
当所用待测样本是血液样本时，采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA的提取，具体操作参见试剂盒说明书。
2.DNA模板的亚硫酸盐转化所用核酸转化试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(离心柱型)(DP215)，具体实验操作参见试剂盒说明书。
3.PCR扩增
建立PCR扩增反应体系，具体如表2所示。
表2：PCR扩增反应体系
上述反应体系中各引物的终浓度均为0.5μM，各检测探针的终浓度均为0.5μM。
如表2所示，在检测区域1至区域4中任一区域在待测样本中的甲基化状态时，只需将表1中该区域对应的上、下游引物和检测探针，针对β-actin内参基因的上、下游引物和检测探针，2×Robustart Premix OmniⅢ(Probe qPCR)和亚硫酸盐转化后的DNA模板等按照表2中的体积加入到反应体系中进行PCR扩增即可。其中PCR扩增的条件如表3所示。
表3：PCR扩增的条件
4.试验结果读取
使用仪器配套软件对数据进行读取、分析。其中SLAN-96P机型结果读取如下：
(1)PCR扩增程序结束后，在菜单栏点击“常用选项”-扩增曲线-绝对荧光值法-页面下方的确定-菜单栏“分析”；
(2)基线设置：反应结束后，手动调整基线10-22个循环；
(3)荧光阈值设置：根据扩增曲线，划定合适的荧光阈值。β-actin阈值设定原则以阈值线处于阳性对照的指数扩增期的初始阶段拐点处为准；检测区域1至区域4中任一区域在待测样本中的甲基化状态的阈值设定原则以阈值线超过阴性对照的最高点，且处于阳性对照的指数扩增期的初始阶段拐点处为准；
(4)Ct值确定：设定基线及荧光阈值后，阈值线与扩增曲线的交点为Ct值。
5.质量控制
在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测，阴性对照为纯化水，阳性对照为含有β-actin内参基因和甲基化的目标序列的人工合成质粒，浓度为104拷贝/微升，阴性对照应无扩增，阳性对照应有明显的指数增长期，且阳性对照的Ct值应在25-32之间。阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
6.结果分析和判读方法
在相同的实验条件下，对不同的待测样本检测同一基因的甲基化时，Ct值越小，表明该基因在该样本中的甲基化水平越高。若某一检测区域在待测样本上的Ct值≤38，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阳性，判定该样本为食管癌阳性样本，若某一检测区域在待测样本上的Ct值>38，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阴性，判定该样本为食管癌阴性样本。将待测样本的甲基化特异性PCR检测结果同病理结果进行对比，计算本申请所建立的甲基化特异性PCR检测的灵敏度和特异性。灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化PCR阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化PCR阴性的比例。
实施例3：检测方法灵敏度和特异性评价
1.食管组织样本的检测
收集郑州某医院临床病理确诊为高级别瘤变的食管癌鳞组织50例、早期食管鳞癌组织60例、进展期食管鳞癌组织50例及癌旁组织60例，所有样本均为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织，样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有患者均签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理，食管癌患者均为食管鳞癌。分别采用实施例1中设计的针对区域1至区域4的引物探针组1至引物探针组4，按照实施例2中所建立的方法进行待测样本的甲基化特异性PCR检测，甲基化特异性PCR检测结果与同病理结果进行对比，并计算采用引物探针组1至引物探针组4进行检测的检测结果的灵敏度和特异性，检测结果如表4所示。其中，采用引物探针组1对进展期食管癌样本中区域1的甲基化位点进行检测的阳性结果示意图如图1所示，对癌旁组织样本中区域1的甲基化位点进行检测的阴性结果示意图如图2所示，β-actin内参基因的质控检测结果示意图如图3所示；采用引物探针组2对进展期食管癌样本中区域2的甲基化位点进行检测的阳性结果示意图如图4所示，对癌旁组织样本中区域2的甲基化位点进行检测的阴性结果示意图如图5所示，β-actin内参基因的质控检测结果示意图如图6所示；采用引物探针组3对进展期食管癌样本中区域3的甲基化位点进行检测的阳性结果示意图如图7所示，对癌旁组织样本中区域3的甲基化位点进行检测的阴性结果示意图如图8所示，β-actin内参基因的质控检测结果示意图如图9所示；采用引物探针组4对进展期食管癌样本中区域4的甲基化位点进行检测的阳性结果示意图如图10所示，对癌旁组织样本中区域4的甲基化位点进行检测的阴性结果示意图如图11所示，β-actin内参基因的质控检测结果示意图如图12所示。
表4：引物探针组1至引物探针组4对组织样本的检测灵敏度和特异性
2.血液样本的检测
收集郑州某医院临床病理确诊为高级别瘤变的食管鳞癌血液样本80例、早期食管鳞癌血液样本80例、进展期食管鳞癌血液样本100例及正常人血液样本100例，样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有患者均签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。分别采用实施例1中设计的针对区域1至区域4的引物探针组1至引物探针组4，按照实施例2中所建立的方法进行待测样本的甲基化特异性PCR检测，甲基化特异性PCR检测结果与同病理结果进行对比，并计算采用引物探针组1至引物探针组4进行检测的检测结果的灵敏度和特异性，检测结果如表5所示。
表5：引物探针组1至引物探针组4对血液样本的检测灵敏度和特异性
由表4和表5可以看出，采用本申请所提供的引物探针组合物中的引物探针组1至引物探针组4对食管癌患者检测诊断时，检测结果均有良好的灵敏度和特异性。具体来说，对于食管组织样本，针对区域1至区域4的引物探针组1至引物探针组4对于高级别瘤变食管癌的检测灵敏度可以达到70％及以上，对于早期食管癌的检测灵敏度可以达到85％以上，对于进展期食管癌的检测灵敏度可以达到90％及以上，特异性达95％以上，可见本申请所提供的引物探针组合物可通过食管组织样本的DNA甲基化检测有效检测出食管癌病变，对于高危癌前病变也有良好的预警作用；对于血液样本，针对区域1至区域4的引物探针组1至引物探针组4对于高级别瘤变食管癌的检测灵敏度可以达到75％以上，对于早期食管癌的检测灵敏度可以达到85％以上，对于进展期食管癌的检测灵敏度可以达到90％及以上灵敏度，特异性达95％及以上，可见本申请所提供的引物探针组合物也可用于血液样本，尤其是可有效检测进展期食管癌，采用血液样本可简化取样环节，减小取样创伤，可大大提高食管癌检测诊断试剂的可及性。另外，当采用SEQ ID NO:2(区域2)及SEQ ID NO:3(区域3)两个序列作为目标靶序列，分别采用引物探针组2和引物探针组3进行检测时，无论是采用组织样本还是血液样本，均有优异的灵敏度和特异性，其中灵敏度均在80％及以上，对于进展期食管癌的检测灵敏度达95％及以上，可用于早期高危病变的筛查和辅助诊断，对食管癌的早筛早干预有重大意义。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改，以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (10)
1.一种用于检测食管癌的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物用于检测RNF31基因启动子中目标区域的DNA甲基化水平；以GRCh38. p14为参考基因组，所述目标区域选自Chr14:24147140-24148147区域及其互补序列，和Chr14:24147140-24148147区域中的部分区域及其互补序列中的至少一个。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述目标区域选自如下所示的区域1至区域4中的至少一个：
区域1为Chr14:24147140-24147369，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
区域2为Chr14:24147703-24147481，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
区域3为Chr14:24147716-24147921，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
区域4为Chr14:24147930-24148147，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3. 根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括用于分别检测所述区域1至区域4的引物探针组1至引物探针组4中的至少一组；其中引物探针组1中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6-7所示，检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；引物探针组2中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9-10所示，检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；引物探针组3中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12-13所示，检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；引物探针组4中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:15-16所示，检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。
4.根据权利要求3所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组1所检测的区域1中胞嘧啶甲基化位点选自Chr14:24147370、Chr14:24147375、Chr14:24147380、Chr14:24147413、Chr14:24147415、Chr14:24147421、Chr14:24147429、Chr14:24147459和Chr14:24147469中的至少一个；
所述引物探针针组2所检测的区域2中胞嘧啶甲基化位点选自Chr14:24147672、Chr14:24147669、Chr14:24147665、Chr14:24147655、Chr14:24147652、Chr14:24147650、Chr14:24147643、Chr14:24147641、Chr14:24147639、Chr14:24147634、Chr14:24147630、Chr14:24147627、Chr14:24147618和Chr14:24147607中的至少一个；
所述引物探针针组3所检测的区域3中胞嘧啶甲基化位点选自Chr14:24147827、Chr14:24147834、Chr14:24147838、Chr14:24147855、Chr14:24147858、Chr14:24147862、Chr14:24147871、Chr14:24147879、Chr14:24147900和Chr14:24147906中的至少一个；
所述引物探针针组4所检测的区域4中胞嘧啶甲基化位点选自Chr14:24148029、Chr14:24148033、Chr14:24148054、Chr14:24148060、Chr14:24148069、Chr14:24148099和Chr14:24148106中的至少一个。
5. 根据权利要求1-4中任意一项所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物中还包括针对β-Actin内参基因的引物探针组；所述β-Actin内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述针对β-Actin内参基因的引物探针组中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:18-19所示，检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
6.一种用于检测食管癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如权利要求1-5中任意一项所述的引物探针组合物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括PCR反应试剂。
8.一种如权利要求1-5中任意一项所述的引物探针组合物或者权利要求6或7所述的试剂盒在制备用于诊断或辅助诊断待测样本是否为食管癌样本或食管癌的癌前病变样本的检测产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述待测样本选自血液样本、组织样本和食管来源的细胞样本中的任意一种。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述食管癌为食管鳞癌。
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