CN117867126A - 基于TaqMan探针熔解曲线法检测食管癌的引物探针组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及基因检测技术领域的一种基于TaqMan探针熔解曲线法检测食管癌的引物探针组合物及其应用。所述引物探针组合物用于检测SIM1基因启动子中目标区域的甲基化水平;以GRCh38.p14为参考基因组,所述目标区域选自Chr6:100465479‑100465115区域及其互补序列,和Chr6:100465479‑100465115区域中的部分区域及其互补序列中的至少一个。利用该引物探针组合物或者包括该引物探针组合物的试剂盒能够基于TaqMan探针熔解曲线法对SIM1基因启动子中目标区域的甲基化位点进行特异性检测,且检测结果具有较高的特异性和灵敏度,检测结果准确可靠,可用于食管癌患者的早期诊断及辅助诊断。
Description
技术领域
本申请涉及基因检测技术领域,尤其是涉及一种基于TaqMan探针熔解曲线法检测食管癌的引物探针组合物及其应用。
背景技术
食管癌是起源于食管黏膜上皮的恶性肿瘤,是临床常见的恶性肿瘤之一。食管癌的早期症状并不明显,且多为非持续性的,因而超过90%的食管癌患者在确诊时已进展至中晚期,患者预后差,生活质量低,总体的5年生存率不足20%。而早期食管癌(仅累及黏膜层和黏膜下浅层的病变)通常经内镜下微创治疗即可根治,患者5年生存率超过95%。因此,食管癌的早期发现、早期诊断和早期治疗是降低死亡率和提高生存率的主要策略。目前,食管内镜及病理活检是诊断食管癌的金标准。但是,由于内镜检查操作难度比较大,对医师的技术水平要求较高,且患者对内镜检查存在一定的畏惧心理,其依从性较差。因此,完善现有的筛查和诊断方法,是实现食管癌诊治的关键步骤。
食管癌的发生是由环境和遗传因素共同作用引起的。DNA甲基化是人类基因组的主要表观遗传形式。在大多数类型的癌症中,DNA甲基化通常存在异常。甲基化是基因组DNA中胞嘧啶的共价修饰,主要发生在脊椎动物的CpG二核苷酸中,并且通常与长期转录抑制相关。申请人前期研究发现,食管鳞癌(ESCC)组织中SIM1基因启动子甲基化水平明显高于癌旁正常组织,且它们的高甲基化和表达水平具有显著相关性,表明其高甲基化水平促进食管鳞癌的发展。因此,探索食管癌中基因的甲基化对于ESCC的早期诊断,精确预后和个体化治疗具有重要意义。
目前就甲基化检测而言,方法众多,大体可以分为两类:甲基化分型检测和甲基化图谱分析(methylation profiling,也称甲基化组学),主要包括以下方法:1)直接测序法:这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。这种方法可靠,且精确度高,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态,但需要大量的克隆测序,过程较为繁琐、昂贵。2)焦磷酸测序(Pyrosequencing):焦磷酸测序技术能够快速地检测甲基化的频率,对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测。但焦磷酸测序的准确性受制于片段长度,CpG与前向引物3’端的距离也可影响检测结果的准确性。3)飞行质谱:EpiTYPERTM DNA甲基化分析技术结合了碱基特异性酶切反应和MALDI-TOF检测原理,可实现多重CpG的分析检测。此种方法无需任何荧光标记,且灵敏度高,可检测低至5%的甲基化水平,适用于高通量的样本。但由于其需要昂贵的设备,方法具有复杂性,限制了其临床应用。4)甲基化特异性PCR(MS-PCR):该经济实惠,无需特殊仪器,目前应用最广,且避免了使用限制性内切酶及其后续相关问题,敏感性高。但需要预先知道待测片段DNA的序列,同时引物设计非常重要,若待测DNA中5-甲基胞嘧啶分布极不均衡,则检测时较为复杂,可能出现假阳性。5)荧光定量法(Methylight):该方法的原理是使用荧光水解探针,在MSP扩增同时检测荧光强度,使得定量检测甲基化成为可能。优势在于高通量、高敏感性,可以做到多样本、多基因位点的快速分析。但费用较高,测定每个位点都要用两端标有荧光素的探针和一对引物,且受较多因素影响。6)甲基化敏感性解链曲线分析:其为将DNA经重亚硫酸盐处理与Lightcycle联用检测DNA序列甲基化的方法。该方法不能够精确检测甲基化的具体位点,研究序列的长度不宜过长,且对低水平的DNA甲基化敏感性低。7)甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(HRM):该方法的基本原理同MS-MCA,针对甲基化区域附近设计引物,将修饰后的DNA进行PCR,再进行低温到高温的熔解的过程,参照标准曲线,即可对样本做定性和定量的分析,但方法的敏感性有待进一步提升。
针对现有技术中甲基化检测存在的问题,需要提供一种新的用于检测SIM1基因启动子甲基化的方法,进而用于食管癌的诊断和辅助诊断。
发明内容
为了解决现有技术的不足,本申请提供一种基于TaqMan探针熔解曲线法检测食管癌的引物探针组合物,利用该引物探针组合物或包括该引物探针组合物的试剂盒可对待测样本的SIM1基因启动子中目标区域的DNA甲基化水平进行检测,根据检测结果即可对待测样本是否患有食管癌进行诊断,检测方法简单、高效,可用于不同分期的食管癌患者,且检测结果具有良好的灵敏度和特异性。
为此,本申请第一方面提供了一种基于TaqMan探针熔解曲线法检测食管癌的引物探针组合物,所述引物探针组合物用于检测SIM1基因启动子中目标区域的甲基化水平;以GRCh38.p14为参考基因组,所述目标区域选自Chr6:100465479-100465115区域及其互补序列,和Chr6:100465479-100465115区域中的部分区域及其互补序列中的至少一个。
本申请的发明人从UCSC及Ensembl Genomes数据库检索到SIM1基因启动子的序列,通过对该启动子区域的DNA序列进行分析,最终获得了SIM1基因启动子中的目标区域。通过对目标区域设计基于TaqMan探针熔解曲线的PCR扩增引物以及检测探针,构建了SIM1基因启动子甲基化检测的引物探针组合物,利用该引物探针组合物可用于食管癌患者的早期诊断及辅助诊断,尤其适用于食管鳞状细胞癌的检测诊断/辅助诊断,可用于不同分期食管癌患者,且检测结果具有良好的灵敏度和特异性,对于食管癌早期诊断及改善患者预后具有重要意义。
在一些实施方式中,所述目标区域为如下所示的区域1和/或区域2;
所述区域1为Chr6:100465479-100465286,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
所述区域2为Chr6:100465285-100465115,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本申请的发明人通过进一步筛选优化最终将目标区域优化为区域1和/或区域2,通过对上述任一区域中的CpG二核苷酸位点是否发生甲基化进行检测,即可对待测样本作出精准判定。本申请中的上述区域1和区域2均为负链DNA序列,且均属于Chr6:100465479-100465115区域中的部分区域的互补序列。
在一些实施方式中,所述引物探针组合物包括用于检测所述区域1的引物探针组1和/或用于检测所述区域2的引物探针组2;所述引物探针组1和引物探针组2均包括一对上、下游引物和2条检测探针;其中引物探针组1中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:3-4所示,2条检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5-6所示;引物探针组2中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7-8所示,2条检测探针的核苷酸序列分别如SEQID NO:9-10所示;所述2条检测探针中一条为目标序列的甲基化检测探针,另外一条为目标序列的非甲基化检测探针。
本申请中,针对各目标区域的引物探针组中均包括2条检测探针,其中一条检测探针为目标序列的甲基化检测探针,另外一个检测探针为目标序列的非甲基化检测探针,这样可以根据目标序列甲基化状态的不同,检测不同样本的甲基化水平。
本申请的发明人通过对上述区域1和区域2序列中胞嘧啶甲基化位点进行分析,并根据上述区域中的甲基化位点设计了针对各区域的基于TaqMan探针熔解曲线的PCR扩增引物以及检测探针。利用该引物探针组合物或包括该引物探针组合物的试剂盒可对区域1和/或区域2中的甲基化位点进行检测,且检测结果具有较高的特异性和灵敏性,检测结果准确可靠,可用于早期高危病变的筛查和辅助诊断,对食管癌的早筛早干预有重大意义。
本申请中,术语“引物”表示这样的寡核苷酸:其能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成,即例如寡核苷酸的3’-末端提供游离3’-OH基团,可以通过模板依赖性DNA聚合酶将更多的“核苷酸”连接至所述3’-OH基团,建立3’至5’磷酸二酯键,由此使用脱氧核苷三磷酸,并且由此释放焦磷酸。
本申请中,术语“上游引物”,是沿着负链进行不间断延长的寡核苷酸;术语“下游引物”,是沿着正链进行不间断延长的寡核苷酸。应理解,当正链和负链的指定发生互换时,对应的上游引物和下游引物的命名也可随之互换。也即,本申请中的上游引物和下游引物是相对而言的。
在一些实施方式中,所述引物探针组合物中还包括针对β-Actin内参基因的引物探针组,所述引物探针组中包括一对上、下游引物和1条检测探针;所述β-Actin内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示,所述引物探针组中上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQID NO:12-13所示,检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
本申请还设计了针对内参基团的上、下游引物和检测探针,在对待测样本进行检测时同时加入上述针对内参基团的上、下游引物和检测探针可以监测采样情况以及监测全流程的检测过程,以确保检测过程的准确性。
本申请中的检测探针均为TaqMan探针,其5’端均标记有荧光报告基团,3’端均标记有荧光淬灭基团,利用该检测探针进行检测的原理为:当所述检测探针游离于溶液中处于无规则卷曲状态时,检测探针上标记的荧光报告基团与荧光淬灭基团相对靠近,荧光信号较弱;而当PCR反应体系中存在靶标序列时,检测探针与靶标序列互补配对,形成伸展状态,荧光报告基团与荧光淬灭基团相对远离,发射出较强的荧光信号。当PCR扩增完成,产物量达到最高峰,荧光信号也最强,此时再对扩增产物进行升温检测,则杂交在产物上的检测探针与靶标序列逐渐解离,形成无规则卷曲状态,荧光信号逐渐减弱,绘制温度与荧光信号的变化曲线图,即可进行熔解曲线分析。所述荧光报告基团例如可以选自FAM、JOE、VIC、HEX、ROX、TEXAS RED和CY5中的任意一种,所述荧光淬灭基团例如可以选自MGB、BHQ1和BHQ2中的任意一种。
需要注意的是,引物探针组1中所包括的2条检测探针上所标记的荧光报告基团互不相同,引物探针组2中所包括的2条检测探针上所标记的荧光报告基团也互不相同,以便根据不同荧光通道中获得的熔解曲线的Tm值及峰高不同判定待测样本中SIM1基因启动子的甲基化水平,进而对待测样本是否患有食管癌作出判断。同时针对内参基因的检测探针上所标记的荧光报告基团和荧光淬灭基团应与针对目标区域的检测探针上所标记的荧光报告基团和荧光淬灭基团均不同,以便对内参基因的检测情况作出单独判定,用于整个反应体系的质控。
本申请中,利用本申请所提供的引物探针组合物基于TaqMan探针熔解曲线对SIM1基因启动子中目标区域的甲基化水平进行检测的过程为:首先用亚硫酸氢盐处理待测样本的DNA片段,然后利用特异性的引物探针组合物进行PCR扩增,随着目标序列甲基化状态的不同,针对目标区域的引物探针组的2条检测探针与目标序列杂交程度存在差异(当目标序列中CpG二核苷酸位点为高甲基化水平状态时,甲基化检测探针优先与目标序列杂交;当目标序列中CpG二核苷酸位点为低甲基化水平状态时,非甲基化检测探针优先与目标序列杂交),PCR结束后对获得的双链DNA杂交产物进行熔解曲线分析,由于不同的检测探针与目标序列所形成的双链DNA的熔点(Tm值)及峰高不同,根据获得的熔解曲线的Tm值及峰高,即可获知待测样本的甲基化状态,进而对待测样本是否患有食管癌作出判定(具体检测原理如图1所示)。该方法具有高通量、高特异性和高灵敏性等优势,且无需在PCR后电泳、杂交等操作,减少了污染和操作误差。
本申请第二方面提供了一种基于TaqMan探针熔解曲线法检测食管癌的试剂盒,所述试剂盒中包括如本申请第一方面所述的引物探针组合物。
在一些实施方式中,所述试剂盒中还包括PCR反应试剂。
本申请中,所述PCR反应试剂中包括PCR反应所需的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)、dNTPs和Mg2+等成分。在一些具体实施例中,所述PCR反应试剂为2×Robustart Premix OmniⅢ(Probe qPCR)。
本申请中,所述试剂盒中还可以进一步包括阳性对照和阴性对照,所述阳性对照可以为含有甲基化的目标序列的人工合成质粒,所述阴性对照可以为纯化水。
在一些实施方式中,所述试剂盒在使用时,PCR反应体系内每条上游引物的终浓度各自独立地为0.02~0.05μM,每条下游引物的终浓度各自独立地为0.2~0.5μM,每条检测探针的终浓度各自独立地为0.1~0.3μM。
在一些具体实施方式中,所述试剂盒在使用时,PCR反应体系内每条上游引物与每条下游引物的终浓度比为1:10;优选地,PCR反应体系内每条上游引物的终浓度各自独立地为0.04μM,每条下游引物的终浓度各自独立地为0.4μM,每条检测探针的终浓度各自独立地为0.2μM。
本申请通过将反应体系内上、下游引物和检测探针的浓度控制在上述范围内,使得所述方法的检测效果最好,反应效率最高;反应体系内上、下游引物和检测探针的浓度过高或高低均会降低检测效果。
在一些实施方式中,利用所述试剂盒进行检测后,对检测结果的判读方式为:
当采用引物探针组1进行检测后,若目标序列的甲基化检测探针荧光通道上获得的熔解曲线的Tm为65.00~67.55、峰高为60.85~175.25,且目标序列的非甲基化检测探针荧光通道上获得的熔解曲线的Tm不大于60.50、峰高为0~60.84,则判读为甲基化阳性样本,即食管癌阳性样本;
当采用引物探针组1进行检测后,若目标序列的非甲基化检测探针荧光通道上获得的熔解曲线的Tm为44.60~47.80、峰高为60.85~175.25,且目标序列的甲基化检测探针荧光通道上获得的熔解曲线的Tm不小于60.50、峰高为0~60.84,则判读为甲基化阴性样本,即食管癌阴性样本;
当采用引物探针组2进行检测后,若目标序列的甲基化检测探针荧光通道上获得的熔解曲线的Tm为67.50~70.60、峰高为68.85~185.25,且目标序列的非甲基化检测探针荧光通道上获得的熔解曲线的Tm不大于56.50、峰高为0~68.84,则判读为甲基化阳性样本,即食管癌阳性样本;
当采用引物探针组2进行检测后,若目标序列的非甲基化检测探针荧光通道上获得的熔解曲线的Tm为44.06~47.50、峰高为68.85~185.25,且目标序列的甲基化检测探针荧光通道上获得的熔解曲线的Tm不小于56.50、峰高为0~68.84,则判读为甲基化阴性样本,即食管癌阴性样本。
本申请通过上述判定方式可以对检测结果进行准确判定,且判读方式简单。
本申请中,利用所述试剂盒对SIM1基因启动子中目标区域的甲基化水平进行检测的具体步骤如下:
S1,提取待测样本的DNA模板,对并所述DNA模板进行亚硫酸盐转化,获得亚硫酸盐转化后的DNA模板;
S2,将所述亚硫酸盐转化后的DNA模板、所述的引物探针组合物和PCR反应试剂混合物,形成反应体系;
S3,对所述反应体系进行PCR扩增,得到PCR扩增产物;
S4,对所述扩增产物进行熔解曲线分析,获得熔解曲线,并根据所述熔解曲线的Tm值作出判断。
本申请中,若检测结果判定为待测样本在目标检测区域为甲基化阳性,则该样本为食管癌阳性样本;若检测结果判定为待测样本在目标检测区域为甲基化阴性,则该样本为食管癌阴性样本。
本申请第三方面提供了一种如本申请第一方面所述的引物探针组合物或者第二方面所述的试剂盒在制备用于诊断或辅助诊断待测样本是否为食管癌样本或食管癌的癌前病变样本的检测产品中的应用。
本申请所提供的引物探针组合物或者包括该引物探针组合物的试剂盒,通过检测SIM1基因启动子中CpG二核苷酸位点是否发生甲基化,为食管癌患者的诊断及辅助诊断提供参考,且可用于不同分期食管癌患者,检测结果具有良好的灵敏度和特异性,因此能较好的应用于诊断或辅助诊断待测样本是否为食管癌样本或食管癌的癌前病变样本的检测产品中,对于食管癌非介入性检测、早期筛查及改善患者预后具有重要意义。
在一些实施方式中,所述待测样本选自血液样本、组织样本和食管来源的细胞样本中的任意一种,所述食管癌为食管鳞癌。
本申请的检测样本除了组织样本和食管来源的细胞样本外,还可以为血液样本,采用血液样本可简化取样环节,减小取样创伤,可大大提高食管癌检测诊断试剂的可及性。同时针对不同的待测样本可以选择对应的DNA提取试剂盒进行模板DNA的提取。
本申请的有益技术效果:本申请所提供的引物探针组合物或者包括该引物探针组合物的试剂盒能够对SIM1基因启动子中目标区域的甲基化位点进行特异性检测,且检测结果具有较高的特异性和灵敏度,检测结果准确可靠,可用于食管癌患者的早期诊断及辅助诊断,尤其适用于食管鳞状细胞癌的检测诊断/辅助诊断,同时可用于不同分期食管癌患者,对于食管癌的非介入性检测、早期诊断筛查及改善患者预后具有重要意义。
附图说明
图1为利用本申请所提供的引物探针组合物对SIM1基因启动子中目标区域的甲基化水平进行检测的原理图。
图2为采用引物探针组1对进展期血液样本中区域1的甲基化位点进行检测的阳性结果示意图。
图3为采用引物探针组1对正常人血液样本中区域1的甲基化位点进行检测的阴性结果示意图。
图4为采用引物探针组2对进展期血液样本中区域2的甲基化位点进行检测的阳性结果示意图。
图5为采用引物探针组2对正常人血液样本中区域2的甲基化位点进行检测的阴性结果示意图。
图6为对区域2进行检测时β-Actin内参基因的质控检测结果示意图。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解,下面将结合实施例来进一步详细说明本申请,这些实施例仅起说明性作用,并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1:引物探针组合物的设计与合成
1.SIM1基因启动子的序列分析
(1)从UCSC及Ensembl Genomes数据库下载SIM1基因的启动子序列,对该基因启动子区域的DNA序列进行分析,获得了SIM1基因启动子中的目标区域(GRCh38.p14为参考基因组)为:Chr6:100465479-100465115区域、Chr6:100465479-100465115区域的互补序列、Chr6:100465479-100465115区域中的部分区域和Chr6:100465479-100465115区域中的部分区域的互补序列。其中Chr6:100465479-100465115区域的核苷酸序列如下所示:TCCTCTGGCAATGAATTCCGTGTCGCCATGGTTTCAGAGAAACGAGAAAGAGAAAATAACTCCCCAAACCGGCCTCGCGCACGCCGTCGGCCAGCGACTGCCAGCGGGATGGGCCTTTGGGCGAACCCTGCCTCCTCCGCCGGTAGACCTAACCCGCAGGCCCGACCTCCGCTGCCTCCGGACGTTCCCGGTTCTGCTGGGCCGCCGCGCTGGACTGAGCGCTCAACCACCCGACCCCAGGGAGCTCGAGGAGCGCGGGTCGCGCACGACGTCGGGAAGGCCCAGGAGGCCGCGAGCAGCGGCGGCAACCGGACAGCGCCGACCCGGCACCCTGAGCTCATTAGGAGTCCAGCGGTCCCGCGGGT(SEQ ID NO:15)。
(2)SIM1基因启动子中的目标区域(Chr6:100465479-100465115区域)序列中的CpG位点经亚硫酸盐处理后均发生甲基化的核苷酸序列如下:
TTTTTTGGTAATGAATTTCGTGTCGTTATGGTTTTAGAGAAACGAGAAAGAGAAAATAAT
TTTTTAAATCGGTTTCGCGTACGTCGTCGGTTAGCGATTGTTAGCGGGATGGGTTTTTGG
GCGAATTTTGTTTTTTTCGTCGGTAGATTTAATTCGTAGGTTCGATTTTCGTTGTTTTCGG
ACGTTTTCGGTTTTGTTGGGTCGTCGCGTTGGATTGAGCGTTTAATTATTCGATTTTAGGG
AGTTCGAGGAGCGCGGGTCGCGTACGACGTCGGGAAGGTTTAGGAGGTCGCGAGTAGC
GGCGGTAATCGGATAGCGTCGATTCGGTATTTTGAGTTTATTAGGAGTTTAGCGGTTTCGC
GGGT(SEQ ID NO:16)
(3)SIM1基因启动子中的目标区域(Chr6:100465479-100465115区域)序列中的CpG位点经亚硫酸盐处理后均未发生甲基化的核苷酸序列如下:
TTTTTTGGTAATGAATTTTGTGTTGTTATGGTTTTAGAGAAATGAGAAAGAGAAAATAAT
TTTTTAAATTGGTTTTGTGTATGTTGTTGGTTAGTGATTGTTAGTGGGATGGGTTTTTGGG
TGAATTTTGTTTTTTTTGTTGGTAGATTTAATTTGTAGGTTTGATTTTTGTTGTTTTTGGAT
GTTTTTGGTTTTGTTGGGTTGTTGTGTTGGATTGAGTGTTTAATTATTTGATTTTAGGGAG
TTTGAGGAGTGTGGGTTGTGTATGATGTTGGGAAGGTTTAGGAGGTTGTGAGTAGTGGT
GGTAATTGGATAGTGTTGATTTGGTATTTTGAGTTTATTAGGAGTTTAGTGGTTTTGTGGG
T(SEQ ID NO:17)
2.SIM1基因启动子的目标区域甲基化检测的引物探针组合物的设计与合成通过对目标区域(Chr6:100465479-100465115区域)的核苷酸序列进行分析,并筛选优化,最终将目标区域优化定义为区域1(Chr6:100465479-100465286区域,负链)和/或区域2(Chr6:100465285-100465115区域,负链),其中区域1和区域2的核苷酸序列具体分别如表1中SEQID NO:1-2所示。
通过对上述区域1和区域2序列中胞嘧啶甲基化位点进行分析,设计针对目标区域的引物探针组合物,引物探针组合物包括用于分别检测区域1和区域2的引物探针组1和引物探针组2中的至少一组。具体地,针对区域1的引物探针组1中的上、下游引物和2条检测探针(甲基化检测探针及非甲基化检测探针)的核苷酸序列具体分别如表1中SEQ ID NO:3-6所示,针对区域2的引物探针组2中的上、下游引物和2条检测探针(甲基化检测探针及非甲基化检测探针)的核苷酸序列具体分别如表1中SEQ ID NO:7-10所示。
选择β-actin基因为内参基因,具体核苷酸序列如表1中SEQ ID NO:11所示,通过对β-actin基因进行序列分析,设计针对择β-actin内参基因的上、下游引物和检测探针,具体核苷酸序列如表1中SEQ ID NO:12-14所示。
表1:目标序列、上下游引物以及检测探针的核苷酸序列
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实施例2:食管癌检测方法的建立
1.待测样本模板DNA的提取
当所用待测样本是食管组织样本时,采用天根生化科技(北京)有限公司的石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(DP340)提取组织DNA,具体操作参见试剂盒说明书。
当所用待测样本是血液样本时,采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA的提取,具体操作参见试剂盒说明书。
2.DNA模板的亚硫酸盐转化
所用核酸转化试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(离心柱型)(DP215),具体实验操作参见试剂盒说明书。
3.PCR扩增
建立PCR扩增反应体系,具体如表2所示。
表2:PCR扩增反应体系
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上述反应体系内每条上游引物的终浓度均为0.04μM,每条下游引物的终浓度均为0.4μM,每条检测探针的终浓度均为0.2μM。
如表3所示,在检测SIM1基因启动子中SEQ ID NO.12任一区域在待测样本中的甲基化状态时,只需将表1中该区域对应的上、下游引物和2条检测探针,针对β-actin内参基因的上、下游引物和检测探针、2×Robustart Premix OmniⅢ(Probe qPCR)和亚硫酸盐转化后的DNA模板按照表2中的体积加入到反应体系中进行PCR反应即可。其中PCR反应条件如表3所示。
表3:PCR反应的条件
1.试验结果读取
实验运行结束后,各通道的参考Tm值及峰高由全自动医用PCR分析系统(SLAN-96P;上海宏石医疗科技有限公司)软件自动输出。Tm值及峰高以仪器自动判读所得为准,当出现仪器无法自动给出Tm值及峰高时,可通过人工设定特定基因型的峰高阈值获得Tm值及峰高。
1)每次检验均需设置阴性对照和阳性对照,当质控结果满足【质量控制】要求时才可进行结果判定。
2)结果判断:阴性对照、阳性对照和内参质控合格之后,则可按照表4对待测样本检测结果进行判定。
表4:基因检测结果判定标准
当基因检测结果为甲基化阳性时,则待测样本判定为食管癌阳性样本;当基因检测结果为甲基化阴性时,则待测样本判定为食管癌阴性样本。
实施例3:检测方法灵敏度和特异性评价
1.临床食管组织样本的检测
收集新乡某医院临床病理确诊为高级别瘤变的食管癌鳞组织50例、进展期食管鳞癌组织40例、早期食管鳞癌组织50例及癌旁组织60例,所有样本为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织,样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有患者均签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理,食管癌患者均为食管鳞癌。分别采用实施例1中设计的针对区域1和区域2的引物探针组1及引物探针组2,按照实施例2中所建立的方法进行待测样本SIM1基因启动子中目标区域的甲基化检测,并将检测结果与同病理结果进行对比,并计算采用引物探针组1和引物探针组2进行检测的检测结果的灵敏度和特异性(灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化检测为阳性的比例,特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化检测为阴性的比例),检测结果如表5所示。
表5:引物探针组1和引物探针组2对组织样本的检测灵敏度和特异性
2.临床血液样本的检测
收集新乡某医院临床病理确诊为高级别瘤变的食管鳞癌血液样本50例、进展期食管鳞癌血液样本60例、早期食管鳞癌血液样本60例及正常人血液样本80例,样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有患者均签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理。分别采用实施例1中设计的针对区域1和区域2的引物探针组1及引物探针组2,按照实施例2中所建立的方法进行待测样本SIM1基因启动子中目标区域的甲基化检测,并将检测结果与同病理结果进行对比,并计算采用引物探针组1和引物探针组2进行检测的检测结果的灵敏度和特异性(灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化检测为阳性的比例,特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化检测为阴性的比例),检测结果如表6所示。其中,采用引物探针组1对进展期血液样本中区域1的甲基化位点进行检测的阳性结果示意图如图2所示,采用引物探针组1对正常人血液样本中区域1的甲基化位点进行检测的阴性结果示意图如图3所示;采用引物探针组2对进展期血液样本中区域2的甲基化位点进行检测的阳性结果示意图如图4所示;采用引物探针组2对正常人血液样本中区域2的甲基化位点进行检测的阴性结果示意图如图5所示;β-actin内参基因的质控检测结果示意图如图6所示。
表6:引物探针组1和引物探针组2对血液样本的检测灵敏度和特异性
由表5和表6可以看出,采用本申请所提供的引物探针组合物中的引物探针组1和引物探针组2对食管癌患者检测诊断时,检测结果均有良好的灵敏度和特异性。具体来说,对于食管组织样本,分别针对SIM1基因启动子区域1和区域2的引物探针组1和引物探针组2对于高级别瘤变食管癌的检测灵敏度可以达到76%及以上,对于早期食管癌的检测灵敏度可以达到86%以上,对于进展期食管癌的检测灵敏度可以达到90%及以上,特异性达95%以上,可见本申请所提供的引物探针组合物可通过食管组织样本的DNA甲基化检测有效检测出食管癌病变,对于高危癌前病变也有良好的预警作用;对于血液样本,分别针对SIM1基因启动子区域1和区域2的引物探针组1和引物探针组2对于高级别瘤变食管癌的检测灵敏度可以达到72%及以上,对于早期食管癌的检测灵敏度可以达到83%以上,对于进展期食管癌的检测灵敏度可以达到90%以上,特异性达95%以上,可见本申请提供的引物探针组合无也可用于血液样本,尤其是可有效检测进展期食管癌,采用血液样本可简化取样环节,减小取样创伤,可大大提高食管癌检测诊断试剂的可及性。尤其采用SEQ ID NO:1(区域1)及SEQ ID NO:2(区域2)作为靶序列时,无论是采用组织样本还是血液样本,均有优异的灵敏度和特异性,可用于早期高危病变的筛查和辅助诊断,对食管癌的早筛早干预有重大意义。
应当注意的是,以上所述的实施例仅用于解释本申请,并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述,但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇,而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改,以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例,但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例,相反,本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (10)
1.一种基于TaqMan探针熔解曲线法检测食管癌的引物探针组合物,其特征在于,所述引物探针组合物用于检测SIM1基因启动子中目标区域的甲基化水平;以GRCh38. p14为参考基因组,所述目标区域选自Chr6:100465479-100465115区域及其互补序列,和Chr6:100465479-100465115区域中的部分区域及其互补序列中的至少一个。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物,其特征在于,所述目标区域为如下所示的区域1和/或区域2;
所述区域1为Chr6:100465479-100465286,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
所述区域2为Chr6:100465285-100465115,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3. 根据权利要求2所述的引物探针组合物,其特征在于,所述引物探针组合物包括用于检测所述区域1的引物探针组1和/或用于检测所述区域2的引物探针组2;所述引物探针组1和引物探针组2均包括一对上、下游引物和2条检测探针;其中引物探针组1中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3-4所示,2条检测探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:5-6所示;引物探针组2中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7-8所示,2条检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9-10所示;所述2条检测探针中一条为目标序列的甲基化检测探针,另外一条为目标序列的非甲基化检测探针。
4. 根据权利要求1-3中任意一项所述的引物探针组合物,其特征在于,所述引物探针组合物中还包括针对β-Actin内参基因的引物探针组,所述引物探针组中包括一对上、下游引物和1条检测探针;所述β-Actin内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示,所述引物探针组中上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12-13所示,检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
5.一种基于TaqMan探针熔解曲线法检测食管癌的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中包括如权利要求1-4中任意一项所述的引物探针组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中还包括PCR反应试剂。
7.据权利要求5或6所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒在使用时,PCR反应体系内每条上游引物的终浓度各自独立地为0.02~0.05μM,每条下游引物的终浓度各自独立地为0.2~0.5μM,每条检测探针的终浓度各自独立地为0.1~0.3μM。
8.根据权利要求5或6所述的试剂盒,其特征在于,利用所述试剂盒进行检测后,对检测结果的判读方式为:
当采用引物探针组1进行检测后,若目标序列的甲基化检测探针荧光通道上获得的熔解曲线的Tm为65.00~67.55、峰高为60.85~175.25,且目标序列的非甲基化检测探针荧光通道上获得的熔解曲线的Tm不大于60.50、峰高为0~60.84,则判读为甲基化阳性样本,即食管癌阳性样本;
当采用引物探针组1进行检测后,若目标序列的非甲基化检测探针荧光通道上获得的熔解曲线的Tm为44.60~47.80、峰高为60.85~175.25,且目标序列的甲基化检测探针荧光通道上获得的熔解曲线的Tm不小于60.50、峰高为0~60.84,则判读为甲基化阴性样本,即食管癌阴性样本;
当采用引物探针组2进行检测后,若目标序列的甲基化检测探针荧光通道上获得的熔解曲线的Tm为67.50~70.60、峰高为68.85~185.25,且目标序列的非甲基化检测探针荧光通道上获得的熔解曲线的Tm不大于56.50、峰高为0~68.84,则判读为甲基化阳性样本,即食管癌阳性样本;
当采用引物探针组2进行检测后,若目标序列的非甲基化检测探针荧光通道上获得的熔解曲线的Tm为44.06~47.50、峰高为68.85~185.25,且目标序列的甲基化检测探针荧光通道上获得的熔解曲线的Tm不小于56.50、峰高为0~68.84,则判读为甲基化阴性样本,即食管癌阴性样本。
9.一种如权利要求1-4中任意一项所述的引物探针组合物或者权利要求5-7中任意一项所述的试剂盒在制备用于诊断或辅助诊断待测样本是否为食管癌样本或食管癌的癌前病变样本的检测产品中的应用。
10.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述待测样本选自血液样本、组织样本和食管来源的细胞样本中的任意一种,所述食管癌为食管鳞癌。
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