CN114958988A - 基于探针熔解曲线分析的多重核酸检测方法和试剂盒 - Google Patents

基于探针熔解曲线分析的多重核酸检测方法和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN114958988A
CN114958988A CN202110221469.8A CN202110221469A CN114958988A CN 114958988 A CN114958988 A CN 114958988A CN 202110221469 A CN202110221469 A CN 202110221469A CN 114958988 A CN114958988 A CN 114958988A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
primer
sequence
pcr
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110221469.8A
Other languages
English (en)
Inventor
雷向东
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Acebiox Biotechnology Co ltd
Wuhan Easydiagnosis Biomedicine Co ltd
Original Assignee
Shanghai Acebiox Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Acebiox Biotechnology Co ltd filed Critical Shanghai Acebiox Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110221469.8A priority Critical patent/CN114958988A/zh
Priority to PCT/CN2022/076520 priority patent/WO2022179419A1/zh
Publication of CN114958988A publication Critical patent/CN114958988A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种基于探针熔解曲线分析的多重核酸检测方法，所述方法包括以下步骤：步骤A：不对称PCR体系设计；步骤B：PCR扩增；步骤C：熔解曲线分析。本发明解决了传统的Taqman技术不能在扩增后进行熔解曲线分析以进一步判断探针区域序列是否与目标序列完全一致的重要问题，本发明能够在PCR扩增后进行熔解曲线分析，并且可以提升荧光PCR的检测多重度，同时还能进行基因分型和定量。

Description

基于探针熔解曲线分析的多重核酸检测方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及核酸扩增和荧光PCR技术领域，具体涉及基于探针熔解曲线分析的多重核酸检测方法和试剂盒。
背景技术
荧光PCR具有定量准确，使用简便，快捷，经济和PCR污染风险低的优点，是分子检测极其重要的技术。特别是Taqman技术，采用了探针，增强了检测专一性，为荧光PCR在临床的广泛使用做出了巨大贡献。然而荧光PCR也存在明显的缺点，存在技术发展的迫切需要。首先，现在的Taqman技术不能在PCR后进行熔解曲线分析，不能进一步确定探针与目标序列是否完全一致，从而不能发现很多潜在的问题。此外，荧光PCR通常一个通道检测一个靶标，检测多重度低，不适应科研特别是临床检测发展的需要。本发明公开了一种基于探针熔解曲线分析的方法，很好地解决了Taqman不能进行熔解曲线分析的问题，并且可以提升荧光PCR的检测多重度。
Taqman技术采用自淬灭荧光探针和具有5’->3’外切酶活力的DNA聚合酶实时检测PCR扩增过程。自淬灭探针5’标记报告荧光基团，3’标记荧光淬灭基团。在游离存在时，自淬灭探针由于淬灭基团对报告基团的淬灭作用，本底荧光较弱，而在PCR引物延伸时，通过DNA聚合酶的5’->3’外切酶的作用，标记在5’端的报告基团被酶切，使得报告基团与3’端的淬灭基团分离，报告基团发出强的荧光。此过程在PCR扩增每个循环重复，PCR过程得到实时监控。Taqman技术实现了传统终端法PCR到实时荧光PCR的伟大转变，并通过Ct(threshholdcycle)值对目标序列进行准确定量的革命性的进步。同时由于Taqman技术不需要在PCR后再将PCR产物取出进行后PCR分析，从根本上解决了PCR检测的致命的PCR污染痛点问题，极大地推动了荧光PCR在临床上的应用，创造了分子检测的辉煌。
然而，Taqman技术也有其固有缺陷，那就是Taqman技术不能像荧光染料法定量PCR那样，对PCR产物进行熔解曲线分析，因为探针在扩增过程被降解了。即使有少量完整的探针留下，也因为PCR过程中大量被降解的探针，具有很强的荧光背景，而掩盖了熔解曲线分析时微小的荧光信号的变化，使得熔解曲线分析没有意义。
正如Taqman技术本身所声称的一样，Taqman技术已经使用探针对PCR产物进行鉴别，大大提升了专一性，没有必要对PCR产物进行熔解曲线分析。这是本领域技术人员公知常识。
发明人在该技术应用过程中发现，如果对Taqman技术进行发展，使其能够对PCR产物进行熔解曲线分析，将解决Taqman技术的一些技术问题，使其具有更好的应用前景，以下列举几种情况说明：
(1)产生假阳性结果。当样本存在序列相似的目标序列(如同源基因或同一家族不同成员基因)时，PCR引物和探针很有可能在目标序列和非目标序列相差很小，因此PCR引物会扩增非目标序列，探针也可以与非目标序列结合而在扩增中被降解，只是效率较差而已。结果是产生假阳性结果。
解决途径：如果PCR后可以进行探针熔解曲线分析，根据测到的探针熔解温度，可以判断探针检测区域是否为目标序列。如果不是目标序列，测到的探针Tm值要小于探针与目标序列的双链的Tm值。
(2)影响弱阳性样本的判断。基于Taqman技术的检测经常会遇到扩增曲线在扩增过程快结束时出现翘尾的情况，很难分清究竟是弱阳性样本还是由于非特异性扩增所导致。通常的做法是被迫设定较小的Ct值作为阳性判断标准，结果是降低了检测灵敏度，影响了弱阳性样本的检出。
解决途径：如果PCR后可以进行探针熔解曲线分析，根据测到的探针熔解温度，可以判断是弱阳性样本还是阴性样本。如果测到的探针Tm值正确，样本是弱阳性样本。
(3)产生假阴性结果。当目标序列在探针区域存在突变，且突变导致探针与目标序列结合的Tm大幅下降，探针不能在PCR扩增过程与目标序列结合而被降解，结果是产生假阴性。
解决途径：如果PCR后可以进行探针熔解曲线分析，根据测到的探针熔解温度，可以判断样本是否真是阴性样本。如果熔解曲线呈现显著的熔解曲线峰，且Tm值小于正确的Tm值，说明探针区域很有可能发生了突变，需要测序核实，不能简单报为阴性结果。
(4)导致定量错误。当目标序列在探针区域存在突变时，如果突变没有造成Tm值的巨大改变，探针依然可以检测到目标序列，但效率降低了。宏观表现是同一浓度的样本，探针区域发生突变的样本比没有发生突变的样本Ct值大，结果是样本浓度被低估了。
解决途径：如果PCR后可以进行探针熔解曲线分析，根据测到的探针熔解温度，可以判断定量是否低估。如果测到的Tm值小于正确的Tm值，说明探针区域很有可能发生了突变，此时定量结果会偏低。
综上所述，以为Taqman技术采用了探针，检测到的结果就一定是正确的，这只是一种想当然。如果应用Taqman技术也能在PCR扩增后进行熔解曲线分析，将可以帮助判断包括以上列举的多种情况。长久以来，一直有各种努力，希望Taqman技术也能在扩增后进行熔解曲线分析，但至今未有满意的通用解决方法。
现有荧光PCR技术的另一个重要缺陷是多重度低，一般一个通道检测一个靶标，常见的4通道荧光PCR仪只能检测4个靶标。采用多重探针熔解曲线法，理论上可以提高检测多重度。但是，多重探针熔解曲线分析技术开发难度大，体系不稳定，至今没有成熟和公开的技术，本发明在大量的研发中发现了一种可控制可重复并普遍适应的多重探针熔解曲线方法。该技术不仅可以用于定性检测，还可以用于定量检测。
PCR-探针熔解曲线分析产品研发难度大，体系不稳定，还有一个重要原因是检测探针与检测区域的杂交面临两个竞争：一个是PCR产物单链形成分子内高级结构，从而阻止检测探针与检测区域的结合：情况轻微者，表现是熔解曲线峰峰高很低，影响结果判断；情况严重者，完全没有熔解曲线峰，导致假阴性。从理论分析，任何一定长度的DNA单链都有形成不同程度的稳定结构的趋势。由于DNA单链形成高级结构是分子内反应，而探针与PCR产物单链形成双链是分子间反应，前者具有明显的反应动力学的优势。要克服这种不利影响，提高探针的熔解温度是最有效和最容易想到的办法，但是，探针的Tm值受检测序列的制约，比如对基因多样性或基因突变的检测，目标序列位置已大致确定，没有很大选择余地；同时要区分野生型和突变型，更进一步限制了Tm值的设计选择空间。另一个竞争是PCR产物双链的结合。这种结合虽然也是分子间反应，但PCR产物的Tm一般都大大高于检测探针与检测序列形成双链的Tm，因此前者具有优势。本发明公开了使用辅助序列解决这个问题的方法。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的问题，本申请发明人进行了深入研究，在多重熔解曲线技术研究中意外的发现，基于Taqman技术，能在扩增后进行熔解曲线分析这个问题可以巧妙而有效地解决：
将PCR正向引物和反向引物设计成Tm值相差几度，在PCR扩增体系中低Tm值的引物(简称低温引物)浓度高于高Tm值的引物(简称高温引物)浓度，而且探针和高温引物与目标序列PCR产物的同一条链杂交(即探针设计在高温引物的目标链上)，我们惊奇的发现PCR扩增后进行熔解曲线分析，我们得到了熔解曲线峰，和正确、稳定的探针Tm值。
在常规的定量PCR可以接受的引物、探针浓度范围内设计PCR体系，通常在PCR体系中的终浓度为0.01-10umol/L,引物、探针Tm值经过公式或软件(例如Tm calculator、OligoAnalyzer Tool，Primer3)进行计算并通过有限次的实验，获得符合要求的Tm值，一个简单的Tm值计算公式为：
Tm＝4(G+C)+2(A+T)℃。
探针和高温引物与目标序列PCR产物的同一条链杂交，达到的效果是PCR扩增中只有当高温引物被用于合成PCR产物时，探针才会被降解。由于探针浓度高于高温引物浓度，这种设计注定在PCR扩增结束后依然有一定浓度的完整的探针存在，这些完整的探针在熔解曲线分析时发挥了作用。而将PCR正向引物和反向引物设计成相差几度，解决了由于高温引物(低浓度)用量少于低温引物(高浓度)时PCR扩增的效率降低的问题。
应用本发明公开的技术，发明人测试了多种基于Taqman技术的检测体系，都可以进行熔解曲线分析，并得到了有意义的熔解曲线。因此本发明解决了传统的Taqman技术不能在扩增后进行熔解曲线分析以进一步判断探针区域序列是否与目标序列完全一致的重要问题，是对Taqman技术的重要发展。
本发明的基于探针熔解曲线分析的多重核酸检测方法包括以下步骤：
A)不对称PCR体系设计；
B)PCR扩增；
C)熔解曲线分析。
步骤A.不对称PCR体系设计
A1.引物设计和不对称引物浓度设计：
在步骤A)的引物设计中，将PCR正向引物和反向引物设计成Tm值相差0.1-15℃,优选的相差3-10℃，Tm值低的引物浓度(按摩尔浓度计)高于Tm值高的引物，如低Tm引物浓度与高Tm引物浓度的比值为1.05至30，优选的，1.3至5，更优选的，2至15。
在常规的定量PCR可以接受的引物、探针浓度范围内设计PCR体系，通常在PCR体系中的终浓度为0.01-10umol/L,引物、探针Tm值经过相关软件进行计算并通过有限次的实验调整，获得符合要求的Tm值。
A2.探针设计：
在步骤A)的探针设计中，如果检测完全不同的目标序列，对每个目标核酸序列设计一条探针；如果用于基因突变或基因多样性，如单核苷酸多样性SNP或少数几个碱基(≤3个)的缺失或插入，可以只设计一条探针，设计的探针可同时识别野生型目标序列和突变的目标序列；碱基差别≥3个的，需要设计多条探针。探针位于正向和反向引物之间，且探针和Tm值高的引物与目标序列的同一条链杂交。
同一荧光通道内，针对需要区分的不同目标序列，探针Tm值不同，不需要区分目标序列的，探针Tm值可以相同，不同荧光通道的探针Tm值可以相同；Tm范围在40-80℃。相邻的Tm值的差值在2-35℃，优选的，在2.5-16℃，更优选的，在3-12℃。
当用于检测基因突变或基因多样性，如单核苷酸多样性SNP或少数几个碱基(≤3个)的缺失或插入时，可以只设计一条探针，设计的探针可同时识别野生型目标序列和突变的目标序列；两者Tm值相差2-30℃，优选的，在2.5-15℃，更优选的，在3-12℃。
当用于检测基因突变或基因多样性，野生型序列与突变型序列相差较大时，如达到或超过3个碱基差别时，可以为野生型序列和突变序列分别设计探针，分别设计的探针Tm值相差2-30℃,优选的，在2.5-15℃，更优选的，在3-12℃。探针的Tm设计与上述引物的Tm值设计方法相同。
探针标记有荧光发色基团，如FAM、ROX、VIC、CY5、HEX、Texas Red、TET、等，和荧光淬灭基因，荧光发色基团和淬灭基团可以标记在探针的两端或非两端位置，例如5’荧光标记，3’淬灭基团；或5’淬灭基团，3’荧光标记。
A3.DNA聚合酶、dNTP、镁离子浓度设计；
按照本领域技术人员公知常识的PCR扩增经验进行上述组分的浓度设计，例如：DNA聚合酶：0.05-10U/体系；镁离子:1-6mM，dNTP(含U或不含U)：0.01-10mM，也可以使用市售的预混PCR MasterMix,例如境象生物货号Ace104，楚天生物货号Ctb104，TAKARA货号RR390，天根货号FP206等等。
进一步地，步骤A3中，用于PCR扩增的DNA聚合酶有无5’->3’外切酶活力的聚合酶(基于Taqman技术，有经典的S型扩增曲线，还可进行熔解曲线分析)，或无5’->3’外切酶活力的聚合酶(非Taqman技术，有熔解曲线，也能有经典的S型扩增曲线，可用于定量)，或两者的混合物(比采用无5’->3’外切酶活力的聚合酶有更高的扩增信号)，无5’->3’外切酶活力的聚合酶：有5’->3’外切酶活力的聚合酶二者的活性比可以是1:0.005～200，优选约5:1。
步骤B.PCR扩增
按照设计好的PCR体系进行PCR反应配制，按本领域常规的方法进行PCR扩增。例如常规的三步法(变性-退火-延伸)或两步法(变性-退火延伸)PCR扩增。
步骤C.熔解曲线分析步骤
C1.复性：在PCR扩增步骤结束后在进行从低温到高温的熔解曲线分析前，优选的，包括一个缓慢的从高温到低温的DNA从单链形成双链的复性步骤，降温速度低于8℃/秒，优选的低于3℃/秒，更优选的低于2℃/秒。或者，分阶段降温，如94℃至80℃，常规快速降温，从80℃至45℃进行缓慢降温。
C2：熔解曲线分析步骤：
常规的熔解曲线分析步骤，例如，将PCR条件降温到40℃左右，再升温到80-95℃，再降温到40℃左右，具体降温速度和时间根据PCR仪的说明书进行常规设定。
本发明的方法在一个反应中检测多个目标核酸序列，利用特别设计的引物通过PCR扩增多个目标核酸序列，利用与目标序列形成双链后具有不同熔解温度(Tm)的多条荧光标记探针对PCR产物进行熔解曲线分析，根据荧光标记和Tm值对结果进行判读，实现一管反应对多个目标序列的多重检测或基因分型；同时利用探针实时监测扩增过程，并获取扩增的Ct值，用于目标序列的定量评估。
本发明进一步提供一种基于探针熔解曲线分析的多重核酸检测试剂盒，该试剂盒包括：
针对每个目标核酸序列设计的正向和反向PCR引物，每个目标序列设计至少一对引物，针对多个目标核酸序列可以设计简并引物，或设计多条引物；
针对每个目标核酸序列设计的一条探针，探针设计位置位于正向和反向引物之间，针对不同目标序列的探针Tm值不同；
以及用于PCR扩增的DNA聚合酶和其它PCR组分如dNTP、镁离子；
其中正向和反向引物的Tm值不同，引物在PCR扩增体系中Tm值低的引物浓度高于Tm值高的引物；探针和Tm值高的引物与目标序列的同一条链杂交。
优选地，高温和低温引物的Tm值相差0.1-15℃；低Tm引物浓度与高Tm引物浓度的比值为1.05至30；A2步骤中，探针Tm范围在40-80℃；相邻的Tm值的差值在2-35℃。
优选地，DNA聚合酶为无5’->3’外切酶活力的聚合酶，或有5’->3’外切酶活力的聚合酶，或两者的混合物。
本发明的方法优选进一步包括在步骤B中使用辅助序列，所述辅助序列为长度5-200个碱基的核酸序列，辅助序列与检测探针在与PCR产物杂交区域不重叠，优选地，所述辅助序列3’端进行修饰以阻止其被延长。
本发明还公开了一种提高PCR熔解曲线分析灵敏度的方法，包括步骤A：引物、探针、辅助序列设计；步骤B：PCR扩增；步骤C：熔解曲线分析；特征在于使用辅助序列。辅助序列可以有一个或多个，为长度5-200个碱基的核酸序列，采用多条辅助序列时，可与PCR产物的任何一条DNA链互补；辅助序列不能与PCR的引物、探针、其它辅助序列互补；辅助序列与引物或检测探针在与PCR产物杂交区域不重叠；为避免其被当做引物延伸，需对其3’端进行化学修饰。
辅助序列可以有几个作用：
1.与检测探针协同杂交：一条或多条辅助序列与检测探针一起，与模板杂交，能够增强检测探针与模板的结合能力。
2.破坏PCR产物高级结构：例如与容易产生高级结构的部位结合，从而阻止PCR产物内部产生高级结构。
3.阻止PCR产物两条链自身结合，从而增加检测探针与检测序列的结合。
本发明的提高PCR探针熔解曲线分析灵敏度的方法包括以下步骤：
A)引物探针、辅助序列设计；
B)PCR扩增；
C)熔解曲线分析。
在步骤A的引物探针、辅助序列设计中，包括以下要点：
引物探针设计：采用本领域技术人员常用的引物探针软件设计引物探针；或者使用本发明的方法设计引物探针和不对称PCR体系。
辅助序列的设计：
a.辅助序列为5-200个碱基的核酸序列，针对一个检测靶标可以包括多条辅助序列；
b.可与PCR产物的任何一条DNA链互补；
c.不能与PCR的引物、探针、其它辅助序列互补(例如连续6个以上碱基互补)；
d.与引物、探针在与PCR产物杂交区域不重叠(每条辅助序列与引物或探针之间不能有例如连续6个以上碱基相同)；
e.优选的，为避免其被当做引物延伸，需对其3’端进行化学修饰，修饰方法包括但不限于3’磷酸化，3’采用双脱氧碱基，或用C3,或C6,C18修饰；
f.优选的，辅助序列的Tm值高于探针的Tm值，还可以引入如LNA,MGB,PNA等碱基修饰以提高其Tm值。
本发明进一步提供一种核酸检测试剂盒，该试剂盒包括：
针对每个目标核酸序列设计的正向和反向PCR引物，每个目标序列设计至少一对引物，针对多个目标核酸序列可以设计简并引物，或设计多条引物；
针对每个目标核酸序列设计的一条探针，探针设计位置位于正向和反向引物之间，针对不同目标序列的探针Tm值不同；
在引物扩增区域内，针对非探针检测区域设计的辅助序列；
以及用于PCR扩增的DNA聚合酶和其它PCR组分如dNTP、镁离子。
本发明的有益效果：
根据本发明，通过简单可行的体系设定，本发明解决了以下几个重要问题：
第一，解决了传统的Taqman技术不能在扩增后进行熔解曲线分析以进一步判断探针区域序列是否与目标序列完全一致的重要问题，让Taqman技术在PCR扩增后也能进行熔解曲线分析，赋予了Taqman技术新的生命力，实现了对Taqman技术的重要发展。
第二，现有荧光PCR技术的一个重要缺陷是多重度低，一般一个通道检测一个靶标，常见的4通道荧光PCR仪只能检测4个靶标。采用多重探针熔解曲线法，理论上可以提高检测多重度。但是，多重探针熔解曲线分析技术开发难度大，体系不稳定，至今没有成熟和公开的技术，本发明在大量的研发中发现了一种可控制可重复并普遍适应的多重探针熔解曲线方法。
第三，对需要进行定量的目标序列，设计相应探针的Tm高于PCR的复性温度(三步法)，或复性与延伸温度(二步法)，并在此步骤采集荧光，PCR扩增体系采用无5’->3’外切酶活力的DNA聚合酶，发明人惊奇地发现这样也能达到实时监测PCR扩增过程的效果，(少数情况下，探针的熔解温度略低于PCR的退火温度时也能监测PCR的扩增过程)。这时的荧光的变化不是自淬灭探针的水解造成的，而是探针与目标序列杂交后荧光的增强所造成，这种荧光变化，虽然比Taqman技术中观察到的荧光变化要小很多，但我们大量的实验证明这种变化足以监测PCR扩增过程；且由于探针不被降解，探针浓度可以高于、等于、或低于高温引物，均可以获得扩增曲线和熔解曲线。更重要的是，我们发现从扩增曲线获得的Ct值，也与检测目标序列的浓度相关，能用于定量，如同Taqman技术一样。因此本发明形成了一种高多重定量检测技术，这种方法不使用具有5’->3’外切酶活力的DNA聚合酶，不属于Taqman技术，是对Taqman技术的超越。
第四，发明人发现通过混合使用具有5’->3’外切酶活力和不具有5’->3’外切酶活力的DNA聚合酶，并调节到合适的比例，扩增曲线的荧光能够进一步增强，同时熔解曲线并没有受到影响。形成一种定量和熔解曲线分析定性检测完美结合的方案。
本发明可以用于对一个或多个目标序列同时进行定量检测、熔解曲线分析和基因分型。本发明特别适用于多重核酸检测，但也可以用于对一个目标序列同时进行定量检测和基因分型。
第五，利用辅助序列，突破了传统的探针熔解曲线分析思维，进一步提高了探针熔解曲线分析的灵敏度。
附图说明
图1为高温引物、低温引物、探针工作原理图。
图2为实施例1扩增曲线和熔解曲线。
图3为实施例2扩增曲线和熔解曲线。
图4为实施例3扩增曲线和熔解曲线。
图5为实施例4扩增曲线和熔解曲线。
实施例4的扩增曲线，其中有Ct值的，具有明显的S型扩增曲线；没有Ct值的，在图中表现为X轴上的平线，但有Tm值，可以定性不能定量。
实施例4的熔解曲线，各通道中，各型别HPV具有明显可区分的熔解曲线峰值，同一荧光通道内Tm值相差2℃以上，不会混淆。
图6为辅助序列基本工作原理图。
图7为添加辅助序列前、实施例5、实施例6的扩增曲线和熔解曲线。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步说明本发明。
实施例1
实验目的：利用本发明实现在Taqman技术检测后，进行熔解曲线分析的示例
经典的Taqman方法在扩增后不能进行熔解曲线分析，无法判断扩增片段是否与目标序列完全一致；利用本发明的设计方法(将PCR正向引物和反向引物设计成Tm值相差几度，在PCR扩增体系中低Tm值的引物(简称低温引物)浓度高于高Tm值的引物(简称高温引物)浓度，而且探针和高温引物与目标序列PCR产物的同一条链杂交(即探针设计在高温引物的目标链上))设计引物探针和浓度，可以在Taqman扩增后获得熔解曲线，如果多个反应中都可以得到正确、稳定的探针Tm值，则可以判断扩增片段在探针检测区域与目标序列完全一致。如果得到的Tm值小于探针Tm值，说明探针检测区域的序列与目标序列不完全一致。
探针Tm值：扩增片段在探针检测区域与目标序列完全一致时的Tm；
Tm值稳定性：通过标准差SD体现，SD越小，稳定性越好。
实验设计：
针对HPV33设计引物和Taqman探针，标记ROX荧光基团。序列在序列表中的编号分别是4、5、6。其中，引物4是高温引物，引物5是低温引物，探针6和高温引物目标链杂交，探针6的Tm值高于退火温度(60℃)，浓度高于引物4。采用有5’->3’外切酶活力的DNA聚合酶进行PCR扩增(本示例是实施例4的一个单项)。
实验条件：各组分及其在PCR反应体系中终浓度如下：(同实施例4，HPV33)
Figure BDA0002955269190000091
注：引物Tm为设计温度，探针Tm为多次实际检测的正确的探针Tm值的平均值。
有5’->3’外切酶活性的DNA聚合酶来自市售TAKARA R001；PCR预混液来自楚天生物，货号Ctb104，含有镁离子，dNTP，buffer等PCR基本组分。
步骤B、C在PCR仪上的反应程序设置如下：(所有实施例均采用此程序设置)
Figure BDA0002955269190000092
Figure BDA0002955269190000101
采用经测序验证HPV33为阳性的临床样本1例(3个浓度梯度)，实验数据如下：
Figure BDA0002955269190000102
扩增曲线和熔解曲线原始图见附图2。
实验结果显示：实验结果具有良好的扩增曲线和正确、稳定的探针Tm值，可仅根据Tm值定性判断经扩增的HPV33片段与目标序列完全一致，进行HPV33定性检测。
结论：采用本发明的方法(正向和反向引物的Tm值不同，引物在PCR扩增体系中低温引物浓度高于高温引物；探针和高温引物与目标序列的同一条链杂交；探针的浓度不低于高温引物的浓度，使用有5’->3’外切酶活力的DNA聚合酶)能够在Taqman探针法的基础上进行熔解曲线分析，即不仅获得了良好的扩增曲线，还获得了稳定的熔解曲线和正确的探针Tm值。本发明的方法解决了传统的Taqman技术不能在扩增后进行熔解曲线分析以进一步判断探针区域序列是否与目标序列完全一致的重要问题，是对Taqman技术的重要发展。
实施例2
实验目的：使用无外切酶活性DNA聚合酶，不水解Taqman探针，不属于Taqman方法，仍然可以观察到扩增曲线和定量，并能进行熔解曲线分析。
使用无外切酶活性DNA聚合酶，我们惊奇地发现这样也能达到实时监测PCR扩增过程的效果。少数情况下，探针的熔解温度略低于PCR的退火温度时也能监测PCR的扩增过程。这时的荧光的变化不是自淬灭探针的水解造成的，而是探针与目标序列杂交后荧光的增强所造成。这种荧光变化，虽然比Taqman技术中观察到的荧光变化要小很多，但我们大量的实验证明这种变化足以监测PCR扩增过程；且由于探针不被降解，探针浓度可以高于、等于、或低于高温引物，均可以获得扩增曲线和熔解曲线。更重要的是，我们发现从扩增曲线获得的Ct值，也与检测目标序列的浓度相关，能用于定量。因此本发明还形成了一种多重检测技术，它超越了Taqman技术。
实验设计：
针对HPV16、33设计多重PCR引物和Taqman探针，分别标记VIC、ROX荧光基团。序列在序列表中的编号分别为1-6，其中，引物1为HPV16的高温引物，引物2为HPV16的低温引物，序列3为HPV16的探针；引物4为HPV33的高温引物，引物5为HPV33的低温引物，序列6为HPV33的探针；探针3、6均和高温引物目标链杂交，浓度不低于高温引物，探针Tm值均高于退火温度(60℃)。采用无5’->3’外切酶活力的DNA聚合酶进行PCR扩增。
实验条件：各组分及其在多重PCR反应体系中终浓度如下：
Figure BDA0002955269190000111
无5’->3’外切酶活性的DNA聚合酶来自楚天生物，货号Ctb113；PCR预混液来自楚天生物，货号Ctb104。
步骤B、C在PCR仪上的反应程序设置同实施例1。
采用HPV16、33国家标准品(中国食品药品检定研究院，注册检验用体外诊断试剂国家标准品，编号：360003)，稀释5个梯度，每个孔位分别加入一种HPV型别、一种浓度的样品，检测结果如下：
Figure BDA0002955269190000112
Figure BDA0002955269190000121
扩增曲线和熔解曲线原始图见附图3。
实验结果显示：HPV16、33进行5个梯度的浓度稀释，同一型别HPV不论浓度大小，具有正确、稳定的探针Tm值；根据Ct值得出线性关系方程，R2大于0.977，线性关系良好。
结论：采用本发明的方法(正向和反向引物的Tm值不同，引物在PCR扩增体系中低温引物浓度高于高温引物；探针和高温引物与目标序列的同一条链杂交；探针的浓度不低于高温引物的浓度，使用无外切酶活性DNA聚合酶)，不采用有5’->3’外切酶活性DNA聚合酶，不水解Taqman探针，不属于Taqman方法，仍然可以观察到扩增曲线和熔解曲线，且适用于多种指标、多重核酸检测和定量。
实施例3
实验目的：使用混合酶，可以克服使用无5’->3’外切酶活力的DNA聚合酶时，扩增熔解曲线信号很低，影响定量的问题。
发明人在实践中发现，使用无5’->3’外切酶活力的DNA聚合酶这种方法在针对一些指标(如HPV52)时，扩增熔解曲线信号很低，影响定量。通过混合使用具有5’->3’外切酶活力和不具有5’->3’外切酶活力的DNA聚合酶，并调节到合适的比例，我们发现扩增曲线的荧光得到了增强，Ct值也有不同程度的变小，同时熔解曲线峰高未受到显著影响，不影响定性分析。
实验设计：
针对HPV52设计引物和Taqman探针，标记VIC荧光基团。序列在序列表中的编号分别是7、8、9。其中，引物8是低温引物，引物7是高温引物，探针和高温引物目标链杂交，探针9的Tm值低于退火温度(60℃)，浓度高于高温引物7。采用无5’->3’外切酶活力的DNA聚合酶(同实施例2)和有5’->3’外切酶活力的DNA聚合酶(同实施例1)按不同比例(无：有＝2:1；5:1；1)混合，进行PCR扩增。
实验条件：各组分及其在PCR反应体系中终浓度如下：
Figure BDA0002955269190000122
Figure BDA0002955269190000131
步骤B、C在PCR仪上的反应程序设置同实施例1。
采用经测序验证HPV52为阳性的临床样本检测，实验数据如下：
Figure BDA0002955269190000132
扩增曲线和熔解曲线原始图见附图4。
实验结果显示：随着有5’->3’外切酶活力的DNA聚合酶的比例增加，Ct值逐渐减小，扩增曲线信号整体升高；Tm值稳定，均为正确的探针Tm值，但熔解曲线信号有所降低。当调节到合适比例(5:1)时，扩增曲线的荧光得到了增强，同时熔解曲线并没有受到太大影响，不影响定性。
结论：使用本发明的方法(正向和反向引物的Tm值不同，引物在PCR扩增体系中低温引物浓度高于高温引物；探针和高温引物与目标序列的同一条链杂交；探针的浓度不低于高温引物的浓度，使用混合酶)，通过混合使用具有5’->3’外切酶活力和不具有5’->3’外切酶活力的DNA聚合酶，并调节到合适的比例，扩增曲线的荧光得到了增强，Ct值也有不同程度的变小，同时熔解曲线并没有受到显著影响。这是一种定量和熔解曲线分析定性检测完美结合的方案。
实施例4
实验目的：使用本发明的方法，开发简单通用的超多重PCR体系(本实施例是对实施例1的补充)
实验设计：
物种：人、HPV病毒；指标：共9个，设计在一个PCR反应内，探针设计在高温引物目标链上；探针Tm值覆盖范围：40-80℃；探针共标记4种荧光，涉及4个荧光通道，每个通道2-3种指标，4个通道共检测9种检测序列。同一指标的高温引物和低温引物Tm值相差0.1-15℃，低温引物浓度：高温引物浓度约为1.05-30；同一通道探针Tm值两两之间相差2-35℃不等；优选，高温引物和低温引物Tm值相差3-10℃，探针Tm值覆盖范围：40-66.5℃；同一通道探针Tm值两两之间相差4-16℃；低温引物浓度：高温引物浓度约为1.3-25。优选探针浓度高于高温引物；探针Tm值有的高于、有的低于PCR退火步骤的温度，优选的，对于需要定量的指标，不低于PCR退火步骤的温度。
不同Tm引物和探针的设计表
Figure BDA0002955269190000141
注：引物Tm为设计温度，探针Tm为多次实际观测的温度平均值。
其中，HPV16、33、66，B2M的探针Tm高于退火温度，HPV52、53、59、68、73的探针Tm低于退火温度。
实验条件：各组分及其在PCR反应体系中终浓度如下：
Figure BDA0002955269190000151
步骤B、C在PCR仪上的反应程序同实施例1。
采用经测序验证的对应指标为阳性的临床样本(1个样本3个浓度梯度，从上而下分别为组成浓度、稀释10倍、稀释100倍)，检测结果如下：
Figure BDA0002955269190000152
注：部分指标没有Ct值，该栏空白。
扩增曲线和熔解曲线原始结果见附图5。
检测结果显示：
1.Tm值低于退火温度(60℃)的指标没有扩增曲线、没有Ct值，但有正确、稳定的探针Tm值，可仅根据探针Tm值判断经扩增的目标片段探针检测区域与目标序列完全一致，进行各指标定性检测。
2.Tm值高于退火温度的指标(60℃)的指标有较为理想的扩增曲线、Ct值，熔解曲线和正确、稳定的Tm值，可根据Tm值判断经扩增的目标片段探针检测区域与目标序列完全一致，进行各指标定性检测；以Ct值为基础，可以进行定量分析。
结论：采用本发明的方法(正向和反向引物的Tm值不同，引物在PCR扩增体系中低温引物浓度高于高温引物；探针和高温引物与目标序列的同一条链杂交；探针的浓度不低于高温引物的浓度，使用有5’->3’外切酶活力的DNA聚合酶)能够在Taqman探针法的基础上进行熔解曲线分析，广泛适用于多种指标、多重核酸检测；同一指标具有正确、稳定的探针Tm值，可仅根据Tm值判断经扩增的目标片段探针检测区域与目标序列一致，进行各指标定性检测。对于探针Tm值高于PCR退火温度的指标，还具有良好的扩增曲线，可以进行定量分析。本发明的方法解决了高多重PCR中，传统的Taqman技术不能在扩增后进行熔解曲线分析以进一步判断探针区域序列是否与目标序列完全一致的重要问题。
实施例5
实验目的：在本发明独特的引物探针设计基础上，采用辅助序列，可提高探针熔解曲线分析的灵敏度。
发明人在PCR-熔解曲线产品开发实践过程中，发现人类G6PD基因SNP位点rs398123546经过多次设计开发均无法获得理想的实验结果，具体表现为：用测序确定的野生型、杂合子和突变型，用本实验无法区分。由于有一个正确、稳定的熔解曲线峰，排除了引物、探针和PCR体系的问题，判断是突变型的检出灵敏度问题。
利用本发明步骤A的方法，设计引物、探针、辅助序列，在PCR体系中的终浓度如下：
Figure BDA0002955269190000161
步骤B、C在PCR仪上的反应程序设置如下：
Figure BDA0002955269190000162
Figure BDA0002955269190000171
检测结果如下：
Figure BDA0002955269190000172
扩增曲线和熔解曲线见附图7。
实验结果表明：加辅助序列后测得两个稳定的熔解曲线峰，突变型Tm为50.5℃左右，野生型为57℃左右。
未加辅助序列时，野生型能够稳定检出，但突变型无法检出，加辅助序列后，实施例5的野生型和突变型Tm都能稳定检出，表明辅助序列有效地克服了阻碍突变等位基因检出的因素，增强了突变等位基因的检测灵敏度。
实施例6
实验目的：采用辅助序列，在对称PCR中也可实现提高探针熔解曲线分析的灵敏度。
发明人在实验过程中发现，使用辅助序列，并不一定需要设计成本发明权利要求1所述的不对称PCR，对称PCR也可行。
利用本发明一种提高PCR熔解曲线分析灵敏度的方法，设计引物、探针、辅助序列，检测对象、引物、探针、辅助序列的序列设计同实施例5，采用对称PCR设计，各组分在PCR体系中的终浓度如下：
Figure BDA0002955269190000173
Figure BDA0002955269190000181
步骤B、C在PCR仪上的反应程序设置如下：
Figure BDA0002955269190000182
检测结果如下：
Figure BDA0002955269190000183
扩增曲线和熔解曲线见附图7。
实验结果表明：加辅助序列后，实施例6的野生型和突变型Tm都能稳定检出，Tm值与实施例5一致，表明辅助序列有效地克服了阻碍突变等位基因检出的因素，增强了突变等位基因的检测灵敏度，辅助序列功能的实现不依赖于不对称PCR设计。
上述实施例仅为说明本发明，不能以此限定本发明的保护范围。应当理解，本发明提供的引物浓度要求、探针浓度要求、上下游引物倍数差异要求、Tm值要求、各Tm值之间的差异要求、混合酶比例要求相当宽泛，能够满足绝大多数核酸检测的引物探针设计需求，绝非仅适合于实施例中的引物探针。
序列表
<110> 上海境象生物科技有限公司
<120> 基于探针熔解曲线分析的多重核酸检测方法和试剂盒
<130> 2102067F-1
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgatactgca tccacaacat tactgg 26
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacagacaaa agcagcgg 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgcttttgt gtgtctgcc 19
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctgtatggt tcgtaggtca cttg 24
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
accagccaca gctgatta 18
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgaactgtgg tgttacaagt gtgac 25
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcgacggacc ttcgtactct aca 23
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcctccatt gcagggtt 18
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cacattacaa gttgtgtgc 19
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aactgcacca acgactcaca cc 22
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtagaccatc tgcaggag 18
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgtctagctt gctgtgg 17
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
accttacagt gctgcgtctg gatgt 25
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aggttccaga cccggact 18
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcaaacgaac tatat 15
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gccatagtgc aaatgtagct ccct 24
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acctacaggc cccagtac 18
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gaaggagact gaggtacgaa gggcc 25
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
caacacatgg cactggtaca gaac 24
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cacgaacctg ttgatgtg 18
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtagtactcc tatacctgg 19
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggtacaggac tctgtggtgg gat 23
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gacagtgtga ctcggacc 18
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tatgcaaaca atccagg 17
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccatagccca caggtatgca g 21
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tcatcctgga cgtcttctg 19
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cacctgcgca cgaagt 16
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gccggcagct gggcct 16
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tcagacttgt ctttcagcaa ggact 25
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cttaactatc ttgggctgtg aca 23
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gtatgcctgc cgtgtgaacc atg 23

Claims (14)

1.一种基于探针熔解曲线分析的多重核酸检测方法，所述方法包括以下步骤：
步骤A：不对称PCR体系设计；
步骤B：PCR扩增；
步骤C：熔解曲线分析；
所述步骤A的不对称PCR体系设计包括：
A1.针对每个目标核酸序列设计正向和反向PCR引物，每个目标序列设计至少一对引物，针对多个目标核酸序列设计简并引物，或设计多条引物；
A2.对每个目标核酸序列设计一条探针，探针设计位置位于正向和反向引物之间；
其中A1中正向和反向引物的Tm值不同，引物在PCR扩增体系中低温引物浓度高于高温引物；A2中探针和高温引物与目标序列的同一条链杂交。
2.根据权利要求1所述的多重核酸检测方法，其特征是，A1中，高温和低温引物的Tm值相差0.1-15℃，优选高温引物和低温引物Tm值相差3-10℃；低Tm引物浓度与高Tm引物浓度的比值为1.05至30，优选的，1.3至25；A2中，探针Tm范围在40-80℃；同一通道相邻的Tm值的差值在2-35℃，优选探针Tm值两两之间相差2.5-16℃。
3.根据权利要求1所述的多重核酸检测方法，其特征是，所述方法用于1-3个核苷酸突变、插入或缺失的核酸检测，对每个目标突变位点的野生型和突变型仅设计一条探针；设计的探针在与野生型目标序列和突变的目标序列分别结合，野生型目标序列和突变的目标序列与探针分别结合的Tm值相差2-30℃；
或
所述的方法用于≥3个碱基差别的核酸检测，其中对野生型序列和突变序列分别设计探针，分别设计的探针Tm值相差2-30℃。
4.根据权利要求1所述的多重核酸检测方法，其特征是：探针标记有荧光发色基团和荧光淬灭基团，荧光发色基团和淬灭基团标记在探针的两端或非两端位置。
5.根据权利要求1所述的多重核酸检测方法，其特征是，步骤B中，用于PCR扩增的DNA聚合酶是无5’->3’外切酶活力的聚合酶，或有5’->3’外切酶活力的聚合酶，或两者的混合物；
优选地，当PCR扩增采用具有5’->3’外切酶活力的聚合酶时，探针的浓度至少不能低于高温引物的浓度。
6.根据权利要求5所述的多重核酸检测方法，其特征是，针对需要进行定量检测的目标序列的检测探针，其Tm值至少不能低于PCR退火步骤的温度。
7.根据权利要求1所述的多重核酸检测方法，其特征是，在熔解曲线分析步骤C时，在PCR扩增步骤结束后在进行从低温到高温的熔解曲线分析前，包括一个缓慢的从高温到低温的DNA从单链形成双链的复性步骤，降温速度低于8℃/秒，优选的低于3℃/秒，更优选的低于2℃/秒；或分阶段降温，94℃至80℃，常规快速降温，从80℃至45℃进行缓慢降温。
8.根据权利要求1所述的多重核酸检测方法，其特征是，可用于对多个目标序列进行多重检测，或对一个目标序列进行单重检测。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征是：使用辅助序列，所述辅助序列为长度5-200个碱基的序列，且辅助序列与检测探针在与PCR产物杂交区域不重叠，优选地，所述辅助序列3’端进行修饰以阻止其被延长。
10.一种基于探针熔解曲线分析的核酸检测试剂盒，该试剂盒包括：
针对每个目标核酸序列设计的正向和反向PCR引物，每个目标序列设计至少一对引物，针对多个目标核酸序列可以设计简并引物，或设计多条引物；
针对每个目标核酸序列设计的一条探针，探针设计位置位于正向和反向引物之间，针对不同目标序列的探针Tm值不同；
以及用于PCR扩增的dNTP和DNA聚合酶、镁离子等常规组分；
其中正向和反向引物的Tm值不同，引物在PCR扩增体系中Tm值低的引物浓度高于Tm值高的引物；探针和Tm值高的引物与目标序列的同一条链杂交；
优选地，高温和低温引物的Tm值相差0.1-15℃；低Tm引物浓度与高Tm引物浓度的比值为1.05至30；A2步骤中，探针Tm范围在40-80℃；相邻的Tm值的差值在2-35℃；
优选地，DNA聚合酶为无5’->3’外切酶活力的聚合酶，或有5’->3’外切酶活力的聚合酶，或两者的混合物。
11.一种提高PCR熔解曲线分析灵敏度的方法，包括以下步骤：
步骤A：引物、探针、辅助序列设计；
步骤B：PCR扩增；
步骤C：熔解曲线分析；
其特征在于，反应体系使用了辅助序列。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征是：步骤A中所述辅助序列是一条或多条长度为5-200个碱基的核酸链，采用多条辅助序列时，可与PCR产物的任何一条DNA链互补；辅助序列不能与PCR的引物、探针、其它辅助序列互补；辅助序列与引物、探针在与PCR产物杂交区域不重叠；优选的，辅助序列的Tm值高于检测探针的Tm值，优选的，还可以引入如LNA,MGB,PNA等碱基修饰。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征是，对所述辅助序列3’端进行修饰以阻止其被延长。
14.一种核酸检测试剂盒，其特征是，使用了辅助序列，所述辅助序列是一条或多条长度为5-200个碱基的核酸链，采用多条辅助序列时，可与PCR产物的任何一条DNA链互补；辅助序列不能与PCR的引物、探针、其它辅助序列互补；辅助序列与引物、探针在与PCR产物杂交区域不重叠；优选的，辅助序列的Tm值高于检测探针的Tm值，优选的，还可以引入如LNA、MGB、PNA等碱基修饰。
CN202110221469.8A 2021-02-27 2021-02-27 基于探针熔解曲线分析的多重核酸检测方法和试剂盒 Pending CN114958988A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110221469.8A CN114958988A (zh) 2021-02-27 2021-02-27 基于探针熔解曲线分析的多重核酸检测方法和试剂盒
PCT/CN2022/076520 WO2022179419A1 (zh) 2021-02-27 2022-02-16 基于探针熔解曲线分析的多重核酸检测方法和试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110221469.8A CN114958988A (zh) 2021-02-27 2021-02-27 基于探针熔解曲线分析的多重核酸检测方法和试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114958988A true CN114958988A (zh) 2022-08-30

Family

ID=82973232

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110221469.8A Pending CN114958988A (zh) 2021-02-27 2021-02-27 基于探针熔解曲线分析的多重核酸检测方法和试剂盒

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN114958988A (zh)
WO (1) WO2022179419A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116206686A (zh) * 2023-03-07 2023-06-02 深圳市天大生物医疗器械有限公司 非对称pcr反应中的pcr熔解曲线分析方法及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3985959B2 (ja) * 1999-04-20 2007-10-03 独立行政法人産業技術総合研究所 核酸の測定方法に用いる核酸プローブおよびデータを解析する方法
JP4909501B2 (ja) * 2000-09-26 2012-04-04 独立行政法人産業技術総合研究所 定量的多型解析方法
AU2002312411A1 (en) * 2001-06-07 2002-12-16 Proligo Llc Microcalorimetric detection of analytes and binding events
EP2603607B1 (en) * 2010-08-11 2016-04-06 Celula, Inc. Genotyping dna
ES2961374T3 (es) * 2015-04-24 2024-03-11 Atila Biosystems Incorporated Amplificación con cebadores de composición de nucleótidos limitada

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116206686A (zh) * 2023-03-07 2023-06-02 深圳市天大生物医疗器械有限公司 非对称pcr反应中的pcr熔解曲线分析方法及其应用
CN116206686B (zh) * 2023-03-07 2024-03-22 深圳市天大生物医疗器械有限公司 非对称pcr反应中的pcr熔解曲线分析方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022179419A1 (zh) 2022-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3394287B1 (en) A method of fluorescent detection of isothermal loop-mediated amplification (lamp) of a target nucleic acid
CN101871007B (zh) 用标记探针进行检测和熔解曲线分析的方法
US9359639B2 (en) Method for the detection of multiple single nucleotide variations or single nucleotide polymorphisms in a single tube
CA2786696C (en) Oligonucleotides and methods for detecting pik3ca mutations
JP2004033216A (ja) アンプリコン融解曲線分析による遺伝子型分析
CN104164478A (zh) 一种基因单碱基变异的cras-pcr检测方法
US20190106735A1 (en) Method for analyzing cancer gene using multiple amplification nested signal amplification and kit
CN107365850B (zh) 一种单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法
CN105755134B (zh) 一种内切酶介导的实时多交叉置换核酸扩增技术及应用
CN102286616A (zh) 一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变的方法及试剂盒
CN112442525B (zh) 用于检测人类自然杀伤细胞免疫球蛋白样受体kir基因分型的试剂盒
CN114958988A (zh) 基于探针熔解曲线分析的多重核酸检测方法和试剂盒
Seifi et al. Overview of real-time PCR principles
CN106636409A (zh) 一种通用荧光探针及其检测方法和应用
CN106319079A (zh) 一种检测22q11.2拷贝数缺失的方法
CN107937493B (zh) 一种用于等位基因pcr的发夹修饰引物
NL2031160B1 (en) Primer Set, Probe and Application for Distinguishing Brucella S2 Vaccine Strain from Wild Strain
US20180237853A1 (en) Methods, Compositions and Kits for Detection of Mutant Variants of Target Genes
CN105779570B (zh) 一种检测snp位点的方法
CN111793676A (zh) 一种基因多态性检测的方法、试剂盒及其应用
CN107400722B (zh) 一种检测人基因组的竞争性实时荧光pcr snp探针
Frayling et al. PCR-based methods for mutation detection
CN113337582B (zh) 一种单管多重核酸检测的方法
CN110863039B (zh) 基于共享性引物探针检测slco1b1和apoe基因多态性的引物组、方法及其试剂盒
CN117867126A (zh) 基于TaqMan探针熔解曲线法检测食管癌的引物探针组合物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20230809

Address after: 201403 1st floor, 1990 Jinbi Road, Fengxian District, Shanghai

Applicant after: SHANGHAI ACEBIOX BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.

Applicant after: WUHAN EASYDIAGNOSIS BIOMEDICINE Co.,Ltd.

Address before: Building 6, No. 399, Jindou Road, Jinhui Town, Fengxian District, Shanghai, 201404

Applicant before: SHANGHAI ACEBIOX BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.

TA01 Transfer of patent application right