CN110863039B - 基于共享性引物探针检测slco1b1和apoe基因多态性的引物组、方法及其试剂盒 - Google Patents
基于共享性引物探针检测slco1b1和apoe基因多态性的引物组、方法及其试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110863039B CN110863039B CN201911199502.0A CN201911199502A CN110863039B CN 110863039 B CN110863039 B CN 110863039B CN 201911199502 A CN201911199502 A CN 201911199502A CN 110863039 B CN110863039 B CN 110863039B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- slco1b1
- primer
- mutant
- type
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请公开了一种基于共享性引物探针检测SLCO1B1和APOE基因多态性的引物组、方法及其试剂盒。该方法将报告基团标记在同向性设计的野生型ARMS引物和突变型ARMS引物5′端，制备具有探针性的ARMS引物，并经筛选后用于基因的多态性检测。本方法检测灵敏度更高，特异性更强，结果更准确客观，同时设计简单，成本低廉。
Description
技术领域
本申请涉及基因检测领域，具体涉及一种基因多态性的PCR检测。
技术背景
目前用于检测基因多态性的方法主要有以下几种：测序分型法、高分辨率熔解曲线分型法、基因芯片分型法、TaqMan探针分型法和MGB探针分型法等。测序分型法是该领域检测的金标准，但受限于操作繁琐性和设备特殊性，没有广泛推广；而其余方法都是基于PCR扩增技术衍生而来，使用相对广泛。其中，测序分型法检测过程包含PCR扩增、测序，操作繁琐，检测时间一般长达4～5个小时，而且操作过程中需要打开PCR反应管，容易带来PCR产物的污染；高分辨率熔解曲线分型法的特征是利用多态性位点的碱基不同而带来的Tm值差别，通过识别不同的Tm值而进行检测，往往野生型和突变型位点的Tm值差别不到1℃，所以需要精准识别温度的设备，这类设备比较少，而且大多属于进口，价格昂贵；基因芯片分型法检测过程包含PCR扩增、探针杂交，操作繁琐，检测时间一般长达4～5个小时，而且操作过程中需要打开PCR反应管，容易带来PCR产物的污染；TaqMan探针分型法是利用ARMS引物识别多态性位点，该方法学检测一个多态性位点需要2个反应孔，通量相对较低；MGB探针分型利用MGB标记的探针识别多态性位点，MGB探针设计难度大，价格高，且寻找一条合适的MGB探针需要筛选很多条，成本较高。
SLCO1B1和ApoE基因多态性检测对于他汀类药物使用剂量有重要意义。SLCO1B1基因编码有机阴离子转运多肽OATP1B1，该基因第5外显子521T>C(Val174Ala)多态性是亚洲人群中的主要遗传变异，等位基因频率为10～15％，SLCO1B1基因的多态性显著降低OATP1B1对其底物的摄取能力，使他汀类药物如普伐他汀、阿托伐他汀和罗苏伐他汀等的血药浓度升高，导致他汀的不良反应显著升高。APOE基因位于19号染色体19q13.2，其编码的载脂蛋白APOE是一种存在于乳糜微粒和中间密度脂蛋白中的载脂蛋白，主要由肝脏和巨噬细胞产生，参与血脂的运输、存储和排泄。该基因的两个功能性SNP rs429358(c.388T>C，Cys130Arg)和rs7412(c.526C>T，Arg176Cys)构成3种单倍型，分别是E2(rs429358T-rs7412T)、E3(rs429358T-rs7412C)、E4(rs429358C-rs7412C)。由三种单倍型构成6种不同的基因型(E2/E2、E3/E3、E4/E4、E2/E3、E2/E4和E3/E4)。E3/E3是最常见的基因型，人群中的频率约60％。
现有技术中对人SLCO1B1和APOE基因多态性检测手段主要是上述方法。
可见上述方法仍存在诸多缺陷，有必要寻求一种新的检测方法，使检测效果更特异、灵敏度更高、通量更高、结果更客观等，同时还保证设计简单、成本低廉、操作简便、检测时间短等。基于此，特提出本申请。
发明内容
本申请的第一目的在于提供一种用于SLCO1B1和APOE基因多态性检测的共享性ARMS引物探针制备方法；
本申请的第二目的在于提供一种用于SLCO1B1和APOE基于共享性引物探针检测基因多态性的方法；
本申请的第三目的在于提供一种用于SLCO1B1和APOE基于共享性引物探针检测基因多态性引物体系、试剂盒及其应用。
为实现上述目的，本申请采用的技术方案如下：
本申请提供一种用于SLCO1B1和APOE基因多态性检测的探针性ARMS引物制备方法，所述方法包括针对野生型位点和突变型位点同向设计野生型ARMS引物和突变型ARMS引物，所述野生型ARMS引物和突变型ARMS引物5′端最后一个碱基通过不同报告基团的标记，引物和探针共享同一条核苷酸序列，制备具有探针性质的探针性ARMS引物(见图1-3)；
优选的，所述报告基因选自FAM、ROX、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、TAMRA、Texas Red、LC RED640或LC RED705；
在一些实施方式中，进一步包括筛选高扩增效率引物作为制备探针性ARMS引物；
在一些实施方式中，进一步包括淬灭探针和下游引物的设计；
在一些实施方式中，所述淬灭探针是针对野生型探针性ARMS引物和突变型探针性ARMS引物设计互补核苷酸序列，并对互补核苷酸序列的3′端进行非荧光淬灭基团的标记；
在一些实施方式中，所述淬灭探针的碱基数比野生型探针性ARMS引物和突变型探针性ARMS引物碱基数少3-9个；优选的，少4-7个；更优选的少5-6个；
在一些实施方式中，进一步包括野生型探针性ARMS引物和突变型探针性ARMS引物错配基因的引入；
在一些实施方式中，所述错配基因靠近野生型探针性ARMS引物和突变型探针性ARMS引物的3′端；
在一些实施方式中，所述野生型探针性ARMS引物和突变型探针性ARMS引物在靠近3′端第2-4个碱基上引入错配碱基，相同序列位置引入的错配碱基不同，不同序列位置引入的错配碱基可以相同，也可以不同。例如：野生型探针性ARMS引物在靠近3′端第2个碱基引入错配碱基A，则突变型探针性ARMS引物在靠近3′端第2个碱基可引入除A之外的错配碱基T、G或C，在靠近3′端第3个或第4个碱基可引入含A的错配碱基A、T、G或C；
在一些实施方式中，所述野生型探针性ARMS引物和突变型探针性ARMS引物的Tm值为65～70℃；
在一些实施方式中，所述野生型位点检测和突变型位点检测在同一个反应体系中进行PCR扩增；
在一些实施方式中，所述基因多态性检测是针对SLCO1B1和APOE多态性检测；优选的，针对SLCO1B1*5和SLCO1B1*1b；更优选的，还针对APOE2和APOE4；
在一些实施方式中，所述SLCO1B1*5的野生型探针性ARMS引物5′端标记FAM荧光基团，SLCO1B1*5的突变型探针性ARMS引物5′端标记TET荧光基团，SLCO1B1*5的淬灭探针3′端标记BHQ2淬灭基团；所述SLCO1B1*1b野生型探针性ARMS引物5′端标记ROX荧光基团，SLCO1B1*1b的突变型探针性ARMS引物5′端标记CY5荧光基团，SLCO1B1*1b的淬灭探针3′端标记BHQ2淬灭基团；
在一些实施方式中，所述SLCO1B1*5的野生型探针性ARMS引物、突变型探针性ARMS引物、淬灭探针和下游引物序列分别如SEQ ID NO.1-4所示；所述SLCO1B1*1b的野生型探针性ARMS引物、突变型探针性ARMS引物、淬灭探针和下游引物序列分别如SEQ ID NO.5-8所示；
在一些实施方式中，所述APOE2野生型探针性ARMS引物5′端标记FAM荧光基团，APOE2的突变型探针性ARMS引物5′端标记TET荧光基团，APOE2的淬灭探针3′端标记BHQ2淬灭基团；所述APOE4野生型探针性ARMS引物5′端标记ROX荧光基团，APOE4的突变型探针性ARMS引物5′端标记CY5荧光基团，APOE4的淬灭探针3′端标记BHQ2淬灭基团；
在一些实施方式中，所述APOE2的野生型探针性ARMS引物、突变型探针性ARMS引物、淬灭探针和下游引物序列分别如SEQ ID NO.9-12所示；APOE4的野生型探针性ARMS引物、突变型探针性ARMS引物、淬灭探针和下游引物序列分别如SEQ ID NO.13-16所示；
本申请提供一种基于共享性引物探针检测基因多态性的检测方法，所述检测方法包括用于基因多态性检测的探针性ARMS引物制备的步骤；
所述步骤包括针对野生型位点和突变型位点同向设计野生型ARMS引物和突变型ARMS引物，所述野生型ARMS引物和突变型ARMS引物5′端最后一个碱基通过不同报告基团的标记，引物和探针共享同一条核苷酸序列，制备具有探针性质的探针性ARMS引物；
优选的，所述报告基因选自FAM、ROX、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、TAMRA、Texas Red、LC RED640或LC RED705；
在一些实施方式中，进一步包括筛选高扩增效率引物作为制备探针性ARMS引物；
在一些实施方式中，进一步包括淬灭探针和下游引物的设计；
在一些实施方式中，所述淬灭探针是针对野生型探针性ARMS引物和突变型探针性ARMS引物设计互补核苷酸序列，并对互补核苷酸序列的3′端进行非荧光淬灭基团的标记；
在一些实施方式中，所述淬灭探针的碱基数比野生型探针性ARMS引物和突变型探针性ARMS引物碱基数少3-9个；优选的，少4-7个；更优选的少5-6个。
在一些实施方式中，进一步包括野生型探针性ARMS引物和突变型探针性ARMS引物错配碱基的引入；
在一些实施方式中，所述错配碱基在靠近野生型探针性ARMS引物和突变型探针性ARMS引物的3′端；
在一些实施方式中，所述野生型探针性ARMS引物和突变型探针性ARMS引物相同序列位置引入的错配碱基不同，不同序列位置引入的错配碱基可以相同，也可以不同；
在一些实施方式中，所述野生型探针性ARMS引物和突变型探针性ARMS引物的Tm值为65～70℃。
在一些实施方式中，所述野生型位点检测和突变型位点检测在同一个反应体系中进行PCR扩增；
在一些实施方式中，所述基因多态性检测是针对SLCO1B1和APOE多态性检测；优选的，针对SLCO1B1*5和SLCO1B1*1b；更优选的，还针对APOE2和APOE4；
在一些实施方式中，所述SLCO1B1*5的野生型探针性ARMS引物5′端标记FAM荧光基团，SLCO1B1*5的突变型探针性ARMS引物5′端标记TET荧光基团，SLCO1B1*5的淬灭探针3′端标记BHQ2淬灭基团；所述SLCO1B1*1b野生型探针性ARMS引物5′端标记ROX荧光基团，SLCO1B1*1b的突变型探针性ARMS引物5′端标记CY5荧光基团，SLCO1B1*1b的淬灭探针3′端标记BHQ2淬灭基团；
在一些实施方式中，所述SLCO1B1*5的野生型探针性ARMS引物、突变型探针性ARMS引物、淬灭探针和下游引物序列分别如SEQ ID NO.1-4所示；所述SLCO1B1*1b的野生型探针性ARMS引物、突变型探针性ARMS引物、淬灭探针和下游引物序列分别如SEQ ID NO.5-8所示；
在一些实施方式中，所述APOE2野生型探针性ARMS引物5′端标记FAM荧光基团，APOE2的突变型探针性ARMS引物5′端标记TET荧光基团，APOE2的淬灭探针3′端标记BHQ2淬灭基团；所述APOE4野生型探针性ARMS引物5′端标记ROX荧光基团，APOE4的突变型探针性ARMS引物5′端标记CY5荧光基团，APOE4的淬灭探针3′端标记BHQ2淬灭基团；
在一些实施方式中，所述APOE2的野生型探针性ARMS引物、突变型探针性ARMS引物、淬灭探针和下游引物序列分别如SEQ ID NO.9-12所示；所述APOE4的野生型探针性ARMS引物、突变型探针性ARMS引物、淬灭探针和下游引物序列分别如SEQ ID NO.13-16所示
在一些实施方式中，所述基于共享性引物探针检测基因多态性的检测方法还包括样本处理步骤、检测体系配制步骤、反应参数设置步骤和结果判读及分析步骤；
在一些实施方式中，检测体系配制步骤中，检测时用于扩增多态性位点的PCR混合液中，所述探针性ARMS引物和下游引物的浓度介于400～600nM，优选500nM；所述淬灭探针的浓度介于0.8～1.2μM，优选1.0μM；
在一些实施方式中，检测体系配制步骤中，检测时阴性质控品由Tris-Hcl缓冲液组成；
在一些实施方式中，检测体系配制步骤中，检测时阳性质控品由SLCO1B1*5野生型质粒和突变型质粒，SLCO1B1*1b野生型质粒和突变型质粒，APOE2野生型质粒和突变型质粒，APOE4野生型质粒和突变型质粒；优选的，所述的质粒为人工克隆环状质粒，用Tris-Hcl(pH8.0)进行稀释至2000拷贝；所述的试剂盒中Taq酶为热启动酶；
在一些实施方式中，所述反应参数设置步骤中，反应参数设置为95℃3分钟预变性，1个循环；95℃15秒变性，60℃1分钟，收集荧光信号，40个循环；荧光信号采集通路设置FAM、TET、ROX、CY5；
在一些实施方式中，所述结果判读及分析步骤为①阳性质控品FAM、TET、ROX、CY5荧光有扩增曲线，阴性质控品无扩增曲线，检测数据有效；②用扩增SLCO1B1*5和SLCO1B1*1b的PCR混合液中FAM和TET荧光信号判断SLCO1B1*5的多态性，FAM有扩增曲线而TET无扩增曲线，判断结果为SLCO1B1*5纯合野生型；FAM无扩增曲线而TET有扩增曲线，判断结果为SLCO1B1*5纯合突变型；FAM、TET均有扩增曲线，判断结果为SLCO1B1*5杂合型；③用扩增SLCO1B1*5和SLCO1B1*1b的PCR混合液中ROX和CY5荧光信号判断SLCO1B1*1b的多态性，ROX有扩增曲线而CY5无扩增曲线，判断结果为SLCO1B1*1b纯合野生型；ROX无扩增曲线而CY5有扩增曲线，判断结果为SLCO1B1*1b纯合突变型；ROX、CY5均有扩增曲线，判断结果为SLCO1B1*1b杂合型；④用扩增APOE2和APOE4的PCR混合液中FAM和TET荧光信号判断APOE2的多态性，FAM有扩增曲线而TET无扩增曲线，判断结果为APOE2纯合野生型；FAM无扩增曲线而TET有扩增曲线，判断结果为APOE2纯合突变型；FAM、TET均有扩增曲线，判断结果为APOE2杂合型；⑤用扩增APOE2和APOE4的PCR混合液中ROX和CY5荧光信号判断APOE4的多态性，ROX有扩增曲线而CY5无扩增曲线，判断结果为APOE4纯合野生型；ROX无扩增曲线而CY5有扩增曲线，判断结果为APOE4纯合突变型；ROX、CY5均有扩增曲线，判断结果为APOE4杂合型
本申请提供一种检测SLCO1B1和APOE基因多态性的引物组(或引物体系)，所述引物组(或引物体系)是由基因多态性检测的共享性ARMS引物探针制备方法制备；
所述步骤包括针对野生型位点和突变型位点同向设计野生型ARMS引物和突变型ARMS引物，所述野生型ARMS引物和突变型ARMS引物5′端最后一个碱基通过不同报告基团的标记，引物和探针共享同一条核苷酸序列，制备具有探针性质的探针性ARMS引物；
优选的，所述报告基因选自FAM、ROX、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、TAMRA、Texas Red、LC RED640或LC RED705；
在一些实施方式中，进一步包括筛选高扩增效率引物作为制备探针性ARMS引物；
在一些实施方式中，进一步包括淬灭探针和下游引物的设计；
在一些实施方式中，所述淬灭探针是针对野生型探针性ARMS引物和突变型探针性ARMS引物设计互补核苷酸序列，并对互补核苷酸序列的3′端进行非荧光淬灭基团的标记；
在一些实施方式中，所述淬灭探针的碱基数比野生型探针性ARMS引物和突变型探针性ARMS引物碱基数少3-9个；优选的，少4-7个；更优选的少5-6个；
在一些实施方式中，进一步包括野生型探针性ARMS引物和突变型探针性ARMS引物错配碱基的引入；
在一些实施方式中，所述错配碱基靠近野生型探针性ARMS引物和突变型探针性ARMS引物的3′端；
在一些实施方式中，所述野生型探针性ARMS引物和突变型探针性ARMS引物相同序列位置引入的错配碱基不同，不同序列位置引入的错配碱基可以相同，也可以不同；
在一些实施方式中，所述野生型探针性ARMS引物和突变型探针性ARMS引物的Tm值为65～70℃；
在一些实施方式中，所述野生型位点检测和突变型位点检测在同一个反应体系中进行PCR扩增；
在一些实施方式中，所述基因多态性检测是针对SLCO1B1和APOE多态性检测；优选的，针对SLCO1B1*5和SLCO1B1*1b；更优选的，还针对APOE2和APOE4；
在一些实施方式中，所述SLCO1B1*5的野生型探针性ARMS引物5′端标记FAM荧光基团，SLCO1B1*5的突变型探针性ARMS引物5′端标记TET荧光基团，SLCO1B1*5的淬灭探针3′端标记BHQ2淬灭基团；所述SLCO1B1*1b野生型探针性ARMS引物5′端标记ROX荧光基团，SLCO1B1*1b的突变型探针性ARMS引物5′端标记CY5荧光基团，SLCO1B1*1b的淬灭探针3′端标记BHQ2淬灭基团；
在一些实施方式中，所述SLCO1B1*5的野生型探针性ARMS引物、突变型探针性ARMS引物、淬灭探针和下游引物序列分别如SEQ ID NO.1-4所示；所述SLCO1B1*1b的野生型探针性ARMS引物、突变型探针性ARMS引物、淬灭探针和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.5-8所示；
具体如下：
SLCO1B1*5野生型探针性ARMS引物：
5′-FAM-CACGAAGCATATTACCCATGAGCA-3′SEQ ID NO.1
SLCO1B1*5突变型探针性ARMS引物：
5′-TET-CACGAAGCATATTACCCATGGACG-3′SEQ ID NO.2
SLCO1B1*5淬灭探针：
5′-ATGGGTAATATGCTTCGTG-BHQ2-3′SEQ ID NO.3
SLCO1B1*5下游引物：
5′-GGAATCTGGGTCATACATGTGGAT-3′SEQ ID NO.4
SLCO1B1*1b野生型探针性ARMS引物：
5′-ROX-GGTCGATGTTGAATTTTCTGATGAGTT-3′SEQ ID NO.5
SLCO1B1*1b突变型探针性ARMS引物：
5′-CY5-GGTCGATGTTGAATTTTCTGATAAATC-3′SEQ ID NO.6
SLCO1B1*1b淬灭探针：
5′-GAAAATTCAACATCGACC-BHQ2-3′SEQ ID NO.7
SLCO1B1*1b下游引物：
5′-AATTCAGTGATGTTCTTACAGTTACAGGT-3′SEQ ID NO.8
在一些实施方式中，所述APOE2野生型探针性ARMS引物5′端标记FAM荧光基团，APOE2的突变型探针性ARMS引物5′端标记TET荧光基团，APOE2的淬灭探针3′端标记BHQ2淬灭基团；APOE4野生型探针性ARMS引物5′端标记ROX荧光基团，APOE4的突变型探针性ARMS引物5′端标记CY5荧光基团，APOE4的淬灭探针3′端标记BHQ2淬灭基团；
在一些实施方式中，所述APOE2的野生型探针性ARMS引物、突变型探针性ARMS引物、淬灭探针和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9-12所示；APOE4的野生型探针性ARMS引物、突变型探针性ARMS引物、淬灭探针和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.13-16所示；
具体如下：
APOE2野生型探针性ARMS引物：
5′-FAM-TGCCGATGACCTGCAGATGC-3′SEQ ID NO.9
APOE2突变型探针性ARMS引物：
5′-TET-TGCCGATGACCTGCAGCAGT-3′SEQ ID NO.10
APOE2淬灭探针：
5′-GCAGGTCATCGGCA-BHQ2-3′SEQ ID NO.11
APOE2下游引物：
5′-CGGCCTGGTACACTGCCA-3′SEQ ID NO.12
APOE4野生型探针性ARMS引物：
5′-ROX-CGCGGACATGGAGGACTTGT-3′SEQ ID NO.13
APOE4突变型探针性ARMS引物：
5′-CY5-CGCGGACATGGAGGACGTGC-3′SEQ ID NO.14
APOE4淬灭探针：
5′-GTCCTCCATGTCCGCG-BHQ2-3′SEQ ID NO.15
APOE4下游引物：
5′-GCAGCTCCTCGGTGCTCTG-3′SEQ ID NO.16
一种检测SLCO1B1和APOE基因多态性的引物组(或引物体系)，所述引物序列如1-12所示；
在一些实施方式中，所述引物的荧光标记分别为：所述SLCO1B1*5的野生型探针性ARMS引物5′端标记FAM荧光基团，SLCO1B1*5的突变型探针性ARMS引物5′端标记TET荧光基团，SLCO1B1*5的淬灭探针3′端标记BHQ2淬灭基团；所述SLCO1B1*1b野生型探针性ARMS引物5′端标记ROX荧光基团，SLCO1B1*1b的突变型探针性ARMS引物5′端标记CY5荧光基团，SLCO1B1*1b的淬灭探针3′端标记BHQ2淬灭基团；所述APOE2野生型探针性ARMS引物5′端标记FAM荧光基团，APOE2的突变型探针性ARMS引物5′端标记TET荧光基团，APOE2的淬灭探针3′端标记BHQ2淬灭基团；所述APOE4野生型探针性ARMS引物5′端标记ROX荧光基团，APOE4的突变型探针性ARMS引物5′端标记CY5荧光基团，APOE4的淬灭探针3′端标记BHQ2淬灭基团；
上述引物组(或引物体系)在制备用于检测SLCO1B1和APOE基因多态性的试剂盒中的应用。
一种检测SLCO1B1和APOE基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包含上述引物组(或引物体系)。
在一些实施方式中，所述试剂盒进一步包括阴性质控品和阳性质控品，以及常规组分，比如PCR缓冲液、dNTP、Mg2+、Taq酶等；
在一些实施方式中，所述的阴性质控品由Tris-Hcl缓冲液组成；所述的阳性质控品由SLCO1B1*5野生型质粒和突变型质粒，SLCO1B1*1b野生型质粒和突变型质粒，APOE2野生型质粒和突变型质粒，APOE4野生型质粒和突变型质粒；
在一些实施方式中，所述的质粒为人工克隆环状质粒；
在一些实施方式中，所述试剂盒中Taq酶为热启动酶；
上述试剂盒用于检测SLCO1B1和APOE基因多态性的方法，包含如下步骤：
⑴样本处理：采用血液基因组DNA提取试剂盒提取人外周血基因组DNA，作为待测样本；
⑵检测体系配制：向反应管中加入18μl PCR混合液和2μl待测样本，同时设置阴性质控体系和阳性质控体系，反应管放入荧光定量PCR仪中；
⑶反应参数设置：95℃3分钟预变性，1个循环；95℃15秒变性，60℃1分钟，收集荧光信号，40个循环；荧光信号采集通路设置FAM、TET、ROX、CY5；
⑷结果判读及分析：①阳性质控品FAM、TET、ROX、CY5荧光有扩增曲线，阴性质控品无扩增曲线，检测数据有效；②用扩增SLCO1B1*5和SLCO1B1*1b的PCR混合液中FAM和TET荧光信号判断SLCO1B1*5的多态性，FAM有扩增曲线而TET无扩增曲线，判断结果为SLCO1B1*5纯合野生型；FAM无扩增曲线而TET有扩增曲线，判断结果为SLCO1B1*5纯合突变型；FAM、TET均有扩增曲线，判断结果为SLCO1B1*5杂合型；③用扩增SLCO1B1*5和SLCO1B1*1b的PCR混合液中ROX和CY5荧光信号判断SLCO1B1*1b的多态性，ROX有扩增曲线而CY5无扩增曲线，判断结果为SLCO1B1*1b纯合野生型；ROX无扩增曲线而CY5有扩增曲线，判断结果为SLCO1B1*1b纯合突变型；ROX、CY5均有扩增曲线，判断结果为SLCO1B1*1b杂合型；④用扩增APOE2和APOE4的PCR混合液中FAM和TET荧光信号判断APOE2的多态性，FAM有扩增曲线而TET无扩增曲线，判断结果为APOE2纯合野生型；FAM无扩增曲线而TET有扩增曲线，判断结果为APOE2纯合突变型；FAM、TET均有扩增曲线，判断结果为APOE2杂合型；⑤用扩增APOE2和APOE4的PCR混合液中ROX和CY5荧光信号判断APOE4的多态性，ROX有扩增曲线而CY5无扩增曲线，判断结果为APOE4纯合野生型；ROX无扩增曲线而CY5有扩增曲线，判断结果为APOE4纯合突变型；ROX、CY5均有扩增曲线，判断结果为APOE4杂合型；
相比于现有技术，本申请的有益效果在于：
1)本申请对ARMS引物和TaqMan或MGB探针设计进行改良，将TaqMan或MGB探针上的报告基团直接标记在AMRS引物5′端最后一个碱基上，引物探针共享同一条核苷酸序列，制备具有探针性质的探针性ARMS引物，相对于普通ARMS引物，Tm值高，特异性及灵敏度大大提高，检测结果更加准确(见图1-3)；
2)探针性ARMS引物，共享同一条核苷酸序列、具有引物和探针双重功能，不另外设计TaqMan探针、MGB探针或其它探针，节省了TaqMan或MGB探针的设计和成本，设计简单，成本低廉；
3)探针性AMRS引物和淬灭探针互补配对，报告基团与淬灭基团彼此接触，相对于TaqMan探针、MGB探针，本底信号更低，检测结果更加客观；
4)本申请针对SLCO1B1和APOE多态性位点设计方法，野生型探针性ARMS引物和突变型探针性ARMS引物为同向设计，优势在于，带有错配碱基的野生型探针性AMRS引物扩增野生型模板，PCR产物在相同的位置会发生碱基突变，导致野生型PCR产物与突变型探针性ARMS引物错配碱基数量增加，进而降低了突变型探针的非特异性扩增几率，因此提高了突变型探针性ARMS引物的扩增特异性；同理，野生型探针性ARMS引物也会提高特异性；
6)本申请通过优化筛选出适于SLCO1B1和APOE多态性检测的探针性ARMS引物组，经验证其检测灵敏度高、特异性强，且可在同一反应体系中实现多种类型多态性的检测。
7)本申请采用FAM标记SLCO1B1*5野生型ARMS引物、TET标记SLCO1B1*5突变型ARMS引物、ROX标记SLCO1B1*1b野生型ARMS引物、CY5标记SLCO1B1*1b突变型ARMS引物；FAM标记APOE2野生型ARMS引物、TET标记APOE2突变型ARMS引物、ROX标记APOE4野生型ARMS引物、CY5标记APOE4突变型ARMS引物可实现在同一个反应孔检测SLCO1B1*5和SLCO1B1*1b，同一个反应孔检测APOE2和APOE4，通量显著提高；
8)本申请SLCO1B1*5的野生型和突变型检测体系、SLCO1B1*1b的野生型和突变型检测体系可设置在同一个PCR混合液，APOE2的野生型和突变型检测体系设置在同一个PCR混合液，APOE4的野生型和突变型检测体系设置在同一个PCR混合液，根据一个样本仅纯合野生型、纯合突变型、杂合型三种型别原则，不需设置内标体系；
9)本申请可采用预混合液的形式，预先将检测所需的ARMS引物、淬灭探针、下游引物、PCR缓冲液、dNTP、Mg2+、Taq酶进行混合，使用时不需要配制，仅分装加入模板DNA上机检测，操作简便，时间短；
10)本申请根据荧光定量PCR仪收集的荧光信号判读结果，不需要统计ct值，结果分析简单；
11)本申请的检测方法和试剂盒填补该领域的市场空白，市场反馈良好，适于产业化应用。
附图说明
图1本申请所述的基因多态性检测方法原理图a；
图2本申请所述的基因多态性检测方法原理图b；
图3本申请所述的基因多态性检测方法原理图c；
图4本申请SLCO1B1*5突变型ARMS引物的标记优化结果；
图5本申请SLCO1B1*1b突变型ARMS引物的标记优化结果；
图6本申请APOE2突变型ARMS引物的标记优化结果；
图7本申请APOE4突变型ARMS引物的标记优化结果；
图8本申请SLCO1B1*5淬灭探针序列优化结果；
图9本申请SLCO1B1*1b淬灭探针序列优化结果；
图10本申请APOE2淬灭探针序列优化结果；
图11本申请APOE4淬灭探针序列优化结果；
图12本申请SLCO1B1*5纯合野生型检测结果；
图13本申请SLCO1B1*5纯合突变型检测结果；
图14本申请SLCO1B1*5杂合型检测结果；
图15本申请SLCO1B1*1b纯合野生型检测结果；
图16本申请SLCO1B1*1b纯合突变型检测结果；
图17本申请SLCO1B1*1b杂合型检测结果；
图18本申请APOE2纯合野生型检测结果；
图19本申请APOE2纯合突变型检测结果；
图20本申请APOE2杂合型检测结果；
图21本申请APOE4纯合野生型检测结果；
图22本申请APOE4纯合突变型检测结果；
图23本申请APOE4杂合型检测结果
具体实施方式
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
实施例1引物的设计优化、标记的优化筛选
一、野生型、突变型探针性ARMS引物的设计和筛选，具体步骤如下：
1)针对SLCO1B1*5、SLCO1B1*1b、APOE2、APOE4野生型和突变型位点初步设计一系列ARMS引物，Tm值为58～62℃，序列如下表1：
表1、初步设计SLCO1B1*5、SLCO1B1*1b、APOE2、APOE4野生型和突变型ARMS引物
2)SLCO1B1*5野生型ARMS引物、下游引物、SYBR-premix缓冲液配制PCR反应液，分别检测5000copy/μl的SLCO1B1*5野生型质粒和突变型质粒；SLCO1B1*5突变型ARMS引物、下游引物、SYBR-premix缓冲液配制PCR反应液，分别检测5000copy/μl的SLCO1B1*5野生型质粒和突变型质粒；SLCO1B1*1b野生型ARMS引物、下游引物、SYBR-premix缓冲液配制PCR反应液，分别检测5000copy/μl的SLCO1B1*1b野生型质粒和突变型质粒；SLCO1B1*1b突变型ARMS引物、下游引物、SYBR-premix缓冲液配制PCR反应液，分别检测5000copy/μl的SLCO1B1*1b野生型质粒和突变型质粒；APOE2野生型ARMS引物、下游引物、SYBR-premix缓冲液配制PCR反应液，分别检测5000copy/μl的APOE2野生型质粒和突变型质粒；APOE2突变型ARMS引物、下游引物、SYBR-premix缓冲液配制PCR反应液，分别检测5000copy/μl的APOE2野生型质粒和突变型质粒；APOE4野生型ARMS引物、下游引物、SYBR-premix缓冲液配制PCR反应液，分别检测5000copy/μl的APOE4野生型质粒和突变型质粒；APOE4突变型ARMS引物、下游引物、SYBR-premix缓冲液配制PCR反应液，分别检测5000copy/μl的APOE4野生型质粒和突变型质粒；反应参数设置如下：
表2、PCR扩增参数设计
统计SLCO1B1*5野生型PCR反应液检测5000copy/μl的野生型质粒和突变型质粒的扩增Ct值及△Ct值，统计SLCO1B1*5突变型PCR反应液检测5000copy/μl的野生型质粒和突变型质粒的扩增Ct值及△Ct值，统计SLCO1B1*1b野生型PCR反应液检测5000copy/μl的野生型质粒和突变型质粒的扩增Ct值及△Ct值，统计SLCO1B1*1b突变型PCR反应液检测5000copy/μl的野生型质粒和突变型质粒的扩增Ct值及△Ct值，统计APOE2野生型PCR反应液检测5000copy/μl的野生型质粒和突变型质粒的扩增Ct值及△Ct值，统计APOE2突变型PCR反应液检测5000copy/μl的野生型质粒和突变型质粒的扩增Ct值及△Ct值，统计APOE4野生型PCR反应液检测5000copy/μl的野生型质粒和突变型质粒的扩增Ct值及△Ct值，统计APOE4突变型PCR反应液检测5000copy/μl的野生型质粒和突变型质粒的扩增Ct值及△Ct值，以上△Ct值＝|野生模板Ct值-突变模板Ct值|，见下表：
SLCO1B1*5野生型PCR反应液中优选扩增野生型质粒模板Ct值相对小且△Ct值相对大的野生型ARMS引物，SLCO1B1*5突变型PCR反应液中优选扩增突变型质粒模板Ct值相对小且△Ct值相对大的突变型ARMS引物；SLCO1B1*1b野生型PCR反应液中优选扩增野生型质粒模板Ct值相对小且△Ct值相对大的野生型ARMS引物，SLCO1B1*1b突变型PCR反应液中优选扩增突变型质粒模板Ct值相对小且△Ct值相对大的突变型ARMS引物；APOE2野生型PCR反应液中优选扩增野生型质粒模板Ct值相对小且△Ct值相对大的野生型ARMS引物，APOE2突变型PCR反应液中优选扩增突变型质粒模板Ct值相对小且△Ct值相对大的突变型ARMS引物，APOE4野生型PCR反应液中优选扩增野生型质粒模板Ct值相对小且△Ct值相对大的野生型ARMS引物，APOE4突变型PCR反应液中优选扩增突变型质粒模板Ct值相对小且△Ct值相对大的突变型ARMS引物。同时考量引物的扩增特异性以及多重扩增体系的兼容性。获得优化的备选引物序列见下表。
表3、优化筛选的ARMS引物
二、备选ARMS引物报告基团标记的优化、筛选，具体步骤如下：
1)对上述备选AMRS引物5′端尝试进行FAM、VIC、HEX、TET、NED、CY3、ROX、CY5等不同类型的标记，FAM和ROX为常用探针标记，性能稳定，因此作为野生型位点基团标记，主要进行突变型ARMS引物不同报告基团标记的筛选，报告基团的标记由上海生工完成，具体标记情况如下：
表4、备选ARMS引物的标记与筛选
2)SLCO1B1*5突变型不同报告基团TET、VIC、HEX标记的ARMS引物分别与淬灭探针、下游引物、PCR-premix缓冲液配制PCR反应液，检测5000copy/μl的SLCO1B1*5突变型质粒；SLCO1B1*1b突变型不同报告基团CY3、CY5、NED标记的ARMS引物分别与淬灭探针、下游引物、PCR-premix缓冲液配制PCR反应液，检测5000copy/μl的SLCO1B1*1b突变型质粒；APOE2突变型不同报告基团TET、VIC、HEX标记的ARMS引物分别与淬灭探针、下游引物、PCR-premix缓冲液配制PCR反应液，检测5000copy/μl的APOE2突变型质粒；APOE4突变型不同报告基团TET、VIC、HEX标记的ARMS引物分别与淬灭探针、下游引物、PCR-premix缓冲液配制PCR反应液，检测5000copy/μl的APOE4突变型质粒。
表5、PCR反应参数设置
3)结果分析
不同标记效果差异显著，最终确定：
SLCO1B1*5突变型ARMS引物标记优选TET标记，测试结果如图4；
SLCO1B1*1b突变型ARMS引物标记优选CY5标记，测试结果图5；
APOE2突变型ARMS引物标记优选TET标记，测试结果如图6；
APOE4突变型ARMS引物标记优选CY5标记，测试结果如图7。
三、淬灭探针序列的设计、优化和筛选，具体步骤如下：
1)根据探针性ARMS引物的序列，设计与之完全互补的一系列不同长度的淬灭探针，3′端进行BHQ2标记，具体情况如下表。
表6、淬灭探针标记序列
2)SLCO1B1*5野生型和突变型探针性ARMS引物，分别与不同长度的淬灭探针、下游引物、PCR-premix缓冲液配制PCR反应液，检测5000copy/μl的SLCO1B1*5野生型质粒和突变型质粒；SLCO1B1*1b野生型和突变型探针性ARMS引物，分别与不同长度的淬灭探针、下游引物、PCR-premix缓冲液配制PCR反应液，检测5000copy/μl的SLCO1B1*1b野生型质粒和突变型质粒；APOE2野生型和突变型探针性ARMS引物，分别与不同长度的淬灭探针、下游引物、PCR-premix缓冲液配制PCR反应液，检测5000copy/μl的APOE2野生型质粒和突变型质粒；APOE4野生型和突变型探针性ARMS引物，分别与不同长度的淬灭探针、下游引物、PCR-premix缓冲液配制PCR反应液，检测5000copy/μl的APOE4野生型质粒和突变型质粒；反应参数设置如下表：
表7、PCR反应参数
3)结果分析
SLCO1B1*5优选扩增Ct值相对小，荧光信号值相对高的淬灭探针，测试结果如图8所示；
SLCO1B1*1b优选扩增Ct值相对小，荧光信号值相对高的淬灭探针，测试结果如图9所示：
APOE2优选扩增Ct值相对小，荧光信号值相对高的淬灭探针，测试结果如图10所示；
APOE4优选扩增Ct值相对小，荧光信号值相对高的淬灭探针，测试结果如图11所示。最终确立优选后的淬灭探针序列如下：
SLCO1B1*5淬灭探针5′-ATGGGTAATATGCTTCGTG-BHQ2-3′；
SLCO1B1*1b淬灭探针5′-GAAAATTCAACATCGACC-BHQ2-3′；
APOE2淬灭探针5′-GCAGGTCATCGGCA-BHQ2-3′；
APOE4淬灭探针5′-GTCCTCCATGTCCGCG-BHQ2-3′。
实施例2引物制备和试剂盒组装
一、本申请探针性ARMS引物、淬灭探针、下游引物的合成和荧光标记
根据实施例1优化筛选到的探针性ARMS引物、淬灭探针、下游引物以及标记，进行引物合成和荧光标记，具体标记为SLCO1B1*5野生型探针性ARMS引物5′端标记FAM、SLCO1B1*5突变型探针性ARMS引物5′端标记TET、SLCO1B1*5淬灭探针3′端标记BHQ2、SLCO1B1*5下游引物；SLCO1B1*1b野生型探针性ARMS引物5′端标记ROX、SLCO1B1*1b突变型探针性ARMS引物5′端标记CY5、SLCO1B1*1b淬灭探针3′端标记BHQ2、SLCO1B1*1b下游引物；APOE2野生型探针性ARMS引物5′端标记FAM、APOE2突变型探针性ARMS引物5′端标记TET、APOE2淬灭探针3′端标记BHQ2、APOE2下游引物；APOE4野生型探针性ARMS引物5′端标记ROX、APOE4突变型探针性ARMS引物5′端标记CY5、APOE4淬灭探针3′端标记BHQ2、APOE4下游引物。
具体序列如下：
SLCO1B1*5野生型探针性ARMS引物：
5′-FAM-CACGAAGCATATTACCCATGAGCA-3′SEQ ID NO.1；
SLCO1B1*5突变型探针性ARMS引物：
5′-TET-CACGAAGCATATTACCCATGGACG-3′SEQ ID NO.2；
SLCO1B1*5淬灭探针：
5′-ATGGGTAATATGCTTCGTG-BHQ2-3′SEQ ID NO.3；
SLCO1B1*5下游引物：
5′-GGAATCTGGGTCATACATGTGGAT-3′SEQ ID NO.4；
SLCO1B1*1b野生型探针性ARMS引物：
5′-ROX-GGTCGATGTTGAATTTTCTGATGAGTT-3′SEQ ID NO.5；
SLCO1B1*1b突变型探针性ARMS引物：
5′-CY5-GGTCGATGTTGAATTTTCTGATAAATC-3′SEQ ID NO.6；
SLCO1B1*1b淬灭探针：
5′-GAAAATTCAACATCGACC-BHQ2-3′SEQ ID NO.7；
SLCO1B1*1b下游引物：
5′-AATTCAGTGATGTTCTTACAGTTACAGGT-3′SEQ ID NO.8；
APOE2野生型探针性ARMS引物：
5′-FAM-TGCCGATGACCTGCAGATGC-3′SEQ ID NO.9；
APOE2突变型探针性ARMS引物：
5′-TET-TGCCGATGACCTGCAGCAGT-3′SEQ ID NO.10；
APOE2淬灭探针：
5′-GCAGGTCATCGGCA-BHQ2-3′SEQ ID NO.11；
APOE2下游引物：
5′-CGGCCTGGTACACTGCCA-3′SEQ ID NO.12；
APOE4野生型探针性ARMS引物：
5′-ROX-CGCGGACATGGAGGACTTGT-3′SEQ ID NO.13；
APOE4突变型探针性ARMS引物：
5′-CY5-CGCGGACATGGAGGACGTGC-3′SEQ ID NO.14；
APOE4淬灭探针：
5′-GTCCTCCATGTCCGCG-BHQ2-3′SEQ ID NO.15；
APOE4下游引物：
5′-GCAGCTCCTCGGTGCTCTG-3′SEQ ID NO.16。
二、用于基因多态性检测的PCR混合液配制
1.用于扩增SLCO1B1*5和SLCO1B1*1b的PCR混合液配制，包括SLCO1B1*5野生型探针性ARMS引物、SLCO1B1*5突变型探针性ARMS引物、SLCO1B1*5淬灭探针、SLCO1B1*5下游引物、SLCO1B1*1b野生型探针性ARMS引物、SLCO1B1*1b突变型探针性ARMS引物、SLCO1B1*1b淬灭探针、SLCO1B1*1b下游引物，序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8，PCR缓冲液、dNTP、Mg2+、Taq酶，具体成分如下。
表8、SLCO1B1*5和SLCO1B1*1b的PCR混合液组分和含量
2.用于扩增APOE2和APOE4的PCR混合液配制，包括APOE2野生型探针性ARMS引物、APOE2突变型探针性ARMS引物、APOE2淬灭探针、APOE2下游引物、APOE4野生型探针性ARMS引物、APOE4突变型探针性ARMS引物、APOE4淬灭探针、APOE4下游引物，序列为SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.16，PCR缓冲液、dNTP、Mg2+、Taq酶。具体成分如下表：
表9、APOE2和APOE4的PCR混合液组分和含量
| 组分 | 含量 |
| PCR缓冲液 | 1× |
| dNTP | 150μM |
| Mg2+ | 2mM |
| Taq酶 | 1U |
| APOE2野生型探针性ARMS引物 | 500nM |
| APOE2突变型探针性ARMS引物 | 500nM |
| APOE2淬灭探针 | 1.0μM |
| APOE2下游引物 | 500nM |
| APOE4野生型探针性ARMS引物 | 500nM |
| APOE4突变型探针性ARMS引物 | 500nM |
| APOE4淬灭探针 | 1.0μM |
| APOE4下游引物 | 500nM |
| 去离子水 | 至18μl |
3.阴性质控品的配制，配制包括Tris-Hcl(pH8.0)的常规缓冲液。
4.阳性质控品的配制，配制包括SLCO1B1*5野生型质粒和突变型质粒、SLCO1B1*1b野生型质粒和突变型质粒、APOE2野生型质粒和突变型质粒、APOE4野生型质粒和突变型质粒，具体成分如下表：
表10、野生型质粒成分
| 种类 | 拷贝数 |
| SLCO1B1*5野生型质粒 | 2000拷贝 |
| SLCO1B1*5突变型质粒 | 2000拷贝 |
| SLCO1B1*1b野生型质粒 | 2000拷贝 |
| SLCO1B1*1b突变型质粒 | 2000拷贝 |
| APOE2野生型质粒 | 2000拷贝 |
| APOE2突变型质粒 | 2000拷贝 |
| APOE4野生型质粒 | 2000拷贝 |
| APOE4突变型质粒 | 2000拷贝 |
三、试剂盒组装
试剂盒包括4种试剂：用于扩增SLCO1B1*5和SLCO1B1*1b的PCR混合液，用于扩增APOE2和APOE4的PCR混合液，阴性质控品，阳性质控品，具体成分如下：
表11、试剂盒组成
实施例3检测灵敏度
使用实施例2中制备的基于共享性引物探针检测人类SLCO1B1和APOE基因多态性的试剂盒a与基于ARMS引物+TaqMan探针检测SLCO1B1和APOE基因多态性试剂盒b、基于MGB探针检测SLCO1B1和APOE基因多态性试剂盒c对比测试，具体对比测试步骤如下：
步骤一、制备灵敏度模板，包括SLCO1B1*5纯合野生型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.2ng/μl，SLCO1B1*5纯合突变型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.2ng/μl，SLCO1B1*5杂合型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.2ng/μl；SLCO1B1*1b纯合野生型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.2ng/μl，SLCO1B1*1b纯合突变型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.2ng/μl，SLCO1B1*1b杂合型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.2ng/μl；APOE2纯合野生型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.2ng/μl，APOE2纯合突变型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.2ng/μl，APOE2杂合型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.2ng/μl；APOE4纯合野生型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.2ng/μl，APOE4纯合突变型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.2ng/μl，APOE4杂合型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.2ng/μl；
步骤二、根据说明书配制试剂盒a、试剂盒b、试剂盒c，加入模板，每个反应孔20个重复，混合均匀，置于荧光定量PCR仪设备中；
步骤三、反应参数的设置，具体如下表：
表12、PCR反应参数
步骤四、检测结果分析见下表
表13、灵敏度检测结果
基于共享性引物探针检测人类SLCO1B1和APOE基因多态性的试剂盒a、基于ARMS引物+TaqMan探针检测SLCO1B1和APOE基因多态性试剂盒b、基于MGB探针检测SLCO1B1和APOE基因多态性试剂盒c检测2ng/μl、1ng/μl的灵敏度模板，检出率均为100％，在检测更低浓度的0.5ng/μl和0.2ng/μl时，本发明的基于共享性引物探针检测人类SLCO1B1和APOE基因多态性的试剂盒a有更高的检出率，表明本发明的共享性引物探针制备的试剂盒检测灵敏度更高，应用范围更广。
实施例4临床样本检测
使用实施例2中制备的人类SLCO1B1和APOE基因多态性检测试剂盒检测50例待测样本静脉全血，具体检测步骤如下：
步骤一、样本处理：外购全血基因组DNA提取试剂盒对50例样本进行核酸DNA提取，OD260/280介于1.8～2.0，OD260/230在1.8～2.2，浓度大于5ng/μl；
步骤二、检测试剂配制：将实施例2中制备的用于扩增SLCO1B1*5和SLCO1B1*1b的PCR混合液、用于扩增APOE2和APOE4的PCR混合液平衡至室温，颠倒混匀，分别取18μl的PCR混合液至PCR反应管中，然后加入步骤一中纯化的2μl核酸DNA样本、2μl阴性质控品、2μl阳性质控品，混合均匀，置于荧光定量PCR仪设备中；
步骤三、反应参数的设置，具体如下：
表14、PCR反应参数
步骤四、检测结果分析：
1.结果判读标准见下表：
表15、结果判读标准
注：阳性代表有S型扩增曲线；阴性代表没有S型扩增曲线，具体检测曲线见图12-23。
2.根据结果判读标准分析50例样本分析结果，见下表：
表16、50例样本检测结果
| 纯合野生型 | 杂合型 | 纯合突变型 | |
| SLCO1B1*5 | 35 | 8 | 7 |
| SLCO1B1*1b | 5 | 20 | 25 |
| APOE2 | 40 | 9 | 1 |
| APOE4 | 42 | 8 | 0 |
3.如下是50例样本第三方测序结果，作为结果参照。
表17、50例样本的第三方测序结果
| 纯合野生型 | 杂合型 | 纯合突变型 | |
| SLCO1B1*5 | 35 | 8 | 7 |
| SLCO1B1*1b | 5 | 20 | 25 |
| APOE2 | 40 | 9 | 1 |
| APOE4 | 42 | 8 | 0 |
可见，本申请的方法与第三方测序结果对比，上述50例待测样本分析结果，符合率100％。以上结果表明：本发明所设计的试剂盒可用于检测人类SLCO1B1和APOE基因多态性，其结果准确可靠，特异性强，达到了测序检测效果；同时该方法操作简便、检测时间短、结果分析简单、成本低。
以上对本申请具体实施方式的描述并不限制本申请，本领域技术人员可以根据本申请作出各种改变或变形，只要不脱离本申请的精神，均应属于本申请所附权利要求的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京安智因生物技术有限公司
<120> 基于共享性引物探针检测SLCO1B1和APOE基因多态性的引物组、方法及其试
剂盒
<130> 2019
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cacgaagcat attacccatg agca 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cacgaagcat attacccatg gacg 24
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgggtaata tgcttcgtg 19
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggaatctggg tcatacatgt ggat 24
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggtcgatgtt gaattttctg atgagtt 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggtcgatgtt gaattttctg ataaatc 27
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gaaaattcaa catcgacc 18
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aattcagtga tgttcttaca gttacaggt 29
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgccgatgac ctgcagatgc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tgccgatgac ctgcagcagt 20
<210> 11
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gcaggtcatc ggca 14
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cggcctggta cactgcca 18
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cgcggacatg gaggacttgt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cgcggacatg gaggacgtgc 20
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gtcctccatg tccgcg 16
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gcagctcctc ggtgctctg 19
Claims (3)
1.一种检测SLCO1B1和APOE基因多态性的引物和探针组，其特征在于，所述引物和探针组包括如下引物：
SLCO1B1*5野生型探针性ARMS引物：5′-FAM- CACGAAGCATATTACCCATGAGCA-3′，
SLCO1B1*5突变型探针性ARMS引物：5′-TET- CACGAAGCATATTACCCATGGACG-3′，
SLCO1B1*5下游引物：5′- GGAATCTGGGTCATACATGTGGAT- 3′，
SLCO1B1*1b野生型探针性ARMS引物：5′-ROX- GGTCGATGTTGAATTTTCTGATGAGTT-3′，
SLCO1B1*1b突变型探针性ARMS引物：5′-CY5- GGTCGATGTTGAATTTTCTGATAAATC-3′，
SLCO1B1*1b下游引物：5′- AATTCAGTGATGTTCTTACAGTTACAGGT- 3′；
APOE2野生型探针性ARMS引物：5′-FAM- TGCCGATGACCTGCAGATGC-3′，
APOE2突变型探针性ARMS引物：5′-TET- TGCCGATGACCTGCAGCAGT-3′，
APOE2下游引物：5′- CGGCCTGGTACACTGCCA- 3′,
APOE4野生型探针性ARMS引物：5′-ROX- CGCGGACATGGAGGACTTGT -3′，
APOE4突变型探针性ARMS引物：5′-CY5- CGCGGACATGGAGGACGTGC -3′，APOE4下游引物：5′- GCAGCTCCTCGGTGCTCTG - 3′；
所述引物和探针组还包括如下淬灭探针：
SLCO1B1*5淬灭探针： 5′- ATGGGTAATATGCTTCGTG-BHQ2-3′，
SLCO1B1*1b淬灭探针：5′-GAAAATTCAACATCGACC -BHQ2-3′，
APOE2淬灭探针：5′- GCAGGTCATCGGCA-BHQ2-3′，
APOE4淬灭探针：5′- GTCCTCCATGTCCGCG -BHQ2-3′。
2.一种检测SLCO1B1和APOE基因多态性的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述引物和探针组。
3.权利要求1所述的引物和探针组在制备用于检测SLCO1B1和APOE基因多态性的试剂盒中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911199502.0A CN110863039B (zh) | 2019-11-29 | 2019-11-29 | 基于共享性引物探针检测slco1b1和apoe基因多态性的引物组、方法及其试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911199502.0A CN110863039B (zh) | 2019-11-29 | 2019-11-29 | 基于共享性引物探针检测slco1b1和apoe基因多态性的引物组、方法及其试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110863039A CN110863039A (zh) | 2020-03-06 |
| CN110863039B true CN110863039B (zh) | 2020-08-11 |
Family
ID=69656888
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911199502.0A Active CN110863039B (zh) | 2019-11-29 | 2019-11-29 | 基于共享性引物探针检测slco1b1和apoe基因多态性的引物组、方法及其试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110863039B (zh) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1216894C (zh) * | 2001-12-21 | 2005-08-31 | 上海复星医学科技发展有限公司 | 利用发夹结构产生信号的核酸扩增及检测方法 |
| CN106544419B (zh) * | 2016-10-13 | 2021-05-18 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的引物、探针及试剂盒 |
| CN107630073A (zh) * | 2017-10-30 | 2018-01-26 | 厦门基源医疗科技有限公司 | 一种叶酸代谢基因多态性位点的基因型检测方法及试剂盒 |
| CN110387407A (zh) * | 2019-08-29 | 2019-10-29 | 无锡市申瑞生物制品有限公司 | 用于检测人SLCO1B1和ApoE基因分型的引物探针组合物、试剂盒及检测方法 |
-
2019
- 2019-11-29 CN CN201911199502.0A patent/CN110863039B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110863039A (zh) | 2020-03-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113584216B (zh) | 小麦粒重基因TaCYP78A16的KASP标记开发及其应用 | |
| CN107119107A (zh) | 一种检测人类cyp2c19基因多态性的方法及试剂盒 | |
| CN112029837A (zh) | 一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测snp位点的试剂盒及其检测方法 | |
| CN110564861B (zh) | 人类Y染色体STR基因座和InDel位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 | |
| CN110846408A (zh) | 用于检测ttn基因突变的引物组合及其应用 | |
| CN111961753B (zh) | 一种辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的snp标记及其特异性引物和应用 | |
| CN105624315A (zh) | 一种ALDH2基因c.1510位点多态性检测的引物和试剂盒 | |
| CN111996244A (zh) | 一种单核苷酸多态性检测用组合物及其应用 | |
| CN110863039B (zh) | 基于共享性引物探针检测slco1b1和apoe基因多态性的引物组、方法及其试剂盒 | |
| CN114085926B (zh) | Abcb1基因c3435t的snp位点多态性的引物和探针、试剂盒及检测方法 | |
| CN114606335A (zh) | 玉米抗甘蔗花叶病毒病基因的kasp分子标记的开发及应用 | |
| CN115505648A (zh) | 玉米耐旱基因的kasp分子标记的开发及应用 | |
| CN111172248B (zh) | 一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒 | |
| CN110628883B (zh) | 基于共享性引物探针检测基因多态性的试剂盒、方法及应用 | |
| CN112553349A (zh) | 一种呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的鉴定引物、探针、试剂盒及方法 | |
| CN111793676A (zh) | 一种基因多态性检测的方法、试剂盒及其应用 | |
| CN111909990A (zh) | 单管同时检测基因的缺失突变和点突变的荧光pcr检测方法 | |
| CN116656804B (zh) | 遗传性耳聋基因分型试剂盒 | |
| CN114395639B (zh) | 用于鉴定水稻品系纯度的snp分子标记组合及其应用 | |
| CN112921082B (zh) | 用于检测cyp2c19*2基因多态性的特异性探针及试剂盒 | |
| CN106755493B (zh) | 用于羊草品种鉴定的snp标记引物组合及鉴定方法 | |
| CN109082460B (zh) | 应用于snp分型的非竞争性探针设计方法、检测方法及应用 | |
| CN114032322A (zh) | 玉米花期基因的snp分子标记的开发及应用 | |
| CN114836571A (zh) | 番茄抗白粉病相关的kasp分子标记及其应用 | |
| CN117535387A (zh) | 一套基于液相芯片和kasp技术开发的水稻核心snp标记组合及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |