CN111172248B - 一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒，包括长度多态性遗传标记和质控位点的引物组合物、Taq DNA聚合酶、PCR扩增的缓冲液、对照基因组DNA、纯水，其中，多态性遗传标记和质控位点的引物组合物包括单条引物含有荧光素标记的如SEQ·ID·No.1～SEQ·ID·No.20所示的引物对。本发明所提供的通用试剂盒可对目标区域CNV拷贝数为0、1、2、3或以上进行准确判断，既适用于拷贝数增加也适用于拷贝数减少，有效克服了一代测序方案和实时荧光方案的缺点，且无需制备标准曲线，操作简单，准确度高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒。
背景技术
拷贝数变异(CopyNumber Variations，CNVs)通常指长度涉及1kb或以上的DNA片段的缺失(拷贝数减少)、重复(拷贝增加)等，这种类型的变异是目前在人类遗传学领域、肿瘤学领域中的研究热点之一。如Zarrei M等在2015年报告了人类全基因组CNV图谱(ZarreiM,et al.Nat Rev Genet.2015；16(3):172-83.)，Liang等发现通过测序方法对CNV进行检测有助于人类染色体病综合征的诊断(Liang D,et al.J Mol Diagn.2014；16(5):519-526.)；而Shao等则在2019年发现CNV与泛肿瘤组织中的基因表达情况密切相关(Shao X,etal.BMC Med Genet.2019；20(1):175.)。
CNV检测方案依据位点通量的不同，可分为高通量检测技术和低通量检测技术。高通量检测技术通常包括比较基因组杂交(aCGH)技术(Zhang,et al.Methods MolBiol.2017；1541:167-179.)、基于单核苷酸多态性的基因芯片(Uddin M,et al.GenetMed.2015；17(9):747-52.)，以及基于二代测序技术的CNV-seq(CN201680067423.2；Xie C,et al.BMC Bioinformatics.2009；10:80；Liang D,et al.JMol Diagn.2014；16(5):519-526.)等。上述这些高通量的CNV分子检测手段通常用于科学研究或疾病的筛查。对于这些高通量分子手段所发现的、有进一步研究价值或可能与疾病相关的CNV，通常需要针对这些特定的CNV的拷贝数进行验证。特定CNV拷贝数的验证通常采用的是一些成本更低的、通量较低的、检测结果更为可靠的技术手段，这通常包括FISH、实时荧光PCR、MLPA、甚至一代测序的方法。
FISH即原位荧光杂交，这是一种相对传统与成熟的检测方案，是依据所发现的特定CNV区域的序列特征设计特异性的探针，探针采用荧光标记，在培养细胞中进行原位杂交后通过荧光显微镜直接观察。如Abbott公司已开发了一系列针对人类染色体病或基因组病的FISH探针(https://www.molecular.abbott/int/zh/vysis-fish-chromosome-search)。
多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probeamplification,MLPA，Schouten等，2002)是MRC-Holland公司(http://www.mrc-holland.com/)的专利技术，该公司也依据这一技术，开发了一系列与特定CNV拷贝数检测相关的产品，如SALSAMLPAP060SMACarrier probemix，可对人类5号染色体长臂区域的SMN1与SMN2的拷贝数进行相对定量检测。
实时荧光技术是一种相对简单与低成本的特定CNV拷贝数验证的技术方案。采用这一技术方案时，需要在所发现的CNV区域设计特异性的PCR引物与Taq-Man探针，同时设计内参基因的PCR引物与探针，通过制备标准曲线的方法获得目标区域的相对拷贝数定量结果，如申请号为201810096023.5的专利技术方案。
近年来，也有人提出可以通过一代测序的定性方式对特定的CNV拷贝数进行验证，如申请号为201811492690.1的专利技术方案。在该技术方案中，申请人提出可利用与CNV区域紧邻的单个多态性位点，通过一代基因测序的方法进行特定区域CNV的验证方案，当基因测序未发现该杂合性位点只有一个等位基因时，可提示相应的CNV区域存在拷贝数的丢失。
对通过高通量的分子生物技术手段发现的、需要进一步研究的CNV，当然可以采用其它的、技术原理不同的高通量技术手段进行验证，但这通常不具有经济性。对于通过高通量技术手段发现的、需要进一步进行拷贝数验证的CNV，通常采用上述低通量技术手段进行验证。但上述低通量技术手段在实际应用中，均存在一些不尽如人意的地方。
(1)FISH：FISH是一种可靠的技术，但FISH探针的设计、标记均相对困难，也相对难以标准化，其检测的样本类型必需是细胞。而一些商品化的FISH探针通常检测成本高昂。尤其是对于一些科学研究项目，对于一个批次的研究样本单独开发相应的FISH探针通常不具备成本效益性。
(2)MLPA：MLPA是MRC-Holland的专利技术，该技术的特点是提供了一种相对通用的探针设计和探针制备方案，以使不同CNV区域对应的连接后探针的扩增长度不同。同时，CNV拷贝数的计数结果通过多条(通常需要十余条)单拷贝基因参考探针进行校准。虽然不同的连接后探针使用公用引物进行扩增，以提供相对一致的扩增效率，但连接效率的差异仍然导致同一个反应内不同的连接后探针的PCR扩增峰高存在显著差异，校准CNV计数的标准差较大，对结果判断造成一定的干扰。同时MLPA的实验操作复杂，需要通过探针杂交、连接酶反应、PCR扩增、毛细管电泳才能实现对特定CNV拷贝数的检验。另外，采用MLPA技术对任意新发现的CNV区域验证时，也需要委托MRC-Holland公司对针对这些特定的CNV区域重新设计检测用探针。
(3)实时荧光定量PCR方案：该方案操作相对简单，也是目前相对常用的一种技术方案。采用实时荧光方案对任意新发现的CNV区域进行拷贝数验证时，都需要单独设计专门性的引物与探针。但该方案所需要的引物与探针的设计要求较高，尤其CNV区域存在高度同源序列时常导致相应的引物、探针设计困难，而无法采用该技术方案。同时，采用实时荧光定量进行CNV拷贝数变异检测时也通常需要制备标准曲线。依据实时荧光PCR的基本原理，采用实时荧光PCR判断0拷贝是准确的(实际上是定性判断)；在区分1拷贝与2拷贝时，Ct值相差的理论值是1，尚可接受；但区分2拷贝与3拷贝时，Ct值相差的理论值是0.8，实际应用中极易出现灰区。
(4)一代测序方案：在申请号为201811492690.1的专利中所提出的一代测序方案中，较好地解决了部分CNV无法采用实时荧光定量PCR方案的问题，同时通过一代基因测序的定性判断对缺失型CNV的进行准确判断；但存在的问题是，一是需要在CNV与临近区域(小于800bp)要找到合适的多态性位点且该位点在该样本中为杂合状态，二是对于拷贝数增加型的CNV(重复)通过一代基因测序判断相对困难。
另外，在上述技术方案中，只有MLPA是一种相对而言针对任意CNV区域可用于构建验证试剂盒的技术方案，但采用这一方案开发通用试剂盒的难度在于，对于新发现的特定CNV区域，研究者本人无法自行设计相应的MLPA探针；另外这一技术方案最大的问题是实验的操作相对复杂，进行MLPA检测包括了DNA提取、探针杂交、探针连接、PCR扩增、毛细管电泳，并且这种技术通常需要较高的模板量，这对于临床微量的珍贵样本而言，难以满足这一方案的检测要求。
因此，考虑到近年来CNV高通量检测技术在科学研究以及临床诊断上的广泛应用，目前迫切需要一种易于研究者自行使用、可用于任意CNV区域拷贝数研究的通用试剂盒。
发明内容
本发明是为解决现有技术中的上述问题，提出的一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒，在需要验证拷贝数的CNV区域内设计1对或多对PCR引物，并采用FAM荧光素进行标记后，将该对引物加入该试剂盒中，通过常规的PCR扩增与毛细管电泳后，获得各扩增产物峰的峰高或峰面积，即可依据相应的计算模型得到待检样本中目标区域的拷贝数。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个方面是提供一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒，包括长度多态性遗传标记和质控位点的引物组合物、Taq DNA聚合酶、PCR扩增的缓冲液、对照基因组DNA、纯水；
其中，所述长度多态性遗传标记包括位于人基因组5号染色体70.8-71.2Mb范围内的rs146950089、rs76897176、rs59913469、rs36192652、ATA26A05和位于人基因组5号染色体68.0-68.6Mb范围内的rs201750616、rs142599011、rs540996931。
进一步地，上述引物组合物中的引物的终反应浓度为100-300pmol/L。
进一步地，上述质控位点为位于X染色体上的ZFX、Y染色体上的ZFY和位于15号染色体上的B2M基因。质控位点的相应的拷贝数在待测样本中均是已知，待测样本中的B2M基因均为2拷贝，男性待测样本中ZFX和ZFY均为1拷贝，女性待测样本ZFX为2拷贝，ZFY为0拷贝。采用本试剂盒对目标CNV拷贝数进行判断时，首先应对质控位点的拷贝数进行判断且判断结果应正确。
进一步地，引物组合物包括单条引物含有荧光素标记的如SEQ·ID·No.1～SEQ·ID·No.20所示的引物对。
进一步地，所述对照基因组DNA为对目标区域的拷贝数已自行验证的、表型正常的人基因组DNA。
本发明的第二方面是提供使用该通用试剂盒来验证拷贝数变异的方法，包括如下步骤：
步骤一，获取待测样本的基因组DNA；
步骤二，按照如下配方配制PCR反应体系，所述反应体系的总体积为20μL：
步骤三，设置PCR扩增程序并扩增：94℃2min；98℃10s，60℃1min，68℃1min，循环次数为26-28次；72℃10min；4℃∞；
步骤四，将步骤三的得到的扩增产物进行毛细管电泳，并对电泳数据进行分析，获得对照样本与各待检样本中相应遗传标记的扩增产物峰峰高/峰面积数据；
步骤五，将步骤四测得的峰高通过下式算法计算并验证CNV区域拷贝数：
(1)计算PCR扩增阳性对照品中S01-S08所有PCR扩增产物峰的峰高和Hc(c指对照样本)；
(2)计算PCR扩增阳性对照品中S01-S08各位点所有PCR扩增产物峰的峰高和(分别计为h1c,h2c,…,h8c)与Hc的比值，记为R1c，R2c，…R8c；如S04为杂合子，h4c指S04两个扩增产物峰的峰高和；
(3)同样的，计算待测样本中的Hs(s指待测样本)；h1s，h2s,…h8s；R1s，R2s，…R8s；
(4)计算RRi(i＝1,2,…,8)值：RR1＝R1s/R1c；RR2＝R2s/R2c；…；RR8＝R8s/R8c；
(5)计算RR1-RR8的均值RR0和标准差SD；
(6)相应地计算目标CNV区域扩增产物峰的RR值，记作RRv；质控位点ZFX、ZFY、B2M对应的RR值分别记作：RRx,RRy,RRb；
(7)目标区域拷贝数的z检验：
当目标区域无扩增产物峰时，即为0拷贝，不进行z检验；
当目标区域出现相关的扩增产物峰时，通过z检验判断目标区域的拷贝数：
其中：m为对照样本中相应目标区域的拷贝数，为已知变量。常数2指8个多态性遗传标记所指代的两个单倍型的在人基因组中的拷贝数为2拷贝。在对质控位点ZFX、ZFY、B2M、相应拷贝数进行检验时，分别以RRx、RRy、RRb代替RRV。
进一步地，z检验对目标区域进行拷贝数判定的判断标准：
z<＝-3时，即目标区域拷贝数显著低于2拷贝，则目标区域为1拷贝；
z>＝3时，即目标区域拷贝数显著高于2拷贝，则目标区域为3拷贝或以上；
-3<z<3时，即目标区域拷贝数与2拷贝相比无显著差异，即为2拷贝。
进一步地，步骤二的PCR缓冲液包括Tris，dATP，dTTP，dCTP，dGTP，和镁离子。
进一步地，步骤五的峰高可以替换为步骤四中获得的峰面积来进行z检验。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
(1)本发明提供了一个可用于任意CNV拷贝数验证的通用试剂盒。采用该试剂盒，对于任意需要验证该拷贝数CNV区域，仅需要研究者依据PCR设计的基本原则，在需要验证拷贝数的CNV区域内部适当位置自行设计1对或多对、扩增子长度与通用试剂盒中各遗传标记扩增子长度不同的PCR引物(其中1条标记FAM荧光素)，加入到该通用试剂盒的PCR反应体系中，依据本发明提供的数据分析方法，便可对该CNV区域拷贝数的进行判断。
(2)采用本发明所提供的通用试剂盒，可对目标区域CNV拷贝数为0、1、2、3或以上进行准确判断，既适用于拷贝数增加也适用于拷贝数减少，有效克服了一代测序方案和实时荧光方案的缺点，且无需制备标准曲线。
(3)采用本发明所提出的通用试剂盒，仅需要DNA提取、PCR扩增与毛细管电泳，与MLPA技术方案相比，实验流程更为简单。
(4)采用本发明所提出的通用试剂盒，在对目标CNV区域拷贝数进行判断时，同步有ZFX、ZFY和B2M作为质控位点，提高了检验的准确度。
综上所述，本发明提供的一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒可实现对CNV区域拷贝数变异的计算和验证，操作简单，准确度高。
附图说明
图1为本发明一实施例中通用试剂盒中PCR扩增对照基因组DNA的毛细管电泳图谱(毛细管电泳图谱中的下半部分的数据区域，各PCR扩增产物峰下方第一行均为相应的等位基因名称，第二行较大数字即为相应PCR扩增产物峰的峰高)；
图2为本发明一验证实施例中对SAA基因拷贝数检验时对照基因组DNA的毛细管电泳图谱(家系样本中父亲样本)；
图3为本发明一验证实施例中对SAA基因拷贝数检验时家系中母亲(正常女性)的毛细管电泳图谱；
图4为本发明一验证实施例中对SAA基因拷贝数检验时家系中儿子(正常男性)的毛细管电泳图谱；
图5为本发明一验证实施例中对SAA基因拷贝数检验时国家参考品14(15号染色体三体)的毛细管电泳图谱；
图6为本发明一验证实施例中对SAA基因拷贝数检验时国家参考品21(XO)的毛细管电泳图谱；
图7为本发明一验证实施例中对SAA基因拷贝数检验时国家参考品22(XXX)的毛细管电泳图谱；
图8为本发明一验证实施例中对SAA基因拷贝数检验时国家参考品23(XXY)的毛细管电泳图谱；
图9为本发明一验证实施例中对SAA基因拷贝数检验时国家参考品24(XYY)的毛细管电泳图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例一
本实施例提供一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒，其包括：
组分1(容器1)：各遗传标记和质控位点基因的引物混合得到的引物组，各引物终反应浓度为100-300pmol/L，同一遗传标记的上下游引物终反应浓度相等；
组份2(容器2)：用于PCR扩增的热启动Taq DNA聚合酶；
组份3(容器3)：用于PCR扩增的缓冲液，包含Tris，dATP，dTTP，dCTP，dGTP，以及镁离子等；
组份4(容器4)：用作PCR扩增阳性对照的、表型正常的一男性基因组DNA溶液，基因组DNA浓度为2ng/μL；(实际使用中，使用者也可以采用对目标区域拷贝数已自行验证的、表型正常的基因组DNA作为PCR扩增阳性对照品)。
组份5(容器5)：纯水，用于配制PCR反应体系。
其中，质控位点为X染色体上的ZFX、Y染色体上的ZFY和15号染色体上的B2M基因。
通过对人基因组5号染色体68.0-68.6Mb范围和70.8-71.2Mb范围分别筛选得到3和5个合适的片段长度多态性遗传标记，分别构成两个单倍型(Haplotype)。同时选择ZFX、ZFY和B2M三个个遗传标记作为质控位点。质控位点的相应的拷贝数在待测样本中均是已知，待测样本中的B2M基因均为2拷贝，男性待测样本中ZFX和ZFY均为1拷贝，女性待测样本ZFX为2拷贝，ZFY为0拷贝。采用本试剂盒对目标CNV拷贝数进行判断时，首先应对质控位点的拷贝数进行判断且判断结果应正确。针对上述10个遗传标记设计相应的PCR引物见表1。
表1.各遗传标记和质控位点基因的引物序列
实施例二
本实施例利用实施例1提供的试剂盒提供验证拷贝数变异的方法，包括如下步骤：
步骤一，获取待测样本基因组DNA；
步骤二，按照如下表2配方配制PCR反应体系：
表2.通用试剂盒的PCR反应体系
其中，目标CNV区域PCR引物组为研究者自行设计与混合，加入适当体积至终反应浓度为100-300pmol。
研究者设计目标CNV区域内的PCR引物时，依据表1通用试剂盒中已有10个遗传标记的扩增子长度，所设计的CNV区域扩增子允许长度范围包括：80-100bp；170-230bp；235-265bp；360-500bp；Tm值为58-62度。
步骤三，根据下表3设置PCR扩增程序并进行扩增：
表3.通用试剂盒的PCR反应条件
步骤四，将步骤三的得到的扩增产物取1μL按3500遗传分析仪片段分析操作说明常规进行毛细管电泳，毛细管电泳结果采用3500遗传分析仪配套GeneMapper软件进行分析后，得到对照样本与各待检样本中相应遗传标记的扩增产物峰峰高数据。如图1所示为通用试剂盒中PCR扩增阳性对照品的毛细管电泳图谱。
步骤五，将步骤四测得的峰高通过下式算法计算并验证CNV区域拷贝数：
(1)计算PCR扩增阳性对照品中S01-S08所有PCR扩增产物峰的峰高和Hc，其中，c指对照样本；
(2)计算PCR扩增阳性对照品中S01-S08各位点所有PCR扩增产物峰的峰高和h1c,h2c,…,h8c，及其与Hc的比值Rc，记为R1c，R2c，…R8c；
(3)同样的，计算待测样本中的Hs和Rs：h1s，h2s,…h8s；R1s，R2s，…R8s，其中，s指待测样本；
(4)计算RRi值：RR1＝R1s/R1c；RR2＝R2s/R2c；…；RR8＝R8s/R8c，其中，i＝1,2,…,8；
(5)计算RR1-RR8的均值RR0和标准差SD；
(6)相应地计算目标CNV区域扩增产物峰的RR值，记作RRv；质控位点ZFX，ZFY和B2M对应的RR值分别记作：RRx、RRy、RRb；
(7)目标CNV区域拷贝数的z检验：
当目标CNV区域无扩增产物峰时，即为0拷贝，不进行z检验；
当目标CNV区域出现相关的扩增产物峰时，通过z检验判断目标区域的拷贝数：
在对质控位点ZFX、ZFY、B2M相应拷贝数进行检验时，分别以相应的RR值(RRx,RRy,RRb)代替RRV。其中，m为对照样本中相应目标区域的拷贝数，为已知变量，如图1所示，该对照样本为一正常男性样本，则计算待测样本中B2M拷贝数相应z值时的m值即为2，因为B2M基因作为单拷贝管家基因，其在所有正常样本中的拷贝数均为2；则计算男性待测样本中Y与X拷贝数相应z值时的m值均为1，因为所有正常男性样本中Y与X染色体的拷贝数均为1。
常数2指8个多态性遗传标记所指代的两个单倍型的在人基因组中的拷贝数为2拷贝。
依据z值对目标区域进行拷贝数判定：
z<＝-3时，即目标区域拷贝数显著低于2拷贝，则目标区域为1拷贝；
z>＝3时，即目标区域拷贝数显著高于2拷贝，则目标区域为3拷贝或以上；
-3<z<3时，即目标区域拷贝数与2拷贝相比无显著差异，即为2拷贝。
验证实施例一
本实施例对通用试剂盒中2个单倍型中8个多态性遗传标记、各质控位点有效性的验证。实验步骤如下：
(1)样本DNA提取：
正常人外周血样本308例，采用QIAGEN人血基因组DNA提取盒，按试剂盒说明书提取基因组DNA，并稀释至2ng/μL。
(2)PCR扩增：
采用实施例一所提供的通用试剂用试剂盒引物，实施例二中所提供的通用试剂盒PCR反应体系、PCR反应条件，对308例样本基因组DNA进行扩增。
(3)将步骤(2)扩增的DNA片段进行毛细管电泳：PCR产物取1μL按3500遗传分析仪片段分析操作说明常规进行毛细管电泳，毛细管电泳结果采用3500遗传分析仪配套GeneMapper软件进行分析后，得到对照样本与各待检样本中相应遗传标记的基因型、扩增产物峰峰高数据；
(4)数据分析：
(A)统计各遗传遗传标记的等位基因频率：
按照法医遗传学计算公式计算各遗传标记在人群中的杂合度：即杂合度＝1-(该位点各等位基因频率平方和)。各遗传标记的等位基因频率与杂合度计算结果见表4和表5。
表4.通用试剂盒中S01-S07的等位基因频率与杂合度
表5.S08的等位基因频率与杂合度
各遗传标记的杂合度均在0.4以上。杂合度在0.4以上的含义为，平均每100个样本至少有40个以上的样本在该位点表现为杂合(双峰)型。308例样本中，仅有2样本在8个遗传标记均表现为纯合型(单峰)，306例样本中，8个遗传标记均至少有1个遗传标记显示为杂合型，占99.4％，表明本发明所提出的通用试剂盒中所包含的8个遗传标记满足绝大多数样本的检测。
(B)308例样本中质控位点ZFX、ZFY与B2M的拷贝数计算结果
依据实施例二所提出的目标CNV区域拷贝数计算方法，将ZFX、ZFY与B2M作为目标区域，计算其相应拷贝数。
308例样本中，B2M的拷贝数计算结果均为2，与预期的一致性为100.0％；
308例样本中，通过ZFX与ZFY计算相应样本中X染色体与Y染色体拷贝数，均与已知的样本性别相一致，一致性100.0％；
综上所述，本发明所提出的目标CNV区域拷贝数通用试剂盒中，所采用的8个多态性遗传标记是适宜的，目标CNV拷贝数计算方法对质控位点的拷贝数计算结果是准确的。
验证实施例二
本验证实施例提供采用本发明所提供的通用试剂盒，对待测样本CNV区域拷贝数检验的示例。
如申请号为201810096023.5的专利所示，已知SAA基因是位于人类第11号染色体上的人类血清淀粉样蛋白A(SerumAmyloidA，SAA)基因，包括SAA-1和SAA-2，且二者在人群中存在拷贝数变异。本实施例采用存在SAA拷贝数变异的1个母-子-父家系样本和部分国家参考品样本进行检测，样本信息见表6。其中，以母-子-父家系样本中父亲样本替代通用试剂盒中的PCR阳性对照品，已知家系样本中父亲样本的SAA1与SAA2的拷贝数均为2，作为此次检验中的正常对照样本。
表6 各样本的信息
检验的实验步骤包括如下：
(1)样本DNA提取：常规提取基因组DNA，稀释至2ng/μL。国家参考品为15ng/μL的基因组DNA贮存液，采用纯水稀释至2ng/μL。
(2)设计引物：依据人类基因组数据库(Hg19)中SAA1与SAA2的基因序列，参考PCR引物设计基本原则分别设计SAA1与SAA2的PCR引物，各PCR引物对中的一条采用FAM标记，所设计的扩增长度与本发明所提供的通用试剂盒中各遗传标记的扩增长度不等，如表7所示。
表7 SAA基因的PCR扩增引物与荧光标记
(3)PCR扩增：按表2所示通用试剂盒的PCR反应体系，将表6中的PCR引物加入通用试剂盒反应体系，依据表3所示通用试剂反应条件进行PCR反应。
(4)对扩增片段进行毛细管电泳：PCR产物取1μL按3500遗传分析仪片段分析操作说明常规进行毛细管电泳，毛细管电泳结果采用3500遗传分析仪配套GeneMapper软件进行分析后，得到表6所示各样本的毛细管电泳图谱，分别见图2-图9。图2-图9各图数字区域的上半部分显示各遗传标记的等位基因，上半部分显示的为各PCR扩增产物峰的峰面积。
(5)数据分析：以家系样本中父亲样本为对照样本，依照实施例2所提供的方法计算各待测样本中目标区域的拷贝数，在计算各样本中SAA1与SAA2基因拷贝数时，同时计算各样本中X染色体、Y染色体、B2M的拷贝数以监控计算过程、计算结果的准确性。结果见表8。
表8.各待测样本中SAA1与SSA2以及各质控位点拷贝数计算结果
从计算结果表8可以看出，各待检样本中，质控位点ZFX、ZFY与B2M的拷贝数检验结果均与预期结果一致，表明计算过程与计算结果均正确。家系样本中SAA1与SAA2拷贝数的检验结果，符合孟德尔遗传规律。
同时，检出的各待检样本SAA1与SAA2基因拷贝数，既有拷贝数增加，也有拷贝数减少。表明，本发明所提供的通用试剂盒即可用于目标区域拷贝数增加的检验，也可用于目标区域拷贝数减少的检验。这一特性通过对不同类型的性染色体倍型异常国家参考品的检验也得到进一步验证。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中，包括但不限于：
(1)对本发明所提供的通用试剂盒中的多态性遗传标记的部分替换；
(2)对本发明所提供的通用试剂盒中各遗传标记的引物的部分或全部替换；
(3)对本发明所提供的通用试剂盒所采用的荧光素的替换；
(4)对本发明所提供通用试剂盒中DNA聚合酶、对照品基因组DNA等的替换；
(5)对实施式(2)中目标CNV区域引物以及CNV区域的替换；
(6)对实施式中PCR产物片段分析平台的替换；
(7)对计算过程中，峰高值与峰面积值的替换。
因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海晶准生物医药有限公司
赵书民
<120> 一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> rs146950089的正向引物（Artificial Sequence）
<400> 1
agctgttagt ctgagtagta a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> rs146950089的反向引物（Artificial Sequence）
<400> 2
taaatttaat gcaactgaat t 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> rs76897176的正向引物（Artificial Sequence）
<400> 3
agttgactgt gtaacttacc atc 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> rs76897176的反向引物（Artificial Sequence）
<400> 4
cacacatccc agttcaaact g 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> rs59913469的正向引物（Artificial Sequence）
<400> 5
gaaatcttgg ctctgtcagt 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> rs59913469的反向引物（Artificial Sequence）
<400> 6
attcacctat tgaatccatc ca 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> rs36192652的正向引物（Artificial Sequence）
<400> 7
tgcctggtta ccattcattt 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> rs36192652的反向引物（Artificial Sequence）
<400> 8
accccaactc tactaaaaat a 21
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> ATA26A05的正向引物（Artificial Sequence）
<400> 9
aatcatcttt ggttatggaa tac 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> ATA26A05的反向引物（Artificial Sequence）
<400> 10
caagaatggc ccatgaaagt ttg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> rs201750616的正向引物（Artificial Sequence）
<400> 11
ttaggttcag gggtacatgt gca 23
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> rs201750616的反向引物（Artificial Sequence）
<400> 12
ctggggcctg cttaaggatg ga 22
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> rs142599011的正向引物（Artificial Sequence）
<400> 13
aacatagtca aatgctgtgg a 21
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> rs142599011的反向引物（Artificial Sequence）
<400> 14
cattgttcta ccgaaccctg gtc 23
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> rs540996931的正向引物（Artificial Sequence）
<400> 15
gcatgccagt caacagcatc ct 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> rs540996931的反向引物（Artificial Sequence）
<400> 16
gcgtttagat gatattctga ga 22
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> ZFXY的正向引物（Artificial Sequence）
<400> 17
ttcagaaaag aaccagcaca taatg 25
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> ZFXY的反向引物（Artificial Sequence）
<400> 18
tgaattttct gcttcaaggc c 21
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> B2M的正向引物（Artificial Sequence）
<400> 19
gagtggaaat ggaattggga ga 22
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> B2M的反向引物（Artificial Sequence）
<400> 20
cttcaatgtc ggatggatga aac 23
Claims (6)
1.一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒，其特征在于，包括长度多态性遗传标记和质控位点的引物组合物、Taq DNA聚合酶、PCR扩增的缓冲液、对照基因组DNA、纯水；
其中，所述长度多态性遗传标记由位于人基因组5号染色体70.8-71.2Mb范围内的rs146950089、rs76897176、rs59913469、rs36192652、ATA26A05和位于人基因组5号染色体68.0-68.6Mb范围内的rs201750616、rs142599011、rs540996931组成；
所述质控位点为X染色体上的ZFX、Y染色体上的ZFY和15号染色体上的B2M基因；
所述引物组合物包括单条引物含有荧光素标记的如SEQ·ID·No.1～SEQ·ID·No.20所示的引物对；
所述对照基因组DNA为对目标区域的拷贝数已自行验证的、表型正常的人基因组DNA样本。
2.根据权利要求1所述的一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒，其特征在于，所述引物组合物中的引物的终反应浓度为100-300pmol/L。
3.一种非诊断目的的使用如权利要求1-2任意一项所述的一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒来验证拷贝数变异的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，获取待测样本的基因组DNA；
步骤二，按照如下配方配制PCR反应体系，所述反应体系的总体积为20μL：
步骤三，设置PCR扩增程序并扩增：94℃2min；98℃10s，60℃1min，68℃1min，循环次数为26-28次；72℃10min；4℃∞；
步骤四，将步骤三的得到的扩增产物进行毛细管电泳，并对电泳数据进行分析，获得对照样本与各待检样本中相应长度多态性遗传标记的扩增产物峰峰高或峰面积数据；
步骤五，将步骤四测得的峰高通过下式算法计算并验证CNV区域拷贝数：
(1)计算PCR扩增对照基因组DNA中长度多态性遗传标记所有PCR扩增产物峰的峰高和Hc，其中，c指对照样本；
(2)计算PCR扩增对照基因组DNA中长度多态性遗传标记各位点所有PCR扩增产物峰的峰高和h1c,h2c,…,h8c，及其与Hc的比值Rc，记为R1c，R2c，…R8c；
(3)同样的，计算待测样本中的Hs和Rs：h1s，h2s,…h8s；R1s，R2s，…R8s，其中，s指待测样本；
(4)计算RRi值：RR1＝R1s/R1c；RR2＝R2s/R2c；…；RR8＝R8s/R8c，其中，i＝1,2,…,8；
(5)计算RR1-RR8的均值RR0和标准差SD；
(6)相应地计算目标CNV区域扩增产物峰的RR值，记作RRv；质控位点ZFX，ZFY和B2M对应的RR值分别记作：RRx,RRy,RRb；
(7)目标CNV区域拷贝数的z检验：
当目标CNV区域无扩增产物峰时，即为0拷贝，不进行z检验；
当目标CNV区域出现相关的扩增产物峰时，通过z检验判断目标区域的拷贝数：
在对质控位点ZFX、ZFY、B2M相应拷贝数进行检验时，分别以相应的RR值RRx、RRy、RRb代替RRV；其中，m为对照样本中相应目标区域的拷贝数，为已知变量；常数2指8个长度多态性遗传标记所指代的两个单倍型的在人基因组中的拷贝数为2拷贝；
所述目标CNV PCR引物的扩增子长度与所述通用试剂盒中各长度多态性遗传标记扩增子长度不同，且引物对中的1条标记FAM荧光素；所述目标CNV的扩增子的长度范围为80-100bp、170-230bp、235-265bp或360-500bp，Tm值为58-62度。
4.根据权利要求3所述的验证拷贝数变异的方法，其特征在于，所述z检验对目标区域进行拷贝数判定的判断标准：
z<＝-3时，即目标区域拷贝数显著低于2拷贝，则目标区域为1拷贝；
z>＝3时，即目标区域拷贝数显著高于2拷贝，则目标区域为3拷贝或以上；
-3<z<3时，即目标区域拷贝数与2拷贝相比无显著差异，即为2拷贝。
5.根据权利要求3所述的验证拷贝数变异的方法，其特征在于，步骤二的PCR缓冲液包括Tris、dATP、dTTP、dCTP、dGTP和镁离子。
6.根据权利要求3所述的验证拷贝数变异的方法，其特征在于，步骤五所述峰高替换为步骤四中获得的峰面积来进行z检验。
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-
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