CN111850142B - 商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异indel及其分子标记与应用 - Google Patents

商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异indel及其分子标记与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL及其分子标记与应用，所述的差异INDEL，分别位于地熊蜂参考基因组序列NC_015772.1的第14757029位核苷酸位点、NW_003566591.1的第623097位核苷酸位点以及NC_015772.1的第16893418核苷酸位点；本发明要解决的技术问题是结合三个INDEL遗传变异的分子标记更好的帮助地熊蜂育种家进行分子标记辅助育种，同时区分待测地熊蜂为进口商业化地熊蜂还是野生的地熊蜂。

Description

商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL及其分子标记与应用
技术领域
本发明属于变异或遗传工程技术领域，涉及商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL及其分子标记与应用。
背景技术
蜜蜂是维持生态环境不可或缺的物种，对促进农业生产和维持生态系统平衡都非常重要。蜜蜂种类繁多，而区分不同种类的蜜蜂、甚至于区分同种类不同来源的蜜蜂对于养殖者来说有着非要重要的意义。
目前蜂种鉴定主要依赖于形态学鉴定，误差较大，尤其是同一蜂种比如地熊蜂的鉴定更加难以从形态上快速鉴别，甚至使用基于线粒体COI基因的条形码技术也区分不开。
熊蜂是重要的传粉昆虫，但近年来许多种类的熊蜂都发生了明显的数量下降现象。熊蜂数量下降的原因之一是外来熊蜂对引入地所造成的生物入侵。现在商业化最成功的熊蜂是来自于欧洲某公司的地熊蜂。该公司通过对野外捕获的野生地熊蜂进行人工驯化、选择及繁育，形成了现在商业化的地熊蜂。商业化的地熊蜂比野生的地熊蜂具有许多优良的繁殖及授粉性能，但是也会对引入地造成生态入侵。这种地熊蜂不仅与引入地的熊蜂种类抢夺食物、巢穴和配偶，而且还会引入外来的病原体，对引入地的生态系统造成破坏。
而对于现有从国外引进的商业化地熊蜂和野生地熊蜂的快速区分，对于评估进口的商业化地熊蜂对生物入侵现状，以及对于保护生态安全非常重要。
申请人在2019.04.25申请号为201910338173.7，名称为一个能够识别出商业化地熊蜂的分子标及其应用的专利申请，但其缺陷为仅含有一个单一的分子标记，无法对最终结果进行验证。且受检测的样本量低；本发明提供三个分子标记，从而能够互相验证最终结果，并且三个分子标记是从54只野生地熊蜂和24只商业化地熊蜂样本中检测出来。并且本发明从INDEL变异的层面进行对商业化地熊蜂和野生地熊蜂进行区分，是对之前SNP变异分子标记的补充。
发明内容
本发明就是针对上述存在的缺陷而提供商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL及其分子标记与应用。本发明要解决的技术问题是结合三个INDEL遗传变异的分子标记更好的帮助地熊蜂育种家进行分子标记辅助育种，同时区分待测地熊蜂为进口商业化地熊蜂还是野生的地熊蜂。
本发明的商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL及其分子标记与应用技术方案为，商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL，所述的差异INDEL，分别位于地熊蜂参考基因组序列NC_015772.1的第14757029位核苷酸位点、NW_003566591.1的第623097位核苷酸位点以及NC_015772.1的第16893418核苷酸位点。
所述的商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL，包括：
（1）一号位点，即地熊蜂参考基因组序列NC_015772.1的第14757029位核苷酸位点，该INDEL位点以及侧翼序列为5’-AAGTGGTTATTTTATAAATGGAACTTGAAC[-/A]AAAAAATGCGTATAATTACAATTGGAGCGC-3’（序列表的序列1或序列2），其中该序列第31位核苷酸是此特异INDEL位点；基因型为野生型Del/Del或杂合型Del/A或商业型A/A；
（2）二号位点，即地熊蜂参考基因组序列NW_003566591.1的第623097位核苷酸位点，该INDEL位点以及侧翼序列为5’-GTATTTAAAATGAATAATCTTCGGATCATA[-/G]GGCTGCGAGATTATTATTAAGAGGATTATT-3’ （序列表的序列3或序列4），其中该序列第31位核苷酸是此特异INDEL位点；基因型为野生型Del/Del或杂合型Del/G或商业型G/G；
（3）三号位点，即地熊蜂参考基因组序列NC_015772.1的第16893418位核苷酸位点，该INDEL位点以及侧翼序列为5’- ATAAAGAAAGTTTT[-/T]GTGAAATATAACACTGTACTATTACCGTCTTCACCTGTAAGGAAA -3’ （序列表的序列5或序列6），其中该序列第16位核苷酸是此特异INDEL位点；基因型为野生型Del/Del或杂合型Del/Ins或商业型Ins/Ins。
所述的商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL在区分或辅助区分待测地熊蜂为商业化地熊蜂还是野生的地熊蜂或制备区分或辅助区分待测地熊蜂为商业化地熊蜂还是野生的地熊蜂产品中的应用。
所述的商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL在鉴定待测地熊蜂是否驯化过或制备鉴定待测地熊蜂是否驯化过产品中的应用。
所述的商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL在选育易于室内饲养或授粉能力强的地熊蜂或制备选育易于室内饲养或授粉能力强的地熊蜂产品中的应用。
所述的商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL在评价商业化地熊蜂是否已经对本土造成了生物入侵或制备评价商业化地熊蜂是否已经对本土造成了生物入侵产品中的应用。
检测待测地熊蜂的三个特异INDEL位点基因型都为野生型还是商业型；若三个特异INDEL位点的基因型都为商业型，则该地熊蜂为或候选为商业化地熊蜂；若特异INDEL位点的基因型都为野生型，则该地熊蜂为或候选为野生地熊蜂。
一种用于区分商业地熊蜂与野生地熊蜂的分子标记，包括以下引物组：
用于检测共显性标记NC14757029的引物组如下：
NC14757029FAMF1（序列表的序列7）：
5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTCCAATTGTAATTATACGCATTTTTTG -3’ （该序列5’端21bp为FAM荧光探针对应的接头序列（下划线部分），该接头序列能够与LGC Genomics 公司的KASP试剂中的FAM荧光探针相匹配，在扩增情况下，产生FAM荧光（蓝色）；3’端27bp为INDEL位点A等位基因特异的缺失，该序列与相应的参考基因组序列为反向互补关系）；
NC14757029HEXF1（序列表的序列8）：
5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCAATTGTAATTATACGCATTTTTTTG -3’ （该序列5’端21bp为HEX荧光探针对应的接头序列，该接头序列能够与LGC Genomics 公司的KASP试剂中的HEX荧光探针相匹配，在扩增情况下，产生HEX荧光（红色）；3’端27bp为INDEL位点A等位基因特异的插入，该序列与相应的参考基因组序列为反向互补关系）；
NC14757029R（序列表的序列9）：5’- CGATAAATGCGTGCAAAGTGGTT -3’；
用于检测共显性标记NW623097的引物组如下：
NW623097FAMF1（序列表的序列10）：
5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCCTCTTAATAATAATCTCGCAGCCT -3’ （该序列5’端21bp为FAM荧光探针对应的接头序列（下划线部分），该接头序列能够与LGC Genomics 公司的KASP试剂中的FAM荧光探针相匹配，在扩增情况下，产生FAM荧光（蓝色）；3’端26bp为INDEL位点G等位基因特异的缺失，该序列与相应的参考基因组序列为反向互补关系）；
NW623097HEXF1（序列表的序列11）：
5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCTCTTAATAATAATCTCGCAGCCC -3’ （该序列5’端21bp为HEX荧光探针对应的接头序列，该接头序列能够与LGC Genomics 公司的KASP试剂中的HEX荧光探针相匹配，在扩增情况下，产生HEX荧光（红色）；3’端26bp为INDEL位点G等位基因特异的插入，该序列与相应的参考基因组序列为反向互补关系）；
NW623097R（序列表的序列12）：5’- ACACGTTGTATCACCGGTCTAAAT -3’；
用于检测共显性标记NC16893418的引物组如下：
NC16893418FAMF1（序列表的序列13）：
5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAAATAATTTCCTTACAGGTGAAAAAAC -3’ （该序列5’端21bp为FAM荧光探针对应的接头序列（下划线部分），该接头序列能够与LGC Genomics 公司的KASP试剂中的FAM荧光探针相匹配，在扩增情况下，产生FAM荧光（蓝色）；3’端30bp为INDEL位点ACACTGTACTATTACCGTC等位基因特异的缺失，该序列与相应的参考基因组序列为反向互补关系）；
NC16893418HEXF1（序列表的序列14）：
5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGTGAAGACGGTAATAGTACAGTGT -3’ （该序列5’端21bp为HEX荧光探针对应的接头序列，该接头序列能够与LGC Genomics 公司的KASP试剂中的HEX荧光探针相匹配，在扩增情况下，产生HEX荧光（红色）；3’端30bp为INDEL位点ACACTGTACTATTACCGTC等位基因特异的插入，该序列与相应的参考基因组序列为反向互补关系）；
NC16893418R（序列表的序列15）：5’- TTCCGTAGTTCCAAGACTATCCAAA -3’；
a以上序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的DNA分子；
b以上序列所示的单链DNA分子或a的5'端连接一种荧光序列。
一种用于区分商业地熊蜂与野生地熊蜂的方法，检测待测地熊蜂的特异INDEL位点的基因型为商业型还是野生型的方法为A）或B）：
A）直接测序；
B）用上述成套引物对所述待测地熊蜂基因组DNA进行KASP扩增，得到KASP扩增产物；检测KASP扩增产物的荧光信号或荧光信号值：
若所述KASP扩增产物仅显示序列NC14757029FAMF1、NW623097FAMF1、NC16893418FAMF1所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色（FAM），则待测地熊蜂的特异INDEL位点的基因型为野生型；若所述KASP扩增产物仅显示序列NC14757029HEXF1、NW623097HEXF1、NC16893418HEXF1所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色（HEX），则待测地熊蜂的特异INDEL位点的基因型为商业型；
或若序列NC14757029FAMF1、NW623097FAMF1、NC16893418FAMF1所示DNA分子5'端连接荧光序列的荧光信号值与对应序列NC14757029HEXF1、NW623097HEXF1、NC16893418HEXF1所示DNA分子5'端连接荧光序列的荧光信号值的比值（FAM/HEX）大于或等于3.5，则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为野生型；若序列NC14757029FAMF1、NW623097FAMF1、NC16893418FAMF1所示DNA分子5'端连接荧光序列的荧光信号值与对应序列NC14757029HEXF1、NW623097HEXF1、NC16893418HEXF1所示DNA分子5'端连接荧光序列的荧光信号值的比值（FAM/HEX）小于0.5,则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为商业型。
位点NC14757029KASP扩增体系（10μl）：含100ng模板DNA、0.12μMNC14757029FAMF1、0.12μM NC14757029HEXF1、0.3μM NC14757029R、5μL KASP试剂，余量为水；
位点NW623097KASP扩增体系（10μl）：含100ng模板DNA、0.12μM NW623097FAMF1、0.12μM NW623097HEXF1、0.3μM NW623097R、5μL KASP试剂，余量为水；
位点NC16893418KASP扩增体系（10μl）：含100ng模板DNA、0.12μMNC16893418FAMF1、0.12μM NC16893418HEXF1、0.3μM NC16893418R、5μL KASP试剂，余量为水；
KASP扩增程序：94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃-55℃退火45s（第一个循环退火温度为61℃，之后每个循环比上一个循环降低0.6℃，最后一个循环退火温度为55℃），10个循环；94℃变性20s，55℃退火45s，36个循环；10℃保存。
设置用等体积水代替模板DNA作为无模板空白对照。
本发明的有益效果为：本发明发现三个特异INDEL位点，并根据该位点设计竞争性等位基因特异性PCR的引物；利用得到的引物进行PCR反应，可以有效地区分开野生与进口商业化的地熊蜂。本发明提供的方法，检测快速精准，不受环境影响，选择目标明确，大大提高了进口商业化地熊蜂的检出效率。相较于之前申请的专利，本发明提供的三个分子标记是基于54只野生地熊蜂和24只商业化地熊蜂，相较于之前的检测样本在数量上大大增加；同时通过三个差异INDEL标记对最终结果互相验证，使本发明的结果在准确性上大大提高。因而，该发明有利于评价从欧洲进口的商业化地熊蜂是否已经对我国造成了生物入侵，这对于保障我国的生态安全非常重要。另外，本发明对于筛选易于室内饲养、授粉能力强的育种材料以进行优良熊蜂品种的选育也将很有帮助。
附图说明
图1所示为三个商业化地熊蜂与野生地熊蜂基因组DNA中特异的INDEL差异位点部分样品图，由上至下的INDEL变异位点依次是NC_015772.1的第14757029位核苷酸位点、NW_003566591.1的第623097位核苷酸位点以及NC_015772.1的第16893418核苷酸位点；
图2所示为对本发明的分子标记进行基因型检测时部分熊蜂个体的示例性结果图，INDEL变异位点是NC_015772.1的第14757029位核苷酸位点；
图3所示为对本发明的分子标记进行基因型检测时部分熊蜂个体的示例性结果图，INDEL变异位点是NW_003566591.1的第623097位核苷酸位点；
图4所示为为对本发明的分子标记进行基因型检测时部分熊蜂个体的示例性结果图，INDEL变异位点是NC_015772.1的第16893418核苷酸位点。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
对24只商业化地熊蜂和54野生型地熊蜂进重测序分析，查找商业化地熊蜂与野生型地熊蜂的差异INDEL，具体步骤如下：
1.世界范围内地熊蜂样本的采集，主要有3个来源，分别是：来自中国新疆地区地熊蜂、来自欧洲某商业化地熊蜂、来自英国历史自然博物馆的世界范围内的地熊蜂标本。样本涵盖世界范围内10个国家地区，其中7个欧洲国家—英国、法国、德国、瑞士、瑞典、土耳其、俄罗斯，3个亚洲国家—中国、塔吉克斯坦、吉尔吉斯坦；
2.DNA提取、质控以及基因组修复，将总共78只地熊蜂进行基因组的提取；
3.测序文库的制备与基因组重测序，将DNA中按比例加入5 ×TAB、2ul PPM、2ulN5、2ul N7、1ul TAE，ddH2O定容至50ul，设置8个循环。PCR完成后，1.8倍体积Beads纯化，测定DNA样品浓度，计算DNA产量并进行基因组测序；
4.测序数据的质控。获得测序数据之后，为防止碱基脱氨基反应对痕量DNA测序文库的影响，我们首先用Fastqc软件对所有痕量DNA测序文库的每条reads去除开头和结尾的两个碱基，以确保测序数据的准确性。随后进行原始数据的质控，发现所有文库碱基准确率均在99.9%以上，且过滤掉过滤带有测序接头(adapter)的Reads，过滤N(不确定碱基)含量比例大于10%的Reads，过滤低质量碱基（Q<20）含量大于50％的Reads；
5.INDEL(Insertion-Deletion)遗传变异的检测。使用BWA(版本：0.7.8，参数：-t4 -k 32，Li H, et al. 2009)将Clean data与参考基因组进行比对，并用SAMtools(版本：1.3，参数：rmdup，Li H, et al. 2009)去除PCR或光学重复。参考基因组与所研究样本基因组的相似程度对后期的信息分析影响也非常大，一般用比对率(mapping rate)、深度(depth)、覆盖度(coverage)来评估参考基因组是否合适以及测序数据是否均匀覆盖基因组。其中个体的比对率(85.13-94.98%)平均为93.88%(SD=1.85)；个体的深度(11.30-60.77X)平均为35.27X(SD=14.71)；个体的覆盖度(96.90-99.60%)平均为99.30%(SD=0.61)；
6.通过比较基因组学手段，进行商业化地熊蜂与野生地熊蜂差异基因的检测。通过生物信息学手段，将商业化地熊蜂与野生地熊蜂作为两个组，查找在基因组同一位点上组内相同、组间不同的碱基位点找出，并结合地熊蜂基因组的注释文件，查找变异位于基因外显子并造成为同义突变的INDEL位点。最终得到三个商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL，分别位于地熊蜂参考基因组序列NC_015772.1的第14757029位核苷酸位点、NW_003566591.1的第623097位核苷酸位点以及NC_015772.1的第16893418核苷酸位点；
7.通过分子生物学手段，设计分子标记引物对目标INDEL检测，基于KASP方法（Kompetitive Allele Specific PCR, KASP,竞争性等位基因特异性PCR）技术，设计KASP扩增引物，并进一步转换为共显性的检测标记，经过PCR扩增后测序验证该位点的准确性。
实施例2
一、特异性分子标记位点的发掘
通过对对24只商业化地熊蜂（购自荷兰科伯特公司）和54野生型地熊蜂（世界范围内采集，样本涵盖世界范围内10个国家地区，其中7个欧洲国家—英国、法国、德国、瑞士、瑞典、土耳其、俄罗斯，3个亚洲国家—中国、塔吉克斯坦、吉尔吉斯坦）进行基因组重测序，采用生物信息学方法，在熊蜂的基因组上鉴定出三个特异INDEL位点，分别命名为NC14757029，NW623097，NC16893418。在NC14757029上，所有的商业化地熊蜂具有相同的基因型(均为A/A)，所有的野生地熊蜂具有相同的基因型(均为Del/Del)；在NW623097上，所有的商业化地熊蜂具有相同的基因型(均为G/G)，所有的野生地熊蜂具有相同的基因型(均为Del/Del)；在NC16893418上，所有的商业化地熊蜂具有相同的基因型(均为Ins/Ins)，所有的野生地熊蜂具有相同的基因型(均为Del/Del)。并且商业化的与野生的地熊蜂基因型不相同（说明书附图图1）。图1显示的分别是三个位点的INDEL信息，这里只展示了部分熊蜂个体的序列比对结果。
在地熊蜂参考基因组上，NC14757029位于NC_015772.1的第14757029位核苷酸位点，该INDEL位点以及侧翼序列为 5’-AAGTGGTTATTTTATAAATGGAACTTGAAC[-/A]AAAAAATGCGTATAATTACAATTGGAGCGC-3’，其中该序列第31位核苷酸是此特异INDEL位点；NW623097位于NW_003566591.1的第623097位核苷酸位点，该INDEL位点以及侧翼序列为5’-GTATTTAAAATGAATAATCTTCGGATCATA[-/G]GGCTGCGAGATTATTATTAAGAGGATTATT-3’，其中该序列第31位核苷酸是此特异INDEL位点；NC16893418位于NC_015772.1的第16893418核苷酸位点，该INDEL位点以及侧翼序列为 5’- ATAAAGAAAGTTTT[-/TGTGAAATATAACACTGTACTATTACCGTC]TTCACCTGTAAGGAAA-3’，其中该序列第16位核苷酸是此特异INDEL位点。
二、差异分子标记的引物组设计
根据特异三个INDEL位点及其两侧DNA序列，基于KASP方法（Kompetitive AlleleSpecific PCR, KASP,竞争性等位基因特异性PCR）技术，设计KASP扩增引物，并进一步转换为共显性的检测标记，分别称为共显性标记NC14757029、NW623097、NC16893418。
用于检测共显性标记NC14757029的引物组如下：
NC14757029FAMF1：
5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTCCAATTGTAATTATACGCATTTTTTG -3’（该序列5’端21bp为FAM荧光探针对应的接头序列（下划线部分），该接头序列能够与LGC Genomics 公司的KASP试剂中的FAM荧光探针相匹配，在扩增情况下，产生FAM荧光（蓝色）；3’端27bp为INDEL位点A等位基因特异的缺失，该序列与相应的参考基因组序列为反向互补关系）；
NC14757029HEXF1：
5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCAATTGTAATTATACGCATTTTTTTG -3’；
（该序列5’端21bp为HEX荧光探针对应的接头序列，该接头序列能够与LGCGenomics 公司的KASP试剂中的HEX荧光探针相匹配，在扩增情况下，产生HEX荧光（红色）；3’端27bp为INDEL位点A等位基因特异的插入，该序列与相应的参考基因组序列为反向互补关系）；
NC14757029R：5’- CGATAAATGCGTGCAAAGTGGTT -3’。
用于检测共显性标记NW623097的引物组如下：
NW623097FAMF1：
5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCCTCTTAATAATAATCTCGCAGCCT -3’（该序列5’端21bp为FAM荧光探针对应的接头序列（下划线部分），该接头序列能够与LGC Genomics 公司的KASP试剂中的FAM荧光探针相匹配，在扩增情况下，产生FAM荧光（蓝色）；3’端26bp为INDEL位点G等位基因特异的缺失，该序列与相应的参考基因组序列为反向互补关系）；
NW623097HEXF1：
5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCTCTTAATAATAATCTCGCAGCCC -3’；
（该序列5’端21bp为HEX荧光探针对应的接头序列，该接头序列能够与LGCGenomics 公司的KASP试剂中的HEX荧光探针相匹配，在扩增情况下，产生HEX荧光（红色）；3’端26bp为INDEL位点G等位基因特异的插入，该序列与相应的参考基因组序列为反向互补关系）；
NW623097R：5’- ACACGTTGTATCACCGGTCTAAAT -3’。
用于检测共显性标记NC16893418的引物组如下：
NC16893418FAMF1：
5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAAATAATTTCCTTACAGGTGAAAAAAC -3’（该序列5’端21bp为FAM荧光探针对应的接头序列（下划线部分），该接头序列能够与LGC Genomics 公司的KASP试剂中的FAM荧光探针相匹配，在扩增情况下，产生FAM荧光（蓝色）；3’端30bp为INDEL位点ACACTGTACTATTACCGTC等位基因特异的缺失，该序列与相应的参考基因组序列为反向互补关系）；
NC16893418HEXF1：
5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGTGAAGACGGTAATAGTACAGTGT -3’；
（该序列5’端21bp为HEX荧光探针对应的接头序列，该接头序列能够与LGCGenomics 公司的KASP试剂中的HEX荧光探针相匹配，在扩增情况下，产生HEX荧光（红色）；3’端30bp为INDEL位点ACACTGTACTATTACCGTC等位基因特异的插入，该序列与相应的参考基因组序列为反向互补关系）；
NC16893418R：5’- TTCCGTAGTTCCAAGACTATCCAAA -3’。
三、区分野生的与商业化的地熊蜂方法的建立
提取待测地熊蜂胸部基因组DNA作为模板，用上述二的共显性KASP标记进行KASP扩增，得到PCR扩增产物。
位点NC14757029KASP扩增体系（10μl）：含100ng模板DNA、0.12μMNC14757029FAMF1、0.12μM NC14757029HEXF1、0.3μM NC14757029R、5μL KASP试剂，余量为水。
位点NW623097KASP扩增体系（10μl）：含100ng模板DNA、0.12μM NW623097FAMF1、0.12μM NW623097HEXF1、0.3μM NW623097R、5μL KASP试剂，余量为水。
位点NC16893418KASP扩增体系（10μl）：含100ng模板DNA、0.12μMNC16893418FAMF1、0.12μM NC16893418HEXF1、0.3μM NC16893418R、5μL KASP试剂，余量为水。
KASP扩增程序：94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃-55℃退火45s（第一个循环退火温度为61℃，之后每个循环比上一个循环降低0.6℃，最后一个循环退火温度为55℃），10个循环；94℃变性20s，55℃退火45s，36个循环；10℃保存。
设置用等体积水代替模板DNA作为无模板空白对照。
将PCR扩增产物置于ABI7500荧光定量PCR仪进行荧光信号检测，将荧光定量PCR仪设置为基因分型终点法读取荧光模式，30℃，30s读取荧光值，收集FAM荧光信号（蓝色）和HEX荧光信号（红色），根据荧光信号颜色判定样品基因型；
位点NC14757029检测若荧光信号显示蓝色荧光信号（FAM），则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Del/Del，则该地熊蜂为或候选为进口野生地熊蜂；若荧光信号显示红色荧光信号（HEX），则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为A/A，则该地熊蜂为或候选为商业地熊蜂。
位点NW623097检测若荧光信号显示蓝色荧光信号（FAM），则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Del/Del，则该地熊蜂为或候选为进口野生地熊蜂；若荧光信号显示红色荧光信号（HEX），则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为G/G，则该地熊蜂为或候选为商业地熊蜂。
位点NC16893418检测若荧光信号显示蓝色荧光信号（FAM），则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Del/Del，则该地熊蜂为或候选为进口野生地熊蜂；若荧光信号显示红色荧光信号（HEX），则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Ins/Ins，则该地熊蜂为或候选为商业地熊蜂。
或，根据荧光信号值比值大小判定样品基因型：
FAM信号值和HEX信号值同时小于0.6，则为阴性对照，或者认为检测结果失败；FAM信号值和HEX信号值两者其一大于或等于0.6，则计算二者比值用于判定基因型。
位点NC14757029的FAM信号值/HEX信号值大于或等于3.5，则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Del/Del，则该地熊蜂为或候选为野生地熊蜂；FAM信号值/HEX信号值比值大于0.7，且小于3.0,则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Del/A；FAM信号值/HEX信号值小于0.5，则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为A/A，则该地熊蜂为或候选为商业地熊蜂；其他比值为灰区，需要重新进行检测。
位点NW623097的FAM信号值/HEX信号值大于或等于3.5，则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Del/Del，则该地熊蜂为或候选为野生地熊蜂；FAM信号值/HEX信号值比值大于0.7，且小于3.0,则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Del/G；FAM信号值/HEX信号值小于0.5，则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为G/G，则该地熊蜂为或候选为商业地熊蜂；其他比值为灰区，需要重新进行检测。
位点NC16893418的FAM信号值/HEX信号值大于或等于3.5，则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Del/Del，则该地熊蜂为或候选为野生地熊蜂；FAM信号值/HEX信号值比值大于0.7，且小于3.0,则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Del/Ins；FAM信号值/HEX信号值小于0.5，则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Ins/Ins，则该地熊蜂为或候选为商业地熊蜂；其他比值为灰区，需要重新进行检测。
特殊说明：一些实施例中，完全可以使用VIC替代HEX。HEX与VIC均为一种荧光基团，两者化学结构不同，但性质基本相似，在实际应用上两者可以完全相互替换。在一些应用环境下，比如使用ABI公司的ABI7500 实时荧光定量PCR仪进行检测，会用VIC指代HEX；在另外一下应用场景下会使用HEX指代VIC，比如使用LGC Genomics的SNPline仪器进行检测。
因此，采用特异INDEL位点的基因型能区别商业化地熊蜂与野生地熊蜂，具体方法如下：
检测待测地熊蜂的三个特异INDEL位点基因型都野生型还是商业型；若三个特异INDEL位点的基因型都为商业型，则该地熊蜂为或候选为进口商业化地熊蜂；若特异INDEL位点的基因型都为野生型，则该地熊蜂为或候选为野生地熊蜂。
检测待测地熊蜂的三个特异INDEL位点基因型为商业性还是野生型的方法为如下A）或B）：
A）直接测序；
B）用上述二的检测三个共显性标记NC14757029、NW623097、NC16893418的引物组对待测地熊蜂基因组DNA进行KASP扩增产物，对KASP扩增产物进行基因分型。
基因分型方法同上，可以采用荧光酶标仪照射后，根据荧光颜色或荧光信号值比值大小判断。
实施例3
商业化地熊蜂特异性分子标记的有效性评估
以随机挑选的4只野生地熊蜂（来源于我国新疆地区）、4只商业化的地熊蜂（购自荷兰科伯特公司）为研究对象。
1、取野生地熊蜂和商业化地熊蜂的胸部，分别提取基因组DNA。
2、以野生地熊蜂基因组DNA、商业化地熊蜂基因组DNA以及野生地熊蜂基因组DNA和商业化地熊蜂基因组DNA混样（质量比为1:1）为模板，按照实施例1的进行KASP扩增。
位点NC14757029KASP扩增体系（10μl）：含100ng模板DNA、0.12μMNC14757029FAMF1、0.12μM NC14757029HEXF1、0.3μM NC14757029R、5μL KASP试剂，余量为水。
位点NW623097KASP扩增体系（10μl）：含100ng模板DNA、0.12μM NW623097FAMF1、0.12μM NW623097HEXF1、0.3μM NW623097R、5μL KASP试剂，余量为水。
位点NC16893418KASP扩增体系（10μl）：含100ng模板DNA、0.12μMNC16893418FAMF1、0.12μM NC16893418HEXF1、0.3μM NC16893418R、5μL KASP试剂，余量为水。
KASP扩增程序：94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃-55℃退火45s（第一个循环退火温度为61℃，之后每个循环比上一个循环降低0.6℃，最后一个循环退火温度为55℃），10个循环；94℃变性20s，55℃退火45s，36个循环；10℃保存。
设置用等体积水代替模板DNA作为空白对照。
将KASP扩增产物置于ABI7500荧光定量PCR仪进行荧光信号检测，将荧光定量PCR仪设置为基因分型终点法读取荧光模式，30℃，30s读取荧光值，收集FAM荧光信号（蓝色）和HEX荧光信号（红色），根据荧光信号颜色判定样品基因型；
位点NC14757029检测若荧光信号显示蓝色荧光信号（FAM），则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Del/Del，则该地熊蜂为或候选为进口野生地熊蜂；若荧光信号显示红色荧光信号（HEX），则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为A/A，则该地熊蜂为或候选为商业地熊蜂。
位点NW623097检测若荧光信号显示蓝色荧光信号（FAM），则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Del/Del，则该地熊蜂为或候选为进口野生地熊蜂；若荧光信号显示红色荧光信号（HEX），则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为G/G，则该地熊蜂为或候选为商业地熊蜂。
位点NC16893418检测若荧光信号显示蓝色荧光信号（FAM），则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Del/Del，则该地熊蜂为或候选为进口野生地熊蜂；若荧光信号显示红色荧光信号（HEX），则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Ins/Ins，则该地熊蜂为或候选为商业地熊蜂。
或，根据荧光信号值比值大小判定样品基因型：
位点NC14757029的FAM信号值/HEX信号值大于或等于3.5，则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Del/Del，则该地熊蜂为或候选为野生地熊蜂；FAM信号值/HEX信号值比值大于0.7，且小于3.0,则该地熊蜂在特异SNP位点的基因型为Del/A；FAM信号值/HEX信号值小于0.5，则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为A/A，则该地熊蜂为或候选为商业地熊蜂；其他比值为灰区，需要重新进行检测。
位点NW623097的FAM信号值/HEX信号值大于或等于3.5，则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Del/Del，则该地熊蜂为或候选为野生地熊蜂；FAM信号值/HEX信号值比值大于0.7，且小于3.0,则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Del/G；FAM信号值/HEX信号值小于0.5，则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为G/G，则该地熊蜂为或候选为商业地熊蜂；其他比值为灰区，需要重新进行检测。
位点NC16893418的FAM信号值/HEX信号值大于或等于3.5，则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Del/Del，则该地熊蜂为或候选为野生地熊蜂；FAM信号值/HEX信号值比值大于0.7，且小于3.0,则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Del/Ins；FAM信号值/HEX信号值小于0.5，则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为Ins/Ins，则该地熊蜂为或候选为商业地熊蜂；其他比值为灰区，需要重新进行检测。
结果如说明书附图图2-4所示，横坐标表示读取HEX的荧光强度值，纵坐标表示读取的FAM的荧光强度值，左下角为空白对照；左上角4只商业化地熊蜂的荧光检测结果均为蓝色；右下角4只野生地熊蜂的荧光检测结果均为红色；中间位置4个样品为商业化地熊蜂与野生地熊蜂基因组DNA的等量混合样品，荧光检测结果均为绿色。
另外，4只商业化地熊蜂的FAM信号值/HEX信号值均大于3.5，即基因型为野生型；4只野生地熊蜂的FAM信号值/HEX信号值均小于0.5，即基因型为商业型；4个商业化地熊蜂与野生地熊蜂基因组DNA的等量混合样品，FAM信号值/HEX信号值均在0.7-3.0之间。
以上方法均可以通过三对分子标记的结果进行相互验证，因此，针对该特异INDEL位点所设计的引物组能够很精确地判断出待测的基因组DNA是来源于商业化地熊蜂还是来源于野生地熊蜂。
序列表
<110> 中国农业科学院蜜蜂研究所
<120> 商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL及其分子标记与应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 地熊蜂(Ground Bumblebee)
<400> 1
aagtggttat tttataaatg gaacttgaac aaaaaatgcg tataattaca attggagcgc 60
<210> 2
<211> 61
<212> DNA
<213> 地熊蜂(Ground Bumblebee)
<400> 2
aagtggttat tttataaatg gaacttgaac aaaaaaatgc gtataattac aattggagcg 60
c 61
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 地熊蜂(Ground Bumblebee)
<400> 3
gtatttaaaa tgaataatct tcggatcata ggctgcgaga ttattattaa gaggattatt 60
<210> 4
<211> 61
<212> DNA
<213> 地熊蜂(Ground Bumblebee)
<400> 4
gtatttaaaa tgaataatct tcggatcata gggctgcgag attattatta agaggattat 60
t 61
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 地熊蜂(Ground Bumblebee)
<400> 5
ataaagaaag ttttgtgaaa tataacactg tactattacc gtcttcacct gtaaggaaa 59
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 地熊蜂(Ground Bumblebee)
<400> 6
ataaagaaag tttttgtgaa atataacact gtactattac cgtcttcacc tgtaaggaaa 60
<210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial sequence)
<400> 7
gaaggtgacc aagttcatgc tctccaattg taattatacg cattttttg 49
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial sequence)
<400> 8
gaaggtcgga gtcaacggat ttccaattgt aattatacgc atttttttg 49
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial sequence)
<400> 9
cgataaatgc gtgcaaagtg gtt 23
<210> 10
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial sequence)
<400> 10
gaaggtgacc aagttcatgc ttcctcttaa taataatctc gcagcct 47
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial sequence)
<400> 11
gaaggtcgga gtcaacggat ttcctcttaa taataatctc gcagccc 47
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial sequence)
<400> 12
acacgttgta tcaccggtct aaat 24
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial sequence)
<400> 13
gaaggtgacc aagttcatgc tgaaaataat ttccttacag gtgaaaaaac 50
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial sequence)
<400> 14
gaaggtcgga gtcaacggat tcaggtgaag acggtaatag tacagtgt 48
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial sequence)
<400> 15
ttccgtagtt ccaagactat ccaaa 25

Claims (3)

1.一种用于区分商业地熊蜂与野生地熊蜂的方法，其特征在于，检测待测地熊蜂的特异INDEL位点的基因型为商业型还是野生型的方法为：
用成套引物对所述待测地熊蜂基因组DNA进行KASP扩增，得到KASP扩增产物；检测KASP扩增产物的荧光信号或荧光信号值：
若所述KASP扩增产物仅显示序列NC14757029FAMF1、NW623097FAMF1、NC16893418FAMF1所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色为FAM，则待测地熊蜂的特异INDEL位点的基因型为野生型；若所述KASP扩增产物仅显示序列NC14757029HEXF1、NW623097HEXF1、NC16893418HEXF1所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色为HEX，则待测地熊蜂的特异INDEL位点的基因型为商业型；
或若序列NC14757029FAMF1、NW623097FAMF1、NC16893418FAMF1所示DNA分子5'端连接荧光序列的荧光信号值与对应序列NC14757029HEXF1、NW623097HEXF1、NC16893418HEXF1所示DNA分子5'端连接荧光序列的荧光信号值的比值FAM/HEX大于或等于3.5，则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为野生型；若序列NC14757029FAMF1、NW623097FAMF1、NC16893418FAMF1所示DNA分子5'端连接荧光序列的荧光信号值与对应序列NC14757029HEXF1、NW623097HEXF1、NC16893418HEXF1所示DNA分子5'端连接荧光序列的荧光信号值的比值FAM/HEX小于0.5,则该地熊蜂在特异INDEL位点的基因型为商业型；
用于检测共显性标记NC14757029的引物组如下：
NC14757029FAMF1：
5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTCCAATTGTAATTATACGCATTTTTTG -3’；
NC14757029HEXF1：
5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCAATTGTAATTATACGCATTTTTTTG -3’；
NC14757029R：5’- CGATAAATGCGTGCAAAGTGGTT -3’；
用于检测共显性标记NW623097的引物组如下：
NW623097FAMF1：
5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCCTCTTAATAATAATCTCGCAGCCT -3’；
NW623097HEXF1：
5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCTCTTAATAATAATCTCGCAGCCC -3’；
NW623097R：5’- ACACGTTGTATCACCGGTCTAAAT -3’；
用于检测共显性标记NC16893418的引物组如下：
NC16893418FAMF1：
5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAAATAATTTCCTTACAGGTGAAAAAAC -3’；
NC16893418HEXF1：
5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGTGAAGACGGTAATAGTACAGTGT -3’；
NC16893418R：5’- TTCCGTAGTTCCAAGACTATCCAAA -3’；
以上序列所示的单链DNA分子的5'端连接一种荧光序列；
检测待测地熊蜂的三个特异INDEL位点基因型都为野生型还是商业型；若三个特异INDEL位点的基因型都为商业型，则该地熊蜂为或候选为商业化地熊蜂；若特异INDEL位点的基因型都为野生型，则该地熊蜂为或候选为野生地熊蜂；
位点NC14757029KASP扩增体系10μl：含100ng模板DNA、0.12μM NC14757029FAMF1、0.12μM NC14757029HEXF1、0.3μM NC14757029R、5μL KASP试剂，余量为水；
位点NW623097KASP扩增体系10μl：含100ng模板DNA、0.12μM NW623097FAMF1、0.12μMNW623097HEXF1、0.3μM NW623097R、5μL KASP试剂，余量为水；
位点NC16893418KASP扩增体系10μl：含100ng模板DNA、0.12μM NC16893418FAMF1、0.12μM NC16893418HEXF1、0.3μM NC16893418R、5μL KASP试剂，余量为水；
KASP扩增程序：94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃-55℃退火45s，第一个循环退火温度为61℃，之后每个循环比上一个循环降低0.6℃，最后一个循环退火温度为55℃，10个循环；94℃变性20s，55℃退火45s，36个循环；10℃保存。
2.如权利要求1所述的方法在区分或辅助区分待测地熊蜂为商业化地熊蜂还是野生的地熊蜂或制备区分或辅助区分待测地熊蜂为商业化地熊蜂还是野生的地熊蜂产品中的应用。
3.如权利要求1所述的方法在评价商业化地熊蜂是否已经对本土造成了生物入侵或制备评价商业化地熊蜂是否已经对本土造成了生物入侵产品中的应用。
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