CN104593510A - 检测花生fad2基因snp等位变异的引物、探针及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测花生FAD2基因SNP等位变异的引物、探针及方法。用于检测AhFAD2A基因448位A/G碱基的TaqMan探针和用于检测AhFAD2B基因442位A碱基插入/缺失的TaqMan探针，该TaqMan探针由一段碱基组成的核苷酸序列和位于核苷酸序列5′端的发光基团及位于3′端的荧光淬灭基团组成。本发明针对与花生油酸亚油酸含量密切相关的AhFAD2A ORF区448位A/G等位变异和AhFAD2B ORF区442位A碱基的缺失与插入，分别设计了特异引物和探针，可鉴别AhFAD2A和AhFAD2B基因，解决了现有技术只能鉴别AhFAD2B基因而无法鉴别AhFAD2A基因的问题。

Description

检测花生FAD2基因SNP等位变异的引物、探针及方法
技术领域
本发明涉及一种检测花生FAD2基因SNP等位变异的引物、探针及方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
花生是重要的油料作物，其籽粒脂肪酸的组成是衡量花生品质的重要指标。从油脂稳定性角度看，高油酸/亚油酸比值(O/L比)的花生及其制品不易氧化和腐败，货架期较长。有研究表明烘焙后的高油酸花生较普通油酸含量花生贮存期延长8倍(Mozingo et al.,2004)；而高油酸花生压榨的花生油较普通油酸含量品种贮藏期延长高达14倍(O’Keefe et al.,1993)。从对人体健康角度考虑，油酸有益于维持有益胆固醇高密度脂蛋白(HDL)水平，增强胰岛素敏感性，还可以改善一些炎症(Mesa Garcia et al.,2006；Vassiliou et al.,2009)。为了提高油脂的稳定性，工业上常通过加氢提高油脂的饱和度，这往往在碳链中引入反式双键生成反式脂肪酸，长期食用会大大增加罹患心脑血管病的几率。因此，提高花生籽粒的油酸含量和O/L比值是花生油脂遗传改良的主要目标。
FAD2是控制植物籽粒油酸、亚油酸含量的关键酶，它催化油酸在碳12位去饱和产生亚油酸。花生是异源四倍体(2n＝4X＝40)，AhFAD2A和AhFAD2B是位于不同基因组上的非等位基因，这两个基因对油酸、亚油酸含量均有贡献，只有这两个基因转录受到抑制或酶活降低，籽粒才表现出高油酸性状。美国上世纪80年代通过化学诱变和自然突变筛选获得的一些高油酸突变体(如F435，8-2122，M2-225，MF)(Norden et al.,1987；Ashri,1988)，一直作为亲本沿用至今。这些品种或品系籽粒油酸含量都在80％左右。分析F435及其衍生系高油酸性状的遗传基础发现，AhFAD2A基因编码区448nt处核苷酸序列由G→A的碱基替代，编码的氨基酸由天冬氨酸D变为天冬酰胺N，AhFAD2A酶活性大幅降低；同时AhFAD2B基因编码区442nt处1个A碱基插入，导致编码蛋白提前终止。针对上述突变体及衍生系AhFAD2A和AhFAD2B基因的SNP差异，近年来开发了多种用于检测的标记和检测方法，如酶切扩增多态性序列法(CAPS,cleaved amplified polymorphic sequence)、等位基因特异PCR(AS-PCR,Allele-Specific PCR)、测序法和荧光定量PCR法，从而实现对高油酸花生育种进行辅助选择(Jung et al.,2000a；Chu et al.,2007；Chu et al.,2009；Chen et al.,2010)。我国目前也培育出了几个高油酸花生品种，如山东花生研究所的培育的花育32(2009年山东省审定)、花育51和花育52，河南省开封市农林科学研究院开农H03-3、开农61、开农176、开17-15，河北省冀花11号、13号等。这些品种与突变体F435AhFAD2A基因在448nt处以及AhFAD2B基因在442nt处的突变位点相同。可以使用相同的标记和检测方法检测。
CAPS技术又称为PCR-RFLP，基本原理是利用己知的DNA序列资源设计出一套特异性的PCR引物(19-27bp)，然后扩增特异的目的DNA片段，接着用一种专一性的限制性内切酶 切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并进行RFLP分析。CAPS标记揭示的是特异PCR片段的限制性长度变异的信息。AhFAD2A未突变基因中存在的1个Hpy991酶切位点(5′CGACG 3′)，由于448nt G→A的突变该酶切位点消失；而AhFAD2B基因的442nt A碱基的插入突变则在突变基因中导致多出了一个Hpy188I酶切位点识别位点(5′TCAGA3′)，进行酶切检测时突变和未突变AhFAD2A和AhFAD2B基因酶切图谱具有明显不同。该方法因为需要经过片段扩增、限制性内切酶酶切、凝胶电泳检测等步骤，过程繁琐、成本较高，并且对扩增产物特异性要求高。AS-PCR方法的基本原理是根据基因上的等位变异位点，设计目的片段特异扩增引物，并进行PCR扩增和产物的凝胶电泳检测分析。差异往往通过扩增产物的大小差异、有或无来判断。为了检测AhFAD2A和AhFAD2B基因的等位差异，Chen等(2010)设计了5条引物，1条正向引物F435-F和4条反向引物F435IC-R、F435WT-R、F435SUB-R、F435INS-R，分别用于PCR扩增的质量控制和扩增非突变基因、AhFAD2A基因448nt碱基替换及AhFAD2B基因A碱基插入。该方法由于检测的多为SNP差异，要求提取DNA质量较好，且需控制较为严格的扩增条件；但检测结果常常出现偏差，需多次重复。针对这两个基因人们还直接采用测序的方法进行检测，这一方法不仅成本高，而且由于AhFAD2A和AhFAD2B基因ORF区序列相似度极高，因此很难设计引物进行特异扩增，严格区分两基因。特别是AhFAD2A 448位的G/A，在AhFAD2B基因为保守的G，难以区分AhFAD2A为纯合的AA还是杂合的G/A状态。
随着分子生物学检测技术的发展，荧光实时定量PCR检测技术不断应用于SNP标记的检测。荧光实时定量PCR检测可分为2类：一类为荧光染料SYBR Green检测法；另一类为TaqMan探针法。Barkley等(2010)设计了针对AhFAD2B基因的442nt A碱基的插入或缺失的TaqMan-MGB探针以区分该位点插入、缺失或呈杂合。该研究设计的扩增引物在AhFAD2A和AhFAD2B基因中没有序列差异，仅靠探针5′端存在的1个A/C碱基差异区分AhFAD2A和AhFAD2B基因；并且对于AhFAD2A的等位差异还需其他方法进行检测。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种检测花生FAD2基因SNP等位变异的引物、探针及方法。本发明分别设计了AhFAD2A和AhFAD2B基因的特异性扩增引物及针对这两个基因野生型和突变型的TaqMan探针，并建立了相应的检测方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种用于检测AhFAD2A基因448位G/A差异的引物，该引物为一对，核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
序列表中SEQ ID No.1由20个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因ORF区自5′端413-432位碱基序列；SEQ ID No.2由20个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因ORF区自5′端528-547位碱基的反向互补序列；扩增长度为135bp。
一种用于检测AhFAD2A基因448位A碱基的TaqMan探针1，该TaqMan探针1由一段22个碱基组成的核苷酸序列和位于核苷酸序列5′端的TAMRA发光基团及位于核苷酸序列3′端的BHQ2荧光淬灭基团组成，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
序列表中SEQ ID No.3由22个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因ORF区自5′端436-457位碱基序列。
一种用于检测AhFAD2A基因448位G碱基的TaqMan探针2，该TaqMan探针2由一段23个碱基组成的核苷酸序列和位于核苷酸序列5′端的CY5发光基团及位于核苷酸序列3′端的BHQ2荧光淬灭基团组成，核苷酸序列如SEQ ID No.4序列。
序列表中SEQ ID No.4由23个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因ORF区自5′端435-457位碱基序列。
一种用于检测AhFAD2B基因442位A碱基插入或缺失的引物，该引物为一对，核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。
序列表中SEQ ID No.5由20个碱基组成，该序列为AhFAD2B基因ORF区自5′端413-432位碱基序列；SEQ ID No.6由20个碱基组成，该序列为AhFAD2B基因ORF区自5′端528-547位碱基的反向互补序列；扩增长度为135bp。
一种用于检测AhFAD2B基因442位A碱基插入的TaqMan探针3，该TaqMan探针3由一段21个碱基组成的核苷酸序列和位于核苷酸序列5′端的HEX发光基团及位于核苷酸序列3′端的BHQ1荧光淬灭基团组成，核苷酸序列如SEQ ID No.7序列。
序列表中SEQ ID No.7由21个碱基组成，该序列为AhFAD2B基因ORF区自5′端433-453位碱基序列。
一种用于检测AhFAD2B基因442位A碱基缺失的TaqMan探针4，该TaqMan探针4由一段20个碱基组成的核苷酸序列和位于核苷酸序列5′端的FAM发光基团及位于核苷酸序列3′端的BHQ1荧光淬灭基团组成，核苷酸序列如SEQ ID No.8序列。
序列表中SEQ ID No.8由20个碱基组成，该序列为AhFAD2B基因ORF区自5′端438-457位碱基序列。
一种标记辅助筛选AhFAD2A基因等位变异的方法，包括如下步骤：
(1)提取供试花生材料的叶片或种子的基因组DNA；
(2)以步骤(1)基因组DNA为模板，配制PCR反应体系，PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，荧光探针为TaqMan探针1和TaqMan探针2，检测反应体系的荧光强度，然后进行PCR扩增，扩增后再次检测荧光强度；
(3)对步骤(2)的检测结果进行分析，当检测到仅有TaqMan探针1的荧光时，则第448位为A碱基纯合，记为aa；当检测到仅有TaqMan探针2的荧光时，则第448位G碱基为纯合，记为AA；当检测到有TaqMan探针1和TaqMan探针2的荧光时，则第448位为杂合子，记为Aa。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的PCR反应体系为20μL，组分如下：
根据本发明优选的，所述步骤(2)中PCR扩增反应条件如下：
95℃预变性1min；扩增反应，95℃变性15s，60℃延伸1min，40个循环；
根据本发明优选的，所述步骤(2)中检测反应体系的荧光强度为在60℃条件下检测1min。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中再次检测反应体系的荧光强度为在60℃条件下检测1min。
一种标记辅助筛选AhFAD2B基因等位变异的方法，包括如下步骤：
(i)提取供试花生材料的叶片或种子的基因组DNA；
(ii)以步骤(i)基因组DNA为模板，配制PCR反应体系，PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，荧光探针为TaqMan探针7和TaqMan探针8，检测反应体系的荧光强度，然后进行PCR扩增，扩增后再次检测荧光强度；
(iii)对步骤(ii)的检测结果进行分析，当检测到仅有TaqMan探针7的荧光时，则第442位为A碱基插入纯合，即突变基因型，记为bb；当检测到仅有TaqMan探针8的荧光时，则第442位A碱基缺失纯合，即野生基因型，记为BB；当检测到有TaqMan探针7和TaqMan探针8的荧光时，则第442位为杂合子，记为Bb。
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中的PCR反应体系为20μL，组分如下：
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中PCR扩增反应条件如下：
95℃预变性1min；扩增反应，95℃变性15s，60℃延伸1min，40个循环；
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中检测反应体系的荧光强度为在60℃条件下检测1min。
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中再次检测反应体系的荧光强度为在60℃条件下检测1min。
有益效果
1、本发明针对与花生油酸亚油酸含量密切相关的AhFAD2A ORF区448位A/G等位变异和AhFAD2B ORF区442位A碱基的缺失与插入，分别设计了特异引物和探针。其可以有效鉴别 AhFAD2A和AhFAD2B基因，解决了现有技术的鉴别方法只能鉴别AhFAD2B基因而无法鉴别AhFAD2A基因的问题；
2、本发明在设计引物时，考虑到AhFAD2A和AhFAD2B基因ORF区序列相似性极高，仅存在10-11个碱基差异，为了保证检测的可靠性，充分考虑等位变异位点附近AhFAD2A和AhFAD2B基因组序列的差异，且使扩增片段尽可能小于150bp，将这两个基因432位的C/A碱基差异设计在扩增正向引物的3′端，同时将两基因528位和534位的C/T差异设计在反向引物的3′端，以利于两基因的区分；
3、本发明在设计探针时，尽可能使用于分型鉴定的等位差异位点靠近探针的3′端，并选择GC含量较高的区段，使AhFAD2A和AhFAD2B 2组探针的Tm值分别达到64.5℃、68.0℃和68.9℃、65.5℃，有利于探针特异性结合。AhFAD2A和AhFAD2B 2组探针的荧光标记基团则分别选择TAMRA(玫红色荧光)、CY5(紫色荧光)和HEX(粉色荧光)、FAM(绿色荧光)，同一组的两个荧光基团检测波长范围不存在交叉，避免检测信号间的相互干扰。
附图说明
图1为实施例3中TaqMan探针法检测AhFAD2A中各基因型点簇分布图；
图2为实施例3部份AhFAD2A样品AS-PCR琼脂糖电泳检测结果；
图中，左侧为野生型引物的AS-PCR检测结果，若携带等位基因A则显示有条带，反之无条带；右侧为碱基转换突变型引物的AS-PCR检测结果，若携带等位基因a则有条带，反之无条带。
图3为实施例3中TaqMan探针法检测AhFAD2B中各基因型点簇分布图；
图4为实施例3中部份AhFAD2B样品AS-PCR琼脂糖电泳检测结果；
图中，左侧为野生型引物的AS-PCR检测结果，若携带等位基因B则显示有条带，反之无条带；右侧为插入突变型引物的AS-PCR检测结果，若携带等位基因b则有条带，反之无条带。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
下述实施例中所有方法如无特殊说明均为常规方法。所用引物、TaqMan探针的的合成均由上海生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
实施例1、用于检测AhFAD2A基因448位G/A等位差异的引物和TaqMan探针的设计
AhFAD2A基因基因组序列ORF区第448位碱基序列存在野生型G和突变型A两种序列，导致编码的氨基酸残基由野生型的天冬氨酸D(密码子GAC)变为突变型天冬酰胺N(密码子AAC)。根据上述突变位点的位置，并考虑AhFAD2A和AhFAD2B基因序列差异，设计包含上述突变位点在内的一对PCR扩增引物(如表1，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2)，使AhFAD2A和AhFAD2B基因差异序列位于引物的3′端；同时根据AhFAD2A野生型基因和突变型基因序列设计2条TaqMan探针SEQ ID No:3和SEQ ID No:4(表1)，将2条TaqMan探针的5′端分别标记 报告荧光基团TAMRA(玫红色荧光)和CY5(紫色荧光)，3′端标记荧光淬灭基团BHQ2。
表1.检测AhFAD2A和AhFAD2B基因等位突变的引物、探针及其解链温度
序列表中SEQ ID No:1由20个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因ORF区自5′端413-432位碱基序列；SEQ ID No:2由20个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因ORF区自5′端528-547位碱基的反向互补序列；扩增长度为135bp。序列表中SEQ ID No:3为检测突变型基因的探针，由22个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因ORF区自5′端436-457位碱基序列，5′端和3′端分别标记TAMRA发光基团和BHQ2荧光淬灭基团，针对检测448位的突变碱基A；序列表中SEQ ID No:4为检测野生型基因的探针，由23个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因ORF区自5′端435-457位碱基序列，5′端和3′端分别标记CY5发光基团和BHQ2荧光淬灭基团，针对检测448位的碱基G。
实施例2、用于检测AhFAD2B基因442位A插入突变的引物和TaqMan探针的设计
AhFAD2B基因基因组序列ORF区第442位碱基序列存在野生型缺失和突变型插入A碱基两种序列，导致编码的氨基酸序列由野生型编码完整的蛋白变为突变型移码提前终止。根据上述突变位点的位置，并考虑AhFAD2A和AhFAD2B基因序列差异，利用Primer premier 5软件设计包含上述突变位点在内的一对PCR扩增引物(如表1，SEQ ID No:5和SEQ ID No:6)，使AhFAD2A和AhFAD2B基因差异序列位于引物的3′端；同时根据AhFAD2B野生型基因和突变型基因序列设计2条TaqMan探针SEQ ID No:7和SEQ ID No:8(表1)，将2条TaqMan探针的5′端分别标记报告荧光基团HEX(粉色荧光)和FAM(绿色荧光)，3′端标记荧光淬灭基团BHQ1。
序列表中SEQ ID No:5由20个碱基组成，该序列为AhFAD2B基因ORF区自5′端413-432 位碱基序列；SEQ ID No:6由20个碱基组成，该序列为AhFAD2B基因ORF区自5′端528-547位碱基的反向互补序列；扩增长度为135bp。序列表中SEQ ID No:7为检测突变型基因的探针，由21个碱基组成，该序列为AhFAD2B基因ORF区自5′端433-453位碱基序列，5′端和3′端分别标记HEX发光基团和BHQ1荧光淬灭基团，针对检测442位的突变碱基A的插入；序列表中SEQ ID No:8为检测野生型基因的探针，由20个碱基组成，该序列为AhFAD2B基因ORF区自5′端438-457位碱基序列，5′端和3′端分别标记FAM发光基团和BHQ1荧光淬灭基团，针对检测442位的碱基G而相对于突变型碱基A缺失。
实施例3、花生AhFAD2A和AhFAD2B基因突变位点的检测
用根据AhFAD2A基因等位差异设计的引物和TaqMan探针进行等位位点检测
用实施例1中根据AhFAD2A基因等位差异设计的引物和TaqMan探针对供试花生材料包括普通油酸花生(基因型AABB)为母本与高油酸花生(基因型aabb)为父本杂交的F1代杂种、F2代分离群体进行检测，同时以母本普通油酸花生和高油酸花生为对照，具体方法如下：
(1)提取花生样品的基因组DNA
按TIANGEN公司提供的植物基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP-305)，并按照试剂盒说明书提取供试花生样品基因组DNA，具体步骤如下：
①在液氮中研磨100mg新鲜或-20℃冷冻的样品材料(注意：样品要快速、充分研磨为粉末)；
②将研磨好的粉末迅速转移到预选装有700μl，65℃预热的缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；
③加入700μl氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min；注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚：氯仿/1:1进行等体积抽提；
④小心的将上一步所得上层水相转入一个新的离心管，加入700μl的缓冲液GP2，充分混匀；
⑤将混匀的液体转入吸附柱CB3，12000rpm离心30s，弃掉废液；
⑥向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃掉废液；
⑦向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液；
⑧重复步骤7；
⑨将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中无水乙醇的残留会影响后续的酶切反应实验；
⑩将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量50-200μl洗脱缓冲 液TE(pH值在7.0-8.5之间)，室温放置2min。12000rpm离心2min收集DNA溶液；
最后用紫外分光光度计检测DNA的含量及纯度，结果显示所测样品A260/280介于1.8～2.0之间，表明所提取的DNA纯度较高。
(2)以步骤(1)基因组DNA为模板，配制PCR反应体系，PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，荧光探针为TaqMan探针1和TaqMan探针2，检测反应体系的荧光强度，然后进行PCR扩增，扩增后再次检测荧光强度；
以步骤(1)提取的DNA为模板，在实施例2表1中所述不同引物、探针组合(qFAD2A-F+qFAD2A-R+qFAD2A-pA+qFAD2A-pG)的指导下，检测AhFAD2A基因基因组序列ORF区第448位碱基转换(G:C→A:T)产生的等位差异。
PCR扩增在ABI7500实时荧光PCR仪(美国应用生物系统公司)上进行，并按照基因分型实验流程操作(具体实验操作流程参见美国应用生物系统公司7300/7500实时定量PCR仪入门指南)。仪器设定成功后，会依次进行读取扩增前荧光信号、扩增过程荧光信号收集、读取扩增后荧光信号、结果分析等操作。
整个PCR的反应条件为：60℃荧光信号收集1min；预变性，95℃，1min；扩增反应，95℃变性15s，60℃延伸1min，40个循环；60℃荧光信号收集1min。PCR反应体系及试剂厂家见表2。
表2 PCR反应体系
(3)对步骤(2)的检测结果进行分析，当检测到仅有TaqMan探针1的荧光时，则第448位为A碱基纯合，记为aa；当检测到仅有TaqMan探针2的荧光时，则第448位G碱基为纯合，记为AA；当检测到有TaqMan探针1和TaqMan探针2的荧光时，则第448位为杂合子，记为Aa。
对于AhFAD2A基因第448位碱基转换的等位差异检测，使用两个TaqMan探针(5’末端分别携有TAMRA和CY5荧光基团，3’端标有荧光淬灭基团)标记一个SNP位点，标有CY5的探针与显性等位基因(A)完全匹配，另一个标有TAMRA的荧光探针与隐性等位基因完全匹配(a)。
等位基因鉴别分析实验设计时，分别以已知的仅含有显性等位基因A和隐性等位基因a的花生品种为标准。将未知样本分为以下3类：①显性纯合子：样本中只含有显性纯合基因AA；②隐性纯合子：样本中只含有隐性纯合基因aa；③杂合子：样品中同时含有等位基因A和等位基因a。
qPCR扩增结果判断：如果仅有CY5荧光信号明显升高，则样本为显性纯合子；如果仅有TAMRA荧光信号明显升高，则样本为隐性纯合子；两种荧光信号均升高，则样本为杂合子Aa。为了便于判断，运用ABI7500自带软件将等位基因鉴别的结果以散点图谱形式表示，水平轴为等位基因a扩增的荧光强度、垂直轴表示等位基因A扩增的荧光强度。AA显性纯合子分布纵坐标的上部区域；aa隐性纯合子分布在横坐标的右侧区域；Aa杂合子则分布在对角线区域；无模板对照(NTC)则分布在横坐标与纵坐标交界区域(图1)。
为验证本发明的可行性和准确性，实验室选取50个未知基因型样本(编号1-50)，为提高实验精确性与可信性，用鲁花14(aa)与丰花1号(AA)作为点簇的标定，运用TaqMan探针检测分析方法与普通AS-PCR检测方法进行共检测验证，并对两种方法检测结果的一致性进行了分析。图1为AhFAD2A基因的TaqMan探针检测的部分实验结果。为了验证本发明的有效性和可靠性，分别用AS-PCR方法和测序法检测了这50个未知样品和编号为21-40的样品。图2为AS-PCR检测的部分实验结果。表3统计和比较了不同检测方法检测结果一致性。
表3.不同检测方法结果统计对比
用根据AhFAD2B基因等位差异设计的引物和TaqMan探针进行等位位点检测
用实施例2中根据AhFAD2B基因等位差异设计的引物和TaqMan探针对供试花生材料包括普通油酸花生(基因型aaBB)为母本与高油酸花生(基因型aabb)为父本杂交的F1代杂种、F2代分离群体进行检测，同时以母本普通油酸花生和高油酸花生为对照，具体方法如下：
(i)供试花生样品基因组DNA的提取，条件同上述步骤(1)；
(ii)以步骤(i)基因组DNA为模板，配制PCR反应体系，PCR引物的核苷酸序列如 SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，荧光探针为TaqMan探针7和TaqMan探针8，检测反应体系的荧光强度，然后进行PCR扩增，扩增后再次检测荧光强度；
以步骤(i)提取的DNA为模板，在实施例2表1中所述不同引物、探针组合(qFAD2B-F+qFAD2B-R+qFAD2B-pA442+qFAD2B-p0)的指导下，检测AhFAD2B基因基因组序列ORF区第442位碱基序列InDel等位差异。
PCR扩增在ABI7500实时荧光PCR仪(美国应用生物系统公司)上进行，并按照基因分型实验流程操作(具体实验操作流程参见美国应用生物系统公司7300/7500实时定量PCR仪入门指南)。仪器设定成功后，会依次进行读取扩增前荧光信号、扩增过程荧光信号收集、读取扩增后荧光信号、结果分析等操作。
整个PCR的反应条件为：60℃荧光信号收集1min；预变性，95℃，1min；扩增反应，95℃变性15s，60℃延伸1min，40个循环；60℃荧光信号收集1min。PCR反应体系及试剂厂家见表4。
表4.PCR反应体系
(iii)对步骤(ii)的检测结果进行分析，当检测到仅有TaqMan探针7的荧光时，则第442位为A碱基插入纯合，即突变基因型，记为bb；当检测到仅有TaqMan探针8的荧光时，则第442位A碱基缺失纯合，即野生基因型，记为BB；当检测到有TaqMan探针7和TaqMan探针8的荧光时，则第442位为杂合子，记为Bb。
对于AhFAD2B基因第442位碱基InDel等位差异检测，使用两个TaqMan探针(5’末端分别携有FAM和HEX荧光基团，3’端标有荧光淬灭基团)标记一个SNP位点，标有FAM的探针与显性等位基因(B)完全匹配，另一个标有HEX的荧光探针与隐性等位基因完全匹配(b)。
等位基因鉴别分析实验设计时，分别以已知的仅含有显性等位基因B和隐性等位基因b的花生品种为标准。未知样本将分为以下3类：①显性纯合子：样本中只含有显性纯合基因BB；②隐性纯合子：样本中只含有隐性纯合基因bb；③杂合子：样品中同时含有等位基因B和等位基因b。
qPCR扩增结果判断：如果仅有FAM荧光信号明显升高，则样本为显性纯合子；如果仅有VIC荧光信号(可检测HEX荧光基团)明显升高，则样本为隐性纯合子；两种荧光信号均升高，则样本为杂合子Bb。为了便于判断，运用ABI7500自带软件将等位基因鉴别的结果以散点图谱形式表示，水平轴为等位基因b扩增的荧光强度，垂直轴表示等位基因B扩增的荧光强度。BB显性纯合子布分纵坐标的上部区域；bb隐性纯合子分布在横坐标的右侧区域；Bb杂合子则分布在对角线区域；无模板对照(NTC)则分布在横坐标与纵坐标交界区域(图3)。
为验证本发明的可行性和准确性，实验室选取45个未知基因型样本(编号1-45)，为提高实验精确性与可信性，用鲁花14(BB)与花育32(bb)作为点簇的标定，分别采用上述TaqMan探针检测分析方法与普通AS-PCR检测方法进行共检测验证，并对两种方法检测结果的一致性进行了分析。图3为AhFAD2B基因的TaqMan探针检测的部分实验结果。为了验证本发明的有效性和可靠性，分别用AS-PCR方法和测序法检测了这45个未知样品和编号为21-40的样品。图4为AS-PCR检测的部分实验结果。表4统计和比较了不同检测方法检测结果一致性。
由于普通AS-PCR易受引物设计、试剂、模板质量、PCR仪等多种因素的影响，发明人对AS-PCR检测实验中结果差异样本进行重检，重检结果与TaqMan探针检测结果保持一致，这充分说明TaqMan探针检测方法的高效性与准确性。
表4.不同检测方法结果统计对比
对比例
Barkley等(2010)利用Primerversion 3软件(Applied Biosystems,Foster City,CA)设计PCR扩增引物和TaqMan-MGB探针，序列如下：正向引物5'GCCGCCACCACTCCA AC 3'，反向引物5'TGGTTTCGGGACAAACACTTC 3'，442位野生型探针5'VIC ACAGGTT CCCTCGAC MGBNFQ 3'和442位插入突变型探针5'6FAM ACAGGTTCCCTCAGAC MGBNFQ 3'。
分别用Barkley等(2010)设计的引物和探针以及本研究针对AhFAD2B 442位InDel等位 位点设计的引物和探针，利用与实施例3AhFAD2B等位差异检测相同的条件，对已知基因型的同一批28个样品(包括用测序法鉴定的20个AhFAD2B基因型鉴定样品和8个已确定含有AA或Aa基因型的样品)分别进行检测，两种方法检测结果完全一致(表5)。
表5.本研究方法与文献报道方法检测结果对比
由上述结果可以看出，现有技术只能区分BB/Bb/bb基因型，而无法对AA/Aa/aa基因型进行区分，而本申请可以将两种基因型有效地进行区分。

Claims (10)

1.一种用于检测AhFAD2A基因448位G/A差异的引物，该引物为一对，核苷酸序列如SEQID No.1和SEQ ID No.2所示。
2.一种用于检测AhFAD2A基因448位A碱基的TaqMan探针1，该TaqMan探针1由一段22个碱基组成的核苷酸序列和位于核苷酸序列5′端的TAMRA发光基团及位于核苷酸序列3′端的BHQ2荧光淬灭基团组成，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
3.一种用于检测AhFAD2A基因448位G碱基的TaqMan探针2，该TaqMan探针2由一段23个碱基组成的核苷酸序列和位于核苷酸序列5′端的CY5发光基团及位于核苷酸序列3′端的BHQ2荧光淬灭基团组成，核苷酸序列如SEQ ID No.4序列。
4.一种用于检测AhFAD2B基因442位A碱基插入或缺失的引物，该引物为一对，核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。
5.一种用于检测AhFAD2B基因442位A碱基插入的TaqMan探针3，该TaqMan探针3由一段21个碱基组成的核苷酸序列和位于核苷酸序列5′端的HEX发光基团及位于核苷酸序列3′端的BHQ1荧光淬灭基团组成，核苷酸序列如SEQ ID No.7序列。
6.一种用于检测AhFAD2B基因442位A碱基缺失的TaqMan探针4，该TaqMan探针4由一段20个碱基组成的核苷酸序列和位于核苷酸序列5′端的FAM发光基团及位于核苷酸序列3′端的BHQ1荧光淬灭基团组成，核苷酸序列如SEQ ID No.8序列。
7.一种标记辅助筛选AhFAD2A基因等位变异的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取供试花生材料的叶片或种子的基因组DNA；
(2)以步骤(1)基因组DNA为模板，配制PCR反应体系，PCR引物的核苷酸序列如SEQID No.1和SEQ ID No.2所示，荧光探针为TaqMan探针1和TaqMan探针2，检测反应体系的荧光强度，然后进行PCR扩增，扩增后再次检测荧光强度；
(3)对步骤(2)的检测结果进行分析，当检测到仅有TaqMan探针1的荧光时，则第448位为A碱基纯合，记为aa；当检测到仅有TaqMan探针2的荧光时，则第448位G碱基为纯合，记为AA；当检测到有TaqMan探针1和TaqMan探针2的荧光时，则第448位为杂合子，记为Aa。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的PCR反应体系为20μL，组分如下：
根据本发明优选的，所述步骤(2)中PCR扩增反应条件如下：
95℃预变性1min；扩增反应，95℃变性15s，60℃延伸1min，40个循环；
根据本发明优选的，所述步骤(2)中检测反应体系的荧光强度为在60℃条件下检测1min；
根据本发明优选的，所述步骤(2)中再次检测反应体系的荧光强度为在60℃条件下检测1min。
9.一种标记辅助筛选AhFAD2B基因等位变异的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(i)提取供试花生材料的叶片或种子的基因组DNA；
(ii)以步骤(i)基因组DNA为模板，配制PCR反应体系，PCR引物的核苷酸序列如SEQID No.5和SEQ ID No.6所示，荧光探针为TaqMan探针7和TaqMan探针8，检测反应体系的荧光强度，然后进行PCR扩增，扩增后再次检测荧光强度；
(iii)对步骤(ii)的检测结果进行分析，当检测到仅有TaqMan探针7的荧光时，则第442位为A碱基插入纯合，即突变基因型，记为bb；当检测到仅有TaqMan探针8的荧光时，则第442位A碱基缺失纯合，即野生基因型，记为BB；当检测到有TaqMan探针7和TaqMan探针8的荧光时，则第442位为杂合子，记为Bb。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)中的PCR反应体系为20μL，组分如下：
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中PCR扩增反应条件如下：
95℃预变性1min；扩增反应，95℃变性15s，60℃延伸1min，40个循环；
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中检测反应体系的荧光强度为在60℃条件下检测1min；
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中再次检测反应体系的荧光强度为在60℃条件下检测1min。
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