CN105506111B - 一种检测南阳牛mapk10基因cnv标记的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测南阳牛MAPK10基因CNV标记的方法及其应用:以南阳牛的血液全基因组DNA为模板,通过实时荧光定量PCR方法分别扩增南阳牛MAPK10基因CNV区域和内参基因BTF3,根据log22‑ΔΔCt将结果分为插入型、缺失型和正常型,鉴定南阳牛MAPK10基因的拷贝数变异。与南阳牛生产数据的关联分析显示,MAPK10不同拷贝数对南阳牛的生长发育有显著影响,其中正常型个体的初生重、18月龄体高和24月龄体重和日增重均显著高于插入型和缺失型个体。本发明在DNA水平上检测与南阳牛生产性状密切相关的CNV标记,可作为中国南阳牛生长性状的标记辅助选择的重要候选分子标记。
Description
技术领域
本发明涉及家畜分子生物学检测领域,具体涉及一种基于QPCR技术检测南阳牛MAPK10基因CNV标记的方法。
背景技术
随着基因组学和生物信息学等学科的迅猛发展,动物育种理论和技术正在发生重大变化,肉牛育种的方向由常规的表型选育向分子育种发展。目前,牛分子育种研究主要集中在以分子标记为基础的标记辅助选择方面。分子育种,即分子标记辅助选择(molecularmark-assist selection,MAS),该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择,对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中,通过对生长性状密切相关,并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择,达到早期选种和提高育种值准确性的目的,从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。
拷贝数变异(Copy Number Variations,CNVs),作为一种新发现的基因组亚显微水平结构变异类型,是指基因组DNA中较大片段的缺失或重复现象,涉及的片段大小在50bp到数Mb之间,包括拷贝数增加(Copy number gain)和拷贝数减少(Copy number loss)。
全基因组范围内寻找CNV的方法主要有比较基因组杂交(CGH)、SNP芯片和重测序,其中前两种主要基于芯片技术。(1)CGH技术是基于微阵列技术的比较基因组杂交,通过在一张芯片上用标记不同荧光素的样品(试验样本与对照样本)同时进行杂交可检测试验样本基因组和对照基因组间DNA拷贝数的变化。CGH芯片的探针覆盖整个基因组,所以这种分析方法是高通量分析法,且具有敏感度、准确度、分辨率高的特点,分析所得的试验数据有较高的可信度。然而该技术分辨率在Mb水平,更小片段的拷贝数片段则不易检出。同时该技术操作繁琐,通量低、耗时长且成本昂贵,需要较为大量的模板DNA,不利于大范围的推广。(2)SNP芯片不需要同时使用两个样本的DNA和探针进行双杂交,仅使用单杂交就可以完成。它可以通过比较测试样本的信号强度与其他个体的强度,而确定每个位点的相对基因组拷贝数。(3)新一代直接测序技术克服了杂交固有的一些缺点,不需要知道更多的背景知识和设计工作,应用配对测序可以鉴定出复杂的结构变化。
对于已确定的CNV的检测,通常是采用基于PCR技术和杂交技术的一些方法。例如QPCR、QMPSF、MLPA、FISH、Southern blotting和MAPH。其中,实时荧光定量PCR(QPCR)最为常用。根据QPCR所使用的荧光化学方法的不同,主要分为荧光染料嵌入法和荧光杂交探针法两类。PCR反应体系中加入过量的SYBR Green染料分子,能特异性地渗入DNA双链并发射荧光信号,而游离的染料分子则仅有很低的荧光本底几乎不发光,从而确保信号的增加与PCR产物的增加同步,可通过检测荧光信号的强度来反映基因组DNA的数量。通过对目的基因(具有拷贝数变异)及参考基因(无拷贝数变异)进行相对定量,根据2-ΔΔCt方法统计检测样本候选基因的拷贝数。染料法的优点是实验成本低、无需设计合成探针、使用方便,可以检测目的片段的绝对拷贝数,但不适用于大样本的高通量检测。
MAPK10又名JNK3,从属于MAPK家族中的含JUN氨基末端激酶(JNK)亚群。MAPK10是重要的抑癌基因,与癫痫病、肝癌、甲状腺癌、肾癌、结肠癌等有关;且研究发现它还可促进成肌或成骨细胞的生成,而抑制脂肪细胞的分化,与体重的变化和一些代谢疾病(如2型糖尿病、脂肪肝、胰岛素抵抗等)密切相关。
对南阳牛全基因组重测序,发现MAPK10基因第10内含子处存在1776bp的拷贝数变异(CNV),可能影响该基因的功能。目前,尚未见有关MAPK10基因该CNV对南阳牛生长性状影响的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测南阳牛MAPK10基因CNV标记的方法及其应用。
为达到上述目的,本发明采用了以下技术方案:
以南阳牛基因组DNA为模板,以引物对P1以及引物对P2为引物,分别通过QPCR扩增MAPK10基因的CNV区域以及作为对照的BTF3基因的部分片段,然后根据定量结果鉴定南阳牛MAPK10基因的拷贝数变异。
所述的MAPK10基因的CNV区域位于MAPK10基因参考基因组序列AC_000163的610515bp-612290bp。
所述的拷贝数变异是根据log22-ΔΔCt将定量结果分为三类:插入型,Log22-ΔΔCt>0.5;缺失型,Log22-ΔΔCt<-0.5;正常型,Log22-ΔΔCt≤|±0.5|。
所述的引物对P1为:
上游引物F1:5’-CTGTGCTTAGAAATCTGGGAGT-3’
下游引物R1:5’-GAGGGAAATGGGAGGGAG-3’;
所述的引物对P2为:
上游引物F2:5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’
下游引物R2:5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。
所述的QPCR所用的扩增体系以20μL计包括:50ng/μL模板DNA 1μL、10pM的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各1μL以及2×SYBR Green QPCR Mix 10μL。
所述的QPCR所用的反应程序为:(1)预变性:95℃,30s;;(2)扩增反应:95℃变性10s,60℃退火30s,39个循环。
基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为208bp,基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为166bp。
上述检测南阳牛MAPK10基因CNV标记的方法在南阳牛分子标记辅助选择育种中的应用。
具有正常型拷贝数变异类型的个体在生长性状上较优。
所述生长性状为初生重、18月龄的体高、24月龄的体重或24月龄的日增重。
本发明中,以牛MAPK10基因候选区域Chr 6:102708523-102710298为候选位点,通过实时荧光定量PCR技术检测该位点在南阳牛群体中的拷贝数变异情况,并与初生重、体重等重要经济性状进行关联分析;如果检测MAPK10基因候选位点的拷贝数变异类型为正常型,则待测牛的初生重、18月龄体高和24月龄体重和日增重更优异;如果拷贝数变异类型为缺失型或插入型,则待测个体表型较差。研究该基因CNV并将其与南阳牛重要生长性状关联分析至关重要,可以为我国南阳牛分子育种提供理论依据,便于中国南阳牛生长性状的标记辅助选择,快速建立遗传资源优良的南阳牛种群。
与现有技术相比,本发明有以下优点:
(1)本发明提供的南阳牛MAPK10基因拷贝数变异检测方法,不受年龄的限制,可用于母牛的早期选育,甚至在刚出生时就可进行选择。
(2)检测MAPK10基因拷贝数变异的方法准确可靠、操作简便。
(3)MAPK10基因拷贝数变异位点的检出,为南阳牛的分子标记辅助选择提供科学依据。
附图说明
图1为本发明中进行QPCR绘制的扩增曲线。
图2是本发明中进行QPCR绘制的溶解曲线。
具体实施方式
本发明利用QPCR对南阳牛MAPK10基因的拷贝数变异进行检测,下面结合附图和实施例对本发明做详细说明,所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明所涉及的一种基于QPCR技术检测的CNV标记,是指牛MAPK10基因候选区域(Chr 6:102708523-102710298)的拷贝数变异。具体地,所述的CNV标记位于牛MAPK10基因(GenBank Accession No.AC_000163)所示序列的610515bp-612290bp区域内,根据log22-ΔΔCt将结果分为三类:Log22-ΔΔCt>0.5为插入型;Log22-ΔΔCt<-0.5为缺失型,Log22-ΔΔCt≤|±0.5|为正常型。
1、南阳牛样本采集
本发明以中国地方南阳牛品种作为检测对象,从河南省南阳牛良种繁育中心采集了79头生长数据资料完善的南阳牛的血液样本。
2、基因组DNA的分离、提取、纯化
参考文献Sambrock et al(2002)方法。
3、目标基因及参考基因扩增
以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛MAPK10基因(目的基因)序列(GenBank Accession No.AC_000163)为参考序列,利用Primer 5.0设计QPCR引物(引物对P1)对检测MAPK10基因拷贝数变异,同时,以NCBI所公布的牛BTF3基因序列(AC_000177.1)为参考序列,采用相同的方法设计扩增参考基因(BTF3基因)中一段166bp的序列的QPCR引物(引物对P2)。引物对序列信息如表1所示。
表1实时荧光定量PCR的引物信息
注明:F表示上游引物,R表示下游引物。
通过绘制扩增曲线和溶解峰来确定引物是否适用于QPCR分析。扩增曲线平滑,表明QPCR试剂质量好且扩增体系和条件合适(图1);绘制的溶解曲线,各样品曲线吻合在一起,且曲线走势平滑,峰高且尖,无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰,表明引物质量好(图2)。
其中,进行QPCR所用的扩增体系以20μL计为:50ng/μL模板DNA 1μL,10pM的上、下游引物各1μL,2×SYBR Green QPCR Mix(TAKAR,Japan)10μL,去离子水7μL。
PCR扩增的反应程序为:
(1)预变性:95℃30s;
(2)扩增反应:95℃变性10s,60℃退火30s,39个循环;
(3)绘制溶解曲线:95℃10s,从65℃到95℃,+0.5℃5s。
4、拷贝数变异的推断
每个样品分别用目标序列和参考序列的引物(引物对P1和P2)进行扩增,并且每对引物3个重复。根据2-ΔΔCt方法进行拷贝数的分析。其中ΔΔCt=(CT目的基因-CT参考基因)实验组-(CT目的基因-CT参考基因)对照组。实验组即为待检测有无CNVs的样本,对照组即为已知无拷贝数变异的样本。2-ΔΔCt表示的是实验组目标序列的拷贝数相对与对照组的倍数。然后将基因的表达丰度进行对数转化(以2为底2-ΔΔCt的对数)使之符合正态分布,进行方差齐性检验后,统计检验各组间的差异。
当目标序列为正常型序列时,根据Log22-ΔΔCt计算出归一化值0左右(Log22-ΔΔCt≤|±0.5|)。当目标序列为缺失型序列时,Log22-ΔΔCt计算出归一化值Log22-ΔΔCt<-0.5。当目标序列为插入型序列时,Log22-ΔΔCt计算出归一化值Log22-ΔΔCt>0.5。
5.南阳牛MAPK10基因CNV位点与生长性状的关联分析
表2MAPK10基因CNV与南阳牛品种生长性状的关联分析
生产数据:各发育阶段(6月龄、12月龄、18月龄、24月龄)体长、体高、体重、胸围、日增重及初生重。
关联分析模型:先对数据进行描述分析,确定是否存在离群值,再利用最小二乘分析对数据校正;根据数据特征,应用SPSS 19软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型:
Yijk=μ+Ai+CNVj+eijk,
其中:Yijk为性状观察值,μ为总体均值,Ai为第i头个体的年龄,CNVj为第j个拷贝数变异类型的固定效应,eijk为随机误差。各组数据间的差异采用LSD多重比较进行检验,试验结果以Mean±SE形式表示。
关联分析结果表明(见表2):南阳牛MAPK10基因CNV位点可显著影响初生重、18月龄的体高和24月龄的体重和日增重。并且,优势拷贝数变异类型均为正常型,说明MAPK10基因该CNV位点可以作为一个提高南阳牛生长性状的候选分子遗传标记。
6.上述CNV标记在南阳牛选育中的应用
获得的CNV可作为候选分子遗传标记,寻找与其相关或紧密连锁的影响牛生长性状的数量性状基因座,以对南阳牛进行分子标记辅助选择,从而加快南阳牛品种改良的选育进程。
Claims (4)
1.一种检测南阳牛MAPK10基因CNV标记的方法,其特征在于:包括以下步骤:以南阳牛基因组DNA为模板,以引物对P1以及引物对P2为引物,分别通过QPCR扩增MAPK10基因的CNV区域以及作为对照的BTF3基因的部分片段,然后根据定量结果鉴定南阳牛MAPK10基因的拷贝数变异;
所述的MAPK10基因的CNV区域位于MAPK10基因参考基因组序列AC_000163的610515bp-612290bp;
南阳牛MAPK10基因CNV位点可显著影响初生重、18月龄的体高和24月龄的体重和日增重,并且,优势拷贝数变异类型均为正常型;
所述的拷贝数变异是根据log2 2-ΔΔCt将定量结果分为三类:插入型,Log22-ΔΔCt>0.5;缺失型,Log2 2-ΔΔCt<-0.5;正常型,Log2 2-ΔΔCt≤|±0.5|;
所述的引物对P1为:
上游引物F1:5’-CTGTGCTTAGAAATCTGGGAGT-3’
下游引物R1:5’-GAGGGAAATGGGAGGGAG-3’;
所述的引物对P2为:
上游引物F2:5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’
下游引物R2:5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。
2.如权利要求1所述一种检测南阳牛MAPK10基因CNV标记的方法,其特征在于:所述的QPCR所用的扩增体系包括:50ng/μL模板DNA 1μL、10pM的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各1μL以及2×SYBR Green QPCR Mix 10μL。
3.如权利要求1所述一种检测南阳牛MAPK10基因CNV标记的方法,其特征在于:所述的QPCR所用的反应程序为:(1)预变性:95℃,30s;(2)扩增反应:95℃变性10s,60℃退火30s,39个循环。
4.如权利要求1所述一种检测南阳牛MAPK10基因CNV标记的方法,其特征在于:基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为208bp,基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为166bp。
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