CN114657267A - 一种牦牛micall2基因cnv标记的检测方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种牦牛MICALL2基因CNV标记的检测方法及其应用。本发明提供了一种与牦牛生长性状相关的CNV标记：牦牛MICALL2基因候选区域Chr 29：8990623‑9009740的拷贝数变异；并提供了检测CNV标记的方法：以牦牛的基因组DNA为模板，以引物对P1和P2分别通过QPCR扩增MICALL2基因的CNV区域以及内参基因，定量牦牛MICALL2基因的拷贝数变异，所述方法准确可靠、操作简便；最后本发明可在DNA水平上检测与牦牛生产性状密切相关的CNV标记，用于牦牛的早期选育。

Description

一种牦牛MICALL2基因CNV标记的检测方法与应用

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种牦牛MICALL2基因CNV标记的检测方法及其应用。

背景技术

分子育种是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

拷贝数变异(Copy Number Variations，CNVs)，作为一种新发现的基因组亚显微水平结构变异类型，是指基因组DNA中较大片段的缺失或重复现象，涉及的片段大小在50bp到数Mb之间，包括拷贝数增加(Copy number gain)和拷贝数减少(Copy number loss)。

CNV常用的检测方法主要分为在全基因组范围内检测未知CNV和用于定点检测或验证已知CNV两类。基因组未知CNV常用的检测方法有芯片法和测序法，但是，这两种方法受检测平台的局限，而且价格昂贵；对于已确定的CNV的检测，通常是采用基于PCR技术和杂交技术的一些方法。其中，实时荧光定量PCR(QPCR)最为常用。QPCR通过对目的基因(具有拷贝数变异)及参考基因(无拷贝数变异)进行相对定量，根据2^-ΔΔCt方法统计检测样本候选基因的拷贝数。该方法操作简单，普适度高，速度快，受认同程度高。

MICAL(The molecules interacting with CasL)基因家族参与动物体内多种生理活动，包括MICAL蛋白和MICAL样蛋白。该基因家族是一种直接的特异肌动蛋白调节因子。MICALL2是MICAL家族的一员，它由于能够结合Rab13因此也被称为Rab13效应蛋白，该蛋白除了能间接结合肌动蛋白之外，还可以结合f-肌动蛋白，促进其稳定性，此外MICALL2还能调节神经突触的生长。

本发明意外发现，所述MICALL2基因位于CNV区域，因此提供了一种与牦牛生长性状相关的CNV标记，并提供了一种方便、准确、大样本量的检测牦牛MICALL2-CNV的检测方法，为牦牛的生长性状的早期选育提供了基础。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种牦牛MICALL2基因CNV标记的方法及其应用，尤其涉及一种基于QPCR技术检测牦牛MICALL2基因CNV标记的方法及其应用。具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种与牦牛生长性状相关的CNV标记，所述CNV标记为牦牛MICALL2基因候选区域Chr 29：8990623-9009740的拷贝数变异。

优选地，根据2^-ΔΔCt法定量结果，将所述拷贝数变异分为三类：2^-ΔΔCt＞2时，为插入型；2^-ΔΔCt<2时，为缺失型；2^-ΔΔCt＝2为正常型；所述正常型和缺失型的牦牛生长性状优于插入型。

第二方面，本发明提供了检测上述第一方面所述牦牛生长性状相关的CNV标记的试剂在检测牦牛生长性状或在牦牛早期育种中的应用。

优选地，根据2^-ΔΔCt法定量结果，将所述拷贝数变异分为三类：2^-ΔΔCt＞2时，为插入型；2^-ΔΔCt<2时，为缺失型；2^-ΔΔCt＝2为正常型；所述正常型和缺失型的牦牛生长性状优于插入型。

优选地，所述试剂包括目标基因引物对P1和参照基因引物对P2；

所述目标基因引物对P1为：

上游引物F1：5’-CCGTCGTCTAATGCCAGTGA-3’；

下游引物R1：5’-CATCTTTCCGCTGGACGGTA-3’；

所述参照基因引物对P2为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’；

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。

第三方面，本发明提供了一种检测上述第一方面所述牦牛生长性状相关的CNV标记的试剂在牦牛分子标记辅助选择育种中的应用。

优选地，所述试剂包括目标基因引物对P1和参照基因引物对P2；

所述目标基因引物对P1为：

上游引物F1：5’-CCGTCGTCTAATGCCAGTGA-3’；

下游引物R1：5’-CATCTTTCCGCTGGACGGTA-3’；

所述参照基因引物对P2为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’；

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。

第四方面，本发明提供了一种用于检测与牦牛生长性状相关的CNV标记的引物对，所述引物对包括目标基因引物对P1和参照基因引物对P2；

所述目标基因引物对P1为：

上游引物F1：5’-CCGTCGTCTAATGCCAGTGA-3’；

下游引物R1：5’-CATCTTTCCGCTGGACGGTA-3’；

所述参照基因引物对P2为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’；

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。

第五方面，本发明提供了一种用于QPCR检测上述第一方面所述CNV标记的试剂盒，所述试剂盒含有上述第四方面所述的引物对。

优选地，所述试剂盒还包括2×SYBR Green qPCR Mix、去离子水、对照样本中的一种或几种。

第七方面，本发明提供了一种与牦牛生长性状相关的CNV标记的检测方法，所述方法包括以下步骤：

以牦牛的基因组DNA为模板，通过QPCR分别利用权利要求5所述的引物对扩增牦牛MICALL2基因的CNV区域和参照基因BTF；

根据2^-ΔΔCt法定量结果，将所述拷贝数变异分为三类：2^-ΔΔCt＞2时，为插入型；2^-ΔΔCt<2时，为缺失型；2^-ΔΔCt＝2为正常型；所述正常型和缺失型的牦牛生长性状优于插入型。

优选地，所述QPCR扩增体系包括：50ng/μL模板DNA1μL，0.4pM的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.4μL，SYBR Premix Ex Taq II 10μL以及ddH₂O 8.2μL。

优选地，所述QPCR所用的反应程序为：

(1)预变性：90℃，30s；

(2)扩增反应：95℃，5s，之后60℃，30s，45个循环；

(3)绘制熔解曲线：95℃，5s，之后65℃，60s。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：

本发明提供了一种与牦牛生长性状相关的CNV标记，所述CNV标记为牦牛MICALL2基因候选区域Chr 29：8990623-9009740的拷贝数变异；

本发明提供了检测CNV标记的方法，以牦牛的血液全基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR方法分别扩增牦牛MICALL2基因CNV区域并将BTF基因作为参照，根据2^-ΔΔCt法可以将牦牛结果分为插入型、缺失型和正常型，鉴定牦牛MICALL2基因的拷贝数变异；所述拷贝数变异与牦牛生长性状相关，其中正常型和缺失型牦牛具有更好的生长性能；本发明在DNA水平上检测与牦牛生产性状密切相关的CNV标记，可作为牦牛生长性状的标记辅助选择的重要候选分子标记；

本发明以牦牛MICALL2基因的CNV为候选位点，通过实时荧光定量PCR技术检测该位点在牦牛群体中的拷贝数变异情况，并与30月龄体重、体高等重要经济性状进行关联分析；如果检测MICALL2基因候选位点的拷贝数变异类型为正常型和缺失型，则正常型和缺失型个体具有更好生长性能；研究该基因CNV并将其与牦牛重要生长性状关联分析至关重要，可以为我国牦牛分子育种提供理论依据，便于牦牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的牦牛种群。

本发明提供的牦牛基因的拷贝数变异检测方法，可用于牦牛的早期选育；检测MICALL2基因拷贝数变异的方法准确可靠、操作简便；MICALL2基因拷贝数变异位点的检出，为牦牛的分子标记辅助选择提供科学依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1本发明实施例提供的检测阿什旦牦牛MICALL2基因CNV标记的方法流程图；

图2本发明实施例提供的检测阿什旦牦牛MICALL2基因CNV标记的QPCR试验的扩增曲线示意图；

图3本发明实施例提供的检测阿什旦牦牛MICALL2基因CNV标记的QPCR试验的溶解峰示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明利用QPCR对阿什旦牦牛MICALL2基因的拷贝数变异进行检测，具体流程如图1所示。

本发明所涉及的一种基于QPCR技术检测的CNV标记(位于阿什旦牦牛MICALL2基因候选区域Chr 29：8990623-9009740)。根据2^-ΔΔCt法将结果分为三类：2^-ΔΔCt＞2为插入型；2^-ΔΔCt<2为缺失型；2^-ΔΔCt＝2为正常型。

实施例1检测阿什旦牦牛HSF1基因CNV标记

1.检测方法

(1)阿什旦牦牛样本采集

本发明以阿什旦牦牛品种作为检测对象，从青海省大通种牛场采集了315头生长数据资料完善的阿什旦牦牛的血液样本。

(2)基因组DNA的分离、提取、纯化

使用Easy Pure Blood Genomic DNA kit试剂盒从阿什旦牦牛血液样本中提取基因组DNA。采用1.2％琼脂糖凝胶电泳和Thermo Scientific Nano Drop 2000c检测DNA的质量和浓度。

(3)目标基因及参考基因扩增

以NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牦牛MICALL2基因(目的基因)序列为参考序列，利用primer-BLAST工具设计QPCR引物对(引物对P1)检测MICALL2基因拷贝数变异，同时，以BTF为参考基因，采用相同的方法设计扩增参考基因(BTF基因)。引物对序列信息如表1所示。

表1实时荧光定量PCR的引物信息

注：F表示上游引物，R表示下游引物。

通过绘制扩增曲线和溶解峰来确定引物是否适用于QPCR分析。扩增曲线平滑，表明QPCR试剂质量好且扩增体系和条件合适(见图2)；绘制的熔解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰，表明引物质量好(见图3)。

其中，进行QPCR所用的扩增体系以20μL计为：50ng/μL模板DNA1μL，0.4pM的上、下游引物各0.4μL、SYBR Premix Ex Taq II 10μL，ddH₂O 8.2μL。

PCR扩增的反应程序为

预变性：95℃，30s；

扩增反应：95℃，5s，之后60℃30s，45个循环；

绘制熔解曲线：95℃，5s，之后65℃，60s。

(4)拷贝数变异的推断

每个样品分别用目标序列和参考序列的引物(引物对P1和P2)进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2^-ΔΔCt方法进行拷贝数的分析。其中ΔΔCt＝(CT_目的基因-CT_参考基因)_实验组-(CT_目的基因-CT_参考基因)_对照组。实验组即为待检测有无CNVs的样本，对照组即为已知无拷贝数变异的样本。2^-ΔΔCt表示的是实验组目标序列的拷贝数相对于对照组的倍数，进行方差齐性检验后，统计检验各组间的差异。

当目标序列为正常型序列时，根据2^-ΔΔCt计算出归一化值为2左右(2^-ΔΔCt＝2)；当目标序列为缺失型序列时，2^-ΔΔCt计算出归一化值小于2(2^-ΔΔCt＜2)；当目标序列为插入型序列时，2^-ΔΔCt计算出归一化值大于2(2^-ΔΔCt＞2)。

(5)阿什旦牦牛HSF1基因CNV位点与30月龄生长性状的关联分析

生长性状数据：30月龄体重、鬐甲高、体长、胸围。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS 19软件分析各基因型间的生产性状效应。

在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：Y_ijk＝μ+CNV_j+e_ijk；其中，Y_ijk为性状观察值，μ为总体均值，CNV_j为第j个拷贝数变异类型的固定效应，e_ijk为随机误差，各组数据间的差异采用LSD多重比较进行检验，试验结果以均值±SD形式表示。

关联分析结果如表2所示，表明在阿什旦牦牛中，MICALL2基因CNV拷贝数插入显著不利影响牦牛生长性状，具体地，正常型能够显著提高30月龄牦牛的胸围性状，缺失型能够显著提高30月龄牦牛体长性状。总体来说，缺失型和正常型拷贝数变异对于牦牛的生长性状具有有利影响，且该影响通常是在青年牦牛而不是幼年牦牛上。表明MICALL2的CNV拷贝数变异与阿什旦牦牛的生长发育相关。

表2 HSF1基因CNV与阿什旦牦牛30月龄生长性状的关联分析

注：不同字母表示类型间差异显著(p<0.05或p<0.01)

(6)上述CNV标记在阿什旦牦牛选育中的应用

获得的CNV可作为候选分子遗传标记，寻找与其相关或紧密连锁的影响牦牛生长性状的数量性状基因座，以对阿什旦牦牛进行分子标记辅助选择，从而加快阿什旦牦牛品种改良的选育进程。

综上所述，本发明对阿什旦牦牛的MICALL2基因的拷贝数进行检测，并对该基因的拷贝数与阿什旦牦牛生长性状进行关联分析，通过SPSS 19.0等软件的统计分析，发现阿什旦牦牛的MICALL2基因的拷贝数显著影响阿什旦牦牛生长性状，即阿什旦牦牛的MICALL2基因的拷贝数与阿什旦牦牛生长性状显著相关，具有缺失型和正常型的个体生长性状最优。该拷贝数变异的检出为阿什旦牦牛生长性状的分子辅助选育提供了科学依据。本发明提供的CNV标记为提高阿什旦牦牛选育提供了理论基础，可用于阿什旦牦牛的早期选育，可加快阿什旦牦牛的种质资源改良。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种与牦牛生长性状相关的CNV标记，其特征在于，所述CNV标记为牦牛MICALL2基因候选区域Chr 29：8990623-9009740的拷贝数变异。

2.检测权利要求1所述牦牛生长性状相关的CNV标记的试剂在检测牦牛生长性状中的应用。

3.检测权利要求1所述牦牛生长性状相关的CNV标记的试剂在牦牛早期育种中的应用。

4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，根据2^-ΔΔCt法定量结果，将所述拷贝数变异分为三类：2^-ΔΔCt＞2时，为插入型；2^-ΔΔCt<2时，为缺失型；2^-ΔΔCt＝2为正常型；所述正常型和缺失型的牦牛生长性状优于插入型。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂包括目标基因引物对P1和参照基因引物对P2；

所述目标基因引物对P1为：

上游引物F1：5’-CCGTCGTCTAATGCCAGTGA-3’；

下游引物R1：5’-CATCTTTCCGCTGGACGGTA-3’；

所述参照基因引物对P2为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’；

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。

6.一种用于检测与牦牛生长性状相关的CNV标记的引物对，其特征在于，所述引物对包括目标基因引物对P1和参照基因引物对P2；

所述目标基因引物对P1为：

上游引物F1：5’-CCGTCGTCTAATGCCAGTGA-3’；

下游引物R1：5’-CATCTTTCCGCTGGACGGTA-3’；

所述参照基因引物对P2为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’；

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。

7.用于QPCR检测权利要求1所述CNV标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求5所述的引物对。

8.一种与牦牛生长性状相关的CNV标记的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

以牦牛的基因组DNA为模板，通过QPCR分别利用权利要求6所述的引物对扩增牦牛MICALL2基因的CNV区域和参照基因BTF；

根据2^-ΔΔCt法定量结果，将所述拷贝数变异分为三类：2^-ΔΔCt＞2时，为插入型；2^-ΔΔCt<2时，为缺失型；2^-ΔΔCt＝2为正常型；所述正常型和缺失型的牦牛生长性状优于插入型。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述QPCR扩增体系包括：50ng/μL模板DNA1μL，0.4pM的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.4μL，SYBR Premix Ex TaqII 10μL以及ddH₂O 8.2μL。

10.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述QPCR所用的反应程序为：

(1)预变性：90℃，30s；

(2)扩增反应：95℃，5s，之后60℃，30s，45个循环；

(3)绘制熔解曲线：95℃，5s，之后65℃，60s。

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