CN111139303B - 一种山羊cadm2基因cnv标记辅助检测生长性状的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种山羊CADM2基因CNV标记辅助检测生长性状的方法及其应用：基于实时荧光定量PCR技术，以山羊的基因组DNA为模板，利用一对特异性PCR引物扩增山羊CADM2基因的拷贝数变异区域部分片段，并应用另外一对特异性PCR引物扩增山羊内参基因MC1R部分片段作为对照，最后利用‑ΔΔCt判定个体的拷贝数变异类型。基于山羊CADM2基因拷贝数变异与生长性状之间的关联，本发明提供的方法可用于快速建立山羊遗传资源优势种群，有利于加快山羊分子标记辅助选择育种工作，该方法简单、快速，便于推广应用。

Description

一种山羊CADM2基因CNV标记辅助检测生长性状的方法及其 应用

技术领域

本发明属于分子遗传育种领域，具体涉及一种检测山羊CADM2基因拷贝数变异的方法，该方法利用基因组DNA进行实时定量PCR，以MC1R基因为参照，根据2^-ΔΔCt值确定个体的拷贝数类型。

背景技术

基因组DNA携带生物体的所有遗传信息，研究证明，遗传信息的改变是相关重要经济性状变异的主要来源，随着分子育种学技术、分子生物学及高通量测序技术的日渐成熟，人们在筛选及鉴定经济性状相关基因方面认识愈加深刻，然而，如何精确而有效的利用分子育种学技术发掘这些重要表型相关位点是一项值得突破的重要任务。

目前分子育种上，主要的研究方向集中在标记辅助选择(molecular mark-assistselection,MAS)上，该技术是通过DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

拷贝数变异(Copy Number Variations，CNVs)指大小从1kb到数Mb的DNA片段拷贝数突变。CNVs是由基因重排导致的，它是基因组变异的重要组成部分，可导致由基因剂量效应、基因断裂、基因融合和位置效应等引起的表型多态性。研究表明，拷贝数变异可能影响基因网络并调节相关基因的表达，促成个体表型，因此，检测与山羊体尺相关基因的CNVs标记有助于加速山羊遗传选育的进展。

在检测已知CNV的各种方法中，实时定量PCR(quantitive Real-Time PCR,qPCR)是使用比较广泛的一种技术。该方法操作简单、敏感性高、速度快，通过对目的基因(有拷贝数变异)和内参基因(无拷贝数变异)进行相对定量，然后利用-ΔΔCt判定个体的拷贝数变异类型。

CADM2(Cell Adhesion Molecule 2)属于免疫蛋白超家族的细胞粘附分子(CADMs)的一类，具有1个或多个IgV样或C样结构域。近年来国内外对CADM2基因的研究较少，CADM2的功能及作用机制的认识都还处在初步阶段。关于CADM2基因的功能研究表明，其在人和小鼠的神经分化等方面具有重要调控作用。目前为止，尚未见到关于利用山羊CADM2基因拷贝数变异辅助检测山羊生长性状的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种山羊CADM2基因CNV标记辅助检测生长性状的方法及其应用，从而加速山羊良种选育。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测山羊CADM2基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：以山羊个体基因组DNA为模板，以引物对P1和引物对P2为引物，分别通过实时定量PCR扩增CADM2基因的拷贝数变异区域及作为内参的MC1R基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定山羊个体CADM2基因的拷贝数变异类型。

优选的，所述的CADM2基因的拷贝数变异区域位于山羊CADM2基因候选区域Chr1:31812401-31814400(参考序列为NC_030808.1)。

优选的，所述的拷贝数变异类型是根据-ΔΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型，-ΔΔCt>0.5；缺失型，-ΔΔCt<-0.5；正常型，-0.5≤-ΔΔCt≤0.5。

优选的，所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’-CCCAGATCATTGCAGGGAAAGTA-3’

下游引物R1：5’-ACTCTTTTCAACAGTGGAGCTAT-3’；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’-GGGCAGTCCCTTGACAAAGA-3’

下游引物R2：5’-ATCTCCCCAGCCTCCTCATT-3’。

优选的，所述的实时定量PCR所用的扩增体系包括：10～50ng/μL模板DNA 1μL、10μmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL以及

Premix Ex Taq ^TMII 5μL和ddH₂O 3μL。

优选的，所述的实时定量PCR所用的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共39个循环。

优选的，基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为152bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为129bp。

上述检测山羊CADM2基因拷贝数变异的方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，所述山羊(例如，贵州黑山羊、贵州白山羊、河南杂交山羊、贵州努比亚山羊)中，具有缺失型拷贝数变异类型的个体在体高、体长、胸围、体重、管围等生长性状上优于具有多拷贝型、正常型的个体。

本发明的有益效果体现在：

本发明以内参基因MC1R作为对照，采用实时定量PCR对山羊CADM2基因(CADM2基因的拷贝数变异区域)的CNV类型进行了检测，发现该CADM2基因的拷贝数变异可以作为分子标记，与现有方法相比，本发明具有以下优点：

1.本发明提供的山羊CADM2基因拷贝数变异检测方法，不受年龄和性别的限制，可用于山羊早期选育；

2.与高通量测序方法、基因芯片等方法相比，本发明快速、简单、成本低，能够准确的鉴定山羊个体的拷贝数类型；

3.本发明在一定程度上为山羊生长性状的分子标记辅助选择提供科学依据，可快速建立山羊遗传资源优势种群，从而加快育种过程。

附图说明

图1为本发明中进行qPCR(CADM2基因)绘制的扩增曲线。

图2是本发明中进行qPCR(CADM2基因)绘制的溶解曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对发明做详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。

本发明利用实时定量PCR对山羊CADM2基因的拷贝数变异进行检测并用于分子育种，包括以下步骤：

(1)利用NCBI数据库的山羊CADM2基因序列，再用Primer-BLAST网站进行引物设计，并用普通PCR检验引物；

(2)采用实时荧光定量PCR技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情况；

(3)利用SPSS 23.0软件将拷贝数变异类型与山羊生长性状进行关联分析，筛选到与山羊生长性状相关的CNV标记；

(4)根据拷贝数变异类型挑选获得生长性状优异的山羊种群，进行选育。

1.山羊样本采集

本发明以贵州白山羊、贵州黑山羊、贵州努比亚山羊和河南杂交山羊为检测对象，采集和使用了443头山羊个体的血液样本(见表1)。并记录它们的生长性状数据，如体高、体重、体长、胸围、体斜长及管围等，以用于后续的关联分析。

表1.样品信息

2.血样基因组DNA的提取

(1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取500μL血液于1.5mL离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(PBS)混匀，温和摇动，4℃、12000r/min离心5min，弃去上清液；重复本步骤至上清液透明、沉淀呈透明色。

(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。

(3)加蛋白酶K至5μL(20mg/mL)，并混匀，55℃水浴中消化过夜(16h左右)至絮状沉淀不见，尚未澄清的，可补加10μL蛋白酶K混匀后继续消化直至澄清。

(4)将反应液冷却至室温，加入500μL Tris饱和酚，温和摇动15min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管；重复本步骤1次。

(5)加入氯仿500mL，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心15min，将上层水相转入另一灭菌的1.5mL离心管。

(6)加入氯仿、异戊醇混合液(24:1)500mL，充分混合20min，4℃、12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

(7)加入0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出。

(8)4℃、12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

(9)4℃、12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净。

(10)干燥后的DNA溶液中加入80～100μL的TE溶解，4℃保存直至DNA完全溶解，利用紫外分光光度仪泳检测其质量，-80℃保存。

3.目的基因及内参基因特异性引物设计

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的山羊CADM2基因(NC_030808.1)为参考序列，查找重测序中筛选出来的CADM2基因(目的基因)拷贝数变异区域的序列(Chr1:31812401-31814400)，利用Primer-BLAST网站设计扩增变异区域内靠近中间位置的一段152bp序列的引物(引物对P1)，同时，以NCBI所公布的山羊MC1R基因序列(FM212940.1)为参考序列，采用相同的方法设计扩增内参基因(MC1R基因)中一段129bp序列的引物(引物对P2)。引物对序列信息如表2所示(引物合成时间2018年8月)。

表2.实时荧光定量PCR的引物信息

4.实时定量PCR

qPCR反应体系如表3所示。

表3.qPCR的反应体系

PCR反应程序为：

(1)95℃预变性10min，然后按照(2)进行扩增反应；

(2)95℃变性15s，60℃退火1min，共39个循环。

通过绘制扩增曲线(图1)和熔解峰确定引物适用于qPCR分析。根据绘制的熔解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰(图2)。

5.个体CNV类型判定

实验结果根据2^-△△Ct方法进行计算，具体的计算方法为：ΔΔCt＝ΔCt_(实验组)-ΔCt_(参照组)，ΔCt_(实验组)＝Ct_{(实验组目的基因)}-Ct_{(实验组内参基因)}，ΔCt_(参照组)＝Ct_{(参照组目的基因)}-Ct_{(参照组内参基因)}

公式中，实验组即为待检测有无拷贝数变异的个体样本。参照组即为已知无拷贝数变异的个体样本，可以采用重测序试验中所选择的参照组各品种山羊个体。Ct即Cyclethreshold，为PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

根据公式计算得出每个待测个体的-ΔΔCt，并根据CNV类型的判定标准：-ΔΔCt>0.5为Gain类型(多拷贝型)；-0.5≤-ΔΔCt≤0.5为Normal类型(正常型)，-ΔΔCt<-0.5为Loss类型(缺失型)，判定检测的山羊个体的拷贝数类型。

6.CADM2基因变异位点与生长性状的关联分析

生长性状：体高、体长、胸围、管围、体重、体斜长

关联分析模型：利用SPSS(23.0)进行关联性分析。在数据处理中，根据影响体尺性状指标的因素的不同，考虑到环境效应、年龄、品种、遗传效应及其互作效应，采用固定模型进行分析，同时根据实际情况进行简化。完整的模型如下：

Y_ijk＝μ+A+B+G_j+E_ijk

其中，Y_ijk为个体表型记录；μ为群体均值；G_j为各位点的拷贝数类型；E_ijk为随机误差。

统计检测群体中各种类型(Gain、Normal和Loss)的个体数，利用SPSS23.0进行关联分析。结果如表4、表5、表6及表7所示。

表4.贵州黑山羊CADM2基因拷贝数变异与生长性状之间的关联分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)。^*P<0.05。括号里面的数值表示拷贝数变异类型的频率。

表5.贵州白山羊CADM2基因拷贝数变异与生长性状之间的关联分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)。括号里面的数值表示拷贝数变异类型的频率。

表6.河南杂交山羊CADM2基因拷贝数变异与生长性状之间的关联分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)。括号里面的数值表示拷贝数变异类型的频率。

表7.贵州努比亚山羊CADM2基因拷贝数变异与生长性状之间的关联分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)。括号里面的数值表示拷贝数变异类型的频率。

关联分析结果表明(见表4-表7)，山羊CADM2基因的拷贝数变异位点与山羊体高、体长这两个生长性状有显著的关联性，例如，在贵州黑山羊中具有缺失型拷贝数变异类型的个体在生长性状上较优，而在贵州白山羊中具有缺失型拷贝数变异的个体在生长性状上较优。另外，在体重、胸围、管围上，具有缺失型拷贝数变异类型的个体也展现了更高的性状优势。因此，山羊CADM2基因的拷贝数变异位点(Chr1:31812401-31814400)的缺失型可以作为一个有效提高山羊生长性状的候选分子遗传标记(CNV标记)。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种山羊CADM2基因CNV标记辅助检测生长性状的方法及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

cccagatcat tgcagggaaa gta 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

actcttttca acagtggagc tat 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gggcagtccc ttgacaaaga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atctccccag cctcctcatt 20

Claims (4)

1.检测山羊CADM2基因拷贝数变异的方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：所述检测山羊CADM2基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：

以山羊基因组DNA为模板，以引物对P1及引物对P2为引物，分别通过实时定量PCR扩增CADM2基因的拷贝数变异区域及作为内参的MC1R基因的部分片段，然后根据定量结果确定山羊CADM2基因的拷贝数变异类型；

所述的CADM2基因的拷贝数变异区域位于山羊CADM2基因候选区域Chr1: 31812401-31814400；

所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’- CCCAGATCATTGCAGGGAAAGTA-3’

下游引物R1：5’- ACTCTTTTCAACAGTGGAGCTAT-3’ ；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’- GGGCAGTCCCTTGACAAAGA-3’

下游引物R2：5’- ATCTCCCCAGCCTCCTCATT -3’ ；

所述的拷贝数变异类型是根据-ΔΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型，-ΔΔCt >0.5；缺失型，-ΔΔCt <-0.5；正常型，-0.5≤-ΔΔCt ≤0.5；

所述山羊中，具有缺失型拷贝数变异类型的个体在生长性状体长、体高上较优；

所述山羊为贵州黑山羊。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的实时定量PCR的扩增体系包括：10~50ng/μL模板DNA 1 μL以及10 μmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5 μL。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的实时定量PCR的反应程序为：95℃预变性10 min；95℃变性15 s，60℃退火1 min，共39个循环。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为152bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为129 bp。

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