JP5993029B2 - 遺伝子変異の検出方法 - Google Patents
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Description
1)試料からシークエンシング対象となる配列を獲得するステップ。例えば、前記シークエンシング対象となる配列断片の長さが25-100ntとすることができ、前記シークエンシング対象となる配列断片の数が少なくとも百万本とすることができる。
2)前記シークエンシング対象となる配列と参考ゲノム配列とを比較するステップ。
3)前記参考ゲノム配列をウィンドウに分割して、各ウィンドウまでに対比されたシークエンシング対象となる配列の数を統計し、前記シークエンシング対象となる配列の数に基づき各ウィンドウの統計量を得る。
4)1段の参考ゲノム配列に対して、その上にすべてのウィンドウの統計量が該段参考ゲノム配列上での変化に基づき、両側ウィンドウの統計量が顕著な変化を発生した位置を獲得し、これらの位置は、テスト試料の遺伝子変異部位が参考ゲノム配列上での位置である。
5)遺伝子変異部位に対してスクリーニングを行って、スクリーニングされた遺伝子変異部位を得る。
各遺伝子変異部位が前遺伝子変異部位および後遺伝子変異部位のそれぞれとの間にある2段配列に対して、前記2段配列が包含するウィンドウの統計量からなる二つの数値群れの差異を統計して、その差異の顕著性値が最大且つ予め設定された閾値より大きい遺伝子変異部位を除いて、すべての遺伝子変異部位の差異顕著性値が予め設定された閾値より小さくなるまで、前記工程を繰り返すようにする。
a)対照試料でテスト試料を代わって、本発明の方法により遺伝子変異部位を得る。
b)各遺伝子変異部位が前遺伝子変異部位及び後遺伝子変異部位のそれぞれとの間にある2段配列に対して、それらが包含するウィンドウの統計量からなる二つの数値群れの差異を統計して、前記差異が最も顕著ではない遺伝子変異部位を除く。
c)残りの突破点候補の数は期待値のNcと等しくなるまで上記ステップb)を重複する、即ちNc=Lc/T、Lcは、ゲノム配列の長さであり、理論極限精度Tは、理論上に検出できる断片の大きさである。ウィンドウの大きさの平均値がWであり、ウィンドウのスライドの長さがSであり、ランレングス検査の各グループウィンドウの数がNである場合に、理論極限精度T=W+S*Nである。残りのすべての突破点候補の顕著性値において、最小値が前記顕著性閾値である。
1)本発明の方法により、1段の参考ゲノム配列上での遺伝子変異部位を得る。
2)前記遺伝子変異部位間の断片に対して信頼確定を行う。
i)ウィンドウの統計量の分布モデルに通じて、統計量の確率の分布を計算し、そして閾値を設定する。
ii)スクリーニングされた遺伝子変異部位間の断片におけるウィンドウの統計量の平均値をと前記閾値とを比較して、比較された結果により遺伝子部位間の断片が異常であるか否かを確定する。
i)ウィンドウの統計量の分布モデルに通じて、統計量の確率分布を計算し、そして第一閾値と第二閾値を設定する。
ii)スクリーニングされた遺伝子変異部位間の断片におけるウィンドウの統計量の平均値と前記第一閾値と第二閾値とを比較して、
断片のウィンドウの統計量が第一閾値より小さい場合、該断片は断片欠失であり、第二閾値より大きい場合、該断片は断片重複である。
胎児核酸を含む母体試料を獲得するステップと、
母体試料に対してシークエンシングを行うステップと
請求項1-16項が記載のいずれかの方法を用いて、遺伝子変異を検出するステップとを含む、胎児の遺伝子変異の検出方法。
(1)臨床可能性:5Mぐらいのシークエンシングデータのみを使用することにより、5MbぐらいのCNV断片を検出することができる。既に公開された方法は243Mに近いのを使用したため、本発明の方法がデータによる発生したコストと時間を大幅に減少する。
(2)拡張可能性:シークエンシングの量を増加する以外に、本発明は、対照群の数量を拡大することに通じて、精度を増大することにより、最初のDNAの量に対する圧力を軽減することができる。
(3)より安定し、より全面的であること:既に公開された文章において、自身の詳細な操作を明確に指すことがないが、本発明はデータ群れの補正、断片化条件好ましいなど各方面を設計する。
a)テスト試料と対照試料について、ゲノム参考配列上に長さがwであるウィンドウを開き、各ウィンドウのGC含有量を計算し、そして各ウィンドウ上に落ちる相対シークエンシング対象となる配列断片の数を計算する。b)上記のテスト試料の相対シークエンシング対象となる配列断片の数を対照試料の相対シークエンシング対象となる配列断片数に対して補正、且つ標準化を行う。
a)テスト試料と対照試料の相対シークエンシング対象となる配列の数を計算する:
テスト試料と対照試料について、ヒトゲノム参考配列上に長さがwであるウィンドウを開き、本発明の方法のステップ2)における各ウィンドウ上に落ちるシークエンシング対象となる配列の数ri,jを統計し、その中に添字iとjがそれぞれウィンドウ番号と試料番号を代表する、そして各ウィンドウのGC含有量GCi,jを計算し、相対シークエンシング対象となる配列の数
b)データ修正と標準化:(1)GC含有量が横軸であり、相対シークエンシング対象となる配列の数Rが縦軸である座標係において、対照試料のRi,jとGCi,jをリニアフィットして、スロープaiと切片biを得る。
(2)テスト試料の各ウィンドウについて、補正した相対シークエンシング対象となる配列の数
(3)テスト試料の各ウィンドウについて、統計量Zi,jを計算する:
。
と記する。断片の
は-1.28より小さい場合、該断片が断片欠失であり、1.28より大きい場合、該断片が断片重複である。
値の閾値の確定について、対照試料をステップa)とb)によって統計して、各ウィンドウ中のZ値が正規分布に満たすことになる。- 1.28と1.28は、それぞれ該正規分布中に累計確率が0.05と0.95の分位点である。本分野の当業者は必要により、
値の絶対値がより大きい又はより小さい値を選択して、それぞれ正規分布中に累計確率がより大きい又はより小さいと対応することができるが、- 1.28と1.28は、発明者が本発明に対して大量の実験を通じて確定した最適な閾値であり、該2つの値以外に絶対値がより大きい閾値は、検査結果の中の偽陰/偽陽性率を増加する。
TiangenDP327-02Kit操作の流れに従って、上記の8例の血漿試料(試料番号は表1を参照)のDNAを抽出し、抽出されたDNAを改正後のIllumina / Solexa標準データベース構築流れに従ってデータベースを構築し、メインバンドが200bpに集中するDNA分子の両端にシークエンシング用コネクターを加え、各試料が異なるタグ配列を加えられてから、flowcell表面に相補継手とハイブリダイゼーションをした。flowcell表面を通じて一層の一本鎖プライマーを接続しており、DNA断片が一本鎖に変わった後に、チップ表面のプライマー塩基と相互補完することを通じて一端がチップ上に「固定」される。もう一方の端は(5’又は3’」)近くの別のプライマーとランダムに補完、「固定」されて「橋(bridge)」になった。30回繰り返し増幅して、各単分子は約1000倍の増幅を得られて、モノクローナルDNAクラスターになった。その後、IlluminaHiseq2000上にダブル末端シークエンシングを通じて、長さは約50bpのDNA断片配列を得た。
本実施例において、上記の10例の血漿から得られたDNA試料に対して、Illumina / Solexa公式に発表されたClusterStationとHiseq2000(PEsequencing)明細書に従って操作を行って、各試料に約0.36Gのデータ量を獲得させてからコンピューターシークエンシングを行い、各試料が前記タグ配列により区分した。対比ソフトSOAP2(soap.genomics.org.cnから得る)を利用して、シークエンシングにより得られたDNA配列とNCBIデータベースにおけるバージョン36(hg18;NCBIBuild36)のヒトゲノム参考配列とを間違いなく対比を行って、シークエンシングするDNA配列が前記ゲノム上での位置付けを得た。
a)テスト試料に対して相対シークエンシング対象となる配列の数を計算した。唯一対比配列を参考することの長さが50bpを選択し、唯一対比配列を参考することの数を統計し、ヒトゲノム参考配列を同様な参考唯一配列の数(84万)を有するウィンドウに分割し、すべてのウィンドウの大きさの平均値が1Mbであり、隣接するウィンドウの距離がS=10kbであった。上記のステップ2における各ウィンドウ上に落ちる実際のシークエンシング対象となる配列の数ri,jを統計し、その中に添字iとjがそれぞれウィンドウ番号と試料番号を代表し、そして各ウィンドウのGC含有量GCi,jを計算し、相対シークエンシング対象となる配列の数
(1)GC含有量が横軸であり、相対シークエンシング対象となる配列の数Rが縦軸である座標係において、対照試料のRi,jとGCi,jをリニアフィットして、スロープaiと切片biを得た。
(2)テスト試料の各ウィンドウについて、補正した相対シークエンシング対象となる配列の数
(3)テスト試料の各ウィンドウについて、標準化の相対シークエンシング対象となる配列の数Zi,jを計算した:
。
(1)初期化:参考ゲノム配列上の各ウィンドウの起点位置を統計量Zの位置として記録した。参考ゲノム上での染色体の位置と対応して、Z値は変化の傾向があった。Z値の転換点(即ち、Z値が増加傾向から減少傾向へ転換する、又は減少傾向から増加傾向へ転換する臨界点)が対応する位置を見つけた。いずれかの染色体に対して、最初のウィンドウの起点から順次に距離が少なくとも100個ウィンドウの位置を選択し、これらの位置を突破点候補bk(k=1、2、…、s、sが >0の整数)(Breakpoint)と記した。
d)ウィンドウを合併した後の断片フィルタ:ウィンドウを合併した後の断片に対して更に濾過を行うために、該断片におけるZi,jの平均値を計算して、
と記した。断片の
が- 1.28より小さい又は1.28より大きい場合、該断片はコピー数多型であった。結果は表1を参照した。
待測見本と同じ性別の健康な人のDNA又は男女健康な人の混合DNAを参照DNAとして採用した。 Cy3、Cy5フルオレセインを利用して参照DNAと待測DNAに対してそれぞれマークを付けてから、プローブとハイブリダイゼーションさせた。待測DNAと参照DNA蛍光強度との比は1である場合、待測DNAと参照DNAとの量が等しいと理解でき、比は1に等しくない場合、待測DNAが欠失又は増幅を有すると表明した。異なる類型のArray CGHの解像度は、マイクロアレイ上にプローブの間隔と長さ次第であった。流れは以下の通りである:Gバンディング染色体検査後に残された細胞培養液を集めて待測見本と対照見本とのゲノムDNAを抽出した。純化が測量待ちの見本及び参照の見本に対して異なる蛍光表記を行い、その後、見本と非特異ハイブリダイゼーションを遮断したCot-1 DNAと混合、変性、プリアニーリング、マイクロアレイとハイブリダイゼーションし、最後に、マイクロアレイ標的特異性と結合していないDNAを溶離して、更にスキャンとソフトウェア分析を通じて各マイクロアレイ標的上での2種類の蛍光信号の強度比を得て、待測見本ゲノムDNAと参照見本ゲノムDNAが対応する配列又はゲノム上でのコピー数の変化を反映した。
(1)穿刺により得られた羊水を5分間遠心してから(回転速度が800〜1 000回転/分である)、接種カバー内に接種を行なった。まず上澄み液を吸出して他の検査のため保留した。遠心チューブ内に0.5ml羊水及び瀋殿された羊水細胞を残った。瀋殿された胎児の剥離細胞及び羊膜細胞を均一に混ぜて細胞懸濁液になった。3つの培養液が入っている培養瓶内に接種した。
(2)培養瓶を炭酸ガスインキュベーターに入れた。
(3)接種5〜7日後、羊水内の活力がある細胞が瓶の底に貼りつけて、成長し始また。倒立顕微鏡(inverted microscope)を用いて細胞の成長情況を観察した。既に壁に貼った場合、培養液を交換して、3〜5mlの新鮮な培養液を加入し、以後2〜3日毎に液を一回交換した。壁に貼ってある細胞は上皮細胞、繊維細胞及び羊水細胞があり、これは形態が上皮細胞と繊維細胞との間にある細胞であった。上記3種類の細胞のいずれもクローンを形成した。もし生長状態は良好であれば、接種11〜14日後、瓶の底に十数個の大作のクローンがあり、肉眼でも瓶の底に綿チップ状のクローンを見え、その細胞核が大きくて丸かった。この時に製片又は収穫(harvest)と言うのを準備することができた。収穫について一日をかかれば、新鮮な培養液を交換すべきであり、核分裂を増やした。
(4)収獲:培養してから平均14〜20日後に収穫した。培養瓶に0.04ng(毫微克)/ミリリットルのコルヒチン(Colchicine)を加入して、細胞を分裂中に停止させて、5〜15時間を培養した。倒立顕微鏡で複数の細胞核分裂を見える、その細胞核が丸く大きくて、真珠のように明るくて、相互に接続した。コルヒチンの量は、各実験室より異なることができた。
Claims (18)
- 1)テスト試料からシークエンシング対象となる配列を獲得するステップと、
2)前記シークエンシング対象となる配列と参考ゲノム配列とを対比するステップと、
3)前記参考ゲノム配列をウィンドウに分割して、各ウィンドウまでに対比されたシークエンシング対象となる配列の数を統計して、前記数に基づいて、各ウィンドウの統計量を得るステップと、
前記統計量は、ウィンドウまでに対比されたシークエンシング対象となる配列の数に対して標準化処理を行った後に得られた正規分布に適合する統計量であり、
前記標準化処理は、
(1)GC含有量が横軸であり、相対シークエンシング対象となる配列の数Rが縦軸である座標系において、対照試料のRi,jとGCi,jをリニアフィットして、スロープaiと切片biを得るステップと、
(2)テスト試料の各ウィンドウについて、補正した相対シークエンシング対象となる配列の数
(3)テスト試料の各ウィンドウについて、統計量Zi,jを計算する:
4)1段の参考ゲノム配列に対して、その上のすべてのウィンドウの統計量の該段参考ゲノム配列上での変化に基づいて、両側ウィンドウの統計量の顕著な変化が発生する位置を獲得し、これらの位置はテスト試料の遺伝子変異部位の参考ゲノム配列上での位置であるとするステップと、
を含むことを特徴とする遺伝子変異の検出方法。 - 5)遺伝子変異部位に対してスクリーニングを行って、スクリーニングされた後の遺伝子変異部位を獲得するステップを更に含む請求項1に記載の遺伝子変異の検出方法。
- 前記シークエンシング対象となる配列断片の長さは、25−100ntであり、好ましいのは35−100ntである請求項1又は2に記載の遺伝子変異の検出方法。
- 前記シークエンシング対象となる配列断片の数は、少なくとも1百万条である請求項1又は2に記載の遺伝子変異の検出方法。
- 前記ウィンドウは、同様な参照ユニークリード数(reference unique reads)を有する請求項1又は2に記載の遺伝子変異の検出方法。
- 前記ウィンドウの間に重なりがある又は重なりがない請求項1又は2に記載の遺伝子変異の検出方法。
- 前記標準化は、すべてのウィンドウまでに対比された平均シークエンシング対象となる配列の数である請求項1に記載の遺伝子変異の検出方法。
- 前記遺伝子変異部位は、前記統計量が増加から減少に変更する転換点と次の同様な転換点との間の中間部位であり、且つ2つの遺伝子変異部位の間に、少なくとも50、好ましいのは70以上、より好ましいのは100以上、最も好ましいのは100個のウィンドウの長さを有する請求項1又は2に記載の遺伝子変異の検出方法。
- 前記ステップ5)は、
各遺伝子変異部位と前遺伝子変異部位及び後遺伝子変異部位のそれぞれとの間にある2段配列に対して、前記2段配列が包含するウィンドウの統計量からなる二つの数値群れの差異を統計して、その差異の顕著性値が最大且つ予め設定された閾値より大きくなる遺伝子変異部位を除いて、すべての遺伝子変異部位の差異顕著性値が予め設定された閾値より小さいまで、前記工程を繰り返すようにすることである請求項2に記載の遺伝子変異の検出方法。 - 前記差異の顕著性はランレングス検査によって行われ、ランレングス検査の顕著性値が最大かつ予め設定された閾値より大きくなる遺伝子変異部位を除いて、すべての遺伝子変異部位のランレングス検査の顕著性値が予め設定された閾値より小さいまで、前記工程を繰り返すこととする請求項9に記載の遺伝子変異の検出方法。
- a)対照試料でテスト試料を代わって、請求項1の方法により遺伝子変異部位を得るステップと、
b)各遺伝子変異部位と前遺伝子変異部位および後遺伝子変異部位のそれぞれとの間にある2段配列に対して、それらが包含するウィンドウの統計量からなる二つの数値群れの差異を統計して、前記差異が最も顕著ではない遺伝子変異部位を除くステップと、
c)残りの突破点候補の数は期待値のNcと等しくなるまで上記のステップb)を重複する、即ちNc=Lc/T、Lcは、ゲノム配列の長さであり、理論極限精度Tは、理論上に検出できる断片の大きさである。ウィンドウの大きさの平均値がWであり、ウィンドウのスライドの長さがSであり、ランレングス検査の各グループウィンドウの数がNである場合に、理論極限精度T=W+S * Nである。残りのすべての突破点候補の顕著性値の中に、最小値は前記顕著性の閾値であるステップと、
を通じて前記予め設定された閾値を獲得する請求項9又は10に記載の遺伝子変異の検出方法。 - 1)請求項1−9のいずれか1項に記載の方法により、1段の参考ゲノム配列上の遺伝子変異部位を得るステップと、
2)前記遺伝子変異部位間の断片に対して信頼確定を行うステップと、
を含むことを特徴とする遺伝子変異の検出方法。 - 前記ステップ2)は、
i)ウィンドウの統計量の分布モデルに通じて、統計量の確率の分布を計算し、そして閾値を設定し、
ii)スクリーニングされた遺伝子変異部位間の断片におけるウィンドウの統計量の平均値と前記閾値とを比較して、比較された結果により遺伝子部位間の断片が異常であるか否かを確定することである請求項12に記載の遺伝子変異の検出方法。 - 前記ステップ2)は、
i)ウィンドウの統計量の分布モデルに通じて、統計量の確率分布を計算し、そして第一閾値と第二閾値を設定し、
ii)スクリーニングされた遺伝子変異部位間の断片におけるウィンドウの統計量の平均値と前記第一閾値と第二閾値とを比較して、
断片におけるウィンドウの統計量が第一閾値より小さい場合、該断片は断片欠失であり、第二閾値より大きい場合、該断片は断片重複であることである請求項13に記載の遺伝子変異の検出方法。 - 累積確率が0.05である部位の統計量の値を前記第一閾値とし、及び/又は、累積確率が0.95である部位の統計量の値を前記第二閾値とする請求項14に記載の遺伝子変異の検出方法。
- コンピュータ可読媒体であって、前記コンピュータ可読媒体が一連の実行可能コードを積載し、請求項1−15のいずれかに記載の方法を執行することができることを特徴とするコンピュータ可読媒体。
- 胎児核酸を含む母体試料に対してシークエンシングを行うステップと、
請求項1−15のいずれかに記載の方法により、遺伝子変異を検出するステップと、
を含むことを特徴とする胎児の遺伝子変異の検出方法。 - 前記母体試料は、母体末梢血である請求項17に記載の遺伝子変異の検出方法。
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