CN107312850A - 一种pcr无效扩增的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PCR无效扩增的检测方法，该方法根据PCR荧光光强检测结果，通过确定第一阈值和第二阈值检测出假阳性、假阴性及波动超限产生的无效扩增。基于这种无效扩增的检测方法可以避免PCR扩增过程中产生的假阳性/假阴性及其他无效扩增对检测结果的干扰，结果更为精准。
Description
技术领域
本发明涉及体外DNA扩增检测领域，具体地说是涉及用于核酸体外扩增反应包括聚合酶链式反应(PCR)中无效扩增的检测方法。
背景技术
为了避免传统PCR的缺陷，并对PCR扩增产物或基因表达水平进行定量分析，1992年诞生了“第二代PCR”分析技术—实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR(real‐timefluorescent quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例的增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化检测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。在低拷贝靶基因分子、模板浓度差异细微的条件下，其检测灵敏度、精确度和分辨率都受到了限制。
在低丰度检测、稀有突变检测等日益增大的应用需求背景下，“第三代PCR”—数字PCR技术诞生(一种核酸分子绝对定量技术)。数字PCR是把荧光定量反应体系均匀地分配到大量微小的反应单元中，每个微小反应单元中不包含或包含一个到多个目标基因片段。扩增结束后，通过终点荧光信号判断的阳性反应单元的数量所占总的反应单元的比率和统计学方法计算原始样本中靶基因的拷贝数。
数字PCR无须依赖对照样品和标准曲线就可以进行比较精度的绝对定量检测，这是由于数字PCR在进行结果判读时仅判读“有/无”两种扩增状态，完全不依赖于Ct值的鉴定。由于数字PCR是终点检测法，只是对终点荧光一次检测进行靶基因的初始浓度计算，对每个反应单元中基因扩增的整个过程是不关注的，这就有可能让假阳性和假阴性等无效扩增参与计算，将导致靶基因浓度计算精度降低。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种PCR无效扩增的检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种PCR无效扩增的检测方法，该方法根据PCR检测结果，通过确定第一阈值和第二阈值检测出假阳性、假阴性及波动超限产生的无效扩增。
进一步地，所述第一阈值R1为至少包含3～20个循环周期的荧光信号标准偏差的3～15倍，起始周期为第2～10个循环周期，结束周期为第10～25个循环周期。或为第Cn个周期的荧光强度值，第Cn个周期的荧光强度值满足：
其中Cn代表扩增周期，R是对应扩增周期的荧光强度值。
进一步地，所述第二阈值R2为终点荧光检测的阴阳分割值。
进一步地，无效扩增的检测方法如下：
若终点阈值R>R2时，判定为待定阳性；将阈值线y＝R1与阈值线y＝R2之间增长区的最大斜率Ki与扩增效率K值进行比较，当Ki>＝K时，判定为阳性，否则为假阳性；
若终点阈值R<R1时，判定为阴性；
若终点阈值R1＝<R<＝R2时，判定为待定阴性。将阈值线y＝R1与阈值线y＝R2之间增长区的最大斜率Ki与扩增效率K值进行比较，当Ki<＝K时，判定为阴性，否则为假阴性；
假阳性和假阳性均为无效扩增。
若扩增曲线在扩增结束前L个周期之间的荧光值波动大于这L个周期的荧光值均方差的2～5倍，L取3‐15，则判定为波动无效扩增。本实施例L取典型值5，荧光值波动大于均方差的倍数选取3倍。
若扩增曲线在扩增的3‐15个循环周期之间，其中，起始周期为第2～10个循环周期，结束周期为第10～25个循环周期，荧光值恒定且高于第一阈值线R1，则判定该扩增为无效扩增。
本发明的有益效果在于：通过本发明，可以有效的检测出PCR扩增过程中产生的假阳性/假阴性及其他无效扩增，有利于获得更为精准的PCR检测结果。
附图说明
图1为本发明实施例的精度与假调用的关系图；
图2为本发明实施例的定量PCR实时荧光扩增曲线图；
图3为本发明实施例的识别假阴性假阳性方法流程图；
具体实施方式
数字PCR技术的应用极大的提高了基因定量检测的精度。为使一次PCR测量时能够达到最大的精度，就必须知道影响测量精度的必要因素。数字PCR技术是基于目标拷贝分散到大量反应孔时符合泊松分布原理，进而求得初始样本目标拷贝的浓度。根据动力学数学框架模型进行数字PCR系统建模，所述影响系统测量精度的因素包括反应单元的数量参与反应单元的样品体积、以及假阳性率和假阴性率及无效点的率。
在统计学上，由泊松概率模型推导的起始模板浓度均值λ作为一次检测结果，不一定刚好就是真实的模板浓度，真实浓度可能是在λ值附近的一段区间内。除了拷贝数均值λ之外，数字PCR的定量结果常需结合置信区间和置信水平表示。在数字PCR检测中，置信区间展现的是样本真实浓度以一定概率落在测量结果λ的周围区间的程度，这个概率被称为置信水平，置信区间的两端被称为置信极限。置信水平越高，置信区间就会越宽泛，检测结果就会越“模糊”，过高或者过低的置信水平对检测结果都是不利的。在数字PCR中一般需要计算95％置信水平对应的置信区间。
数字PCR中，样本中DNA模板会被分布在含有大量反应单元的基因芯片中，每个反应单元中将会获得至少一个或零个DNA模板拷贝。含有DNA模板拷贝的反应单元，称为阳性单元，不含DNA模板拷贝的反应单元称为阴性单元。假设λ所指每个反应单元中目标基因拷贝平均数，P代表在数字PCR实验中在n个反应单元中阴性单元的百分率。
误差因素基本来自两个方面：假阳性，假阴性率和系统相关偏置。假设λfalse表示由于假阳性或假阴性率观察得到的λ。Pfalse表示观察得到的阴性百分率。λfalse＝-ln(e-λ-falsePositiveRate+falseNegativeRate) (1)
Pfalse＝exp(-λfalse) (2)
可以得到95％置信水平的置信区间：
如下得到来自取样及非零假阳性假阴性调用率的变化：
考虑到系统噪声相关偏置σSystemBias得到总变化：
最终得到更准确的估算精度：
如图1所示假阳性或假阴性对测量精度的影响。通过以上建模分析，可以知道影响数字PCR测量精度的一个重要因素就是检查结果中出现的假阳性和假阴性。有效的去除假阳性和假阴性可以显著提高测量的精度。同时去除其他原因造成的无效点，对最终的测量结果精度也有提高。
数字PCR是终点检测法，只是对终点荧光一次检测然后进行计算目标基因的初始浓度，对每个单元基因扩增的整个过程是不关注的，这就有可能导致假阳性和假阴性的出现，最终降低了计算的准确度。本发明提出了提高数字PCR靶基因浓度计算的方法。
目前数字PCR靶基因浓度计算的方法是通过多次PCR循环周期后，通过阅读仪读取扩增后的反应单元荧光强度进行分析计算。其中阳性点和阴性点各自比例决定了最终计算的结果精度。在阳性和阴性判别的过程中，会出现假阳性和假阴性，极大的影响最终的计算结果。本发明对目标DNA进行多周期的实时荧光PCR扩增，获得扩增曲线，对扩增曲线进行处理，不仅关注扩增结束后的荧光值，同时对每个反应单元扩增周期的荧光变化实时关注，可以有效的去除PCR扩增过程中产生的假阳性/假阴性及其他无效扩增。随着靶基因扩增反应的进行，PCR反应产物不断累积，含有靶基因的反应单元荧光强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化检测产物量的变化，从而得到每个反应单元的荧光扩增曲线图，如图2所示。
一般而言，荧光扩增曲线分成4个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段、荧光信号线性增长期和平台期。第一荧光阈值R1为至少包含3个循环周期的荧光信号标准偏差的3～15倍，起始周期为第2～10个循环周期，结束周期为第10～25个循环周期；
或为第Cn个周期的荧光强度值，第Cn个周期的荧光强度值满足：
其中Cn代表扩增周期，R是对应扩增周期的荧光强度值。
本发明主要应用荧光扩增曲线来去除假阳性和假阴性及其他无效扩增。终点荧光采集信号，通过荧光矫正、去本底等操作后，进行大津阈值法或现有的其他方法得到终点荧光检测的阴阳分割值R2，用于阴阳性的判断。
通过设置的荧光阈值线y＝R1与曲线有无交点用来判断该反应是否为阴性，图2中曲线簇400和荧光阈值R1没有交点，可认定该类型的反应表示为阴性。曲线簇300开始时随着扩增周期增加荧光也增加，之后到达一个值后开始下降，虽然该类反应单元中是有靶基因的，前期扩增明显，后期可能由于扩增效率降低或其他因素如分液误差、试剂的内部反应、光学系统噪声等引起的假性反应。已不是完整的阳性扩增曲线，这种反应单元我们认定为假阴性。曲线簇200代表的是假阳性，从前面扩增周期可以看出该类反应没有靶基因扩增，只是后期由于其他原因在定量PCR终点检测时被系统检测成了阳性，从而产生了假阳性。曲线簇100代表的是正常的阳性单元，通过多个扩增周期的PCR反应，在平台期基本都达到了稳定的荧光强度。曲线簇500代表的是基线期大于第一阈值线的反应，该反应从一开始就有比较高的荧光特性，偏离了正常扩增反应轨迹，判定为无效扩增。在扩增反应的平台期波动的范围超过一定范围也被判定为无效扩增。
图3为本发明实施例的识别假阴性假阳性方法流程图。若终点阈值R>R2时，判定为待定阳性；将阈值线y＝R1与阈值线y＝R2之间增长区的最大斜率Ki与扩增效率K值进行比较，当Ki>＝K时，判定为阳性，否则为假阳性；若终点阈值R<R1时，判定为阴性；若终点阈值R1＝<R<＝R2时，判定为待定阴性。将阈值线y＝R1与阈值线y＝R2之间增长区的最大斜率Ki与扩增效率K值进行比较，当Ki<＝K时，判定为阴性，否则为假阴性；若扩增曲线在扩增结束前L个周期之间的荧光值波动大于S2倍均方差，则判定为波动无效扩增，L一般为3～15，典型值为5，S2一般为2～5，典型值为3。若扩增曲线在扩增的3‐15个循环周期之间，其中，起始周期为第2～10个循环周期，结束周期为第10～25个循环周期，荧光值恒定且高于第一阈值线R1，则判定该扩增为无效扩增。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种无效扩增的检测方法，根据PCR反应荧光强度检测结果，通过第一阈值和第二阈值检测出假阳性、假阴性及波动超限产生的无效扩增。
所述第一阈值R1为第10‐13个循环周期的荧光信号标准偏差的3倍。
所述第二阈值R2为终点荧光检测的阴阳分割值，通过大津阈值法获得。
无效扩增的检测方法如下：
若终点阈值R>R2时，判定为待定阳性；将阈值线y＝R1与阈值线y＝R2之间增长区的最大斜率Ki与扩增效率K(K为PCR扩增实测值)值进行比较，当Ki>＝K时，判定为阳性，否则为假阳性；
若终点阈值R<R1时，判定为阴性；
若终点阈值R1＝<R<＝R2时，判定为待定阴性。将阈值线y＝R1与阈值线y＝R2之间增长区的最大斜率Ki与扩增效率K值进行比较，当Ki<＝K时，判定为阴性，否则为假阴性；
假阴性和假阳性均为无效扩增。
若扩增曲线在扩增结束前3个周期之间的荧光值波动大于这3个周期的荧光值均方差的2倍，则判定为波动无效扩增。
若扩增曲线在扩增的第10‐13个循环周期之间，荧光值恒定且高于第一阈值线R1，则判定该扩增为无效扩增。
通过以上方法判定出了阴性、阳性、假阴性、假阳性，并把假阳性和假阴性作为无效扩增并剔除掉。把去除无效扩增后的阴性和阳性数量参与靶基因浓度的计算。基于泊松分布原理的计算结果如下：
设每个反应单元的平均体积为其中v＝u/n，u是参与扩增的反应液总体积，n是有效扩增的单元数，反应液拷贝浓度为：
通过采用含有两万多孔的固态芯片作为扩增反应基底，用不同已知靶基因浓度的反应溶液制作多组扩增反应固态芯片。实验结果如下：
PCR扩增完后，通过常规算法计算得到的结果和采用本实验方法得到的结果进行对比，发现采用本发明方法得到的靶基因浓度更接近原始靶基因浓度值。
实施例2
一种无效扩增的检测方法，根据PCR反应荧光强度检测结果，通过第一阈值和第二阈值检测出假阳性、假阴性及波动超限产生的无效扩增。
所述第一阈值R1为第2～10个周期的荧光信号标准偏差的15倍。
所述第二阈值R2为终点荧光检测的阴阳分割值，通过大津阈值法获得。
无效扩增的检测方法如下：
若终点阈值R>R2时，判定为待定阳性；将阈值线y＝R1与阈值线y＝R2之间增长区的最大斜率Ki与扩增效率K(K为PCR扩增实测值)值进行比较，当Ki>＝K时，判定为阳性，否则为假阳性；
若终点阈值R<R1时，判定为阴性；
若终点阈值R1＝<R<＝R2时，判定为待定阴性。将阈值线y＝R1与阈值线y＝R2之间增长区的最大斜率Ki与扩增效率K值进行比较，当Ki<＝K时，判定为阴性，否则为假阴性；
假阴性和假阳性均为无效扩增。
若扩增曲线在扩增结束前15个周期之间的荧光值波动大于这15个周期的荧光值均方差的5倍。
若扩增曲线在扩增的第2‐10个循环周期之间，荧光值恒定且高于第一阈值线R1，则判定该扩增为无效扩增。
通过以上方法判定出了阴性、阳性、假阴性、假阳性，并把假阳性和假阴性作为无效扩增并剔除掉。把去除无效扩增后的阴性和阳性数量参与靶基因浓度的计算。基于泊松分布原理的计算结果如下：
设每个反应单元的平均体积为其中v＝u/n，u是参与扩增的反应液总体积，n是有效扩增的单元数，反应液拷贝浓度为：
通过采用含有两万多孔的固态芯片作为扩增反应基底，用不同已知靶基因浓度的反应溶液制作多组扩增反应固态芯片。实验结果如下：
PCR扩增完后，通过常规算法计算得到的结果和采用本实验方法得到的结果进行对比，发现采用本发明方法得到的靶基因浓度更接近原始靶基因浓度值。
实施例3
一种无效扩增的检测方法，根据PCR反应荧光强度检测结果，通过第一阈值和第二阈值检测出假阳性、假阴性及波动超限产生的无效扩增。
所述第一阈值R1为第10～25个循环周期的荧光信号标准偏差的10倍；
所述第二阈值R2为终点荧光检测的阴阳分割值，通过大津阈值法获得。
无效扩增的检测方法如下：
若终点阈值R>R2时，判定为待定阳性；将阈值线y＝R1与阈值线y＝R2之间增长区的最大斜率Ki与扩增效率K(K为PCR扩增实测值)值进行比较，当Ki>＝K时，判定为阳性，否则为假阳性；
若终点阈值R<R1时，判定为阴性；
若终点阈值R1＝<R<＝R2时，判定为待定阴性。将阈值线y＝R1与阈值线y＝R2之间增长区的最大斜率Ki与扩增效率K值进行比较，当Ki<＝K时，判定为阴性，否则为假阴性；
假阴性和假阳性均为无效扩增。
若扩增曲线在扩增结束前5个周期之间的荧光值波动大于这5个周期的荧光值均方差的3倍，则判定为波动无效扩增。
若扩增曲线在扩增的第10～15个循环周期之间，荧光值恒定且高于第一阈值线R1，则判定该扩增为无效扩增。
通过以上方法判定出了阴性、阳性、假阴性、假阳性，并把假阳性和假阴性作为无效扩增并剔除掉。把去除无效扩增后的阴性和阳性数量参与靶基因浓度的计算。基于泊松分布原理的计算结果如下：
设每个反应单元的平均体积为其中v＝u/n，u是参与扩增的反应液总体积，n是有效扩增的单元数，反应液拷贝浓度为：
通过采用含有两万多孔的固态芯片作为扩增反应基底，用不同已知靶基因浓度的反应溶液制作多组扩增反应固态芯片。实验结果如下：
PCR扩增完后，通过常规算法计算得到的结果和采用本实验方法得到的结果进行对比，发现采用本发明方法得到的靶基因浓度更接近原始靶基因浓度值。
实施例4
一种无效扩增的检测方法，根据PCR反应荧光强度检测结果，通过第一阈值和第二阈值检测出假阳性、假阴性及波动超限产生的无效扩增。
所述第一阈值R1为第Cn个周期的荧光强度值，第Cn个周期的荧光强度值满足：
其中Cn代表扩增周期，R是对应扩增周期的荧光强度值。
所述第二阈值R2为终点荧光检测的阴阳分割值。
无效扩增的检测方法如下：
若终点阈值R>R2时，判定为待定阳性；将阈值线y＝R1与阈值线y＝R2之间增长区的最大斜率Ki与扩增效率K(K为PCR扩增实测值)值进行比较，当Ki>＝K时，判定为阳性，否则为假阳性；
若终点阈值R<R1时，判定为阴性；
若终点阈值R1＝<R<＝R2时，判定为待定阴性。将阈值线y＝R1与阈值线y＝R2之间增长区的最大斜率Ki与扩增效率K值进行比较，当Ki<＝K时，判定为阴性，否则为假阴性；
假阴性和假阳性均为无效扩增。
若扩增曲线在扩增结束前10个周期之间的荧光值波动大于这10个周期的荧光值均方差的4倍，则判定为波动无效扩增。
若扩增曲线在扩增的第9‐15个循环周期之间，荧光值恒定且高于第一阈值线R1，则判定该扩增为无效扩增。
通过以上方法判定出了阴性、阳性、假阴性、假阳性，并把假阳性和假阴性作为无效扩增并剔除掉。把去除无效扩增后的阴性和阳性数量参与靶基因浓度的计算。基于泊松分布原理的计算结果如下：
设每个反应单元的平均体积为其中v＝u/n，u是参与扩增的反应液总体积，n是有效扩增的单元数，反应液拷贝浓度为：
通过采用含有两万多孔的固态芯片作为扩增反应基底，用不同已知靶基因浓度的反应溶液制作多组扩增反应固态芯片。实验结果如下：
PCR扩增完后，通过常规算法计算得到的结果和采用本实验方法得到的结果进行对比，发现采用本发明方法得到的靶基因浓度更接近原始靶基因浓度值。
综上所述，本发明所述的去除无效扩增反应的方法，可以有效的去除PCR扩增过程中产生的假阳性/假阴性及其他无效扩增，有效的提高目标靶基因浓度计算的结果。
Claims (6)
1.一种PCR无效扩增的检测方法，其特征在于，该方法根据PCR反应荧光强度检测结果，通过第一阈值和第二阈值检测出假阳性、假阴性及波动超限产生的无效扩增。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一阈值R1为至少包含3个循环周期的荧光信号标准偏差的3～15倍，起始周期为第2～10个循环周期，结束周期为第10～25个循环周期；或为第Cn个周期的荧光强度值，第Cn个周期的荧光强度值满足：
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</mrow>
</mrow>
</mfrac>
<mo>></mo>
<mn>1.1</mn>
</mrow>
其中Cn代表扩增周期，R是对应扩增周期的荧光强度值。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一阈值R1为至少包含3个循环周期的荧光信号标准偏差的10倍。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二阈值R2为终点荧光检测的阴阳分割值。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，无效扩增的检测方法如下：
若终点阈值R>R2时，判定为待定阳性；将阈值线y＝R1与阈值线y＝R2之间增长区的最大斜率Ki与扩增效率K(K为PCR扩增实测值)值进行比较，当Ki>＝K时，判定为阳性，否则为假阳性；
若终点阈值R<R1时，判定为阴性；
若终点阈值R1＝<R<＝R2时，判定为待定阴性。将阈值线y＝R1与阈值线y＝R2之间增长区的最大斜率Ki与扩增效率K值进行比较，当Ki<＝K时，判定为阴性，否则为假阴性；
假阴性和假阳性均为无效扩增。
若扩增曲线在扩增结束前L个周期之间的荧光值波动大于这L个周期的荧光值均方差的2～5倍，L取3‐15，则判定为波动无效扩增。
若扩增曲线在扩增的3‐15个循环周期之间，其中，起始周期为第2～10个循环周期，结束周期为第10～25个循环周期，荧光值恒定且高于第一阈值线R1，则判定该扩增为无效扩增。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，L为5个，扩增曲线在扩增结束前5个周期之间的荧光值波动大于这5个周期的荧光值均方差的3倍，则为无效扩增。
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