CN107012202A - 核酸扩增的精度管理方法、精度管理用试剂及其试剂盒 - Google Patents

核酸扩增的精度管理方法、精度管理用试剂及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供包括核酸检测工序和判断工序的核酸扩增的精度管理方法。核酸检测工序包括：调制含目标核酸和精度管理用多核苷酸的核酸样品的工序、调制含上述目标核酸一分子的隔区和含上述精度管理用多核苷酸一分子的隔区的工序、在上述各隔区中进行上述核酸样品中所含的上述目标核酸或上述精度管理用多核苷酸的核酸扩增，使用检测用探针检测上述检测用探针引发的信号的工序。在判断工序中，基于上述信号检测工序的结果，判断上述核酸检测工序适宜或不适宜。

Description

核酸扩增的精度管理方法、精度管理用试剂及其试剂盒
【技术领域】
本发明涉及核酸扩增的精度管理方法、精度管理用试剂及其试剂盒。
【背景技术】
在核酸扩增法中，有由聚合酶的扩增错误、由混杂物质等的扩增抑制、样品调制时的误操作等，由各种要因得不到适宜的结果的情况。因此，有对核酸扩增适宜地进行与否进行精度管理的必要。
在Appl.Environ.Mocrobiol.2001.67,3985-3993中公开有，有与目标核酸结合相同的引物组的区域，与检测目标核酸的检测用探针有结合不同的探针的区域的，对照多核苷酸。通过用检测目标核酸的检测用探针和检测对照多核苷酸的探针标记不同的荧光染料，可在相同反应槽中同时区别检测各自的扩增产物(第3986页、右栏“Primes,Probes,andPCR assay”的项、及第3990页、图2)。
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
近年，作为检测样品中的成为目标的核酸分子(以下也称为“目标核酸”)的方法，开发有数字核酸检测。具体而言，在微孔或液滴等的隔区化的区域(以下也简称为“隔区”)中收容各1分子目标核酸，通过在各隔区中进行核酸扩增，高灵敏度地检测核酸分子的方法。非专利文献1中记载的方法被认为也能在数字核酸检测法中应用，但为了在目标核酸和对照多核苷酸中使用不同的探针，难以评价用于检测目标核酸的探针正常发挥功能与否。
本发明人完成了在数字核酸检测中适宜地使用的精度管理方法。即，本发明人发现，在数字核酸检测中，在能结合与目标核酸相同的引物组的区域、能结合上述引物组的区域间，通过使用有与目标核酸不同的个数的寡核苷酸，可对能结合目标核酸检测用探针的区域进行精度管理。
【解决课题的技术方案】
本发明的第1实施方式是核酸扩增的精度管理方法，其包括核酸检测工序和判断工序。上述核酸检测工序包括：调制核酸样品的工序，所述核酸样品含目标核酸和精度管理用多核苷酸、调制含上述目标核酸一分子的隔区和含上述精度管理用多核苷酸一分子的隔区的工序、在上述各隔区中进行上述核酸样品中所含的上述目标核酸或上述精度管理用多核苷酸的核酸扩增，使用检测用探针检测上述检测用探针引发的信号的工序。在判断工序中，基于上述信号检测工序的结果，判断上述核酸检测工序适宜或不适宜。含上述目标核酸检测序列。上述精度管理用多核苷酸是以下的(1)、(2)或(3)。
(1)含以下第1区域、第2区域及第3区域的单链多核苷酸：上述第1区域含能结合目标核酸扩增用的第1引物的序列；上述第2区域含与能结合目标核酸扩增用的第2引物的序列互补的序列；及上述第3区域含检测序列及与上述检测序列互补的序列的任一方或两方、
(2)含与上述(1)的序列互补的序列的单链多核苷酸、
(3)含上述(1)的多核苷酸和上述(2)的多核苷酸的双链多核苷酸
上述检测用探针含与上述检测序列互补的序列。
上述(1)的精度管理用多核苷酸中的检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数与上述目标核酸中的检测序列的数不同。
【发明效果】
由本发明提供数字核酸检测法中的精度管理方法。
【附图说明】
【图1】显示实施方式1涉及的核酸检测工序的模式图。
【图2】显示实施方式2涉及的核酸扩增的种类(b)及检测信号的2D散点图(a)的模式图。
【图3】显示实施方式3涉及的核酸检测工序的模式图。
【图4】显示实施方式4涉及的核酸检测工序的模式图。
【图5】显示人KRAS基因的核酸扩增中的例示的精度管理方法的结果的2D散点图。2D散点图，在x轴显示有精度管理用多核苷酸(Wt,n＝5)(+)的情况(a)及无(-)的情况(b)的反映变异型(Mut)的KRAS基因来源的扩增产物的信号，在y轴显示反映野生型(Wt)的KRAS基因来源的扩增产物的信号。
【图6】在x轴显示有精度管理用多核苷酸(Mut,n＝5)(+)的情况(a)及无(-)的情况(b)的反映变异型(Mut)的KRAS基因来源的扩增产物的信号，在y轴显示反映野生型(Wt)的KRAS基因来源的扩增产物的信号的2D散点图。
【图7】显示向核酸扩增反应液中添加的精度管理用多核苷酸(a：Wt,n＝5、b：Mut,n＝5)的拷贝数和检测信号强度的相关关系的分布图。
【图8】显示精度管理用多核苷酸中的检测序列的数和检测信号强度的相关关系的箱形图。
【图9】在x轴显示有精度管理用多核苷酸(Wt,n＝6)(+)的情况(a)及无(-)的情况(b)的反映变异型(Mut)的KRAS基因来源的扩增产物的信号，在y轴显示反映野生型(Wt)的KRAS基因来源的扩增产物的信号的2D散点图。
【图10】显示1个实施方式涉及的精度管理用试剂盒的模式图。
【图11】显示1个实施方式涉及的目标核酸(a)及精度管理用多核苷酸(b)的模式图。
【实施方式】
[精度管理方法]
本发明的第1实施方式涉及包括核酸检测工序和判断工序的核酸扩增的精度管理方法。在第1实施方式的核酸检测工序中，调制含目标核酸和精度管理用多核苷酸的核酸样品。在1个实施方式中，核酸样品调制工序通过将含目标核酸的样品和含精度管理用多核苷酸的样品混合，调制核酸样品。
在本说明书中，“核酸”是指DNA或RNA。核酸只要可核酸扩增，就不特别限定，可一部分或全部是核苷酸衍生物。作为核苷酸衍生物，可例示Locked Nucleic Acid(LNA),Bridged Nucleic Acid(BNA)等。
“核酸样品”只要含核酸的样品，就不特别限定。作为核酸样品，例如，可例示血液、淋巴细胞等的生物体样品、尿、便等的排泄物、河川水、海水、土壤等的环境样品等。核酸样品由于通常是液状，在样品不是液状时通过进行适宜预处理，优选作为液状。其中，“液状”的样品不限于溶质完全地溶解的溶液，也含悬浮了细胞或细胞的碎片等的微细的固体物的悬浮液、溶胶等。预处理的方法选择适宜公知的方法。例如，样品是从生物体采集的组织时，通过在预处理液中破碎组织中的细胞、用离心分离等分离－除去破碎物，可调制核酸样品。
在本说明书中，“目标核酸”是有兴趣对象的序列(以下也称为“检测序列”)。目标核酸不仅是核酸样品中所含的核酸，也含扩增核酸样品中的DNA或RNA的扩增产物(扩增子)或，从核酸样品中的RNA由逆转录反应合成的cDNA等。目标核酸通常是生物来源或病毒来源的。
本发明涉及的精度管理用多核苷酸可使用与可扩增含目标核酸中的检测序列的区域的引物(以下也称为“目标核酸扩增用引物”)相同的引物扩增。目标核酸扩增用引物组含第1目标核酸扩增用引物(以下也称为“第1引物”)及第2目标核酸扩增用引物(以下也称为“第2引物”)。在精度管理用多核苷酸中，将含能结合第1引物的序列的区域称为第1区域，将含与能结合第2引物的序列互补的序列的区域称为第2区域。
在由上述目标核酸扩增用引物扩增的精度管理用多核苷酸的区域中，含检测序列及与上述检测序列互补的序列的任一方或其两方。在精度管理用多核苷酸中，将含检测序列及与上述检测序列互补的序列的任一方或其两方的区域称为第3区域。
精度管理用多核苷酸的第3区域中存在的检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数与由上述目标核酸扩增用引物扩增的上述目标核酸的区域中的检测序列的数不同。由此，与精度管理用多核苷酸的扩增产物杂交的检测用探针的数和与目标核酸的扩增产物杂交的检测用探针的数变得不同。例如，含精度管理用多核苷酸的扩增产物的隔区或从珠发生的检测用探针引发的信号的强度与含目标核酸的扩增产物的隔区或从珠发生的检测用探针引发的信号强度变得不同。可区别含精度管理用多核苷酸的扩增产物的隔区或珠和含目标核酸的扩增产物的隔区或珠。
当作为含上述第1区域、第2区域及第3区域的单链多核苷酸的精度管理用多核苷酸中的检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数比目标核酸中的检测序列的数多时，含精度管理用多核苷酸的扩增产物的隔区或珠发生比含目标核酸的扩增产物的隔区或珠强的信号。当目标核酸中的检测序列的数比上述精度管理用多核苷酸中的检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数更多时，含目标核酸的扩增产物的隔区或珠发生比含精度管理用多核苷酸的扩增产物的隔区或珠强的信号。以下，“检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数”是指作为含第1区域、第2区域及第3区域的单链多核苷酸的精度管理用多核苷酸中的检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数。
精度管理用多核苷酸中的检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数不限定，但优选为比目标核酸中的检测序列的数多至少1个。通常，由于目标核酸中的检测序列的数是1，精度管理用多核苷酸中的检测序列和与检测序列互补的序列的合计数可设定为2以上。
精度管理用多核苷酸中的检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数不限定，但可为20个以下，10个以下，优选为6个以下，也可为例如1个～10个、2个～10个、2个～6个。精度管理用多核苷酸不限定，但含至少2个检测序列。
精度管理用多核苷酸可为单链，也可为双链。单链多核苷酸有容易制造，可廉价并且高纯度地制造的益处。双链多核苷酸可显示比单链多核苷酸物理上稳定的倾向。本发明涉及的精度管理用多核苷酸可根据目的以单链形式提供，也可以双链形式提供。
精度管理用多核苷酸的链长不限定，但从调制的容易的观点来看，可为1000bp以下，500bp以下，200bp以下。在1个实施方式中，精度管理用多核苷酸的链长是50bp以上200bp以下，80bp以上170bp以下，更优选为90bp以上160bp以下。精度管理用多核苷酸的链长和目标核酸的扩增产物的链长的差，例如，优选为在核酸扩增中有同等的扩增效率的范围。
在1个实施方式中，精度管理用多核苷酸在第3区域的上游含第1间隔子序列，在第3区域的下游含第2间隔子序列。在1个实施方式中，上述第1间隔子序列和上述第2间隔子序列是互相不同的序列，上述第1间隔子序列和上述第2间隔子序列不互补。其中，“第1间隔子序列和第2间隔子序列互相不同”是指与一方的序列完全地互补的序列在严格的条件下不与另一方的序列杂交。另外，“第1间隔子序列和第2间隔子序列不互补”是指这些序列不在严格的条件下杂交。
当精度管理用多核苷酸中的检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数是2个以上时，精度管理用多核苷酸，例如在1个检测序列和其他检测序列之间，含进一步的间隔子序列。“进一步的间隔子序列”是与上述第1间隔子序列及上述第2间隔子序列各自不同的序列，上述第1间隔子序列及上述第2间隔子序列的各不互补。其中，进一步的关于间隔子序列的“序列互相不同的”及“序列不互补的”是与在上述的第1间隔子序列及第2间隔子序列中言及的“序列互相不同的”及“序列不互补的”同意义。进一步的间隔子序列的数可随精度管理用多核苷酸的第3区域中存在的检测序列及与上述检测序列互补的序列的合计数增减。关于上述的“进一步的间隔子序列”的“序列互相不同”及“序列不互补”也适用于进一步的间隔子序列之间。
各间隔子序列是相同或互补时，特别是，在核酸扩增反应的后半有间隔子序列与间隔子序列的互补链的杂交，或间隔子序列之间的杂交发生的可能性。为了降低此可能性，优选第1间隔子序列和第2间隔子序列互相不同，并且第1间隔子序列和第2间隔子序列不互补。对于进一步的间隔子序列也同样。
在1个实施方式中，上述间隔子序列的长度可为，例如，1bp以上20bp以下，1bp以上10bp以下，2bp以上10bp以下，3bp以上10bp以下，或者4bp以上10bp以下。
为例示目的，1个实施方式涉及的精度管理用多核苷酸及目标核酸的模式图示于图11。图11(a)显示，扩增区域中的检测序列的数是1的目标核酸。图11(b)显示双链的精度管理用多核苷酸，上述精度管理用多核苷酸中的检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数是4。具体而言，上述精度管理用多核苷酸由含有含能结合第1引物的序列的第1区域；含与能结合第2引物的序列互补的序列的第2区域；及含2个检测序列、含2个与上述检测序列互补的序列的第3区域的多核苷酸和含与上述多核苷酸的序列互补的序列的多核苷酸构成。上述第3区域在第3区域的上游含第1间隔子序列，在第3区域的下游含第2间隔子序列。由于第3区域中的检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数是2以上，在检测序列之间、在检测序列和与上述检测序列互补的序列之间、在与检测序列互补的序列们之间含进一步的间隔子序列。
在本说明书中，“杂交(hybridize)”或“杂交(hybridization)”是指碱基由氢键形成碱基对，形成双链的核酸分子。检测用探针和目标核酸的扩增产物的杂交，在序列和与其互补的序列之间有不形成碱基对的错配时，以抑制或防止检测用探针与具有有错配的序列的核酸的双链形成的程度在严格的条件下进行。在本说明书中，“严格的条件”是指进行多核苷酸的杂交时本领域技术人员一般使用的条件。严格的条件是某一单链多核苷酸和与所述单链多核苷酸有一定的互补性的别的单链多核苷酸杂交，基本上不与无互补性的单链多核苷酸杂交的条件。已知杂交时的严格度与温度、盐浓度、多核苷酸的链长、多核苷酸的GC含量、杂交缓冲液中的离液剂的浓度等相关。作为严格的条件，例如，参考Sambrook,J.etal.(1998)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.),ColdSpringHarborLaboratory Press,New York中记载的条件，本领域技术人员可适宜设定。
在核酸检测工序中，在后述的隔区调制工序之前，也可进行样品中的核酸的扩增(以下，此工序也称为“预扩增工序”)。在样品中的目标核酸是低浓度时等，通过在隔区调制工序之前扩增目标核酸，目标核酸的检测可变得容易。预扩增工序中的核酸扩增的方法不特别限定。例如，可例示Polymerase Chain Reaction(PCR)法、RT-PCR法、Nucleic AcidSequence Based Amplification(NASBA)法、Transcription-Mediated Amplification(TMA)法等。预扩增工序可在样品调制工序前及/或样品调制工序后进行。当预扩增工序在样品调制工序后进行时，也由预扩增扩增了精度管理用多核苷酸。
在第1实施方式的核酸检测工序中，进行隔区调制工序。“隔区”，例如，可例示基板上的微孔或油相中的水性液滴等。具体而言，例示使用美国专利7842457号说明书或美国专利8048627号说明书中记载的方法调制的隔区。另外，也可为使用QuantStudio(商标)3D数字PCR系统(ThermoFisher Scientific公司)、Q×200(商标)Droplet Digital(商标)PCR解析系统(Bio-Rad公司)、Biomark(商标)HD MX/HX系统(Fluidigm公司)、RainDrop系统(RainDance公司)等市售的数字PCR装置调制的隔区。
通常使用比目标核酸或精度管理用多核苷酸的分子数大多数的隔区。由此，调制多个理论上每1隔区仅含一分子目标核酸或精度管理用多核苷酸的隔区。再者，目标核酸及精度管理用多核苷酸中的哪个都不含的隔区也调制多个。
各隔区含有对于后述的核酸扩增必要的试剂。此试剂能由本领域技术人员适宜选择通常含核酸扩增用的引物、dNTPs(dATP、dCTP、dGTP、及dTTP或dUTP)、聚合酶、缓冲剂等。引物也可固定在基板或珠等的固相载体上。
在第1实施方式的核酸检测工序中，在各隔区中进行核酸样品中所含的核酸的核酸扩增。在隔区中存在目标核酸时，生成目标核酸的扩增产物。在隔区中存在精度管理用多核苷酸时，生成精度管理用多核苷酸的扩增产物。在该隔区内生成该扩增产物(本说明书中，也称为“数字核酸扩增”)。
核酸扩增的方法不限定，但可举出PCR法、RT-PCR法、NASBA法、TMA法。在1个实施方式中，核酸扩增法是PCR。在核酸一分子水平的PCR也称为数字PCR。作为数字PCR，可为例如，作为上述隔区使用液滴(droplets)的乳液PCR(以下也称为“液滴型的数字PCR”)、或者使用反应孔的数字PCR(以下也称为“孔型的数字PCR”)。PCR可进行例如(1)热变性、(2)退火、(3)延伸的3步骤，也可以(2)在相同的温度条件下进行退火或杂交和(3)延伸，(1)热变性、(2’)退火和延伸的2步骤进行。各工序的条件适宜设定。各步骤的温度变化，例如，可使用Veriti热循环仪(Applied Biosystems公司)等的热循环仪自动控制。
在第1实施方式的核酸检测工序中，进行使用检测用探针的信号检测工序。在1个实施方式涉及的信号检测工序中，首先检测用探针和扩增产物在严格的条件下杂交。在检测到显示检测序列的存在的信号时判断为有含检测序列的扩增产物。在检测不到显示检测序列的存在的信号时判断为无含检测序列的扩增产物。
“检测用探针”包括含与检测序列互补的序列的寡核苷酸。也可使用多种检测用探针。例如，在分析目标序列的核苷酸的有无变异时，可使用与变异型的序列杂交的检测用探针(以下也称为“变异型检测用探针”)和与野生型的序列杂交的检测用探针(以下也称为“野生型检测用探针”)。这些检测用探针发生互相不同的种类的信号。在一例中，变异型检测用探针引发的荧光波长和野生型检测用探针引发的荧光波长不同。通过何波长以何程度被检测，可分析目标序列的有无变异。
在本发明中使用的检测用探针可为预先用标记物质标记的寡核苷酸，或者也可为非标记的寡核苷酸。从检测灵敏度的观点来看，优选使用标记的寡核苷酸。
作为标记物质，可例示荧光物质、酶、半抗原等。在本说明书中，预先标记化的检测用探针也称为“标记化检测用探针”。作为标记物质使用荧光物质时，作为信号可检测到荧光。作为荧光物质，可举出荧光素、若丹明、德克萨斯红、四甲基若丹明、羧基若丹明、藻红蛋白、6-FAM(商标)、Cy(注册商标)3、Cy(注册商标)5、Alexa Fluor(注册商标)的系列等。作为标记物质使用酶时，使之与所述酶的底物反应，通过生成发生发光等的信号的反应产物，可检测到信号。作为标记物质使用半抗原时，经特异性地结合于所述半抗原的物质使酶或荧光物质结合于检测用探针。由此，可检测到荧光或发光等的信号。再者，作为特异性地结合于半抗原的物质，可举出抗半抗原抗体。另外，作为半抗原使用生物素时可使用亲和素类(亲和素、链霉亲和素等)。
由于认为对于标记化检测用探针和含检测序列的核酸的杂交的标记物质的影响(例如立体障碍)小，标记化检测用探针中的标记物质优选在其5’末端及/或3’末端标记化(修饰)。检测用探针可含追加到与检测序列互补的序列的5’末端及/或3’末端的序列。标记化检测用探针含追加到与检测序列互补的序列的5’末端及/或3’末端的序列，其5’末端及/或3’末端也可被标记物质标记化。在这样的标记化检测用探针中，认为与不含追加的序列而其5’末端及/或3’末端用标记物质标记化的标记化检测用探针相比，标记物质对标记化检测用探针和含检测序列的核酸的杂交的影响更得变小。上述追加的序列可为标记化检测用探针与含检测序列的核酸杂交时面对的序列，和其一部分或全部是不形成碱基对的非互补的序列，也可为其全部是形成碱基对的互补的序列。
在1个实施方式中，标记化检测用探针的5’末端由标记物质标记化。
在别的实施方式中，检测用探针是非标记的寡核苷酸。使用非标记的寡核苷酸时，可通过使用嵌入剂等进行荧光物质信号检测。
在其他实施方式中，作为标记物质，也可使用荧光物质和猝灭剂物质的组合。使用这样2种标记物质时，例如，可在检测用探针的5’末端标记化荧光物质及猝灭剂物质的任一方，在其3’末端标记化另一种标记物质。作为用2种标记物质标记化的检测用探针，例如，可举出TaqMan(商标)探针、分子信标等。这些探针是公知的，在多种刊物、专利文献及其他文献中有记载。例如，对于TaqMan(商标)探针，可参照例如美国专利第5538848号，对于分子信标，可参照例如美国专利第5925517号，这些公开内容通过引用并入本说明书中。在本说明书中，“猝灭剂物质”是指有降低或消光荧光的作用的物质。
检测用探针引发的信号的检测不限定，但由对于检测来自可多数(例如，数千万个)存在的隔区或珠(参照后述的实施方式1)的信号适宜的检测器实施。作为检测器不限定，但可使用显微镜、流式细胞仪、像传感器等。
“流式细胞仪”是向流动池中的粒子(例如，珠)或隔区(例如，液滴)照射激发光，通过取得从每个粒子或隔区发出的荧光等的光学信息，可对粒子进行计数的装置。流式细胞仪可在短时间内测定多数的粒子或隔区，从而优选。
使用显微镜或像传感器时，可对视野摄像，使用摄像的数据检测每种珠或隔区。使用珠时，珠可静止，也可流动。根据信号的种类，可使用荧光显微镜等。
在维持隔区调制工序中调制的隔区的情况下进行信号检测时，在隔区调制工序或其之前的工序中检测用探针被添加到反应系统中。
一方面，在向珠等固定化扩增产物时，也可在维持隔区的情况下进行信号检测，可在信号检测前从隔区取出珠而分散到水性溶剂中。信号检测前从隔区取出珠的方法不特别限定。例如，将油相中的水性液滴作为隔区时，可除去油相而将液相分散于水性溶剂中。另外，在将含珠的孔作为隔区时，可清洗各孔而取出各孔中收容的珠，分散到水性溶剂中。在从隔区取出珠时，可在隔区调制工序中将检测用探针添加到反应系统中，也可在取出珠之后使检测用探针杂交于扩增产物。
在第1实施方式的判断工序中，基于信号检测工序的结果，判断上述核酸检测工序适宜或不适宜。其中，对于从隔区发生信号时的例进行说明。
在判断工序中，首先判断各隔区是生成核酸的扩增产物的隔区与否。检测到信号的隔区(阳性隔区)判断为生成核酸的扩增产物的隔区，检测不到信号的隔区(阴性隔区)判断为未生成核酸的扩增产物的隔区。
在阳性判断时，优选比较指定的阈值和从隔区检测的信号强度(阳性判断中使用的阈值也称为“第1阈值”)。孔等的固相载体有时有其自体原本信号(例如自身荧光)。例如，当孔含珠，其珠自体有自身荧光时，作为信号从孔检测到微弱的荧光。为了将这样的隔区判断为阴性隔区，使用上述的第1阈值。
由于目标核酸的扩增产物引发的荧光强度与精度管理用多核苷酸的扩增产物引发的荧光强度不同，为了区别这些可使用第2阈值。第2阈值成为比第1阈值高的值。在精度管理用多核苷酸的扩增产物引发的荧光强度比目标核酸的扩增产物引发的荧光强度大时，可将第1阈值以上不足第2阈值的阳性隔区(以下也称为“第1阳性隔区”)判断为生成目标核酸的扩增产物的隔区。可将第2阈值以上的阳性隔区(以下也称为“第2阳性隔区”)判断为生成精度管理用多核苷酸的扩增产物的隔区。
另外，也可将检测不到信号的隔区(阴性隔区)判断为未生成核酸的扩增产物的隔区。当信号不足第1阈值时可判断为阴性隔区。
当使用固定化引物的珠，检测从珠发出的信号时，可从隔区取出珠，不是每隔区，而是珠每进行阳性－阴性的判断。此时，也可与上述的隔区的阳性－阴性的判断同样地进行珠的阳性－阴性的判断。即，可将第1阈值以上不足第2阈值的珠判断为第1阳性珠，将第2阈值以上的珠判断为第2阳性珠。再者，也可将发生不足第1阈值的信号的珠判断为阴性珠。
当使用流式细胞仪检测从珠发出的信号时，使从隔区取出的珠流过流动池，检测到从各珠发出的信号。此时，也可制成标绘各珠的信号强度的2维散点图(以下也称为“2D散点图”)，在散点图上识别第1阳性珠的群集及第2阳性珠的群集，进行第1阳性珠及第2阳性珠的判断。不管有无珠，在使隔区自体流过流动池而进行信号检测时也是同样。
接下来，基于在判断工序中阳性隔区或阳性珠的判断结果，判断上述核酸检测工序适宜或不适宜。
例如，对第2阳性隔区的个数进行计数，在计数结果在第3阈值以上时，可判断核酸检测工序适宜。由于在计数结果不足第3阈值时认为精度管理用多核苷酸不正常扩增，可判断核酸检测工序不适宜。另外，虽然在此例中进行第2阳性隔区的计数及计数结果和阈值的比较，但使用从第2阳性隔区发生的荧光强度的总和或发生荧光的面积的总和等也可进行同样的判断。另外，使用珠时也可进行同样的判断。
第1阈值及第2阈值可由标记物质的种类或信号的强度等适宜设定。可使用多个核酸样品预先检测阳性隔区或阳性珠变成何程度的信号强度设定为可最高精度分类阴性和第1阳性和第2阳性的阈值。
第3阈值可基于核酸样品中的精度管理用多核苷酸的浓度(拷贝数)等适宜设定。
[变异检测中的精度管理]
本发明的第1实施方式涉及的核酸扩增的精度管理方法能适用于目标核酸的变异检测中的精度管理方法。从而，第1实施方式之一的实施方式是目标核酸的变异检测中的精度管理方法。
再者，在本说明书中，“变异”是指在核酸的碱基序列中与一般被识别为野生型的序列不同。例如，可举出核酸中的核苷酸的取代、缺失、附加、染色体转座等。更具体而言，可例示突变或单核苷酸多态性(SNP)等。
在变异检测中，目标核酸被检测为变异型核酸或野生型核酸。为了变异检测，在目标核酸的扩增产物中使用与变异型核酸杂交的检测用探针和与野生型核酸杂交的检测用探针，由哪个杂交来判断是变异型或野生型。在变异型的目标核酸中含变异型的检测序列(以下也称为“Mut检测序列”)，在野生型的目标核酸中含野生型的检测序列(以下也称为“Wt检测序列”)。以下，作为本发明的一实施方式，对于目标核酸的变异检测中的精度管理方法进行说明。
此实施方式的方法包括核酸检测工序和判断工序。核酸检测工序与上述同样、包括核酸样品的调制工序、隔区的调制工序、核酸扩增工序及信号检测工序。
在此实施方式涉及的核酸样品的调制工序中，例如，通过将含目标核酸的样品和含精度管理用多核苷酸的样品混合，调制核酸样品。
作为精度管理用多核苷酸，使用Mut检测序列的检测涉及的精度管理用多核苷酸(以下也称为“Mut精度管理用多核苷酸”)及Wt检测序列的检测涉及的精度管理用多核苷酸(以下也称为“Wt精度管理用多核苷酸”)的任一方或两方。Mut精度管理用多核苷酸含结合后述的变异型检测用探针的Mut检测序列及与Mut检测序列互补的序列的任一方或两方。因此，Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物与变异型检测用探针结合，发生变异型检测用探针引发的信号。Wt精度管理用多核苷酸含结合后述的野生型检测用探针的Wt检测序列及与Wt检测序列互补的序列的任一方或两方。因此，Wt精度管理用多核苷酸的扩增产物与野生型检测用探针结合，发生野生型检测用探针引发的信号。
在将后述的仅变异型检测用探针作为检测用探针使用时，优选使用至少Mut精度管理用多核苷酸。当作为检测用探针使用变异型检测用探针及野生型检测用探针的两方时，使用Mut精度管理用多核苷酸及Wt精度管理用多核苷酸的任一方或两方。
与上述的精度管理用多核苷酸相关的其他特征也适用于Mut精度管理用多核苷酸、Wt精度管理用多核苷酸。
此实施方式的隔区调制工序、核酸扩增工序及信号检测工序如关于第1实施方式在上所述实施。
作为检测用探针使用含与Mut检测序列互补的序列的变异型检测用探针。当目标核酸含变异时，由于变异型检测用探针结合于目标核酸的扩增产物，检测到变异型检测用探针引发的信号。作为检测用探针也优选使用还含与Wt检测序列互补的序列的野生型检测用探针。变异型检测用探针引发的信号与野生型检测用探针引发的信号是互相不同的种类。例如，作为野生型检测用探针，可使用标记FAM的寡核苷酸，作为变异型检测用探针，可使用标记Cy5的寡核苷酸。关于野生型检测用探针及变异型检测用探针的特征也适用于这些变异型检测用探针、野生型检测用探针。
在此实施方式的信号检测工序中，进行检测用探针引发的信号的检测。在使用变异型检测用探针和野生型检测用探针时，检测到变异型检测用探针引发的信号和野生型检测用探针引发的信号。
在此实施方式的判断工序中，基于信号检测工序的结果，判断有无变异和上述核酸检测工序适宜或不适宜。
其中，首先，作为检测用探针，对于仅使用变异型检测用探针的例进行说明。在此例中，在核酸样品的调制工序中调制的核酸样品含目标核酸和Mut精度管理用多核苷酸和珠。在核酸扩增工序中，可得到结合了目标核酸的扩增产物的珠和结合了Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠。其中，在信号检测工序之前从隔区取出珠。在将从隔区取出的珠分散到水性介质之后，加变异型检测用探针。
在判断工序中，如上所述，首先，判断各珠是结合核酸的扩增产物的珠与否。目标核酸的扩增产物及精度管理用多核苷酸的扩增产物和检测用探针的杂交在严格的条件下进行。从结合了含Mut检测序列的目标核酸的扩增产物的珠、结合了Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠得到了变异型检测用探针引发的信号。一方面，从结合了含Wt检测序列的目标核酸的扩增产物的珠得不到变异型检测用探针引发的信号。
检测不到变异型检测用探针引发的信号的珠(阴性珠)被判断为未结合核酸的扩增产物的珠及结合了含Wt检测序列的目标核酸的扩增产物的珠的任何。检测到变异型检测用探针引发的信号的珠(阳性珠)被判断为结合了含Mut检测序列的核酸的扩增产物的珠。在此阳性判断中，如上所述，也可使用与信号强度相关的阈值(第1阈值)。
如上所述，基于目标核酸的扩增产物的信号强度和基于精度管理用多核苷酸的扩增产物的信号强度不同。也可使用用于区别这些的第2阈值。
当基于Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的信号强度比基于含Mut检测序列的目标核酸的扩增产物的信号强度大时，可将第1阈值以上不足第2阈值的阳性珠(以下也称为“第1阳性珠”)判断为结合了含Mut检测序列的目标核酸的扩增产物的珠。可将第2阈值以上的阳性珠(以下也称为“第2阳性珠”)判断为结合了Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠。
在判断工序中，进行目标核酸中的有无变异的判断。在有无变异的判断中，例如，对第1阳性珠的个数进行计数，在其计数结果在第3阈值以上时，可判断为有变异(阳性)。对第1阳性珠的个数进行计数，其计数结果不足第3阈值时，可判断为无变异(阴性)。
在此例中进行第1阳性珠的计数结果和阈值的比较，但使用从第1阳性珠发生的荧光强度的总和等也可进行同样的判断。
另外，在此例中，虽从隔区取出珠，但可在将珠保持在隔区的情况下，基于从隔区发出的信号检测的结果进行同样的判断。也可不使用珠而进行核酸样品的调制工序、隔区的调制工序、核酸扩增工序，接下来，维持隔区地进行信号检测工序，基于从隔区发出的信号检测的结果进行同样的判断工序。
接下来，在判断工序中，判断核酸检测工序适宜或不适宜。
例如，对第2阳性珠的个数进行计数。在其计数结果在第3阈值以上时，可判断上述核酸检测工序适宜。在第2阳性珠的个数的计数结果不足第3阈值时，可判断上述核酸检测工序不适宜。对应于珠的个数的第3阈值可由核酸样品中的精度管理用多核苷酸的浓度(拷贝数)等适宜设定。
在判断核酸检测工序适宜时，可判断目标核酸中的有无变异的判断结果有信赖性。在判断核酸检测工序不适宜时，可判断目标核酸中的有无变异的判断结果缺信赖性。此时，目标核酸中的变异检测的判断结果，即阳性及阴性各自可判断为有假阳性及假阴性的可能性。如此，由第1实施方式之一的实施方式，对目标核酸的变异检测的判断结果可提供怀疑假阳性或假阴性的结果。由此，可提高目标核酸的变异检测的精度。
而且，在判断核酸检测工序不适宜时，预测核酸检测工序的任何工序不适宜。从而，由此实施方式，可通过提供核酸检测工序不适宜的判断结果，适宜验证其目标核酸的变异检测中的不适宜的工序。
接下来，对于在判断工序中使用变异型检测用探针和野生型检测用探针的例进行说明。在此例中，用核酸样品的调制工序调制的核酸样品含目标核酸、Mut精度管理用多核苷酸和Wt精度管理用多核苷酸和珠。在核酸扩增工序中，得到结合了目标核酸的扩增产物的珠、结合了Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠和结合了Wt精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠。在信号检测工序之前从隔区取出珠。在将从隔区取出的珠分散到水性介质之后，加变异型检测用探针及野生型检测用探针。
虽从结合了含Mut检测序列的目标核酸的扩增产物的珠、结合了Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠得到变异型检测用探针引发的信号，但得不到野生型检测用探针引发的信号。同样地，从结合了含Wt检测序列的目标核酸的扩增产物的珠、Wt精度管理用多核苷酸的扩增产物得到野生型检测用探针引发的信号，但得不到变异型检测用探针引发的信号。
可将变异型检测用探针引发的信号及野生型检测用探针引发的信号都检测不到的珠(阴性珠)判断为未结合核酸的扩增产物的珠。检测到变异型及野生型检测用探针的任一方引发的信号，检测不到另一方引发的信号的珠(阳性珠)可判断为结合了核酸的扩增产物的珠。在此阳性判断中，如上所述，也可使用与信号强度相关的阈值(第1阈值)。即，作为与野生型检测用探针引发的信号强度比较的第1阈值也可使用“第1阈值(Wt)”。另外，作为与变异型检测用探针引发的信号强度比较的第1阈值，也可使用“第1阈值(Mut)”。
如上所述，基于目标核酸的扩增产物的信号强度和基于精度管理用多核苷酸的扩增产物的信号强度不同。用于区别这些的第2阈值可用于各检测用探针引发的信号。即，作为关于野生型检测用探针引发的信号强度的第2阈值，可使用“第2阈值(Wt)”。作为关于变异型检测用探针引发的信号强度的第2阈值，可使用“第2阈值(Mut)”。对应于各信号的第2阈值各自成为比第1阈值高的值。
以下在此例中，对于基于Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的信号强度比基于含Mut检测序列的目标核酸的扩增产物的信号强度大，基于Wt精度管理用多核苷酸的扩增产物的信号强度比基于含Wt检测序列的目标核酸的扩增产物的信号强度大的情况进行说明。
可将第1阈值(Mut)以上不足第2阈值(Mut)且不足第1阈值(Wt)的阳性珠(以下也称为“第1阳性珠(Mut)”)判断为结合了含Mut检测序列的目标核酸的扩增产物的珠。可将第2阈值(Mut)以上且不足第1阈值(Wt)的阳性珠(以下也称为“第2阳性珠(Mut)”)判断为结合了Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠。可将第1阈值(Wt)以上第2阈值(Wt)不足且不足第1阈值(Mut)的阳性珠(以下也称为“第1阳性珠(Wt)”)判断为结合了含Wt检测序列的目标核酸的扩增产物的珠。可将第2阈值(Wt)以上且不足第1阈值(Mut)的阳性珠(以下也称为“第2阳性珠(Wt)”)判断为结合了Wt精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠。
在判断工序中，如上所述，进行有无变异的判断。在有无变异的判断中，例如，可以在目标核酸的浓度(全拷贝数)之中，仅哪个浓度(拷贝数)的目标核酸含Mut检测序列(即，含Mut检测序列的目标核酸的拷贝数对目标核酸的全拷贝数的比例：(含Mut检测序列的目标核酸的拷贝数)/(目标核酸的全拷贝数))作为指标进行判断。此比例通过用第1阳性珠(Mut)的个数和第1阳性珠(Wt)的个数的合计数除以第1阳性珠(Mut)的个数来算出(＝(第1阳性珠(Mut)的个数)/[(第1阳性珠(Mut)的个数+(第1阳性珠(Wt)的个数)])。当算出的比例在对应于此比例的第3阈值以上时，可判断为有变异(阳性)。当此比例不足指定的阈值时，可判断为无变异(阴性)。作为判断的指标，不限于此，如上所述，当第1阳性珠(Mut)的个数在对应于珠的个数的第3阈值以上时可判断为有变异(阳性)，在不足上述第3阈值时可判断为无变异(阴性)。
在判断工序中，判断核酸检测工序适宜或不适宜。
例如，对第2阳性珠(Mut)的个数及第2阳性珠(Wt)的个数各自进行计数。
在第2阳性珠(Mut)的计数结果不足第3阈值(Mut)或第2阳性珠(Wt)的计数结果不足第3阈值(Wt)时，可判断为核酸检测工序不适宜，可判断为有无变异的检测结果信赖性低。此时，可将有无变异的检测结果记为“信赖性低”而输出，也可不输出。
当第2阳性珠(Mut)的计数结果是第3阈值(Mut)以上，并且第2阳性珠(Wt)的计数结果是第3阈值(Wt)以上时，可判断核酸检测工序适宜，可赋予有无变异的检测结果信赖性。
另外，当第2阳性珠(Mut)的计数结果不足对应于第2阳性珠(Mut)的第3阈值时，可判断关于含Mut检测序列的目标核酸的核酸检测工序不适宜。由此，可判断为目标核酸中的有无变异的判断结果缺信赖性。此时，可判断为目标核酸中的变异检测的判断结果，即阳性及阴性各自有假阳性及假阴性的可能性。如上所述，根据需要，也可进行用于验证核酸检测工序的任何的工序不适宜的追试。
在上述例中，虽从隔区取出珠，但可在将珠保持在隔区的情况下，基于从隔区发出的信号检测的结果进行同样的判断。另外，也可不使用珠而进行核酸样品的调制工序、隔区的调制工序、核酸扩增工序，接下来，维持隔区地进行信号检测工序，基于从隔区发出的信号检测的结果同样地进行判断工序。
虽在上述的变异检测的精度管理方法中使用2种精度管理用多核苷酸，但在其中，对于可使用1种精度管理用多核苷酸，实施变异检测的精度管理方法的例进行说明。此例中的精度管理用多核苷酸在第3区域含Wt检测序列及与上述检测序列互补的序列的任一方或其两方，并且含Mut检测序列及与上述检测序列互补的序列的任一方或其两方(以下也称为“Wt和Mut精度管理用多核苷酸”)。
在此例中，用核酸样品的调制工序调制的核酸样品含目标核酸、Wt和Mut精度管理用多核苷酸和珠。在核酸扩增工序中，可得到结合了目标核酸的扩增产物的珠和结合了Wt和Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠。其中，在信号检测工序之前从隔区取出珠。在将从隔区取出的珠分散到水性介质之后，加变异型检测用探针及野生型检测用探针。
在此实施方式中的检测工序中，与上述同样地，从结合了目标核酸的扩增产物的珠取得同样的信号。
Wt和Mut精度管理用多核苷酸含Wt检测序列和Mut检测序列的两方。从而，使Wt和Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物和检测用探针在严格的条件下杂交，则可得到变异型检测用探针引发的信号和野生型检测用探针引发的信号。
检测不到变异型检测用探针引发的信号，并且检测不到野生型检测用探针引发的信号的珠(阴性珠)被判断为未结合核酸的扩增产物的珠。检测到变异型检测用探针和野生型检测用探针引发的两方的信号的珠被判断为结合了Wt和Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠(以下也称为“Wt和Mut阳性珠”)。
在此阳性判断中，如上所述，也可使用与信号强度相关的阈值(第1阈值)。即，作为与野生型检测用探针引发的信号强度比较的第1阈值，可使用“第1阈值(Wt)”。另外，作为与变异型检测用探针引发的信号强度比较的第1阈值，可使用“第1阈值(Mut)”。
Wt和Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物中的Wt检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数与含Wt检测序列的目标核酸的扩增产物中的Wt检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数不同。同样地，Wt和Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物中的Mut检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数与含Mut检测序列的目标核酸的扩增产物中的Mut检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数不同。从而，基于目标核酸的扩增产物的各检测用探针引发的信号强度和基于Wt和Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的各检测用探针引发的信号强度不同。用于区别这些各信号强度的差异的第2阈值可用于各检测用探针引发的信号。即，作为关于野生型检测用探针引发的信号强度的第2阈值，可使用“第2阈值(Wt)”。作为关于变异型检测用探针引发的信号强度的第2阈值，可使用“第2阈值(Mut)”。对应于各信号的第2阈值各自成为比第1阈值高的值。
以下在此例中，对于基于Wt和Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的信号强度比基于含Wt检测序列的目标核酸的扩增产物的信号大，并且基于Wt和Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的信号强度比基于含Mut检测序列的目标核酸的扩增产物的信号强度大的情况进行说明。可将第1阈值(Mut)以上不足第2阈值(Mut)且不足第1阈值(Wt)的阳性珠(第1阳性珠(Mut))判断为结合了含Mut检测序列的目标核酸的扩增产物的珠。可将第1阈值(Wt)以上第2阈值(Wt)不足且不足第1阈值(Mut)的阳性珠(第1阳性珠(Wt))判断为结合了含Wt检测序列的目标核酸的扩增产物的珠。可将是第2阈值(Wt)以上，并且，第2阈值(Mut)以上的阳性珠(以下也称为“第2阳性珠(Wt和Mut)”)判断为结合了Wt和Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠(Wt和Mut阳性珠)。
在判断工序中，与上述实施方式同样地，判断有无变异。例如，在第1阳性珠(Mut)的个数对应于第1阳性珠(Mut)的个数的第3阈值以上时判断为有变异(阳性)，在不足上述第3阈值时可判断为无变异(阴性)。另外，如上所述，也可以在目标核酸的浓度(全拷贝数)之中，仅哪个浓度(拷贝数)的目标核酸含Mut检测序列作为指标判断有无变异。这些是例示，判断有无变异的方法不限于此。
在判断工序中，判断上述核酸检测工序适宜或不适宜。
使用1种Wt和Mut精度管理用多核苷酸的精度管理方法中的判断工序和使用上述的Wt精度管理用多核苷酸和Mut精度管理用多核苷酸这2种的精度管理方法中的判断工序除下述情况外，同样地进行。
在使用上述的Wt精度管理用多核苷酸和Mut精度管理用多核苷酸这2种的精度管理方法中，从第2阳性珠(Wt)判断关于含Wt检测序列的目标核酸的核酸检测工序适宜或不适宜。另外，从第2阳性珠(Mut)判断关于含Mut检测序列的目标核酸的核酸检测工序适宜或不适宜。即，在使用2种精度管理用多核苷酸时，基于2种阳性珠，判断与含Wt检测序列的目标核酸相关的核酸检测工序和与含Mut检测序列的目标核酸相关的核酸检测工序适宜或不适宜。
与此相比，作为精度管理用多核苷酸，在使用1种Wt和Mut精度管理用多核苷酸的精度管理方法中，从1种阳性珠(Wt和Mut阳性珠)，判断与含Wt检测序列的目标核酸相关的核酸检测工序和与含Mut检测序列的目标核酸相关的核酸检测工序适宜或不适宜。
例如，对Wt和Mut阳性珠的个数进行计数。当其计数结果在对应于Wt和Mu阳性珠的个数的第3阈值以上时，可判断为核酸检测工序适宜。当Wt和Mut阳性珠的个数的计数结果不足对应于Wt和Mut阳性珠的个数的第3阈值时，可判断为核酸检测工序不适宜。
在判断为核酸检测工序不适宜时，假定含核酸样品的调制工序、隔区的调制工序、核酸扩增工序及信号检测工序的核酸检测工序的哪个工序不适宜。哪个工序不适宜，如上所述，可通过进行追试等来进行适宜验证。
在使用1种Wt和Mut精度管理用多核苷酸的精度管理方法中，也与使用上述的2种精度管理用多核苷酸的精度管理方法同样地，对目标核酸的变异检测的判断结果给使有信赖性或缺信赖性的判断成为可能的结果。
接下来，参照附图，对于本发明之一的实施方式涉及的实施方式进行说明。再者，以下的说明全部旨在例示而非限制，不以任何方式限定随附的专利权利要求中记载的发明。
[实施方式1]
图1是显示实施方式1涉及的核酸检测工序的模式图。在实施方式1中，向油相中的水性液滴封入珠而进行数字PCR，进行核酸检测。
本实施方式中使用的“珠”的材质不特别限定。可使用金属制粒子、树脂制粒子等。作为金属制粒子的材质的具体例，可例示金、银、铜、铁、铝、镍、锰、钛、这些的氧化物等。另外，也可为这些的合金。作为树脂制粒子的材质的具体例，可例示聚苯乙烯、乳胶等。也可使珠带磁性(以下也称为“磁性珠”)。
首先，调制含目标核酸、精度管理用多核苷酸、在表面结合目标核酸扩增用引物组之中的一方的引物的珠和对于此外的核酸扩增必要的试剂的核酸样品(图1(i))。实施方式1中使用的目标核酸含1个检测序列(n＝1)，精度管理用多核苷酸含2个检测序列(n＝2)。将作为水相的核酸样品、油相、及乳化剂混合，由搅拌等形成多个油相中的水性液滴(隔区)(图1(ii))。由于此水性液滴比目标核酸或精度管理用多核苷酸的拷贝数大过量形成，从而在理论上单一的水性液滴中含精度管理用核酸一分子或目标核酸一分子。另外，由于水性液滴数还比珠数大过量形成，理论上变得在单一的水性液滴中含1个珠。通常，在数字PCR中，形成数千万个液滴，在其中的0.1～1％左右含目标核酸一分子或精度管理用多核苷酸一分子和1个结合了引物的珠(图1(ii)(b)、(c))。在此外的液滴中通常缺少任何的成分(图1(ii)(a1)～(a4))、在珠上的核酸扩增不进行(图1(iii)(a1)～(a4))。通过对水性液滴集团实施PCR法，在含目标核酸一分子或精度管理用多核苷酸一分子和结合引物的珠1个的水性液滴中，在珠上结合延伸的扩增产物(图1(iii)(b)、(c))。
接下来，将水性液滴(隔区)由公知的手段(例如，表面活性剂添加)破坏(破坏工序)、由离心分离等除去含未结合到珠的扩增产物或未反应成分的上清(B/F分离工序)，回收珠。使得用荧光物质预先标记化的检测用探针在严格的条件下杂交于回收的珠上的扩增产物。再次、进行B/F分离，除去未杂交的检测用探针。其后，对每种珠照射激发光(λ1)，测定来自各珠的荧光信号(λ2)(信号检测工序)。由此，得到关于结合到珠上的扩增产物的信号。在信号的检测中，使用流式细胞仪。
在结合精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠(图1(iii)(c))中，比结合了目标核酸的扩增产物的珠(图1(iii)(b))可杂交约2倍的数的检测用探针。由此杂交的检测用探针的数的差异，从结合了精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠可得到计算上比从结合了目标核酸的扩增产物的珠得到的荧光信号强度强约2倍的荧光信号强度。
其中，隔区的调制由微乳剂的形成进行。微乳剂可由移液器吸吐等的搅拌操作形成核酸样品、油相及乳化剂的混合物。在1个实施方式中，形成的微乳剂不限定，但水相可为10～30％(v/v)，油相可为60～85％(v/v)，乳化剂可为5～10％(v/v)。由于数字PCR伴随热循环，乳化剂优选是热稳定性的。
在实施方式1中，在利用数字PCR的核酸扩增中，虽使目标核酸扩增用引物组的一方的引物结合到珠上，但在本发明的实施方式涉及的核酸扩增中结合于珠上的引物的种类不限于1种。在实施方式1的变形例中，也可使目标核酸扩增用引物组的两方结合到珠上。
在实施方式1中，破坏工序后，用荧光染料预先标记化，使用在探针单独的状态下显示信号、杂交之后也显示信号的检测用探针。这样的标记化检测用探针在将不与扩增产物杂交的检测用探针可由B/F分离除去的实施方式中有利地使用。
在实施方式1的变形例中，可在隔区的调制前在核酸样品中使用在探针单独的状态下不显示信号，在杂交的状态下显示信号的探针、例如分子信标探针。由此变形例能不破坏水性液滴(隔区)而在维持隔区的状态下，检测关于来自各隔区的核酸扩增的信号。
基于来自结合精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠的信号的检测结果，判断核酸检测工序适宜或不适宜。如上所述，在判断为核酸检测工序适宜时，可判断为目标核酸的检测结果有信赖性。在判断为核酸检测工序不适宜时，可判断为目标核酸的检测结果缺信赖性。如此，由实施方式1可管理核酸的检测结果的精度－品质。
[实施方式2]
实施方式2关于目标核酸的变异检测中的精度管理方法。图2是显示实施方式2中的核酸扩增的种类(b)及检测信号的2D散点图(a)的模式图。
在实施方式2中，对于使用变异型的目标核酸及野生型的目标核酸混在的样品的情况进行说明。作为精度管理用多核苷酸，使用Mut检测序列的检测用的精度管理用多核苷酸(Mut精度管理用多核苷酸)和Wt检测序列的检测用的精度管理用多核苷酸(Wt精度管理用多核苷酸)的2种。Mut精度管理用多核苷酸含5个Mut检测序列，Wt精度管理用多核苷酸含5个Wt检测序列。
在实施方式2中，核酸样品的调制、隔区调制及核酸扩增工序与实施方式1同样地实施。在实施方式2中的核酸扩增工序中，由目标核酸扩增用引物组(第1引物及第2引物)，可扩增Wt精度管理用多核苷酸(图2(b)(i))、含Wt检测序列的目标核酸(图2(b)(ii))、Mut精度管理用多核苷酸(图2(b)(iii))及含Mut检测序列的目标核酸(图2(b)(iv))。由此，可得到结合了Wt精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠、结合了含Wt检测序列的目标核酸的扩增产物的珠、结合了Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠、及结合了含Mut检测序列的目标核酸的扩增产物的珠。
与实施方式1同样地从隔区回收上述珠。使检测用探针在严格的条件下杂交于回收的珠。在实施方式2中，使用向用荧光物质Cy5标记化的Mut检测序列杂交的检测用探针(以下也称为“Mut检测用探针(Cy5)”)和向用荧光物质FAM标记化的Wt检测序列杂交的检测用探针(以下也称为“Wt检测用探针(FAM)”)。通过将不同的荧光物质标记化，各检测用探针发互相不同的荧光信号。在使上述检测用探针杂交之后，进行B/F分离，除去未杂交的检测用探针。由流式细胞仪，检测来自珠的信号。
图2a是x轴示分配Mut检测用探针(Cy5)来源的荧光信号强度，y轴示分配Wt检测用探针(FAM)来源的荧光信号强度的2D散点图。
由于含Mut检测序列的目标核酸含1个Mut检测序列(n＝1)，Mut精度管理用多核苷酸含5个Mut检测序列(n＝5)，1个Mut检测用探针(Cy5)可杂交于结合了含Mut检测序列的目标核酸的扩增产物的珠，5个Mut检测用探针(Cy5)可杂交于结合了Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠。从而，从结合了Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠得到的Cy5来源的荧光信号强度比从结合了含Mut检测序列的目标核酸的扩增产物的珠得到的Cy5来源的荧光信号强度大。
目标核酸的扩增产物及精度管理用多核苷酸的扩增产物和检测用探针的杂交在严格的条件下进行。从而，从含Mut检测序列的目标核酸的扩增产物和Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物，FAM来源的荧光信号是检测界限以下或即使有也仅略微检测到。
在图2a中，将用于区别珠等的自身荧光和来自结合了含Mut检测序列的目标核酸的扩增产物的珠的荧光信号的阈值作为第1阈值(Cy5)显示。另外，将用于区别来自结合了含Mut检测序列的目标核酸的扩增产物的珠的荧光信号和来自结合了Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠的荧光信号的阈值作为第2阈值(Cy5)显示。
在结合了含Mut检测序列的目标核酸的扩增产物的珠可标绘在第1阈值(Cy5)和第2阈值(Cy5)之间，不足后述的第1阈值(FAM)的区(iv)。结合了Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠可标绘在第2阈值(Cy5)以上且不足后述的第1阈值(FAM)的区(iii)。
同样地，由于含Wt检测序列的目标核酸含1个(n＝1)Wt检测序列，Wt精度管理用多核苷酸含5个(n＝5)Wt检测序列，1个Wt检测用探针(FAM)可杂交于结合了含Wt检测序列的目标核酸的扩增产物的珠，5个Wt检测用探针(FAM)可杂交于结合了Wt精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠。核酸的扩增产物和检测用探针的杂交在严格的条件下进行。从而，从结合了Wt精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠得到的FAM来源的荧光信号强度比从结合了含Wt检测序列的目标核酸的扩增产物的珠得到的FAM来源的荧光信号强度大。另外，从它们扩增产物，Cy5来源的荧光信号是检测界限以下或即使有也仅略微检测到。
在图2a中，将用于区别珠等的自身荧光和来自结合了含Wt检测序列的目标核酸的扩增产物的珠的荧光信号的阈值作为第1阈值(FAM)显示。另外，将用于区别来自结合了含Wt检测序列的目标核酸的扩增产物的珠的荧光信号和来自结合了Wt精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠的荧光信号的阈值作为第2阈值(FAM)显示。
在结合了含Wt检测序列的目标核酸的扩增产物的珠可标绘在第1阈值(FAM)和第2阈值(FAM)之间，不足第1阈值(Cy5)的区(ii)。结合了Wt精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠可标绘在第2阈值(FAM)以上且不足第1阈值(Cy5)的区(i)。
在实施方式2的判断工序中，判断有无变异。例如，可以目标核酸的浓度(全拷贝数)之中仅哪个浓度(拷贝数)的目标核酸含Mut检测序列作为指标而进行判断。在可标绘有结合了目标核酸的扩增产物的珠的区(ii)和区(iv)的两方有点时，算出相对于区(ii)的点数和区(iv)的点数的合计的区(iv)的点数的比例(＝(区(iv)的点数)/[(区(ii)的点数)+(区(iv)的点数)])。在其比例在指定的阈值以上时，可判断为有变异。
在判断工序中，判断核酸检测工序适宜或不适宜。
在实施方式2中，在可标绘有结合了Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠的区(iii)中存在的点的数在指定的阈值以上时，可判断为关于含Mut检测序列的目标核酸的核酸检测工序适宜。此判断结果提示目标核酸的有无变异的判断结果有信赖性。
在实施方式2中，也得到来自Wt精度管理用多核苷酸的野生型检测用探针引发的信号。在可标绘有结合了Wt精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠的区(i)中存在的点的数在指定的阈值以上时，可判断为关于含Wt检测序列的目标核酸的核酸检测工序适宜。基于此区(i)的判断结果可给对于上述的基于区(iii)的判断结果(关于含Mut检测序列的目标核酸的核酸检测工序适宜)的信赖性。
如此，通过使用2种精度管理用多核苷酸，与使用1种精度管理用多核苷酸的情况比，可使目标核酸中的精度管理的信赖性进一步提高，结果，目标核酸的变异检测的精度可进一步提高。
在区(iii)中存在的点的数不足指定的阈值时，可判断为关于含Mut检测序列的目标核酸的核酸检测工序不适宜。此判断结果提示目标核酸的有无变异的判断结果欠信赖性。鉴于核酸检测工序不适宜的判断结果，如需要，也可为了验证核酸检测工序的任何的工序是否不适宜而进行追试。其中，在区(i)中存在的点的数在指定的阈值以上时，可判断为关于含Wt检测序列的目标核酸的核酸检测工序适宜。此时，如上所述，作为上述追试，在核酸检测工序之中，可假定为信号检测工序不适宜。
如此，通过使用2种精度管理用多核苷酸，与使用1种精度管理用多核苷酸的情况比，关于与目标核酸相关的核酸检测工序的任何的工序不适宜而可得到附加的的信息，从而有利。
[实施方式2的变形例]
在实施方式2中，使用变异型检测用探针、野生型检测用探针的2种检测用探针和2种精度管理用多核苷酸(Mut精度管理用多核苷酸和Wt精度管理用多核苷酸)。其中，说明使用1种精度管理用多核苷酸和上述的2种检测用探针的目标核酸的变异检测中的精度管理方法。
在此变形例中，作为精度管理用多核苷酸，使用含2个Wt检测序列、2个Mut检测序列的多核苷酸(以下也称为“Wt和Mut精度管理用多核苷酸”)。目标核酸，与实施方式2同样、含1个Mut检测序列或Wt检测序列。检测用探针，与实施方式2同样，使用Wt检测用探针(FAM)、Mut检测用探针(Cy5)。在此变形例中，核酸检测工序与实施方式2同样地实施。
在图2a中，结合了含Wt检测序列的目标核酸的扩增产物的珠，与实施方式2同样、标绘在区(ii)。另外，结合了含Mut检测序列的目标核酸的扩增产物的珠标绘在区(iv)。
在结合了Wt和Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠中，可杂交2个Wt检测用探针(FAM)，可杂交2个Mut检测用探针(Cy5)。从而，从结合了Wt和Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠得到的FAM来源的荧光信号强度比从结合了含Wt检测序列的目标核酸的扩增产物的珠得到的FAM荧光信号强度大。同样地，从上述珠得到的Cy5来源的荧光信号强度比从结合了含Mut检测序列的目标核酸的扩增产物的珠得到的Cy5荧光信号强度大。
在此变形例中，为了区别基于目标核酸的扩增产物的各检测用探针引发的荧光信号强度和基于Wt和Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的各检测用探针引发的荧光信号强度而使用第2阈值。对于Mut检测用探针(Cy5)引发的信号称为第2阈值(Cy5)，对于Wt检测用探针(FAM)引发的信号称为第2阈值(FAM)(未在图2a中图示)。
结合了Wt和Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠可标绘在第2阈值(FAM)以上，并且，第2阈值(Cy5)以上的区(图2a、区(v))。
此变形例中的有无变异的判断，与实施方式2同样、算出区(iv)的点数对区(ii)的点数和区(iv)的点数的合计的比例(＝(区(iv)的点数)/[(区(ii)的点数)+(区(iv)的点数)])，其比例在指定的阈值以上时，可判断为有变异。
此变形例中的核酸检测工序适宜与否的判断，在可标绘有结合了Wt和Mut精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠的区(v)的点的数不足指定的阈值时，可判断为目标核酸的变异检测中的核酸检测工序不适宜。一方面，区(v)的点的数在指定的阈值以上时，可判断为目标核酸的变异检测中的核酸检测工序适宜。基于这些判断结果，可如在实施方式2中记载进行目标核酸的变异检测的精度管理。
[实施方式3]
图3是显示实施方式3涉及的核酸检测工序的模式图。在实施方式3中，与实施方式1不同，显示由液滴型的数字PCR进行核酸扩增之后，不破坏隔区而从各隔区检测信号的例。
在实施方式3中，调制含目标核酸、精度管理用多核苷酸、能与检测序列杂交的TaqMan(商标)探针(检测用探针)、有5’→3’外切核酸酶活性的聚合酶(未图示)和对此外的核酸扩增必要的试剂的核酸样品(图3(i))。实施方式3中使用的目标核酸及精度管理用多核苷酸，与在实施方式1中使用的同样、目标核酸含1个检测序列(n＝1)，精度管理用多核苷酸含2个检测序列(n＝2)。
在隔区调制工序中，与实施方式1同样地，形成油相中的水性液滴(隔区)(图3(ii))。在形成的多数的水性液滴之中，调制含目标核酸一分子或精度管理用多核苷酸一分子和多个TaqMan(商标)探针的水性液滴(图3(ii)(b)、(c))。通过对水性液滴集团实施PCR法，在含目标核酸一分子或精度管理用多核苷酸一分子的水性液滴中，在其水性液滴中生成核酸的扩增产物(图3(iii)(b)、(c))。在此外的水性液滴中通常缺目标核酸和精度管理用多核苷酸(图3(ii)(a))、在这样的水性液滴中，即使实施PCR法，也不进行核酸扩增(图3(iii)(a))。在核酸扩增工序中，TaqMan(商标)探针由聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性分解。伴随TaqMan(商标)探针的分解而荧光物质与猝灭剂物质隔离，成为能发荧光的状态。在目标核酸的情况中，由第一次的核酸扩增，由每一条链的扩增而一分子的TaqMan(商标)探针可分解。由此，成为一分子的荧光物质能发荧光的状态。在精度管理用多核苷酸的情况中，由第一次的核酸扩增，由每1条链的扩增而二分子的TaqMan(商标)探针可分解。由此，成为二分子的荧光物质能发荧光的状态。
在信号检测工序中，对每种水性液滴照射激发光(λ1)，测定来自各水性液滴的荧光信号(λ2)。测定的荧光信号强度可反映成为能发荧光的荧光物质的数。认为可在含精度管理用多核苷酸一分子的水性液滴中存在的能发荧光的荧光物质的数比可在含目标核酸一分子的水性液滴中存在的能发荧光的荧光物质的数多约2倍。由此能发荧光的荧光物质的数的差异，从含精度管理用多核苷酸一分子的水性液滴可得到比从含目标核酸一分子的水性液滴得到的荧光信号强度计算上强约2倍的荧光信号强度。
基于来自生成精度管理用多核苷酸的扩增产物的隔区(液滴)的信号的检测结果，判断核酸检测工序适宜或不适宜。如上所述，当判断为核酸检测工序适宜时，可判断为目标核酸的检测结果有信赖性。当判断为核酸检测工序不适宜时，可判断为目标核酸的检测结果缺信赖性。如此，由实施方式3可管理核酸的检测结果的精度－品质。
[实施方式4]
图4是显示实施方式4涉及的核酸检测工序的模式图。在实施方式4中，与实施方式3不同，显示由孔型的数字PCR进行核酸扩增的例。
在实施方式4中，调制含目标核酸、精度管理用多核苷酸和对于此外的核酸扩增必要的试剂的核酸样品(图4(i))。实施方式4中使用的目标核酸及精度管理用多核苷酸，与在实施方式3中使用的同样、目标核酸含1个检测序列(n＝1)，精度管理用多核苷酸含2个检测序列(n＝2)。
在隔区调制工序中，与实施方式3不同，将核酸样品分注于微滴定板的多数的孔(隔区)。在多个孔之中，调制含目标核酸一分子或精度管理用多核苷酸一分子的孔(图4(ii)(b)、(c))。通过对分注到孔中的核酸样品实施PCR法，在含目标核酸一分子或精度管理用多核苷酸一分子的孔中，在其孔中生成核酸的扩增产物(图4(iii)(b)、(c))。在此外的孔中通常缺目标核酸和精度管理用多核苷酸(图4(ii)(a))、在这样的孔中即使实施PCR法也不进行核酸扩增(图4(iii)(a))。
在实施方式4中，核酸扩增后，将单独不显示信号、但通过杂交显示信号的检测用探针、例如分子信标加到孔中，在存在时在严格的条件下杂交于扩增产物。分子信标探针是一个末端被荧光物质标记化，另一末端被猝灭剂物质标记化的寡核苷酸，含能与检测序列杂交的序列，是可取发夹型二级结构的寡核苷酸。分子信标探针通过与检测序列杂交，发夹型二级结构破坏，可取延伸的结构。由此，标记化的荧光物质成为能发荧光的状态。在目标核酸的情况中，由于检测序列是1个(n＝1)，可杂交一分子的分子信标探针。在精度管理用多核苷酸的情况中，由于检测序列是2个(n＝2)，可杂交二分子的分子信标探针。
在信号检测工序中，向每种孔照射激发光(λ1)，测定来自各孔的荧光信号(λ2)。在荧光信号的检测中，使用微滴定板读取器。测定的荧光信号强度可反映与扩增产物杂交的分子信标探针的数(即，发荧光可能的荧光物质的数)。认为含精度管理用多核苷酸一分子的孔中与其扩增产物杂交的分子信标探针的数比含目标核酸一分子的孔中与其扩增产物杂交的分子信标探针的数多约2倍。由此杂交的分子信标探针的数的差异，从含精度管理用多核苷酸一分子的孔可得到比从含目标核酸一分子的孔得到的荧光信号强度计算上强约2倍的荧光信号强度。
基于来自生成精度管理用多核苷酸的扩增产物的隔区(孔)的信号的检测结果，判断核酸检测工序适宜或不适宜。如上所述，当判断为核酸检测工序适宜时，可判断为目标核酸的检测结果有信赖性。当判断为核酸检测工序不适宜时，可判断为目标核酸的检测结果缺信赖性。如此，由实施方式4可管理核酸的检测结果的精度－品质。
在实施方式4中，虽作为检测用探针使用了分子信标探针，但本发明的实施方式不限于此。例如，在实施方式4的核酸调制中，也可调制还含实施方式3中使用的TaqMan(商标)探针及有5’→3’外切核酸酶活性的聚合酶的核酸样品，将调制的核酸样品如实施方式4所述分注到孔中(隔区调制)而核酸扩增。在信号检测工序中，核酸扩增时从猝灭剂物质隔离而检测到来自发荧光成为可能的荧光物质的荧光信号。
另外，也可使用固定化引物的珠。此时，可微滴定板1孔收容各1个珠，与上述同样地进行核酸扩增及信号检测。
[精度管理用试剂]
本发明的第2实施方式提供含精度管理用多核苷酸的精度管理用试剂。在第1实施方式中关于精度管理用多核苷酸记载的特征也适用于上述试剂中所含的精度管理用多核苷酸。
[精度管理用试剂盒]
在本发明的第3实施方式之一的实施方式中，精度管理用试剂盒含收容精度管理用多核苷酸的试剂容器。此外，也可适宜含收容上述引物组、上述检测用探针、聚合酶、dNTPs等必要的试剂的试剂容器。再者，也可含记载试剂的使用方法等的附带文书。图10是显示本实施方式的精度管理用试剂盒的一例的模式图。此试剂盒含收容精度管理用多核苷酸的试剂容器11；收容第1引物的试剂容器12；收容第2引物的试剂容器13；收容检测用探针的试剂容器14；收容聚合酶的试剂容器15；收容核苷三磷酸(dNTPs)的试剂容器16；及附带文书18。试剂容器11～16及附带文书18收容到盒17中。
在图10所示的试剂盒中，各自的试剂类被收容到不同的容器中，但对于即使共存也对核酸扩增及信号检测无问题的试剂而言，也可收容到相同容器内。本领域技术人员可适宜选择共存何种试剂。例如，第1引物、第2引物及dNTPs可收容到相同容器内。
在本说明书中，关于精度管理用多核苷酸及检测用探针记载的特征也适用于上述试剂盒中所含的精度管理用多核苷酸及检测用探针。
本发明之一的实施方式是精度管理用多核苷酸用于上述的精度管理用试剂或精度管理用试剂盒的制造的用途。关于精度管理用试剂、精度管理用试剂盒、及精度管理用多核苷酸的特征如上所述。
本发明之一的实施方式是本发明的第1实施方式涉及的核酸扩增的精度管理方法中的，上述的精度管理用多核苷酸、精度管理用试剂或精度管理用试剂盒的使用。其他实施方式是用于在本发明的第1实施方式涉及的核酸扩增的精度管理方法中使用的，上述的精度管理用多核苷酸、精度管理用试剂及精度管理用试剂盒。关于精度管理用试剂、精度管理用试剂盒、精度管理用多核苷酸、及精度管理方法的特征如上所述。
以下，记载具体的实施例，但它们显示本发明的优选的实施方式，不以任何方式限定随附的专利权利要求中记载的发明。从本说明书中记载的具体的实施方式、材料、组合物及方法容易识别的均等物、或者变更、改变或变形在本发明的范围内。
【实施例】
在实施例中，使用以下的试剂、装置及解析软件。
<试剂>
Phusion II热启动高保真度DNA聚合酶(Thermo Scientific公司)
铂Taq DNA聚合酶(Life Techonologies公司)
QuantIt PicoGreen dsDNA测定试剂盒(Life Technologies)
脱氧核苷三磷酸(各10mmol/L、Life Technologies)
10x PCR缓冲液(670mmol/L Tris-HCl pH 8.8、166mmol/L硫化铵、100mmol/L 2-巯基乙醇、11.7mmol/L氯化镁)
EmulsiFIRE(7％(v/v)ABIL WE09,20％(v/v)矿物油,73％(v/v)Tegosoft DEC)
TE缓冲液pH 7.5(10mmol/L Tris-HCl pH 7.0,1mmol/L乙二胺四醋酸)
Breaking缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH 7.5、1％Triton X-100、1％十二烷基硫酸钠、100mmol/L氯化钠、1mmol/L乙二胺四醋酸)
0.1mol/L氢氧化钠
TK缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH 8.4,50mmol/L氯化钾)
5x杂交缓冲液(75mmol/L Tris-HCl pH 9.5、33.5mmol/L氯化镁、25％甲酰胺)
Dynabeads MyOne链霉亲和素C1(Dynal)
不锈钢珠(5mm)
<装置>
Veriti热循环仪(Applied Biosystems公司)
BD Accuri C6流式细胞仪(Beckton Dickinson公司)
<解析软件>
FlowJo(FlowJo公司)
[实施例1]
<KRAS扩增样品DNA的调制>
调制将含野生型人KRAS的基因序列的质粒和含变异型人KRAS c.38G>A的基因序列的质粒以99:1的比率混合的DNA样品。将调制的DNA样品使用Phusion II高保真度DNA聚合酶(Thermo Scientific公司)及表1中显示的引物组由PCR法扩增。PCR反应使用Veriti热循环仪(Applied Biosystems公司)实施。以下，对于实施PCR反应而言，同样地使用Veriti热循环仪。
【表1】
表2示野生型人KRAS基因的外显子2(SEQ ID NO：(8)及变异型人KRAS c.38G>A基因的外显子2(SEQ ID NO：(9)。由上述PCR反应，表2中显示的序列中，大文字中显示的序列部分由使用表1中显示的引物组的上述PCR扩增。表2中显示的序列中，加下划线的区域示后述的检测序列，由四边形框围起来的区域示能杂交后述的共探针的区域。
【表2】
得到的扩增产物使用PicoGreen荧光嵌入剂定量(QuantIt PicoGreen dsDNA测定试剂盒(Life Technologies))。以下，将上述扩增产物称为“KRAS扩增样品DNA”。
<精度管理用多核苷酸的调制>
作为精度管理用多核苷酸，调制含SEQ ID NO：10～SEQ ID NO：15的各序列的单链DNA。上述单链DNA由β-氰基乙基氨基亚磷酸酯法各自化学合成。将合成的各DNA使用Phusion II高保真度DNA聚合酶(Thermo Scientific公司)及表1中显示的引物组，由PCR法各自扩增。纯化各扩增产物，使用紫外吸光法各自定量。上述扩增产物各自，如下所述命名(表3)。各精度管理用多核苷酸含表3中显示的数的野生型(Wt)及变异型(Mut)人KRAS基因序列中的检测序列(以下也各自称为“Wt检测序列”及“Mut检测序列”)。Wt检测序列是在表2中显示的SEQ ID NO：8的序列中加下划线的序列，Mut检测序列是在表2中显示的SEQ IDNO：9的序列中加下划线的序列。在表3中，检测序列加下划线而表示。
【表3】
<引物结合磁性珠的调制>
调制有SEQ ID NO：1的序列(5’-TCCCGCGAAATTAATACGAC-3’)的单链DNA。在上述单链DNA的5’末端结合生物素二聚体，调制生物素化引物。将上述生物素化引物加到用链霉亲和素修饰的磁性珠(Dynabeads MyOne链霉亲和素C1(Dynal))，使上述引物结合于上述磁性珠，调制引物结合磁性珠。清洗上述引物结合磁性珠，除去未结合的生物素化引物。
<BEAMing法>
由作为利用磁性珠的液滴型的数字PCR的BEAMing(Beads，Emulsions，Amplification and Magnetics)法，进行核酸扩增。调制以下显示的PCR反应溶液(浓度是终浓度)。
KRAS扩增样品DNA 1×107拷贝
精度管理用多核苷酸(Wt，n＝5) 100,000拷贝
10×PCR缓冲液 1.6μl
脱氧核苷三磷酸(dNTPs) 0.2mmol/L
正向引物5(SEQ ID NO：1：5’-TCCCGCGAAATTAATACGAC-3’) 50fmol/L
反向引物6(SEQ ID NO：2：5’-GCTGGAGCTCTGCAGCTA-3’) 8pmol/L
引物结合磁性珠 0.64μL
Taq DNA聚合酶(Life Technologies公司) 5单位
容量 16μl
接下来，向此PCR反应溶液添加64μL的EmulsiFIRE(7％(v/v)ABIL WE09、20％(v/v)矿物油、73％(v/v)Tegosoft DEC)。通过将上述溶液在不锈钢珠(5mm)存在下颠倒混合，形成乳液。对于上述乳液，进行接下来显示的条件的PCR反应。
步骤 热变性 退火 延伸 循环数
1 94℃，2分钟
2 98℃，15秒钟 64℃，45秒钟 72℃，75秒钟 3
3 98℃，15秒钟 61℃，45秒钟 72℃，75秒钟 3
4 98℃，15秒钟 58℃，45秒钟 72℃，75秒钟 3
5 98℃，15秒钟 57℃，45秒钟 72℃，75秒钟 50
其中，结合于上述引物结合磁性珠的引物与上述PCR反应溶液中使用的正向引物5有相同的序列(SEQ ID NO：1记载的序列)。由上述PCR，例如，从结合于磁性珠的引物，以与该引物杂交的KRAS扩增样品DNA作为模板延伸其互补链。由此，得到结合KRAS扩增样品DNA的扩增产物的磁性珠。
<检测用探针溶液的调制>
各自调制含表4中显示的序列编号的序列的单链DNA。使表4中显示的荧光物质各自结合于上述单链DNA的各5’末端，调制用荧光物质标记的检测用探针。其中，共探针还能与使用表1中显示的引物组扩增的野生型和变异型的人KRAS基因的扩增产物的任何杂交，SEQ ID NO：5的序列含与上述扩增产物的双方共同的序列互补的序列(参照表2中显示的序列中，由四边形框围起来的序列)。Wt检测用探针能与由上述引物组扩增的野生型的人KRAS基因的扩增产物杂交，SEQ ID NO：6的序列含与Wt检测序列互补的序列。Mut检测用探针能与由上述引物组扩增的变异型的人KRAS基因的扩增产物杂交，SEQ ID NO：7的序列含与Mut检测序列互补的序列。
【表4】
探针名 序列编号 序列5’→3’ 荧光物质
共探针 SEQ ID NO：5 TGACGATACA GCTAATTCA Cy3
Wt检测用探针 SEQ ID NO：6 TGCTGGTGGC GTAGGC FAM
Mut检测用探针 SEQ ID NO：7 TGCTGGTGAC GTAGGC Cy5
向杂交溶液添加调制的3种检测用探针至各探针的终浓度成0.1μmol/L，调制检测用探针溶液(合计探针浓度0.3μmol/L)。
<磁性珠的回收及与检测用探针的杂交>
将含结合由PCR反应合成的扩增核酸的磁性珠的上述乳液使用Breaking缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH7.5、1％Triton X-100、1％十二烷基硫酸钠、100mmol/L氯化钠、1mmol/L乙二胺四醋酸)破坏，回收上述磁性珠。将回收的磁性珠用0.1mol/L氢氧化钠处理，清洗。
将清洗后的磁性珠悬浮于上述检测用探针溶液。将悬浮液于50℃处理15分钟，使上述磁性珠上的扩增核酸和上述检测用探针杂交。此后，将上述磁性珠使用TK缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH8.4、50mmol/L氯化钾)清洗，悬浮于TK缓冲液中。
<流式细胞术解析>
将上述悬浮液中的磁性珠由BD Accuri C6流式细胞仪(Beckton Dickinson公司)测定。在此实施例中，由流式细胞仪(FCM)测定而得到关于磁性珠的信号(前方散射光及测定散射光)，再得到关于扩增核酸的信号(检测用探针及共探针来源的荧光)。在实施例中，将共探针(Cy3标记)来源的荧光用上述流式细胞仪的FL2通道接收，由FL1通道接收Wt检测用探针(FAM标记)来源的荧光，由FL4通道接收Mut检测用探针(Cy5标记)来源的荧光。
基于得到的前方散射及侧方散射，挑选反映非凝集性的磁性珠的测定数据。再者，基于共探针(Cy3标记)来源的荧光信号(LF2通道)，确认为是结合KRAS扩增样品DNA的扩增产物的磁性珠。实施例中使用的精度管理用多核苷酸不含共探针能杂交的区域，但利用含比KRAS扩增样品DNA多数倍的检测序列，能排除磁性珠来源的自身荧光。例如，在结合了精度管理用多核苷酸(Wt,n＝5)的扩增产物的磁性珠中，如后所述，计算上可结合5倍于结合KRAS扩增样品DNA的扩增产物的磁性珠的数的Wt检测用探针(FAM标记)。结果，从结合精度管理用多核苷酸(Wt,n＝5)的扩增产物的磁性珠得到数倍强的FAM荧光信号强度。由此强的FMA荧光信号强度，发生向LF2通道的漏溢。通过利用此FAM荧光信号的向LF2通道的漏溢，可确认是结合精度管理用多核苷酸(Wt,n＝5)的扩增产物的磁性珠。
通过使用共探针，在存在时可排除磁性珠来源的自身荧光，更高精度地进行KRAS扩增样品DNA的分析变得可能。另外，利用精度管理用多核苷酸中存在的检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数与目标核酸的扩增产物中存在的检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数不同，在存在时还能排除磁性珠来源的自身荧光。
对于挑选的测定数据，制成在x轴分配Mut检测用探针来源的荧光信号强度，在y轴分配Wt检测用探针来源的荧光信号强度的2D散点图(图5a)。在制成的2D散点图中，各自计数对应于发Wt检测用探针来源的荧光的磁性珠的区内的点数(对应于显示野生型KRAS基因的存在的磁性珠的个数)、及对应于发Mut检测用探针来源的荧光的磁性珠的区内的点数(对应于显示变异型KRAS基因的存在的磁性珠的个数)。在图5a中，将2D散点图分成4个区(Q1～Q4)、在各区表示计数的各区的点数相对于2D散点图中的点总数的比例(％)。以下同样地，在2D散点图中表示各区(Q1～Q4)中的点的比例。
[比较例1]
在比较例1中，除了调制未添加精度管理用多核苷酸(Wt,n＝5)的PCR反应溶液之外，用与实施例1基本上相同的方法，进行BEAMing法、磁性珠的回收、杂交、及流式细胞术(FCM)解析(图5b)。
在显示实施例1(含精度管理用多核苷酸(Wt,n＝5)(+))的结果的图5a中，在y轴的值是3×103～1×104[事件]之间观察到多数的点(实线圆围起来的区)。在显示比较例1(不含精度管理用多核苷酸(Wt,n＝5)(-))的结果的图5b中也同样地，在y轴的值是3×103～1×104[事件]之间观察到多数的点(实线圆围起来的区)。此区内的点集团显示，Wt检测用探针(FAM标记)来源的荧光信号强度比较强，一方面，Mut检测用探针(Cy5标记)来源的荧光信号强度比较弱。由此提示，对应于此区内的点的磁性珠反映DNA样品中的野生型KRAS基因的存在。其中，可算出相对于2D散点图中的点总数的此区内的点数的比例([区内的点数]/[点总数]×100)。上述比例可反映试验的DNA样品中的野生型KRAS基因的含有率。在实施例1中，使用将含野生型人KRAS的基因序列的质粒和含变异型人KRAS c.38G>A的基因序列的质粒以99:1的比率混合的DNA样品的扩增产物。
在图5a及图5b的2D散点图中，在x轴的值是1×104～3×104之间观察到点集团(被实线四角形围起来的区)。此区内的点集团显示，Mut检测用探针(Cy5标记)来源的荧光信号强度比较强，一方面，Wt检测用探针(FAM标记)来源的荧光信号强度比较弱。由此提示，对应于此区内的点的磁性珠反映DNA样品中的变异型KRAS基因的存在。如上所述，可算出相对于2D散点图中的点总数的此区内的点数的比例。上述比例可反映试验的DNA样品中的变异型KRAS基因的含有率。
在图5a(精度管理用多核苷酸(Wt,n＝5)(+))中，在y轴的值是1×104～3×104之间观察到能与y轴的值是3×103～1×104之间的实线圆围起来的区中存在的点集团区别的点集团(虚线圆围起来的区)。在图5b(精度管理用多核苷酸(Mut,n＝5)(-))中，对应于图5a的虚线圆围起来的区的区观察不到点。图5a的虚线圆围起来的区内的点集团显示，Wt检测用探针(FAM标记)来源的荧光信号强度比实线圆围起来的区内的点集团显示的荧光信号强度大数倍。
这提示，对应于图5a、b的虚线圆围起来的区的点的磁性珠比对应于实线圆围起来的区的点的磁性珠，以数倍多种Wt检测用探针杂交。从而理解，图5a的虚线圆围起来的区内的点集团可反映结合了有5个Wt检测用探针能杂交的检测序列的精度管理用多核苷酸(Wt,n＝5)的扩增产物的磁性珠。理解图5a、b的实线圆围起来的区内的点集团可反映结合了有1个Wt检测用探针能杂交的检测序列的野生型的KRAS扩增DNA的扩增产物的磁性珠。
[实施例2及比较例2]
在实施例2中，除了调制代替精度管理用多核苷酸(Wt,n＝5)而使用精度管理用多核苷酸(Mut,n＝5)的PCR反应溶液之外，用与实施例1基本上相同的方法，进行BEAMing法、磁性珠的回收、杂交、及FCM解析(图6a)。
在比较例2中，除了调制未添加精度管理用多核苷酸(Mut,n＝5)的PCR反应溶液之外，用与实施例2实质上相同的方法，进行BEAMing法、磁性珠的回收、杂交、及FCM解析(图6b)。
实施例2及比较例2的结果，与实施例1及比较例1的结果同样地，在反映DNA样品中的野生型KRAS基因的存在的区内观察到多数的点(图6a及b、实线圆围起来的区)、另外，在反映变异型KRAS基因的存在的区内观察到点集团(图6a及b、被实线四角形围起来的区)。
在图6a(精度管理用多核苷酸(Mut,n＝5)(+))中，在x轴的值是3×104～6×105之间的被虚线四角形围起来的区观察到能与x轴的值是1×104～2×104之间的被实线四角形围起来的区中存在的点集团区别的点集团。在图6b(精度管理用多核苷酸(Mut,n＝5)(-))中，在对应于图6a的被虚线四角形围起来的区的区中观察不到点。图6a的被虚线四角形围起来的区内的点集团显示，Mut检测用探针(Cy5标记)来源的荧光信号强度比被实线四角形围起来的区内的点集团显示的荧光信号强度大数倍。
这提示，图6a、b的对应于被虚线四角形围起来的区的点的磁性珠比对应于被实线四角形围起来的区的点的磁性珠，以数倍多种Mut检测用探针杂交。理解图6a的被虚线四角形围起来的区内的点集团可反映结合了有5个Mut检测用探针能杂交的检测序列的精度管理用多核苷酸(Mut,n＝5)的扩增产物的磁性珠。理解图6a、b的被实线四角形围起来的区内的点集团可反映结合了有1个Mut检测用探针能杂交的检测序列的变异型的KRAS扩增DNA的扩增产物的磁性珠。
从实施例1及实施例2的结果可理解，由本发明之一的实施方式涉及的核酸扩增的精度管理方法，为了使用能使用与用于扩增目标核酸的引物组相同的引物组核酸扩增，可使用与用于检测目标核酸来源的扩增产物的检测用探针相同的检测用探针与目标核酸来源的扩增产物能区别地检测的精度管理用多核苷酸，能判断包括核酸调制、隔区调制、核酸扩增及信号检测的一系列的工序是否适宜。
另外，从实施例1及实施例2的结果理解，本发明之一的实施方式涉及的精度管理用多核苷酸也能在变异检测的精度管理方法中使用。
[实施例3]
<精度管理用多核苷酸的拷贝数和FCM检测信号强度的相关关系>
在实施例1的PCR反应溶液中，各自添加25,000拷贝、50,000拷贝、100,000拷贝、200,000拷贝、400,000拷贝、800,000拷贝精度管理用多核苷酸(Wt,n＝5)，用与实施例1基本上相同的方法，进行BEAMing法、磁性珠的回收、杂交、及FCM解析。还用FlowJo软件(FlowJo公司)解析用FCM解析得到的数据，算出PCR反应后的各精度管理用多核苷酸来源的荧光信号强度的平均值(图7a)。
图7a显示，在x轴分配添加的精度管理用多核苷酸的拷贝数，在y轴分配用FCM测定检测的荧光信号强度的分布图。图7a中的虚线示回归直线，其方程式是y＝0.0098x-357。图7a显示可对应于添加的精度管理用多核苷酸的扩增产物的量的荧光信号强度与添加的精度管理用多核苷酸的拷贝数成比例地增加。
同样地，在实施例2的PCR反应溶液中，各自添加25,000拷贝、50,000拷贝、100,000拷贝、200,000拷贝、400,000拷贝、800,000拷贝精度管理用多核苷酸(Mut,n＝5)，用与实施例2基本上相同的方法，进行BEAMing法、磁性珠的回收、杂交、及FCM解析。还用FlowJo软件(FlowJo公司)解析用FCM解析得到的数据，算出PCR反应后的各精度管理用多核苷酸来源的荧光信号强度的平均值(图7b)。
图7b显示在x轴分配添加的精度管理用多核苷酸的拷贝数，在y轴分配用FCM测定检测的荧光信号强度的分布图。图7b中的虚线显示回归直线，其方程式是y＝0.011x-68。图7b也另外显示，可对应于添加的精度管理用多核苷酸的扩增产物的量的荧光信号强度与添加的精度管理用多核苷酸的拷贝数成比例地增加。
如图7a、b所示，在添加的精度管理用多核苷酸的拷贝数和用FCM检测的荧光信号强度之间有正的相关。结果证实使用本发明涉及的精度管理用多核苷酸的核酸扩增的精度管理方法的定量性。
[实施例4]
<精度管理用多核苷酸中的检测序列的数和FCM检测信号强度的相关关系>
调制各自含40,000拷贝精度管理用多核苷酸(Wt,n＝5)、(Wt,n＝4)、(Wt,n＝3)、(Wt,n＝2)的PCR反应溶液、及不含精度管理用多核苷酸的PCR反应溶液(野生型人KRAS基因中的Wt检测序列的数(n)＝1)，用与实施例1基本上相同的方法，进行BEAMing法、磁性珠的回收、杂交、及FCM解析。还用FlowJo软件解析用FCM解析得到的数据，算出PCR反应后的各精度管理用多核苷酸来源的荧光信号强度的平均值及标准偏差(SD)(图8)。
图8显示，在x轴分配Wt检测序列的数，在y轴分配Wt检测用探针(FAM标记)来源的荧光信号强度的箱形图。在箱形图中，箱的两端表示平均值±1SD，须两端表示平均值±3SD。
如图8所示，理解在可对应于扩增的精度管理用多核苷酸中的检测序列的数的荧光信号强度与精度管理用多核苷酸中的检测序列的数之间有正的相关。
在实施例4中，将显示能互相区别检测精度管理用多核苷酸的基准，例如，作为荧光信号强度的平均值±1SD不重叠，参照图8所示的结果。在假定目标核酸中存在1个检测序列时(n＝1)、提示如果在精度管理用多核苷酸中至少存在2个检测序列(n≥2)、使用1种检测用探针能区别检测上述目标核酸和上述精度管理用多核苷酸。基于同样的基准，可理解在假定例如存在2个目标核酸检测序列时(n＝2)、为了区别上述目标核酸和精度管理用多核苷酸，也可存在在精度管理用多核苷酸中1个检测序列(n＝1)、或者也可存在至少3个检测序列(n≥3)。
从实施例4理解，使用本发明之一的实施方式涉及的精度管理用多核苷酸的核酸扩增的精度管理方法通过使用与目标核酸中可存在的检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数不同的合计数的检测序列和含与上述检测序列互补的序列的精度管理用多核苷酸，使用1种检测用探针能互相区别检测。
[实施例5及比较例3]
在实施例5中，除了代替在实施例1的PCR反应溶液中添加100,000拷贝的精度管理用多核苷酸(Wt,n＝5)而添加50,000拷贝的精度管理用多核苷酸(Wt,n＝6)之外，用与实施例1基本上相同的方法，进行BEAMing法、磁性珠的回收、杂交、及FCM解析(图9a)。在比较例3中，除了调制未添加精度管理用多核苷酸(Wt,n＝6)的PCR反应溶液之外，用与实施例5基本上相同的方法进行BEAMing法、磁性珠的回收、杂交、及FCM解析(图9b)。
在图9a(精度管理用多核苷酸(Wt,n＝6)(+))中，在y轴的值是约1.5×104～约3×104之间的虚线圆围起来的区中观察到能与y轴的值是约3×103～约1×104之间的实线圆围起来的区中存在的多数的点区别的点集团。在图9b(精度管理用多核苷酸(Wt,n＝6)(-))中，在对应于图9a的虚线圆围起来的区的区中观察不到点。图9a的虚线圆围起来的区内的点集团显示，Wt检测用探针(FAM标记)来源的荧光信号强度比实线圆围起来的区内的点集团显示的荧光信号强度大数倍。
这提示，图9a、b的对应于虚线圆围起来的区的点的磁性珠比对应于实线圆围起来的区的点的磁性珠，以数倍多种Wt检测用探针杂交。理解图9a的虚线圆围起来的区内的点集团可反映结合了有6个Wt检测用探针能杂交的检测序列的精度管理用多核苷酸(Wt,n＝6)的扩增产物的珠。理解图9a、b的实线圆围起来的区内的点集团可反映结合了有1个Wt检测用探针能杂交的检测序列的野生型的KRAS扩增DNA的扩增产物的磁性珠。
实施例5中使用的对照多核苷酸(Wt,n＝6)是，Wt检测序列之间的间隔子序列是2bp(参照表3、SEQ ID NO：15的序列中，加下划线的检测序列间的碱基的数(链长))。在实施例1～4中使用的对照多核苷酸(Wt,n＝5)、(Wt,n＝4)、(Wt,n＝3)、(Wt,n＝2)、及(Mut,n＝5)中，各检测序列之间的间隔子序列是5bp(参照表3、SEQ ID NO：10～14的序列中，加下划线的检测序列间的链长)。从实施例5的结果理解，使用本发明之一的实施方式涉及的精度管理用多核苷酸的核酸扩增的精度管理方法，即使检测序列或与上述检测序列互补的序列间的间隔子序列是2bp，也能将精度管理用多核苷酸的扩增产物与目标核酸的扩增产物区别检测。
 序列表
<110> SYSMEX CORPORATION
<120> 核酸扩增的精度管理方法、精度管理用试剂及其试剂盒
<130> 15-051CN
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物5
<400> 1
tcccgcgaaa ttaatacgac 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物6
<400> 2
gctggagctc tgcagcta 18
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物1
<400> 3
gctggagctc tgcagctatg actgaatata aacttgtggt agttg 45
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物2
<400> 4
tcccgcgaaa ttaatacgac catattcgtc cacaaaatga ttc 43
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 共探针
<400> 5
tgacgataca gctaattca 19
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WT 探针
<400> 6
tgctggtggc gtaggc 16
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变型探针
<400> 7
tgctggtgac gtaggc 16
<210> 8
<211> 122
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
ctctattgtt ggatcatatt cgtccacaaa atgattctga attagctgta tcgtcaaggc 60
actcttgcct acgccaccag ctccaactac cacaagttta tattcagtca ttttcagcag 120
gc 122
<210> 9
<211> 122
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
ctctattgtt ggatcatatt cgtccacaaa atgattctga attagctgta tcgtcaaggc 60
actcttgcct acgtcaccag ctccaactac cacaagttta tattcagtca ttttcagcag 120
gc 122
<210> 10
<211> 158
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 串联 DNA, n=5 (OBQ_R050-04)
<400> 10
tcatattcgt ccacaaaatg attcagatgc ctacgccacc agctatcagc ctacgccacc 60
agctcagtgc ctacgccacc agctactagc ctacgccacc agctatgagc ctacgccacc 120
agctacgatg caactaccac aagtttatat tcagtcat 158
<210> 11
<211> 158
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 串联 DNA, n=4 (OBQ_R040-11)
<400> 11
tcatattcgt ccacaaaatg attcagatgc ctacgccacc agctatcagc ctacgccacc 60
agctcagtgc ctacgccacc agctactagc ctacgccacc agctatgaac ctctattgtt 120
ggatacgatg caactaccac aagtttatat tcagtcat 158
<210> 12
<211> 158
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 串联 DNA, n=3 (OBQ_R030-12)
<400> 12
tcatattcgt ccacaaaatg attcagatgc ctacgccacc agctatcagc ctacgccacc 60
agctcagtgc ctacgccacc agctactata ttaaaacaag atttatgaac ctctattgtt 120
ggatacgatg caactaccac aagtttatat tcagtcat 158
<210> 13
<211> 158
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 串联 DNA, n=2 (OBQ_R020-13)
<400> 13
tcatattcgt ccacaaaatg attcagatgc ctacgccacc agctatcagc ctacgccacc 60
agctcagtgc accagtaata tgcaactata ttaaaacaag atttatgaac ctctattgtt 120
ggatacgatg caactaccac aagtttatat tcagtcat 158
<210> 14
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 串联 DNA, n=5, 突变型 (OBQ_R005-03)
<400> 14
tcatattcgt ccacaaaatg attctgccta cgtcaccagc tatcagccta cgtcaccagc 60
tcagtgccta cgtcaccagc tactagccta cgtcaccagc tatgagccta cgtcaccagc 120
tccaactacc acaagtttat attcagtcat 150
<210> 15
<211> 155
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 串联 DNA, n=6 (OBQ_R060-01)
<400> 15
tcatattcgt ccacaaaatg attctgccta cgccaccagc tagcctacgc caccagcttg 60
cctacgccac cagctggcct acgccaccag ctcgcctacg ccaccagcta gcctacgcca 120
ccagctccaa ctaccacaag tttatattca gtcat 155

Claims (24)

1.核酸扩增的精度管理方法，其包括核酸检测工序和判断工序，
上述核酸检测工序包括：
调制核酸样品的工序，所述核酸样品含目标核酸和精度管理用多核苷酸、
调制含上述目标核酸一分子的隔区和含上述精度管理用多核苷酸一分子的隔区的工序、
在上述各隔区中进行上述核酸样品中所含的上述目标核酸或上述精度管理用多核苷酸的核酸扩增，使用检测用探针检测上述检测用探针引发的信号的工序，
在上述判断工序中，基于上述信号检测工序的结果，判断上述核酸检测工序适宜或不适宜，
上述目标核酸含检测序列，
上述精度管理用多核苷酸是以下的(1)、(2)或(3)：
(1)含以下第1区域、第2区域及第3区域的单链多核苷酸：
第1区域，其含能结合目标核酸扩增用的第1引物的序列；
第2区域，其含与能结合目标核酸扩增用的第2引物的序列互补的序列；及
第3区域，其含检测序列及与上述检测序列互补的序列的任一方或两方、
(2)含与上述(1)的序列互补的序列的单链多核苷酸、
(3)含上述(1)的多核苷酸和上述(2)的多核苷酸的双链多核苷酸、
上述检测用探针含与上述检测序列互补的序列，
上述(1)的精度管理用多核苷酸中的检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数与上述目标核酸中的检测序列的数不同。
2.权利要求1所述的精度管理方法，其中上述各隔区还含上述第1引物、上述第2引物、dNTPs及聚合酶。
3.权利要求1所述的精度管理方法，其中上述精度管理用多核苷酸含DNA、RNA或多核苷酸衍生物。
4.权利要求1所述的精度管理方法，其中上述精度管理用多核苷酸是双链。
5.权利要求1所述的精度管理方法，其中在上述精度管理用多核苷酸中，上述第3区域位于上述第1区域和上述第2区域之间。
6.权利要求1所述的精度管理方法，其中
上述精度管理用多核苷酸
在上述第3区域的上游含第1间隔子序列，
在上述第3区域的下游含第2间隔子序列，
上述第1间隔子序列和上述第2间隔子序列是互相不同的序列，
上述第1间隔子序列和上述第2间隔子序列不互补。
7.权利要求1所述的精度管理方法，其中上述精度管理用多核苷酸中的检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数比上述目标核酸的检测序列的数多至少1个。
8.权利要求1所述的精度管理方法，其中上述检测用探针是用选自荧光物质、酶及半抗原的至少1种标记物质预先标记化的寡核苷酸。
9.权利要求8所述的精度管理方法，其中
上述核酸扩增在有外切核酸酶活性的聚合酶的存在下进行，
上述检测用探针是用荧光物质及猝灭剂物质预先标记化的寡核苷酸，在上述检测用探针中，上述猝灭剂物质以上述荧光物质消光方式配置，
上述检测用探针，在上述核酸扩增时，与上述目标核酸及精度管理用多核苷酸杂交，杂交的检测用探针由有上述外切核酸酶活性的聚合酶分解，上述荧光物质从上述猝灭剂物质隔离而发荧光信号变得可能。
10.权利要求2～9之任一项所述的精度管理方法，其中上述核酸样品含珠，
在上述珠上结合上述第1引物及上述第2引物的任一方或两方。
11.权利要求10所述的精度管理方法，其中上述隔区每1个隔区含1个上述珠。
12.权利要求10或11所述的精度管理方法，其中
在上述信号检测工序中，上述检测用探针引发的信号是从上述珠发出的信号强度，
在上述判断工序中，将上述信号强度对应于信号强度的指定的阈值以上的珠作为含上述精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠进行计数，
在计数结果不足对应于珠数的指定的阈值时，判断为上述核酸检测工序不适宜。
13.权利要求1所述的精度管理方法，其中在上述信号检测工序中，上述检测用探针引发的信号是从上述隔区发生的荧光信号强度。
14.权利要求13所述的精度管理方法，其中
在上述判断工序中，将上述荧光信号强度对应于荧光信号强度的指定的阈值以上的隔区作为含上述精度管理用多核苷酸的扩增产物的隔区进行计数，
在计数结果不足对应于隔区数的指定的阈值时，判断为上述核酸检测工序不适宜。
15.权利要求1所述的精度管理方法，其中在上述信号检测工序中，使用流式细胞仪。
16.目标核酸的变异检测中的精度管理方法，其包括核酸检测工序和判断工序，
上述核酸检测工序包括：
调制核酸样品的工序，所述核酸样品含目标核酸和精度管理用多核苷酸、
调制含上述目标核酸一分子的隔区和含上述精度管理用多核苷酸一分子的隔区的工序、
在上述各隔区中进行上述核酸样品中所含的上述目标核酸或上述精度管理用多核苷酸的核酸扩增，使用检测用探针检测上述检测用探针引发的信号的工序、
在上述判断工序中，基于上述信号检测工序的结果，判断上述目标核酸中的有无变异，再者，判断上述核酸检测工序适宜或不适宜，
上述目标核酸含检测序列；
上述精度管理用多核苷酸是以下的(1)、(2)或(3)：
(1)含以下第1区域、第2区域及第3区域的单链多核苷酸：
第1区域，其含能结合目标核酸扩增用的第1引物的序列；
第2区域，其含与能结合目标核酸扩增用的第2引物的序列互补的序列；及
第3区域，其含检测序列及与上述检测序列互补的序列的任一方或两方、
(2)含与上述(1)的序列互补的序列的单链多核苷酸、
(3)含上述(1)的多核苷酸和上述(2)的多核苷酸的双链多核苷酸、
上述(1)的精度管理用多核苷酸中的检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数与上述目标核酸中的检测序列的数不同，
在上述核酸检测工序中，基于结合到上述目标核酸的扩增产物的检测用探针引发的信号，检测上述目标核酸中的有无变异，
在上述判断工序中，基于结合到上述精度管理用多核苷酸的扩增产物的检测用探针引发的信号，判断上述有无变异的检测结果的适宜与否。
17.权利要求16所述的方法，其中上述精度管理用多核苷酸中的检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数比上述目标核酸的检测序列的数多。
18.权利要求17所述的方法，其中
在上述信号检测工序中，上述检测用探针引发的信号是从上述隔区发出的信号强度，
将有比含上述目标核酸的扩增产物的隔区的信号强度高的信号强度的隔区作为含上述精度管理用多核苷酸的扩增产物的隔区进行计数，
在含上述精度管理用多核苷酸的扩增产物的隔区的计数结果不足阈值时，判断上述有无变异的检测结果不适宜。
19.权利要求17所述的方法，其中
上述核酸样品含珠，
在上述珠上结合上述第1引物及上述第2引物的任一方或两方，
上述隔区每1个隔区含1个上述珠，
在上述信号检测工序中，上述检测用探针引发的信号是从珠发出的信号强度，
将有比含上述目标核酸的扩增产物的珠的信号强度高的信号强度的珠作为含上述精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠进行计数，
在含上述精度管理用多核苷酸的扩增产物的珠的计数结果不足阈值时，判断上述有无变异的检测结果不适宜。
20.精度管理方法，其在通过进行目标核酸的核酸扩增，使检测用探针结合于扩增产物来数字检测上述目标核酸的方法中，
在上述核酸扩增中进行以精度管理用多核苷酸作为模板的核酸扩增，
通过使检测用探针结合于上述精度管理用多核苷酸的扩增产物对上述精度管理用多核苷酸进行数字检测，
基于上述精度管理用多核苷酸的数字检测结果，对上述目标核酸的数字检测结果进行精度管理。
21.权利要求20所述的方法，其中与上述精度管理用多核苷酸的扩增产物1分子结合的检测用探针的数比与上述目标核酸的扩增产物1分子结合的检测用探针的数多。
22.核酸扩增的精度管理用试剂，其中上述试剂含精度管理用多核苷酸，
上述精度管理用多核苷酸是以下的(1)、(2)或(3)：
(1)含以下第1区域、第2区域及第3区域的单链多核苷酸：
第1区域，其含能结合目标核酸扩增用的第1引物的序列；
第2区域，其含与能结合目标核酸扩增用的第2引物的序列互补的序列；及
第3区域，其含检测序列及与上述检测序列互补的序列的任一方或两方、
(2)含与上述(1)的序列互补的序列的单链多核苷酸、
(3)含上述(1)的多核苷酸和上述(2)的多核苷酸的双链多核苷酸、
上述(1)的精度管理用多核苷酸中的检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数与目标核酸中的检测序列的数不同。
23.精度管理用试剂盒，其含权利要求22所述的精度管理用试剂。
24.精度管理用试剂，
其为油相中含多个水性液滴的组合物，
其含以下的(A)及(B)的两方：
(A)含精度管理用多核苷酸1分子、第1引物、第2引物、dNTPs及聚合酶的水性液滴、
(B)含目标核酸1分子、第1引物、第2引物、dNTPs及聚合酶的水性液滴，
上述精度管理用多核苷酸是以下的(1)、(2)或(3)：
(1)含以下第1区域、第2区域及第3区域的单链多核苷酸：
第1区域，其含能结合目标核酸扩增用的第1引物的序列；
第2区域，其含与能结合目标核酸扩增用的第2引物的序列互补的序列；及
第3区域，其含检测序列及与上述检测序列互补的序列的任一方或两方、
(2)含与上述(1)的序列互补的序列的单链多核苷酸、
(3)含上述(1)的多核苷酸和上述(2)的多核苷酸的双链多核苷酸、
上述目标核酸含上述第1区域、上述第2区域及检测序列，
上述(1)的精度管理用多核苷酸中的检测序列和与上述检测序列互补的序列的合计数与目标核酸中的检测序列的数不同。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107312850A (zh) * 2017-07-19 2017-11-03 华东医药（杭州）基因科技有限公司 一种pcr无效扩增的检测方法
CN109504745A (zh) * 2017-09-12 2019-03-22 莱弗斯基因股份有限公司 分析样品中多重目标核酸检测方法
CN110872551A (zh) * 2018-08-31 2020-03-10 希森美康株式会社 核酸检测装置及核酸检测方法
CN114456802A (zh) * 2022-02-18 2022-05-10 慈溪市人民医院医疗健康集团(慈溪市人民医院) 一种比率型银纳米簇荧光探针及其制备方法与应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019038843A1 (ja) * 2017-08-23 2019-02-28 富士通株式会社 表示制御プログラム、生成プログラム、情報処理装置、表示制御方法及び生成方法
JP2019103489A (ja) * 2017-12-08 2019-06-27 シスメックス株式会社 粒子測定方法、検体処理方法、および粒子撮像装置
CN110878342A (zh) * 2019-12-25 2020-03-13 陕西师范大学 基于流式细胞仪单荧光颗粒计数的核酸标志物数字式绝对定量分析方法

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1833034A (zh) * 2003-06-20 2006-09-13 埃克斯魁恩公司 用于分析核酸混合物的探针、文库和试剂盒及其构建方法
CN101487062A (zh) * 2008-10-31 2009-07-22 武汉大学 同步检测肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋体核酸的试剂盒
CN101896623A (zh) * 2007-10-22 2010-11-24 Lgc有限公司 寡核苷酸及其应用
CN102071260A (zh) * 2009-11-24 2011-05-25 上海复星医学科技发展有限公司 一种检测甲型h1n1流感病毒rna的靶序列及试剂盒
CN102439171A (zh) * 2008-12-22 2012-05-02 犹他大学研究基金会 单色多重定量pcr
CN102741409A (zh) * 2009-11-25 2012-10-17 生命科技公司 等位基因梯基因座
CN103975062A (zh) * 2011-12-13 2014-08-06 株式会社日立高新技术 核酸扩增方法
CN103998624A (zh) * 2011-09-19 2014-08-20 艾皮斯托姆有限公司 具有多个靶区域特异性和具有分为三部分特征的探针
CN104053786A (zh) * 2011-11-29 2014-09-17 生命技术公司 用于多重pcr 的方法和组合物
WO2014145467A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiplexed digital assay for variant and normal forms of a gene of interest
CN104350161A (zh) * 2012-06-14 2015-02-11 弗莱德哈钦森癌症研究中心 用于核酸分子中的敏感突变检测的组合物和方法
CN104450963A (zh) * 2014-12-08 2015-03-25 上海五色石医学研究有限公司 一种hbv dna数字pcr定量检测试剂盒及其应用
WO2015143385A1 (en) * 2014-03-21 2015-09-24 Life Technologies Corporation Multi-copy reference assay
CN105132571A (zh) * 2015-09-24 2015-12-09 温州医科大学 利用微滴式数字化pcr检测外周血游离线粒体dna含量的方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US6395470B2 (en) * 1997-10-31 2002-05-28 Cenetron Diagnostics, Llc Method for monitoring nucleic acid assays using synthetic internal controls with reversed nucleotide sequences
CA2728746C (en) 2003-01-29 2018-01-16 454 Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
WO2005010145A2 (en) 2003-07-05 2005-02-03 The Johns Hopkins University Method and compositions for detection and enumeration of genetic variations
JP2008072950A (ja) * 2006-09-21 2008-04-03 Sysmex Corp 変換処理の確認方法及びこれに用いられる核酸分子
US9114398B2 (en) 2006-11-29 2015-08-25 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Device and method for digital multiplex PCR assays
EP2089542B1 (en) * 2006-11-29 2017-01-04 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Device and method for digital multiplex pcr assays
US20100041048A1 (en) 2008-07-31 2010-02-18 The Johns Hopkins University Circulating Mutant DNA to Assess Tumor Dynamics
CN106407741A (zh) 2011-09-30 2017-02-15 生命技术公司 用于可视化和评估数据的方法和系统
ES2663234T3 (es) 2012-02-27 2018-04-11 Cellular Research, Inc Composiciones y kits para recuento molecular
WO2014172373A2 (en) 2013-04-19 2014-10-23 Raindance Technologies, Inc Digital analyte analysis

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1833034A (zh) * 2003-06-20 2006-09-13 埃克斯魁恩公司 用于分析核酸混合物的探针、文库和试剂盒及其构建方法
CN101896623A (zh) * 2007-10-22 2010-11-24 Lgc有限公司 寡核苷酸及其应用
CN101487062A (zh) * 2008-10-31 2009-07-22 武汉大学 同步检测肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋体核酸的试剂盒
CN102439171A (zh) * 2008-12-22 2012-05-02 犹他大学研究基金会 单色多重定量pcr
CN102071260A (zh) * 2009-11-24 2011-05-25 上海复星医学科技发展有限公司 一种检测甲型h1n1流感病毒rna的靶序列及试剂盒
CN102741409A (zh) * 2009-11-25 2012-10-17 生命科技公司 等位基因梯基因座
CN103998624A (zh) * 2011-09-19 2014-08-20 艾皮斯托姆有限公司 具有多个靶区域特异性和具有分为三部分特征的探针
CN104053786A (zh) * 2011-11-29 2014-09-17 生命技术公司 用于多重pcr 的方法和组合物
CN103975062A (zh) * 2011-12-13 2014-08-06 株式会社日立高新技术 核酸扩增方法
CN104350161A (zh) * 2012-06-14 2015-02-11 弗莱德哈钦森癌症研究中心 用于核酸分子中的敏感突变检测的组合物和方法
WO2014145467A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiplexed digital assay for variant and normal forms of a gene of interest
WO2015143385A1 (en) * 2014-03-21 2015-09-24 Life Technologies Corporation Multi-copy reference assay
CN104450963A (zh) * 2014-12-08 2015-03-25 上海五色石医学研究有限公司 一种hbv dna数字pcr定量检测试剂盒及其应用
CN105132571A (zh) * 2015-09-24 2015-12-09 温州医科大学 利用微滴式数字化pcr检测外周血游离线粒体dna含量的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
胡伟等: "微滴式数字PCR 技术用于生物样品种属鉴定和绝对定量", 《法医学杂志》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107312850A (zh) * 2017-07-19 2017-11-03 华东医药（杭州）基因科技有限公司 一种pcr无效扩增的检测方法
CN109504745A (zh) * 2017-09-12 2019-03-22 莱弗斯基因股份有限公司 分析样品中多重目标核酸检测方法
CN110872551A (zh) * 2018-08-31 2020-03-10 希森美康株式会社 核酸检测装置及核酸检测方法
CN114456802A (zh) * 2022-02-18 2022-05-10 慈溪市人民医院医疗健康集团(慈溪市人民医院) 一种比率型银纳米簇荧光探针及其制备方法与应用

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