CN103998624A - 具有多个靶区域特异性和具有分为三部分特征的探针 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了用于检测靶核苷酸序列中多态性的探针和方法，所述多态性包括短串联重复序列。所述探针包括由接头序列分开的第一和第二区域，所述第一和第二区域具有分离的与其各自靶序列的解链温度。在第一个实施方案中，所述第一和第二区域都是报告子序列；在第二个实施方案中，一个区域是锚定序列，而另一个是报告子序列。

Description

具有多个靶区域特异性和具有分为三部分特征的探针
发明领域
本发明涉及检测靶核酸序列的核酸探针，和更特别地涉及从基因组的或扩增的DNA检测变体核酸序列的探针。本发明的进一步方面涉及检测变体核酸序列的方法。
发明背景
核酸探针经常用于鉴别基因组的或扩增的DNA中特定靶序列的存在。探针对靶的退火或解链温度受探针和靶共有的互补区域的长度和另外的互补碱基对之间的任何错配的存在影响。这可以用于检测变体，例如SNP或多重复的存在。探针可以设计为具有对野生型序列的第一解链温度(Tm)，并监测探针对靶的退火(例如通过在退火时形成荧光)。如果Tm不同于预期值，那么靶序列包括变体。
然而，用较长的探针区域实施该过程可能是困难的。尤其，长探针可能不提供野生型和变体序列之间Tm方面的足够变化。
本发明意在解决常规探针具有的这些和其它缺点。
US2007/0065847描述了一组用普通序列标记的核苷酸探针用作标签。所述探针用于探测化合物文库。
WO2011/027966描述了具有第一和第二区域的探针，所述第一区域包括报告子分子并且所述第二区域包括猝灭子分子。当探针杂交于靶时，核酸外切酶可以从猝灭子切割报告子，导致信号检测。当存在错配以致报告子部分未被杂交时，所述报告子不被切割，并且不存在信号检测。
WO2007/058499描述了用于呼吸道病毒的探针，所述探针具有由分离部分分开的第一和第二杂交部分。
US2007/0259347描述了用于筛选阵列的探针，所述探针具有由接头分开的两部分，其中选择接头部分以最小化与杂交相关的同源性噪声(homology noise)。
US2003/0170711描述了包括通用碱基(包括2-脱氧肌苷)的寡核苷酸探针。
WO2011/087928描述了用于在野生型序列背景中检测KRAS和PIK3CA SNP的寡核苷酸探针，所述探针包括多脱氧肌苷接头。
发明概述
根据本发明的第一个方面，提供一种核酸探针，其包括与第一靶核酸序列互补的第一核酸序列；与第二靶核酸序列互补的第二核酸序列；和连接第一和第二核酸序列的接头核酸序列；其中所述接头将第一和第二序列两个分开，以致与第一靶核酸序列退火的第一序列的解链温度和与第二靶核酸序列退火的第二序列的解链温度是分离的(discrete)。
接头区域的存在让探针分为具有不同杂交特征的功能性元件。这些接头的包含产生'泡'结构，从热力学的视角分离探针的元件，以提供具有不同结合特性的区域。进一步的，接头核酸序列的存在让整个探针具有单个多核苷酸分子的特性，但表现如由分开的更短核酸探针组成。当第一和第二序列杂交于其各自的靶序列时，接头区域可以折叠形成外环(loop out)。
在一些实施方案中，探针可以进一步被延伸以具有进一步的由多个接头分开的多杂交区域。
这可以以许多不同方式使用。例如，所述探针结构允许探测邻近的区域，其中较长的探针(例如，横跨第一和第二靶区域二者的单个探针)通过Tm分析将不提供足够的报告信息以区分变体。
优选地，所述接头是核苷接头；更优选地，所述接头包括多脱氧核糖核苷酸；最优选地，所述接头包括多脱氧肌苷或由多脱氧肌苷组成。由于较弱的氢键，脱氧肌苷具有相对于天然碱基低的解链温度。可以使用其它核苷。
优选地，所述接头长度达5，10，15，20，30，40，50个核苷酸。
第一和第二核酸序列的至少一个是报告子区域。报告子区域包括标记的部分；优选荧光标记。这允许在结合靶序列时检测探针，和在一个温度范围监测退火以确定任何变体靶序列的存在。优选地，所述探针不包括猝灭部分，也不包括意在与猝灭子一起使用的标记。合适的标记包括FAM，TET，HEX，ROX，TAMRA，Cy3，和Cy5。其它合适的标记将是熟练技术人员已知的。尽管可以使用任何合适的核苷酸，但是优选地所述标记被整合在T核苷酸上。
所述报告子区域长度优选15-200nt，长度更优选15-150，还更优选15-100，或20-100，30-80，40-60，或大约50nt。
所述报告子区域设计为具有与完全互补靶序列相关的第一Tm，和改变的、优选与变体靶序列相关的较低Tm。例如，所述变体可以表示SNP(单核苷酸多态性)，插入，缺失，倒位，或重复序列。
在该实施方案中，退火于第一靶核酸序列的第一序列的解链温度可以不同于退火于第二靶核酸序列的第二序列的解链温度。然而，优选地，第一和第二核酸序列二者都选择为具有对其各自的靶序列相似的Tm。
所述报告子区域可以进一步包括阻断区域(blocking region)；即，用于阻止通过DNA聚合酶的核酸链的延伸，从而阻止在例如，PCR过程中的链延伸的部分。聚合酶酶阻断基团是应该具有阻断聚合物的进一步延长功能性质的基团。阻断基团可以是任何能够连接于核苷酸的化学基团，其将允许修饰的核苷酸的5'端连接于DNA链中另一个核苷酸的3'端但将不允许核苷酸连接于修饰的核苷酸的3'羟基基团。适当地，3'位置OH基团的缺失将阻止通过聚合酶活性的进一步延伸。在一个特别优选的实施方案中，阻断基团选自乙酰基，CH3，甘氨酰基，亮氨酰基和丙氨酰基基团。在另一个实施方案中，所述阻断基团可以是二或三肽的形式。
在本发明的一个实施方案中，第一和第二核酸序列都是报告子区域。它们可以包括不同标记。此种探针可以用作多重报告子，允许用单个探针在扩展的范围内检测靶序列。
在该实施方案中，所述探针被分为多个分离的报告子区域。每个报告子区域具有不同退火温度并且具有1个或更多荧光核苷酸，优选FAM-T，或不同/多个颜色。所述报告子可以用于报告特定的序列或序列变体，SNP，插入，缺失等的存在。这将允许用单个探针在扩展的范围内检测多个序列。每个区域被调整为在野生型靶序列的情况下具有相似的Tm，但在突变的情况下具有改变的Tm；这意味着使用者仅必须检测改变的Tm以知晓变体存在。
作为检测多个靶序列的备选方案，可以将探针构造以例如提供控制结合区域和测试结合区域，用以改善测定的可信度。
在本发明的一个备选实施方案中，第二核酸序列可以是报告子区域，并且第一核酸序列是锚定区域。在该实施方案中，退火于第一靶核酸序列的第一序列的解链温度高于退火于第二靶核酸序列的第二序列的解链温度。接头序列可以形成外环区域或可以杂交于任何探针内部的(inter-probe)核酸序列。锚定区域对靶序列的Tm显著高于(高出至少0.5，1，1.5℃，但更通常可达5℃至20℃)报告子区域与靶序列的Tm。
锚定区域长度优选为至少50nt，更优选至少60，70，80，90，100，125，150nt。锚定区域长度优选为不多于200nt和长度不少于20nt。
在使用中，因为锚定区域具有基本上更高的退火温度，因此其用于将探针锚定于正确的区域。报告子区域具有相对于锚定区域更低的退火温度并且具有1个或更多荧光核苷酸，优选FAM-T。报告子是用于报告特定序列或序列变体，SNP，插入，缺失等的存在。
在优选的实施方案中，探针用于检测大小/长度多态性，例如STR分布(profiling)，脆性X染色体(Fragile X)等。锚定区域用于退火于重复区域的下游，同时报告子区域同源于重复序列的短延伸。因为报告子与主要的锚定区域分开，和因为荧光团仅在报告子区域上，因此，如果报告子在不同位点结合而引起扩增子中形成外环(通常这将改变产物的Tm，使得难以测量)，也没有影响。在一些实施方案中，锚定区域可以设计为与重复区域以及侧翼区的短延伸同源；例如，锚定区域可以包括可达50nt的重复序列和更长的侧翼序列延伸，例如150nt。
本发明的一个进一步的方面提供一种核酸探针，其包括互补于第一靶核酸序列的第一锚定核酸序列；互补于第二靶核酸序列的第二报告子核酸序列；和连接第一和第二核酸序列的接头核酸序列；其中所述接头将第一和第二序列分开，以致杂交于其各自的靶序列的第一和第二序列的解链温度是分离的，并且其中退火于第一靶核酸序列的锚定序列的解链温度高于退火于第二靶核酸序列的报告子序列的解链温度；并且其中每个报告子序列包括至少一个可检测标记。
所述报告子优选包括多个重复的序列单元。优选至少3，4，或5个重复的单元。
所述接头优选包括多脱氧肌苷。
所述锚可以包括一个或多个重复的序列单元，但优选包括单一序列。所述锚长度优选为从50至200nt。
所述探针优选进一步包括阻断序列以阻止PCR过程中的链延伸。
所述探针可以进一步包括一个或多个另外的接头和报告子序列。
本发明的一个更进一步的方面提供一种核酸探针，其包括互补于第一靶核酸序列的第一报告子核酸序列；互补于第二靶核酸序列的第二报告子核酸序列；和连接第一和第二核酸序列的接头核酸序列；其中退火于第一靶核酸序列的第一报告子序列的解链温度相似或相等于退火于第二靶核酸序列的第二报告子序列的解链温度；并且其中每个报告子序列包括至少一种可检测标记。
所述探针优选进一步包括阻断序列以阻止PCR过程中的链延伸。
本发明的一个进一步的方面提供一种检测靶核酸序列中一个或多个多态性的方法，所述方法包括：
提供根据本发明的一个方面的探针；
将探针与测试核酸序列接触，所述测试序列具有第一靶核酸序列和第二靶核酸序列；
让探针的第一核酸序列杂交于第一靶核酸序列；和让探针的第二核酸序列杂交于第二靶核酸序列；和
确定与第一靶序列杂交的第一探针序列的Tm；和确定与第二靶序列杂交的第二探针序列的Tm；
其中Tm指示野生型序列或变体序列的存在。
该方法还可以用于改善解链温度的效用，通过其，第一报告区域的Tm用作测量变体序列区域的Tm的参考。通常，记录的解链温度的位置(用于确定潜在(underlying)序列)，可能受反应混合物中盐浓度影响。通过比较作为已知序列的第一报告子区域的解链位置，更精确地确定第二报告子序列下的序列是可能的，因为两个区域都将同等地受干扰物质(例如外部盐)影响。
因此，本发明的一个进一步的方面提供一种检测靶核酸序列中一个或多个多态性的方法，所述方法包括：
提供根据本发明的一个方面的探针；
将探针与测试核酸序列接触，所述测试序列具有第一靶核酸序列和第二靶核酸序列；让探针的第一核酸序列杂交于第一靶核酸序列；和让探针的第二核酸序列杂交于第二靶核酸序列；和
确定与第一靶序列杂交的第一探针序列的Tm；和确定与第二靶序列杂交的第二探针序列的Tm；
将确定的第一探针序列的Tm与预期的第一探针序列的Tm相比较；
基于确定的和预期的第一探针序列的Tm的不同，标准化确定的第二探针序列的Tm；
其中标准化的第二探针序列的Tm指示野生型序列或变体序列的存在。
本发明的一个更进一步的方面提供一种检测靶核酸序列中串联重复的方法，所述方法包括：
提供根据本发明的一个方面的探针，其中所述报告子序列包括许多串联重复单元；
将探针与测试核酸序列接触，所述测试序列具有第一靶核酸序列和第二靶核酸序列，其中第一靶序列互补于探针锚定序列，并且第二靶序列包括许多互补于报告子序列的串联重复单元的串联重复；
让探针的锚定核酸序列杂交于第一靶核酸序列；和让探针的第二核酸序列杂交于第二靶核酸序列；和
检测报告子序列与测试核酸序列结合与否(or otherwise)。
可以通过确定报告子序列与测试核酸序列的Tm，和/或通过检测源自报告子序列的标记(例如，荧光)来检测结合。结合表明靶序列中重复的数量大于或等于报告子序列中重复的数量；如果在报告子序列中存在更多的重复，那么存在不结合或减少的结合。在一些实施方案中，Tm通常可以被认为是与靶序列中的重复的数量成比例的，并且可以确定Tm以确定重复的数量。备选地，或此外，探针的报告子序列在每个重复单元中可以包括一个或多个标记的部分；这样，检测的标记可以被看作是与靶序列中重复的数量成比例的。
附图简述
现在将仅通过实施例和参考附图描述本发明的这些和其它方面，其中：
图1显示根据本发明的一个实施方案的第一探针结构；
图2至5显示通过图1的探针结合靶序列形成的备选双链体结构；
图6显示根据本发明的一个备选实施方案的第二探针结构；
图7显示结核分枝杆菌(M.tuberculosis)rpoB基因中的普通突变密码子；
图8显示与一些突变基因的序列一起的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)rpoB基因的部分序列和根据本发明的用于检测此种突变体的存在的探针序列；
图9显示通过图8的探针结合靶序列形成的备选双链体结构；
图10显示获自图9的双链体的解链曲线实例；
图11显示痘苗基因组的部分与其它痘病毒的部分的序列比对；
图12显示用于检测痘病毒的探针；
图13比较图12的接头探针的灵敏度与常规痘苗探针的灵敏度；
图14显示图12的接头探针和常规探针与不同扩增的痘病毒基因组序列的解链曲线分析；
图15显示用于扩增用于图14的痘病毒片段的引物序列和扩增条件；和
图16显示用于人酪氨酸羟化酶基因中的短串联重复的引物和探针序列，和解链曲线分析。
附图详述
本发明涉及一种核酸探针，其被分为由核酸接头分开的两个或更多功能元件。所述接头优选是脱氧肌苷，其具有相对天然存在的DNA碱基低的Tm。可以使用其它合适的接头。
图1示意性地显示根据本发明的探针的第一个实施方案。所述探针包括通过长度为5nt的脱氧肌苷接头从15-200nt长度的报告子区域分离的长度大约100-200nt的锚定区域。所述锚定区域被设计为互补于第一靶区域，所述第一靶区域是靶核酸中重复序列区域下游。报告子区域互补于重复序列区域，并且包括已知数量的重复单元。所述报告子区域还包括一个或多个标记的核苷酸，优选FAM-T。在一些实施方案中，每个重复单元包括标记的核苷酸。
这样设计探针序列，以致锚定区域对靶的Tm显著高于报告子对靶的Tm，其又显著高于接头对靶核酸中的任意序列的Tm。
图2至5显示探针结合于靶的各种不同情况。在这些情况中，所述探针被用于确定大小/长度多态性(例如STR分布，脆性X染色体等)。锚定区域用于将探针退火于重复区域的下游，而报告子区域同源于重复序列的短的延伸。因为报告子与主要锚定区域分开，并且因为荧光团仅在报告子区域上，因此，如果报告子在不同位点结合以引起扩增子中的外环形成(通常这将改变产物的Tm，使得难以测量)，也没有影响。
在靶重复序列区域的长度小于报告子区域的长度的情况下(图2)，那么报告子区域不结合靶，并且不存在源自标记的荧光，并且不存在由测量报告子的Tm获得的解链曲线。然而，因为锚定区域已经结合靶，因此，这可以被测量(例如，通过确定Tm)，从而确定探针的确结合和确定重复序列区域缺失。
在靶重复序列区域的长度等于或长于报告子区域的长度的情况下，那么图3至5中的任何情况都可以发生。在图3中，控制报告子小到1，2，3，4或5个重复长度，其限制任何外环的效果对报告子：扩增子双链体Tm的影响。应用的实例是对于大的重复结构(例如脆性X染色体)，其中将重复的数量'分段'是重要的；例如<50，>100，>200。备选地，小的外环可以发生(图4)；再次，因为报告子小，对报告子：扩增子双链体的Tm存在最小的影响，并且能够确定探针上至少重复的数量的存在。
如果增加报告子长度以容纳多个重复(图5)，那么报告子扩增子双链体的Tm将与重复的数量成比例。报告子的未结合部分将由于标记的自猝灭而不发荧光。标记报告子中每个重复的一个或两个核苷酸。该方法学在STR分析中可能是重要的，在所述STR分析中，你对高达15x或20x的3，4或5bp的重复序列的数量感兴趣。
图6中显示备选的探针结构。该探针是多重报告子，并且包括由接头连接的两个分开的报告子区域。每个报告子区域具有不同的退火温度和具有1个或更多荧光核苷酸(优选FAM-T)或不同/多个颜色。所述报告子用于报告特定序列或序列变体(例如，SNP，插入，缺失等)的存在。这允许用单个探针在扩展的范围内检测多个序列。每个区域被调整为在野生型序列的情况下具有相似的-但不是相同的-Tm，但在突变的情况下具有改变的Tm，以便使用者仅必须检测改变的Tm以知晓变体存在。通过"相似的"意为Tm相差至多2，1.5，1，0.5℃。
所述探针还可以被排列以例如提供控制结合区域和测试结合区域。
现在给出使用多重报告子探针在结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)rpoB基因中检测变体的实例。结核分枝杆菌(M.tuberculosis)中的多耐药性是复杂的。利福平(Rifampin)是一线结核分枝杆菌(M.tuberculosis)药物并且是在该领域中治疗前鉴别用的主要靶点。利福平(Rifampin)抗性的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)在编码RNA聚合酶的β-亚单位的rpoB基因的81-bp核心区域具有突变。96％的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)利福平(Rifampin)抗性临床分离株在该基因中具有突变。密码子516，526，或531中的突变导致高水平的利福平(Rifampin)抗性。然而，检测横跨81-bp基因区域的突变将典型地需要多个常规探针，所述常规探针中的一些将需要重叠，因此需要多个检测步骤。
图7显示rpoB基因部分中的野生型和变体密码子；注意，显示9个密码子源自21个密码子(63nt)区域。本发明人设计了探针(显示于图8，标记的探针)以检测和报告任何潜在的具有在主要抗性密码子516，526，或531中的突变的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)基因型的存在。
图8还显示与三条突变序列(MUT516，MUT526，和MUT531)一起的rpoB基因的野生型(WT)序列。WT序列的方框区域是与设计的探针杂交的那些。所述探针自身包括横跨密码子531至525的第一报告子序列，所述第一报告子序列包括可能的突变密码子526和531，具有五个多脱氧肌苷残基(表示为"I")的接头，和横跨密码子518至510的第二报告子序列(包括可能的突变密码子516)。每个报告子序列包括两个标记的T残基(突出显示的)。第二报告子序列还临近PCR阻断基团部分。
在两个位置结合WT序列的探针对于每个报告子序列给出相同的60C的Tm。突变序列的存在将其改变为52C-56C。
图9显示探针对靶序列的可能结合模式。在两个报告子序列都结合野生型(WT：WT)的情况下，第一报告子的Tm(Tm1)等于第二报告子的Tm(Tm2)。第一报告子中的单个突变(MUT：WT)降低第一报告子的Tm至Tm3，其低于Tm2。第二报告子中的单个突变(WT：MUT)降低第二报告子的Tm至Tm4，其低于Tm1。在每个报告子中的单个突变(MUT：MUT)改变各自的Tm至Tm3和Tm4。最后，在第一报告子靶中的第二突变(MUT：WT)的存在降低Tm至Tm5，其低于Tm3。
这些Tm中的每个可相互区分，并且因此单个探针可以用于确定rpoB基因中三个不同的突变的存在。图10给出来自该实验中的代表性解链曲线。能够明确区分突变序列中野生型的存在。因此，该探针结构允许简单多重检测横跨基因组的相对长的延伸的多个突变。
此种探针的进一步说明性使用显示于图11至15中，其说明用于检测痘苗病毒和将该病毒区别于相关痘病毒的探针的使用。图11将痘苗基因组序列的30个核苷酸部分与猴痘(monkeypox)，牛痘(cowpox)，鼠痘(ectromelia)，和骆驼痘(camelpox)病毒的进行比较。将看到横跨该序列存在八个可以不同的碱基。
图12说明用于检测病毒基因组的该区域和将不同病毒彼此区别的探针。所述探针包括被五个肌苷残基的序列从第二报告子区域分开的第一报告子区域。第一报告子区域包括三甲氧基茋帽。每个报告子区域包括两个荧光标记的T残基。
所述探针序列是：
5'-GAG T＊AT TTG T＊CA TTT IIIII TAT ATT T＊GT TGG CT＊G-3':SEQ IDNO：1
覆盖以5'三甲氧基茋，和3'磷酸。I＝肌苷。T*＝荧光标记的T。
两个报告子区域横跨显示于图11的30个核苷酸序列，并且二者都覆盖许多可能的变异位点。
图13将探针的灵敏度与横跨同样的30nt序列的标准痘苗探针的灵敏度进行比较。在同样的拷贝数，接头探针显著更灵敏。为了比较灵敏度，使用表示在图15中的引物和条件扩增基因组的部分，并且随后使用相关探针在扩增子上进行解链曲线测试。
图14显示当杂交于不同痘病毒靶序列时，痘苗探针("接头探针")和常规痘苗探针("标准探针")的解链曲线。接头探针横跨的Tm范围小得多，但是接头探针提供不同痘病毒之间改善的区分，并且允许通过单个探针明确地鉴别和区分五种病毒。与常规探针相比，接头探针的使用降低了产物的Tm，并且降低了Tm范围，以使在所述范围内的多重使用能够更高。本发明的探针允许在30个碱基的短区域中鉴别高达五个碱基的错配，因此允许鉴别痘病毒。
图16显示用于在人酪氨酸羟化酶基因中分析短串联重复序列(STR)的引物和探针序列。
正向和反向引物是：
TH01-FWD
ATT CAA AGG GTA TCT GGG CTC TGG：SEQ ID NO:2
TH01-REV
GTG GGC TGA AAA GCT CCC CAT TAT:SEQ ID NO:3
TH基因包括(AATG)n的短串联重复序列，已知其是多态的。为了确定本发明能够区别不同长度的STR，比较了两个探针的灵敏度和准确度。两个探针都为同样的序列，制备探针1(无接头)，而探针2包括在探针的两个部分之间的用作接头的五个肌苷的碱基序列。探针序列是：
TH01-探针1
M ACAGACTCCAFG GFGAATGAAFGAATGAGGGAAATAAGGG AGGA P:SEQ IDN0：4
TH01-探针2
M ACAGACTCCAFG GFGAATGAAFGAATGA ＊＊＊＊＊GGGAAATAAGGG AGGA P:SEQID NO:5
(M＝三甲氧基茋；P＝磷酸；*＝肌苷；F＝荧光标记的T)。
用引物扩增靶序列之后，用探针1或探针2之一和扩增子进行解链曲线分析。曲线显示于图16。尽管两个探针都能够区别3，6，9，和12个拷贝的重复序列，但是具有接头的探针2提供在窄得多的温度范围内的不同数量的重复序列之间的区分。

Claims (27)

1.一种核酸探针，其包括与第一靶核酸序列互补的第一核酸序列；与第二靶核酸序列互补的第二核酸序列；和连接第一和第二核酸序列的接头核酸序列；其中所述接头分开所述第一和第二序列两个，以致与所述第一靶核酸序列退火的第一序列的解链温度和与所述第二靶核酸序列退火的第二序列的解链温度是分离的。
2.如权利要求1所述的探针，其中所述接头包括多脱氧核糖核苷酸。
3.如权利要求1或2所述的探针，其中所述接头包括多脱氧肌苷或由多脱氧肌苷组成。
4.如任一项在前权利要求所述的探针，其中所述接头的长度为多达5，10，15，20，30，40，50个核苷酸。
5.如任一项在前权利要求所述的探针，其中所述第一和第二核酸序列中的至少一个是报告子区域，所述报告子区域包括标记的部分；优选荧光标记。
6.如任一项在前权利要求所述的探针，其中所述探针不包括猝灭部分。
7.如权利要求5所述的探针，其中所述报告子区域的长度优选为15-200nt，长度更优选为15-150，还更优选为15-100，或20-100，30-80，40-60，或大约50nt。
8.如权利要求5或7所述的探针，其中所述报告子区域被设计为具有与完全互补靶序列相关的第一Tm，和改变的、优选更低的与变体靶序列相关的Tm。
9.如任一项在前权利要求所述的探针，进一步包括阻断区域，所述阻断区域用于阻断通过DNA聚合酶的核酸链的延伸。
10.如任一项在前权利要求所述的探针，其中第一和第二核酸序列二者都是报告子区域。
11.如权利要求10所述的探针，其中报告子区域二者都选择为具有在结合野生型靶序列的情况下相似的Tm，和在结合突变靶序列的情况下降低的Tm；优选的，对于第一报告子区域的降低的Tm不同于第二报告子区域的降低的Tm。
12.如权利要求1至9任一项所述的探针，其中所述第二核酸序列是报告子区域，并且所述第一核酸序列是锚定区域，其中与所述第一靶核酸序列退火的锚定区域的解链温度比与所述第二靶核酸序列退火的第二序列的解链温度高。
13.如权利要求12所述的探针，其中锚定区域：靶序列双链体的Tm显著高于(高出至少0.5，1，1.5，但更通常多达5至20℃)报告子区域对靶序列的Tm。
14.如权利要求12或13所述的探针，其中所述锚定区域的长度是至少50nt，更优选至少60，70，80，90，100，125，150nt。
15.如权利要求12，13，或14所述的探针，其中所述锚定区域的长度为不大于200nt。
16.如权利要求12至15任一项所述的探针，其中所述报告子区域包括串联重复序列。
17.如权利要求12至16任一项所述的探针，其中所述锚定区域包括串联重复序列和单一序列。
18.如权利要求1至11任一项所述的探针，其中第一和第二靶核酸序列发现于结核分枝杆菌(M tuberculosis)的基因组中。
19.如权利要求1至11任一项所述的探针，其中第一和第二靶核酸序列发现于痘苗痘病毒(vaccinia pox virus)的基因组中。
20.如任一项在前权利要求所述的探针，其中第一和第二靶序列在基因组序列中在彼此200，150，100，50，40，30，20，15，10，5，4，3，2，1个核苷酸内。
21.一种核酸探针，其包括与第一靶核酸序列互补的第一锚定核酸序列；与第二靶核酸序列互补的第二报告子核酸序列；和连接第一和第二核酸序列的接头核酸序列；其中所述接头分开第一和第二序列，以致与其各自的靶序列杂交的第一和第二序列的解链温度是分离的，并且其中与所述第一靶核酸序列退火的锚定序列的解链温度高于与所述第二靶核酸序列退火的报告子序列的解链温度；并且其中每个报告子序列包括至少一种可检测标记。
22.一种核酸探针，包括与第一靶核酸序列互补的第一报告子核酸序列；与第二靶核酸序列互补的第二报告子核酸序列；和连接第一和第二核酸序列的接头核酸序列；其中与第一靶核酸序列退火的第一报告子序列的解链温度和与第二靶核酸序列退火的第二报告子序列的解链温度相似或相等；并且其中每个报告子序列包括至少一种可检测标记。
23.根据任一项在前权利要求所述的核酸探针，其进一步包括一个或多个其他接头序列，和用于与一个或多个其他靶序列杂交的一个或多个其他核酸序列。
24.一种检测靶核酸序列中一个或多个多态性的方法，所述方法包括：
提供根据权利要求1至23任一项所述的探针；
将探针与测试核酸序列接触，所述测试序列具有第一靶核酸序列和第二靶核酸序列；
让所述探针的第一核酸序列与所述第一靶核酸序列杂交；和让所述探针的第二核酸序列与所述第二靶核酸序列杂交；和
确定与第一靶序列杂交的第一探针序列的Tm；和确定与第二靶序列杂交的第二探针序列的Tm；
其中Tm指示野生型序列或变体序列的存在。
25.一种检测靶核酸序列中的串联重复的方法，所述方法包括：
提供根据权利要求12至17任一项所述的探针，所述探针包括具有许多串联重复单元的报告子序列；
将所述探针与测试核酸序列接触，所述测试序列具有第一靶核酸序列和第二靶核酸序列，其中所述第一靶序列与探针锚定序列互补，并且所述第二靶序列包括许多与所述报告子序列的串联重复单元互补的串联重复；
让所述探针的锚定核酸序列与所述第一靶核酸序列杂交；和让探针的第二核酸序列与所述第二靶核酸序列杂交；和
检测所述报告子序列与所述测试核酸序列结合与否。
26.一种检测靶核酸序列中的一个或多个多态性的方法，所述方法包括：
提供根据权利要求1至23任一项所述的探针；
将所述探针与测试核酸序列接触，所述测试序列具有第一靶核酸序列和第二靶核酸序列；
让所述探针的第一核酸序列与第一靶核酸序列杂交；和让探针的第二核酸序列与第二靶核酸序列杂交；和
确定与第一靶序列杂交的第一探针序列的Tm；和确定与第二靶序列杂交的第二探针序列的Tm；
将确定的第一探针序列的Tm与预期的第一探针序列的Tm相比较；
基于确定的和预期的第一探针序列的Tm的不同，标准化所确定的第二探针序列的Tm；
其中标准化的第二探针序列的Tm指示野生型序列或变体序列的存在。
27.如权利要求24或26任一项所述的方法，其中所述变体序列是缺失，重复，SNP，或插入。
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