CN1926247A

CN1926247A - 检测strp例如脆性x染色体综合征

Info

Publication number: CN1926247A
Application number: CNA2005800064661A
Authority: CN
Inventors: S·韩
Original assignee: Biocept Inc
Current assignee: Biocept Inc
Priority date: 2004-03-01
Filing date: 2005-02-28
Publication date: 2007-03-07
Also published as: WO2005085476A1; US20050191636A1; EP1723261A1; KR20070011354A; JP2007525998A

Abstract

提供了检测短串联重复多态性(STRP)如脆性X染色体综合征的方法，其中采用PCR扩增基因组DNA染色体中的核酸，扩增的核酸包括所有感兴趣的STR以及毗邻STR的核酸的基本邻接的片段。然后获得了单链产物，将靶向(i)STR和(ii)邻接的DNA片段的荧光标记的寡核苷酸与所述单链产物杂交，然后结合于固相并与剩余的靶向物分开。用碱处理回收标记的寡核苷酸靶向物，然后与含有多个斑点的微阵列杂交，所述斑点中含有与所述寡核苷酸靶向物互补的合适的寡核苷酸探针。杂交后，检测微阵列上具体斑点中存在的标记的杂交靶的荧光强度以获得各值，并与已知对照样品的结果比较，以准确定量被分析DNA感兴趣区域的STR数目。

Description

检测STRP例如脆性X染色体综合征

发明领域

本发明总体涉及用于成人、胎儿和胚胎的遗传或偶发性遗传缺陷的诊断检测，更具体地说涉及由短串联重复(STR)引起的疾病或缺陷的检测，再具体地说涉及引起脆性X染色体综合征(fragile X syndrome)的遗传缺陷的检测。这些STRP检测采用聚合酶链式反应(PCR)，然后与微阵列杂交，并进行分析。

发明背景

真核生物DNA具有很短的简单序列的串联重复，称为短串联重复多态性(STRP)。重复多态性包括二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸重复。三核苷酸和四核苷酸重复是3个核苷酸和4个核苷酸的重复。已知越来越多的疾病与三核苷酸STR的扩增有关(Trottier，Y.等，Current Biology 3：783-786(1993)；Bates，G.等，Bioassays 16：277-284(1994)；Kawaguchi，Y.等，NatureGenetics8：221-227(1994))。这些疾病中，重复块的大小往往与疾病的严重程度和发病年龄相关，因此也反映了疾病的严重程度和发病年龄。一些疾病与重复块大小的轻微增加有关，例如，亨廷顿氏病、I型脊髓小脑性共济失调性疾病、脊髓延髓肌肉萎缩症、马-约病和齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩。其它疾病可能包括高达100倍的正常STR的扩增，如A型脆性X染色体、E型脆性X染色体和肌强直性营养不良。

已提议了某些基于存在于人基因组的高多态性类型或重复DNA的扩增和检测的诊断和法医检定，例如Craig等，J.Forensic Sci.，第33卷，1111-1126页(1988)；Edwards等，Genomics，第12卷，241-253页(1992)；Boerwinkle等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第86卷，212-216页(1989)；Tautz，Nucleic AcidsResearch，第17卷，6463-6471页(1989)等。通常，用聚合酶链式反应(PCR)扩增含有重复序列的DNA片段，然后用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨其大小。

该方法靶向于称为“短串联重复”或“STR”重复DNA，由于这种DNA的大小和在基因组中的分布，诊断和基因定位应用对其尤其感兴趣。这类DNA中重复单元的长度通常为2-6个核苷酸，这使它们成为PCR扩增和电泳分离的方便靶标。国际申请WO 94/03638公开了同时扩增一个或多个染色体特异性STR的方法，通过电泳分辨大小来分离扩增的STR以及测定各扩增的STR DNA的量；该方法用于确定所选染色体的非整倍性。美国专利申请2003/0224380建议对应于这些重复DNA两侧区域的寡核苷酸可用作扩增小DNA样品的聚合酶链式反应(PCR)引物，该专利申请引用了Saiki，Science 239：484-491(1988)。通过用标记的例如放射性或荧光核苷酸扩增DNA，可将样品在测序胶上进行分析，并用已知的方法例如放射自显影图或荧光检测来显像。因为这些多态性包括等位基因，这些等位基因的长度可能只相差几个碱基对，所以据称这些多态性一般不能用常规的(传统的RFLP分析中所用的)Southern印迹检测到。国际申请WO 94/03638揭示了可用扩增的至少3个核苷酸的STR来检测非整倍性。电泳分辨大小来分离扩增的DNA，用可用分光光度计解析的荧光标记来确定相对浓度。

有很多遗传疾病属于STRP的范畴。这些疾病包括：

肌强直性营养不良-CTG重复：亨廷顿病和脊髓小脑性共济失调-CAG重复；以脆性X染色体-CGG重复。脆性X染色体综合征是一种X连锁的外显率降低的显性疾病，是遗传智力迟钝的最常见形式之一。该疾病影响大约1/1250的男性和1/2000的女性。患有该疾病的男性和女性的认知、行为和身体表型不同，由于突变的X连锁遗传，它对男人的影响更严重。

如其名称所表示的，脆性X染色体是一种X染色体连锁的疾病。脆性X染色体表型的特征是在X染色体近末端处(q27.3)有可见的缢痕，X染色体的尖部在组织培养的某些条件下容易断裂。研究者们已鉴定了与该疾病相关的基因组区域，与脆性X染色体综合征相关的DNA序列(FRAXA基因)揭示于美国专利6,197,500。引起该疾病的突变造成位于Xq27.3的FRAXA 5′非翻译区的CGG重复的扩增。脆性X-CGG重复有4种形式：常见(6-40重复)、居间(41-60重复)、前突变(61-200重复)和完全突变(＞230重复)。最终导致脆性X染色体表型的突变往往是分阶段发生的。在早期阶段，该基因还没有完全缺陷，而是“前突变”，前突变携带者可能具有正常表型。但是，在女性携带者中发生的突变可能会在其后代中产生表型。CGG重复数目的增加产生的后果从异常行为到智力迟钝不等。高于正常范围(6-40)的CGG重复数目决定了该综合征的严重程度。

多年来，诊断脆性X染色体综合征的唯一途径就是通过组织培养中细胞生长和处理以后显微检查患者个体的染色体。该检查中，实验室将检查X染色体以确定其尖部是否已断裂。早期一些用基于PCR的方法在基因组水平直接鉴定CGG重复序列的尝试均告失败(见E.J.Kremer，″基因定位方法确定脆性X染色体的DNA不稳定性是由三核苷酸重复序列p(CGG)n造成的″，Science，第252卷，Jun.21，1991，1711-1714页)。

近期一些诊断方法用PCR和凝胶电泳分离基于分子量来进行鉴定。例如授予Bunn等的美国专利5,213,961公开了一种用竞争方法来进行定量PCR的方法，其中讨论了影响DNA扩增的参数和分辨模板(测试和对照)比率以及拷贝数的区别的机制。该专利提到可用其方法来检测体细胞突变。Bunn等揭示了各种参数对扩增过程的影响，这些参数主要来自DNA引物的性质及它们各自的结合位点等；然而，该系统只限于使用与靶DNA足够接近的标准品从而可以用PCR以相同的比率同时扩增靶标和样品。而且，标准品必须与靶标不同从而后续过程中可通过酶的作用改变其长度，用电泳使标准品和靶标分离并定量。

授予Caskey的美国专利6,180,337揭示了一种检测和比较正常和未患病个体中FMR-1基因表达的方法，其中患病个体相对于正常个体FMR-1基因表达的改变表明脆性X染色体突变。该方法试图定量不稳定的mRNA而非稳定的基因组DNA，所以该方法常常造成诊断结果不准确。授予Das的美国专利6,143,504使用甲基特异性PCR以鉴定患有脆性X染色体综合征的男性。然而，该方法只限于诊断具有大于200个重复的完全突变。授予Sutherland的美国专利6,197,500揭示了一种包含人脆性X染色体位点的纯化和分离的DNA分子，该专利教导了用与扩增产物互补的引物杂交(用于鉴定基因组DNA)来检测CGG重复的PCR扩增产物。然而，该专利没有教导如何特异性定量重复的数目从而获得后续的准确诊断结果；它只是暗示使用在合适的严谨度下可与异常序列杂交的引物。美国专利5,658,764和6,200,747公开了一种检测脆性X染色体综合征的方法，其采用了PCR、dGTP的类似物，然后最终用凝胶电泳分离。

然而，这些方法在确定CGG重复的数目从而提供准确诊断结果方面的能力是很有限的。原因通常在于PCR扩增CGG重复区域的难度，以及不能产生足够的PCR产物来进行准确的凝胶电泳分析(需要大量的PCR产物进行检测)。

因此，对STRP引起的疾病和缺陷尤其是脆性X染色体综合征的简易和可信的准确检定方法进行了持续研究。

发明概述

开发了一种使用高灵敏度比色检测的方法，该方法能够准确地评估基因组DNA中存在的STR拷贝数，例如FRAXA基因5′-非翻译区的CGG重复。选择含有STR和邻接区域或区段的DNA区域，所述邻接区域或区段作为内标，从而可用PCR从基因组DNA样品中同时扩增STR和邻接区域或区段。对于脆性X染色体综合征，选择编码内标的DNA区域使其位于X染色体上CGG重复区域的5′或3′；只要CGG重复区域与内标区段是邻接的，它们总是能同时扩增出来。样品PCR扩增之后，采取合适的步骤以获得单链产物。然后提供标记的CCG靶标和标记的内标靶DNA，将这些标记的靶标与单链(PCR扩增产物)杂交。洗涤除去未杂交产物之后，获得了剩余的与PCR产物杂交的标记的寡核苷酸靶标，然后将其与含有CGG探针和内标探针的微阵列杂交以将其定量。然后确定CGG重复区域探针的信号强度与内标探针信号强度的比例并将该比率与先前从已知对照样品产生的数值进行比较，从而准确评估CGG重复的拷贝数。适当地选择相关染色体的毗邻区段用作内标并将其与STR区域共同扩增，从而进行其它STRP的类似分析。

在一个具体方面，本发明提供一种检测脆性X染色体综合征突变指示的方法，该方法包括以下步骤：(a)获得要检测的基因组DNA，(b)用PCR沿基因组DNA中X染色体扩增核酸，该核酸包括FRAXA基因非翻译部分的所有CGG重复和与所述CGG重复毗邻的核酸的基本邻接的(substantial contiguous)区段，(c)从步骤(b)扩增的核酸获得单链产物，(d)将靶向(i)(CGG)重复和(ii)所述邻接核酸区段的比色标记的寡核苷酸与步骤(c)中所述的单链产物杂交，(e)将步骤(c)中所述的单链产物结合于固相，(f)将步骤(d)所述杂交产物与剩余的靶物质分离，(g)从步骤(f)分离的产物中回收标记的靶物质，(h)然后将步骤(g)中回收的标记的靶物质与微阵列杂交，该微阵列具有多个含有合适的与所述靶物质互补的寡核苷酸探针的斑点，(i)与微阵列杂交后，检测微阵列上具体斑点中杂交的标记靶物质的比色强度，以获得各自的数值，和(j)将步骤(i)中的结果与已知对照样品的结果比较，以准确定量获得的基因组DNA中FRAXA基因的CGG重复数目。

在另一个具体方面，本发明提供一种检测脆性X染色体综合征突变指示的方法，该方法包括以下步骤：(a)获得要检测的基因组DNA，(b)用PCR以及正向和反向引物沿基因组DNA的X染色体扩增核酸，该核酸包括所有CGG重复和翻译的FRAXA基因的邻接部分，所述正向引物在其5′末端具有锚定部分，(c)纯化步骤(b)中的双链产物，(d)用外切酶消化步骤(c)中产物的反义链获得其单链产物，(e)将步骤(d)的产物与靶向(CGG)重复和靶向FRAXA基因邻接部分的荧光标记的反义DNA杂交，(f)通过所述正向引物5′端的锚定部分结合于固相，从而将步骤(d)中所述杂交产物与剩余未杂交的靶物质分离，(g)将步骤(g)的产物与含有合适探针的微阵列杂交，杂交于所述微阵列后，检测存在的荧光标记的靶物质荧光强度，以获得各数值，以及(h)用下式：N＝30+(A-1.03)66.4(其中N是重复数目，A是与CGG探针杂交的靶物质的FI和与邻接区段的探针杂交的靶物质的FI之比)，将步骤(g)的结果与获自已知对照样品的结果比较，以准确定量获得的DNA中FRAXA基因的CGG重复数目。

在另一个具体方面，本发明提供检测短串联重复多态性(STRP)的方法，该方法包括以下步骤：(a)获得要检测的基因组DNA，(b)用PCR沿基因组DNA中的染色体扩增核酸，该核酸包括所有感兴趣的STR和与所述STR毗邻的核酸的基本邻接区段，(c)从步骤(b)扩增的核酸获得单链产物，(d)将靶向(i)STR和(ii)所述邻接核酸区段的比色标记的寡核苷酸与步骤(c)中所述的单链产物杂交，(e)将步骤(c)中所述的单链产物结合于固相，(f)将步骤(d)所述杂交产物与剩余的标记靶物质分离，(g)从步骤(f)分离的产物中回收标记的靶物质，(h)然后将步骤(g)中回收的标记的靶物质与微阵列杂交，所述微阵列具有多个含有合适的与所述靶物质互补的寡核苷酸探针的斑点，(i)与微阵列杂交后，检测微阵列上具体斑点中杂交的标记靶物质的比色强度，以获得各自的数值，和(j)将步骤(i)中的结果与已知对照样品的结果比较，以准确定量获得的基因组DNA中FRAXA基因的CGG重复数目。

在另一个具体方面，本发明提供检测脆性X染色体综合征突变指示的试剂盒，该试剂盒包括：(a)一对DNA寡核苷酸，在扩增哺乳动物基因组DNA的聚合酶链式反应中用作正向引物和反向引物，其中正向引物与位于FRAXA基因5’端非翻译区的X染色体位置的反义链的3′核苷酸序列互补，反向引物与FRAXA基因内的位置或其3’端互补，所述正向引物具有与其5′端共价连接的锚定部分，所述反向引物的5′端具有磷酸基团，所述寡核苷酸引物对特异性地扩增含有所有CGG重复和基本邻接区段(用作内标)的基因组DNA区域，(b)标记的寡核苷酸，独立地靶向所述CGG重复和所述内标区段，(c)缓冲液和酶，用于进行(i)PCR，(ii)反义链的酶解，(iii)DNA-DNA杂交和洗涤，(iv)与杂交的标记的寡核苷酸靶分离，和(v)比色定量，(d)至少一个具有多个斑点的微阵列，各斑点附有与所述标记的寡核苷酸靶之一互补的DNA探针；和(e)用所述微阵列的比色扫描结果和先前对照样品的数据来诊断CGG重复数目的工具。

在另一个具体方面，本发明提供检测STRP突变指示的试剂盒，该试剂盒包括：(a)一对DNA寡核苷酸，在扩增哺乳动物基因组DNA的聚合酶链式反应中用作正向引物和反向引物，所述引物寡核苷酸对特异性扩增含有所有STR和基本邻接区段(用作内标)的所选的基因组DNA区域；其中正向引物与所选染色体区域反义链的3’核苷酸序列互补，反向引物与所选区域正义链的3’末端互补，所述正向引物具有与其5′端共价连接的锚定部分，所述反向引物的5′端封闭不能延长，(b)标记的寡核苷酸，独立地靶向所述STR区域和所述内标区段，(c)缓冲液和酶，用于进行(i)PCR，(ii)反义链的酶解，(iii)DNA-DNA杂交和洗涤，(iv)与杂交的标记的寡核苷酸靶分离，和(v)比色定量，(d)至少一个具有多个斑点的微阵列，各斑点附有与所述标记的寡核苷酸靶之一互补的DNA探针；和(e)用所述微阵列的比色扫描结果和先前对照样品的数据来诊断STR数目的工具。

优选实施方式详述

提供了下列术语和首字母缩写词的定义以更好得理解本文下面的发明详述。

杂交，用于表示溶液或固相中互补DNA链之间的双链结构的形成，其中两条链之一固定到固体表面或基质。

退火，本文用于表示在允许探针或引物结合到分析物核酸中探针或引物的互补序列的条件下(温度缓慢降低或在一个温度下)，单链或热变性的双链核酸分析物与寡核苷酸探针或引物一起孵育。

分析物或分析物核酸，用于描述DNA样品中的化合物，它是分析的目标。

标记或可检测标记(或“标签”)指可结合到核酸序列的取代物，它使核酸能够被检测和/或定量。例如放射性标记如32p、33p和35S，比色指示，如荧光，化学发光剂或有色化合物；配体如生物素；以及可通过质谱或其它光谱性质来区分的化学基团。合适的标记的更具体的例子包括黄嘌呤染料、罗丹明染料、萘胺、苯并二唑类(benzoxadiazoles)、二苯乙烯类化合物、嵌二萘化合物、吖啶、花青3和花青5。可用多种方法将标记掺入分析物核酸中，例如通过化学反应，通过酶反应(包括聚合酶、激酶或连接酶)掺入标记的核苷酸，或通过将标记的探针与分析物核酸杂交或退火。

探针，指用作结合于其互补序列的试剂的核酸序列，其互补序列是通过杂交反应由分析物核酸确定的。

序列，指核酸内的一串碱基，包括DNA中的A、G、C、T残基，它们以特定的顺序和链长度连接在一起。

互补或互补序列，指能够形成双链结构的两个序列。

标记的探针，本文指携带一种或多种可检测标记或标签的寡核苷酸，它能够结合于核酸分析物中它的互补序列上，使核酸分析物能够被检测和/或定量。

捕获探针，本文用于指在一端结合(即链接(tether))于固体表面的特定序列的寡核苷酸，它能够在杂交反应中将含有互补序列的核酸或寡核苷酸捕获到固体表面上。

靶标、靶序列、靶链或靶核酸，本文用于指核酸序列，它的存在是检测的目的，例如，通过与特定的DNA探针杂交来检测其存在。术语“靶序列”有时用于广义，指被DNA探针结合的核酸分子或片段，或者从狭义上讲，指衍生自通过互补碱基配对结合于DNA探针的靶核酸的特定核酸序列。

链接或表面链接，本文指一端结合于某些表面的寡核苷酸，这种结合是通过表面的功能团和DNA探针一端的功能团形成的共价键或其它强键。

固相杂交，指参与形成双链结构的两条“反应链”之一固定于固体支持物上进行的杂交反应。

边界或侧翼序列，指接近、毗邻和/或包括所选DNA序列和染色体末端的核酸区段。

寡核苷酸，指可化学合成、通常长度至多约100个核苷酸的短DNA链。

基因，指一种遗传功能单元，包括编码蛋白的序列、位于基因内的内含子(非编码)序列，以及在基因调控中发挥功能的其它序列。

基因组，指组成有机体或自主复制体的整套基因、基因间序列和其它遗传元件。微阵列或DNA芯片指形成在表面上的链接于表面的DNA探针的二维阵列，它能够同时分析多个杂交反应，通常为小型化形式，各DNA探针以小于1毫米的中心-至-中心的距离排列。

引物，指具有游离3′-OH末端的寡核苷酸，它能够与“模板链”碱基配对从而能够用聚合酶来延伸。例如，与DNA模板退火的寡核苷酸引物(和脱氧核苷酸5′-三磷酸一起)可用作DNA聚合物的底物，在PCR反应中形成“引物延伸”。引物对指结合于核酸区段相反链的两个引物。

PCR片段，指由聚合酶链式反应形成的特定长度(由模板上引发位点之间的距离决定)的DNA片段。

变性或变性的，指在使双链螺旋不稳定的条件下(最常见的是温度的提高(热变性))，双链核酸分子两条链的分开(分离)。

重复或重复序列，指短重复序列，尤其是CGGCGGCGG。

5′-端/末端指核酸链的末端，该核酸链含有在其脱氧核糖上具有非酯化碳-5的核苷酸。

3′-端/末端指核酸链的末端，该核酸链含有在其脱氧核糖上具有非酯化碳-3的核苷酸。

CCD-电荷偶联装置。

CI-比色强度。

FI-荧光强度。

PCR-聚合酶链式反应。

SSC-标准柠檬酸盐水，含有150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠的溶液。

STR-短串联重复。

STRP-短串联重复多态性。

本申请人的诊断方法先用PCR扩增相对于总基因组DNA以低丰度存在的特定DNA序列。通过采用PCR，可十万倍甚至更多倍扩增特定的DNA序列以利于其检测(当其在起始DNA中存在时)。

美国专利4,683,202，4,683,195，4,800,159和4,965,188(纳入本文作为参考)，提供了本发明所用现有已知PCR方法的详述。通过使用与特定感兴趣区域的侧翼序列互补的寡核苷酸引物，从而实现相反和重叠方向的引物定向性DNA合成，PCR在几个小时内以几个数量级扩增DNA序列。通过使用高温模板变性、寡核苷酸引物退火和聚合酶介导的延伸这样的重复循环，DNA序列可被忠实地扩增几十万倍。通常，进行PCR需要知道待扩增模板的5′和3′端，以设计对应各模板的两个不同引物，一个正向引物用于产生正义链，一个反向引物用于产生反义链。

本发明的PCR方法优选采用一对引物，该对引物包括能够作为所需DNA合成起始位点的寡核苷酸。寡脱氧核苷酸引物的序列各自具有游离的3′OH基团，寡核苷酸引物与模板序列杂交后，游离的3′OH基团相对于所需模板的3′端是凹进去的，因此在以下物质存在下可作为与模板链互补的核酸聚合物聚合合成的起始位点：(a)脱氧核苷酸底物，(b)可进行DNA复制的合适的酶，和(c)合适的温度，以及提供所需pH的缓冲液。从方便的角度考虑，引物优选是合成产生的。PCR通常使用结合于所选核酸模板的两个引物，这两个引物分别与待扩增双链区段的两个3′端或3’边界之一互补。它们通常称为正向和反向引物。在引发引物延伸的条件下，将引物与其它PCR试剂混合，即与四种不同的核苷三磷酸(或其类似物)、合适的聚合酶和合适的缓冲液(″缓冲液″包括决定pH、离子强度以及其它因子的试剂)在合适的温度下混合。在聚合酶为Taq聚合酶的PCR方法中，缓冲液可含有1.5-2mM的镁盐(优选MgCl₂)、15-200uM的各核苷三磷酸、1uM的各引物，和例如50mM KCl、10mM Tris缓冲液(pH 8.4)以及100g/ml明胶。进行PCR扩增的此类试剂盒可从很多厂商处购得。

各引物应足够长以在合适的聚合酶和其它试剂(如上述提到的)存在的条件下起始或引发延伸的DNA产物的合成。众所周知，合适的引物长度取决于多种因素；通常，在实施本发明方法时，使用含有15-30个核苷酸残基的引物。短的引物分子一般需要低反应温度以形成和维持支持链延伸反应的引物-模板复合物。

所用引物需要基本上与含有待扩增的所选序列的核酸互补，即，引物必须结合于含有所选序列(或其互补序列)的核酸(即与其杂交)。引物序列不需要完全准确地与模板互补；例如，非互补的核苷酸区段或其它部分可能结合于引物的5’末端，而引物序列的剩余部分与所选核酸序列互补。优选并且通常使用与所选核酸序列完全互补的引物。

一般，只要足够详细地知道某序列两端足够多的碱基，从而可以制备与所需序列(位于核酸序列所需的相对位置上)的不同链杂交的两个寡核苷酸引物，就可以用PCR方法扩增任何特定的核酸序列。因此，由一个引物合成的延伸产物在与其模板(互补链)分离以后，可作为下一个循环中另一个引物延伸为特定长度核酸的模板。

在本发明诊断STRP的优选实施方式中，使用了一对引物。引物之一，即正向引物，与接近、毗邻和/或包括所选DNA区域反义链3’端的序列互补。另一个引物，即反向引物，含有接近、毗邻和/或包括所选DNA区域反义链3’端的序列的互补序列。

根据检测方法所要针对的STRP，首先确定相关染色体上要扩增核酸的长度。因为人类基因组测序已完成，这些STRP的位点现在是已知的，因此我们关注出现这些位点的位置。然后判断、选择包括所有STR区段和STR区段3’或5’末端邻接区段(用作内标)的侧翼序列。对于脆性X染色体综合征，虽然也可使用STR区域5’端的邻接序列，但优选STR区域3’端的邻接序列。一旦选择了待扩增的核酸区段长度，设计合适的寡核苷酸引物以实现完整的STR区域和所选邻接区域(用作内标)的共同扩增。这些引物将设计为与核酸各链的3’区互补，所述3’区接近、毗邻和/或包括所选核酸区段的特定末端。

通常，引物长度约为15-30个核苷酸，优选长度约为18-27个核苷酸。优选引物与基因组中独特的DNA序列杂交从而使杂交最大限度地发生在所需位点。

当然，染色体上要扩增的核酸长度将取决于STR区域的长度，因为要检测的就是该长度的变化。一般，正常的人基因组中选择的核酸长度约为350-2000个核苷酸，优选核酸长度约为500-1000个核苷酸。

为了有利于检测，提供了包括所有必要工具的试剂盒。例如，检测脆性X染色体综合征突变指征的试剂盒应包括一对DNA寡核苷酸，在扩增哺乳动物基因组DNA的聚合酶链式反应(PCR)中用作正向引物和反向引物，其中正向引物与FRAXA基因非翻译区5’末端位置(CGG重复位于该位置)的X染色体反义链的3’核苷酸序列互补，反向引物与FRAXA基因内的位置(即重复区域的3’末端)互补。当反向引物在其5’端具有磷酸基团(phosphate(被磷酸化))时，正向引物应具有共价连接于其5’末端的锚定部分。如果需要，这种安排可以倒置。这样，这对引物特异性扩增含有所有CGG重复和基本邻接区段(用作内标)的基因组DNA区域。提供标记的寡核苷酸，它们分别靶向CGG重复区域和内标区域，还提供了缓冲液和酶，用于进行(i)PCR，(ii)反义链的酶解，(iii)DNA-DNA杂交和洗涤，(iv)与杂交的标记的寡核苷酸靶分离，和(v)比色定量。该试剂盒将包括具有多个斑点的微阵列，所述斑点各连接有与标记的寡核苷酸靶之一互补的DNA探针。该试剂盒还包括用微阵列的扫描(例如比色扫描)结果，基于先前对照样品的数据，从而对CGG重复的数目进行诊断的工具。

所用引物对中的正向引物优选具有共价连接于各引物5’端的锚定部分。反向引物在5’用磷酸盐衍生。所述锚定基团在下面将要阐释的该检测方法的分离步骤中发挥其优势。一般，可采用任何锚定基团将寡核苷酸偶联于固体表面或固相。

如本领域众所周知的，可采用各种固相材料；例如，固体支持材料可任意选自常用的多种材料，如可从Amersham Biosciences、BioRad和Sigma购得的材料。其可为颗粒、片状、基质、纤维等形式，可由二氧化硅、纤维素、琼脂糖珠、可控多孔玻璃、聚合物珠、凝胶珠或磁珠制成。优选磁珠，因为采用磁珠有助于后续步骤中通过直接应用磁场而将其从上清中分离。这种分离可使用流式小室或简单的吸打来实现。这种磁珠，例如市售的Dynal小珠或Advanced Magnetics出售的磁珠，可用于通过洗涤将扩增的DNA与剩余的生物材料、PCR材料和反应产物分开。磁珠同样的性质也在本发明检测方法的后期步骤中分离未偶联的靶材料中发挥了优势。虽然出于简易和操作方面考虑，优选小珠形式的颗粒，但也可用其它形状的颗粒或基材。市售的磁珠一般是无孔的小球，涂覆有磁铁层以提供所需的磁性，然后还涂覆有外用涂料。用于这些目的的市售磁珠可用多种方法生产；通常，用合适的涂层材料，例如聚合物或硅酸盐包裹顺磁金属如金属氧化物，以产生直径约1um-100um的涂覆的小珠。

互补并彼此结合的锚定部分和偶联剂用于将扩增的DNA连接到所述固体支持物。本领域已知很多结合对，这些合适的结合对均可使用。锚定部分可直接与结合固相，或者更常见的是结合到固相携带的互补偶联剂上。优选的结合系统采用卵白素或链霉抗生物素和生物素。例如，链霉抗生物素共价连接于固体支持物的外层，例如磁珠上，进而，牢固结合于生物素化的DNA。可用于感兴趣应用的合适磁珠可从很多厂商处购得。标称直径约1微米、有链霉抗生物素结合于其表面的小珠可购自Active Motif of Carlsbad，California。或者，其它结合对例如抗体-抗原等，可也用作中间的连接。这些经过衍生的小珠可以作为试剂盒的一个任选部分提供，和缓冲液一起有助于上述(iii)中的洗涤。

作为试剂盒各类别的一部分提供的其它组分是可通过商业途径获得的公知的组分，常作为任何PCR试剂盒的一部分包括在试剂盒中。上述4个美国专利参考文献提供了现有已知PCR方法的详细信息，也提供了有关于这些组分的详细描述。

试剂盒的一个重要组分是一组标记的寡核苷酸，它们设计为分别靶向CGG重复区域和选作内标的区域。用作标记的物质可以是任何常用的标记，选自用于标记核酸的市售的很多材料，包括指示剂染料、放射性核素、抗体和酶等。优选的，所述标记是比色指示剂，为了最终进行简单的检测，更优选荧光染料；但是也可使用碱性磷酸盐、过氧化物、β-半乳糖苷酶和半抗原，如地高辛和洋地黄毒苷，以及化学发光部分。如本领域熟知的，虽然可使用短接头从而该标记不会影响靶物质的杂交，但一般标记直接连接于靶物质。优选的比色指示剂是Cy-3荧光染料。

在两个独立的、标记的寡核苷酸靶中，一个靶设计用于与STR部分杂交。这些寡核苷酸应包括3-7个三联体密码，优选4-6个三联体密码，即长度约为12-18个核苷酸。用作内标的标记的靶物质长度一般为21-54个核苷酸，优选长度为30-45个核苷酸。进行简单的选择以使其与所选的核酸邻接区段(例如翻译的FRAXA基因区段)的正义链互补。标记的STR靶的量优选至少约是内标靶的5倍，更优选至少约10倍，最优选至少约20倍。

试剂盒还含有具有多个小斑点的微阵列，所述小斑点有所选的DNA探针连接其上；探针与标记的靶标之一互补。虽然可任意使用很多用于标记的DNA靶的已建立的阵列，包括靶探针直接连接于平面基质或者位于微滴定板的孔中的二维阵列；但优选提供三维生物芯片，如美国专利6,174,683和公开的名为“三维形式生物芯片”的国际申请WO 02/059372所述。在这种三维阵列中，探针不连接于板中小孔的固体表面或载玻片或其它平板，而是通过连接于聚合的水凝胶的小斑点而以三维阵列的形式呈现。这种结构将探针与固体基材分离，为探针提供了更大的表面积，也为最终捕获标记的靶分子提供了更大的表面积。优选地，在各载玻片或微孔板的各孔中提供多个三维小斑点，针对本发明检测方法中所用的各个不同靶物质。

在锚定部分共价连接于正向引物(然后该正向引物将掺入正义链中)的优选实施方式中，探针是最初所选择的核酸正义链的一部分；它们经过衍生以偶联或连接于微阵列板上，或在优选的结构中连接于粘附在微阵列板上的水凝胶斑点。如本领域普遍知晓的，可用任何合适的接头，优选采用C-6氨基接头。针对STR部分的探针应含有多个CGG三联体密码，优选含有6-20个三联体密码，更优选8-15个三联体密码；优选探针中的三联体密码数目是靶物质中的至少两倍。同理，针对内标靶物质的探针是所选邻接区域的核酸正义链的合适长度的区段。优选该探针和靶物质至少一样长，优选与文所述的内标靶物质的长度大约相同。

如上所述，该试剂盒可包括合适的化学物质以有助于杂交反应。将杂交溶液和载玻片或微孔板的孔孵育之后，洗涤以除去未结合的靶物质。这样得到的载玻片可以任何合适的方式进行观察，当使用荧光染料时可用荧光检测仪进行观察。当然也可使用其它合适的检测仪，这取决于所选的结合于靶物质的特定标记的性质。然后用试剂盒中提供的合适算法或其他工具来解释微阵列比色扫描结果；这种解释是基于先前从对照样品中获得的数据来建立的。

作为检测STRP存在的检测方法的一个例子，先获得少量的未知基因组DNA；例如，认为约10ng是足够的。该未知样品在50微升体积的反应室中进行PCR。加入针对所选核酸区段(包括STR部分和所选的核酸邻接区段)的约1μM正向引物和约1μM反向引物，以及市售PCR系统的各种成分，这些成分包括合适的脱氧核糖核苷底物、合适的酶和缓冲液。一般，进行约5-40个温度循环的PCR复制过程以产生所需量的扩增的所需核酸序列。PCR扩增完成以后，纯化双链产物，用标准技术除去未反应的引物和核苷酸底物等。此类纯化试剂盒是市售的，然后用合适量的去离子(DI)水进行洗脱。

然后用合适的核酸酶如λ外切核酸酶(NEB)消化纯化的DNA的反义链。消化之后，具有最初所选核酸正义链的核苷酸序列的生物素化的单链DNA仍然存在。然后将其与标记的针对STR部分和内标区段的靶物质混合；使用约200nM针对STR区段的标记的靶寡核苷酸和针对内标部分的约10nM的寡核苷酸，以及合适的市售缓冲液系统。将该混合物置于约95℃的变性温度下约10分钟，然后孵育一段合适的时间，例如，在温度约35-40℃孵育约2-5小时，用连续摇动等方式来促进杂交。

孵育之后，通过扩增的DNA链的生物素锚定部分将杂交的样品材料固定在链霉抗生物素珠或其它合适的固体基材上。通过在摇动等方式下在合适的缓冲液中室温下孵育约15分钟来实现固定。提供一段时间以使小珠和生物素化的DNA之间的结合完成之后，洗涤小珠以去除所有其它成分，包括未发生特异性杂交的标记的靶物质。一般，进行多次洗涤，任选地用递增的严谨度。

洗涤之后，用0.1M NaOH或类似的碱处理并室温孵育约5分钟，将标记的靶物质从结合于固体支持物的链(strand)上洗脱下来。洗脱之后，将液体上清与用磁力固定的小珠分离，收集上清并中和。然后将含有标记的靶物质的液体溶液直接进行合适的微阵列检测。

与微阵列的杂交在含有合适缓冲液的溶液中、合适的温度下(例如40-50℃)进行，通常至少杂交约12小时。杂交后，用含有缓冲液的合适溶液多次洗涤微阵列，然后进行比色分析。当采用优选的荧光标记时，对杂交于扩增的核酸的不同靶物质具有特异性的探针所发出的荧光信号强度被记录下来；如下详述，通过将这些数值与在扩增的PCR产物中被共同扩增的内标数量进行比较，从而提供具体STR区段相对长度的定量指示。

本发明检测方法中最初的某些步骤可根据需要以各种顺序进行。例如，可先将生物素化的、扩增的双链DNA与带有链霉抗生物素的磁珠偶联，然后酶解反义链，或者先进行偶联，然后将标记的靶标加入混合物中。然而，实施本发明方法的优选方式如上所述，即先处理双链产物从而可以酶解反义链，然后加入标记的靶标，即带有荧光标记的DNA寡核苷酸，然后将该混合物维持在允许杂交的条件下，从而单链DNA靶标将先与扩增的DNA的互补序列杂交然后再结合于带有链霉抗生物素的磁珠等基材。一旦磁珠已经过洗涤，可用碱例如氢氧化钠溶液在室温对其处理以释放荧光标记的合成靶标。然后，产生的水溶液可直接用于合适的试验中，以测定与扩增的DNA样品杂交但因这种碱处理已被释放的两种靶标；然而，优选先进行中和。

以设计为检测STRP(称为脆性X染色体综合征)的分析为例，描述了本发明的具体方面。为了提供工具以解释得自要分析其脆性X染色体综合征的未知样品的数据，先用上述方法检测两个对照样品，已知它们分别有30个CGG重复和117个CGG重复。所用标记是荧光；因此，对于微阵列上各独立的探针检测的比色强度是荧光强度(FI)。

获得了以下结果：

1.已知有30个重复的对照样品：

CGG探针的FI＝17,598

内标探针的FI＝17,008

(CGG的FI)/(内标的FI)＝1.03

2.已知有117个重复的对照样品：

CGG探针的FI＝11,005

内标探针的FI＝4,708

(CGG的FI)/(内标的FI)＝2.34

获自这些对照样品的结果是成比例的，利用从这些结果衍生的方程，提供了可用于确定任何未知样品中重复数目的工具。更具体地说，已发现获自这两个对照样品的结果可用于创建一种算法，该算法能够使我们利用以后从未知样品获得的FI或其它类似比色值来计算这些未知样品中的重复数目。

开发了下面的算法，它基于具体基因，例如脆性X(FRAXA)基因中STR的检测数据，从这些数据中获得了特定STRP的简单方程：

N = K + \frac{(A - B) \times Q}{(C - B)}

N＝未知样品中计算出的STR数目。

K＝重复数目较少的对照样品中的STR数目。

CI＝比色强度。

A＝未知样品STR探针的CI除以内标探针的CI得到的比率。

B＝具有K个重复的对照样品的CI比率。

Q＝重复数目较大的对照样品和重复数目较小的对照样品的重复数目之差。

C＝重复数目较大的对照样品STR探针的CI除以内标探针的CI得到的比率。

然后用这种算法衍生一个特定的方程用于分析怀疑患有脆性X染色体综合征的个体。由于有30个和117个重复的两个对照样品的K、B、C和Q的检测值现在是已知的，该算法可简化为针对脆性X染色体的下列方程：

N＝30+(A-1.03)66.4。

为了检测该分析方法的有效性，对一个未知样品进行分析。对该未知样品的具体检测细节示于下面的实施例中；但是，应认为它们是对本发明的阐释而非限制，本发明的范围是由权利要求限定的。

实施例

在含有10ng基因组DNA、针对FRAXA序列所在位置的X染色体所选核酸区段的引物各1uM的50ul总体积中进行PCR。所选区段包括完整的CGG重复部分和与其邻接的3’内标区段。使用Roche的GC-Rich PCR系统。使用的FRAXA正向和反向引物是具有SEQ ID NO：1和2(见表)所示核苷酸碱基序列的寡核苷酸。正向引物的长度是21个核苷酸，反向引物的长度是27个核苷酸。它们跨越在“正常”X染色体上长度至少为254个核苷酸的总基因区段。正向PCR引物是5’生物素化的，反向引物是5’磷酸化的。所用的PCR温度循环条件是：95℃，2分钟，然后是25个循环：95℃，1.5分钟，56℃，1分钟，和72℃，2分钟。最后的延伸在72℃进行7分钟。

用QlAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化扩增的DNA，然后用50ul的去离子(DI)水洗脱。然后用λ外切核酸酶(N EB)消化纯化的DNA反义链。

剩余的生物素化的单链DNA与两种不同的5′-Cy3-标记的靶寡核苷酸杂交：包括(CCG)n的Biocept #3584(SEQ ID NO：3)和与所选3′FRAXA内标互补的Biocept#3595(SEQ ID NO：4)。杂交在Ix B&W缓冲液(5mM Tris-HCl，pH8，0.5mM EDTA，1M NaCl)中进行。样品在95℃变性10分钟，然后在摇床上37℃孵育3小时。

然后通过在摇床上Ix B&W缓冲液中室温孵育15分钟将生物素化的正义链与链霉抗生物素珠(Active Motif)偶联，从而将杂交的靶物质固定。用Ix B&W洗涤DNA/小珠复合物三次，然后加入0.1M NaOH并室温孵育5分钟，将标记的靶寡核苷酸与结合的单链DNA分离。收集并中和含有释放的、标记的靶寡核苷酸的上清液。

然后将标记的靶寡核苷酸与含有两种探针：Biocept#3594(SEQ ID NO：5)和Biocept #3686(SEQ ID NO：6)的HydroArray微阵列杂交。这些探针分别与针对FRAXA内标和CGG重复(见表)的标记的靶标互补。微阵列上的杂交在含有3x SSC和0.1％Triton X-100的缓冲液中45℃进行约14小时。然后在分别含有2x SSC和0.1％Triton X-100的溶液中37℃洗涤三次，每次15分钟。此处所用比色标记是荧光标记，因此用激光扫描仪(ScanArray Lite，Perkin Elmer)获取荧光照片。

表

Biocept	基因	登录号	起始位点	序列	5’修饰
Biocept	基因	登录号	起始位点	序列	5’修饰	3470	FRAXA	L29074	13705	gtcaggcgct cagctccgtt t(SEQ ID NO：1)	生物素
3556	FRAXA	L29074	13967	ctcctccatc ttctcttcag ccctgct(SEQ ID NO：2)	磷酸化	3470	FRAXA	L29074	13705	gtcaggcgct cagctccgtt t(SEQ ID NO：1)	生物素
3556	FRAXA	L29074	13967	ctcctccatc ttctcttcag ccctgct(SEQ ID NO：2)	磷酸化	3686	FRAXA	L29074	13833	cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg(SEQ ID NO：6)	C-6氨基接头
3584	FRAXA	L29074	13893	cgccgccgcc gccgc(SEQ ID NO：3)	CY-3	3686	FRAXA	L29074	13833	cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg(SEQ ID NO：6)	C-6氨基接头
3584	FRAXA	L29074	13893	cgccgccgcc gccgc(SEQ ID NO：3)	CY-3	3594	FRAXA	L29074	13932	gctcccggcg ctagcagggc tgaagagaagatg(SEQ ID NO：5)	C-6氨基接头
3595	FRAXA	L29074	13964	catcttctct tcagccctgc tagcgccggg agc(SEQ ID NO：4)	CY-3	3594	FRAXA	L29074	13932	gctcccggcg ctagcagggc tgaagagaagatg(SEQ ID NO：5)	C-6氨基接头

用作共扩增内标的FRAXA探针(#3594)的比色强度(此处为荧光强度(FI))也提供了PCR效率的一个指示。比较探针#3586和#3594的荧光强度以获得所需的比率。两个FI的比率，即STR探针的FI除以内标探针的FI的比率是1.78。将1.78替代入前述衍生的方程中，从而提供了下列STR数目的计算：

重复数目＝30+(1.78-1.03)66.4＝80

因此，未知样品中CGG重复的检测结果为计算值80。

为了验证该检测的有效性，用PCR和序列分析进行非常繁复但是直接的CGG数目确定；结果约为80-85。因此本发明的检测方法是完全准确的。

虽然已描述了本发明的一些优选实施方式，这些优选实施方式构成了现在本发明人所知的实施本发明的最好方式，但是应理解可进行各种变化和改进而不偏离由权利要求所限定的本发明的范围。

序列表

<110>S.韩

<120>检测STRP例如脆性X染色体综合征

<130>81671

<140>10/791,209

<141>2004-03-01

<160>6

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>合成的引物

<400>1

gtcaggcgct cagctccgtt t 21

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>misc_feature

<223>合成的引物

<400>2

ctcctccatc ttctcttcag ccctgct 27

<210>3

<211>15

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>misc_feature

<223>合成的靶序列

<400>3

cgccgccgcc gccgc 15

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>misc_feature

<223>合成的靶序列

<400>4

catcttctct tcagccctgc tagcgccggg agc 33

<210>5

<211>33

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>misc_feature

<223>合成的探针

<400>5

gctcccggcg ctagcagggc tgaagagaag atg 33

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>misc_feature

<223>合成的探针

<400>6

cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 30

Claims

1.一种检测脆性X染色体综合征突变指征的方法，该方法包括以下步骤：

(a)获得要检测的基因组DNA，

(b)用PCR沿基因组DNA中X染色体扩增核酸，该核酸包括FRAXA基因非翻译部分的所有CGG重复和与所述CGG重复毗邻的核酸的基本邻接区段，

(c)从步骤(b)扩增的核酸获得单链产物，

(d)将靶向(i)(CGG)重复和(ii)所述邻接核酸区段的比色标记的寡核苷酸与步骤(c)中所述的单链产物杂交，

(e)将步骤(c)中所述的单链产物结合于固相，

(f)将步骤(d)所述杂交产物与剩余的靶物质分离，

(g)从步骤(f)分离的产物中回收标记的靶物质，

(h)然后将步骤(g)中回收的标记的靶物质与微阵列杂交，该微阵列具有多个含有合适的与所述靶物质互补的寡核苷酸探针的斑点，

(i)与微阵列杂交后，检测微阵列上具体斑点中杂交的标记靶物质的比色强度，以获得各自的数值，和

(j)将步骤(i)中的结果与已知对照样品的结果比较，以准确定量获得的基因组DNA中FRAXA基因的CGG重复数目。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CGG重复是用以下公式确定的：

N＝30+(A-1.03)66.4，其中N是重复数目，A是与CGG探针杂交的靶物质的Cl和与邻接核酸区段探针杂交的靶物质的Cl之比。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述扩增的核酸包括X染色体上的CGG重复部分和FRAXA基因3’翻译区的至少一大部分。

4.如权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述CGG重复的杂交靶物质含有3-7个三联体密码，CGG重复探针含有6-20个三联体密码并且是所述重复靶物质所含三联体密码数目的至少2倍。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述标记的靶物质在其5’端带有荧光染料。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(b)使用成对的正向和反向引物，所述引物与含有整个CGG重复部分和含有至少30个核苷酸的所述核酸邻接区段的DNA区域3’边界互补。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述邻接区段是CGG重复的部分的3’端，并且含有FRAXA基因翻译区段的至少一大部分。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(b)中所用的与DNA区域反义链的3’边界互补的正向引物在其5’末端有锚定部分。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述反向引物在其5’末端被磷酸化，通过用外切酶消化双链PCR产物的反义链获得步骤(c)中所述的单链产物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述锚定部分是生物素，其中步骤(e)和(f)在步骤(d)之后进行，通过将杂交产物结合于粘附在固相上的卵白素然后洗涤来分离杂交产物。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(g)中通过处理步骤(d)的所述杂交产物以使所述双链变性然后收集上清液从而回收步骤(d)中杂交的标记靶物质。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(b)之后，纯化扩增的核酸产物以除去未结合的引物，然后用外切酶处理，以获得单链靶物质。

13.如权利要求6-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述正向引物包括SEQ ID NO：1，所述反向引物包括SEQ ID NO：2。

14.一种检测脆性X染色体综合征突变指征的方法，该方法包括以下步骤：

(a)获得要检测的基因组DNA，

(b)用PCR以及正向和反向引物沿基因组DNA的X染色体扩增核酸，该核酸包括所有CGG重复和翻译的FRAXA基因的邻接部分，所述正向引物在其5′末端具有锚定部分，

(c)纯化步骤(b)中的双链产物，

(d)用外切酶消化步骤(c)中产物的反义链获得其单链产物，

(e)将步骤(d)的产物与靶向(CGG)重复和靶向FRAXA基因邻接部分的荧光标记的反义靶物质杂交，

(f)通过所述正向引物5’端的锚定部分结合于固相，从而将步骤(d)中所述杂交产物与剩余未杂交的靶物质分离，

(g)将步骤(g)的产物与含有合适探针的微阵列杂交，杂交于所述微阵列后，检测存在的荧光标记靶物质的荧光强度，以获得各数值，以及

(h)用下式：N＝30+(A-1.03)66.4，其中N是重复数目，A是与CGG探针杂交的靶物质的FI和与邻接区段的探针杂交的靶物质的FI之比，将步骤(g)的结果与获自已知对照样品的结果比较，以准确定量获得的DNA中FRAXA基因的CGG重复数目。

15.一种检测短串联重复多态性(STRP)的方法，该方法包括以下步骤：

(a)获得要检测的基因组DNA，

(b)用PCR沿基因组DNA中的染色体扩增核酸，该核酸包括所有感兴趣的STR和与所述STR毗邻的基本邻接核酸区段，

(c)从步骤(b)扩增的DNA获得单链产物，

(d)将靶向(i)STR和(ii)所述邻接核酸区段的比色标记的寡核苷酸与步骤(c)中所述的单链产物杂交，

(e)将步骤(c)中所述的单链产物结合于固相，

(f)将步骤(d)所述杂交产物与剩余的标记靶物质分离，

(g)从步骤(f)分离的产物中回收标记的靶物质，

(h)然后将步骤(g)中回收的标记的靶物质与微阵列杂交，所述微阵列具有多个含有合适的与所述靶物质互补的寡核苷酸探针的斑点，

(j)将步骤(i)中的结果与已知对照样品的结果比较，以准确定量获得的DNA感兴趣区域中STR的数目。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述STR的杂交靶物质含有3-7个重复，STR探针含有6-20个重复并且是STR靶物质所含重复数目的至少2倍。

17.如权利要求15或16所述的方法，其特征在于，步骤(b)使用成对的正向和反向引物，所述引物与含有整个STR部分和含有至少30个核苷酸的所述核酸邻接区段的DNA区域的3’边界互补，步骤(b)中所用正向引物与DNA区域反义链的3’边界互补且在其5’末端有锚定部分，所述反向引物在其5’末端被磷酸化，其中所述标记的靶物质在其5’端有荧光染料，通过用外切酶消化双链PCR产物的反义链获得步骤(c)中所述的单链产物。

18.一种检测脆性X染色体综合征突变指征的试剂盒，该试剂盒包括：

(a)一对DNA寡核苷酸，在扩增哺乳动物基因组DNA的聚合酶链式反应(PCR)中用作正向引物和反向引物，其中正向引物与位于FRAXA基因5’端非翻译区的X染色体位置的反义链的3′核苷酸序列互补，反向引物与FRAXA基因内的位置或其3’端互补，

所述正向引物具有与其5′端共价连接的锚定部分，

所述反向引物的5′端具有磷酸基团，

所述寡核苷酸引物对特异性地扩增含有所有CGG重复和用作内标的基本邻接区段的基因组DNA区域，

(b)标记的寡核苷酸，独立地靶向所述CGG重复和所述内标区段，

(c)缓冲液和酶，用于进行(i)PCR，(ii)反义链的酶解，(iii)DNA-DNA杂交和洗涤，(iv)与杂交的标记的寡核苷酸靶分离，和(v)比色定量，

(d)至少一个具有多个斑点的微阵列，各斑点附有与所述标记的寡核苷酸靶之一互补的DNA探针；和

(e)用所述微阵列的比色扫描结果和先前对照样品的数据来检测CGG重复数目的工具。

19.如权利要求18所述的试剂盒，其特征在于，所述杂交靶物质含有3-7个CCG重复，所述CGG探针含有6-20个重复并且其数目是所述互补靶物质重复数目的至少两倍，其中正向和反向引物与DNA区域的3′边界互补，该DNA区域含有整个CGG重复部分和在其3′并含有至少30个核苷酸的所述核酸邻接区段，正向引物与反义链的3’边界互补且在其5’末端有生物素，所述反向引物在其5’末端被磷酸化，其中所述标记的靶寡核苷酸在其5’端有荧光染料，STR区域的靶物质数目至少是内标区域靶物质的约10倍，提供外切酶消化双链PCR产物的反义链以获得单链PCR产物。

20.一种检测STRP突变指征的试剂盒，该试剂盒包括：

(a)一对DNA寡核苷酸，在扩增哺乳动物基因组DNA的聚合酶链式反应(PCR)中用作正向引物和反向引物，所述寡核苷酸引物对特异性地扩增所选的基因组DNA区域，该所选的基因组DNA区域含有所有STR和用作内标的基本邻接区段；其中正向引物与所选染色体区域反义链的3’核苷酸序列互补，反向引物与所选区域正义链的3’末端互补，

所述正向引物具有与其5′端共价连接的锚定部分，所述反向引物的5′端封闭不能延长，

(b)标记的寡核苷酸，独立地靶向所述STR区域和所述内标区段，

(e)用所述微阵列的比色扫描结果和先前对照样品的数据来诊断STR数目的工具。

21.如权利要求20所述的试剂盒，其包括具有偶联剂的固相物质，所述偶联剂与所述锚定部分互补。