CN104053790A

CN104053790A - 通过差异杂交进行的str基因分型

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Publication number: CN104053790A
Application number: CN201380005829.4A
Authority: CN
Inventors: J·马莫; M·N·费格林; H·盖普
Original assignee: Tecan Trading AG
Current assignee: Tecan Trading AG
Priority date: 2012-01-18
Filing date: 2013-01-18
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2033-01-18
Also published as: EP2773780A1; CN104053790B; EP2773780B1; US9783842B2; US20130183666A1; US20150010908A1; WO2013107857A1

Abstract

在一种推导基因组样品中所选短串联重复序列(STR)中的重复单元数目的方法中，提供了由包含所选STR的基因组样品所生成的至少一条单链目标DNA、一个STR探针(P1,P1’)、一个参考探针(P2)和两个封闭物(B1,B2)，并进行了至少三个差异杂交实验，基于此确定了每个差异杂交实验中每条目标DNA链上结合的STR探针寡核苷酸(P1,P1’)的数目。所述方法还包括比较差异杂交实验中每条目标DNA链上结合的STR探针寡核苷酸(P1,P1’)的数目，用于推导单链目标DNA链上所选STR上的重复单元数目。还公开了用于通过差异杂交实施STR基因分型的试剂盒。

Description

通过差异杂交进行的STR基因分型

相关现有技术

单个人类基因组短串联重复序列(STR)的分析常规用于例如人身份测试以及对其他生物(像植物和细胞)的测试。这类短串联重复序列是简单的序列基序，由最多数十个重复单元构成。人类基因组包含数以千计的这类STR，通常位于非编码区。由于STR是相对于其重复单元数量的多形体，可以根据每个等位基因和每个STR位点所含独特的重复单元个数区分人个体。因此，STR分析在人个体身份的鉴定(如法医学或亲子鉴定)中是特别有用的。

通常，STR分析首先涉及分离人个体的基因组DNA，随后进行聚合酶链式反应(PCR)扩增步骤。此时，特异的、经选择的STR位点得到扩增，多重扩增(同时扩增多个STR位点)已在生物学实验室中常规使用。这使得单个测试中能够平行评估数个STR以实现高甄别率，同时只需使用少量DNA。这进而与法医学有特定的关联性，法医鉴定中通常只能获得少量DNA(大部分DNA可能被降解)。

根据分析目的的不同(如身份鉴定、亲子鉴定、人口分析)，可使用不同的STR。尤其是需要在不同实验室之间比较DNA序型时，STR分析的标准化是一个重要方面。例如，欧洲法医实验室使用了至少七种成熟的用于STR分析的国际刑警STR位点(参见Gill等，“The evolution of DNA databases–Recommendations for new European STR loci”(DNA数据库的进化——关于新的欧洲STR位点的建议)，Forensic Science International，156(2006)，242-244)。分析后STR位点的标准化使得不同实验室之间直接比较DNA序型成为可能。

对所选基因片段进行扩增步骤后，可确定每个扩增后STR的长度。广泛使用例如毛细管电泳确定片段长度。此时，通过电泳分离并通过与标准化等位基因梯相比较的手段检测扩增后DNA产物。使用毛细管电泳进行的DNA长度确定的优势包括高度精确的测量大小(如小于1个核苷酸)，通过使一些扩增子比其他大但对所有扩增子标记相同荧光标签的手段按大小进行多元化(增加通量)。毛细管电泳所提供的优势是更容易解读混合物，因为分析员可同时得到强度和大小数据。然而，毛细管电泳需要使用大型仪器(例如ABI 3730遗传分析仪，应用生物系统公司(Applied Biosystems))。这增加了该应用所承担的费用及其复杂程度。此外，相对长的样品运行时间延缓了样品通量，因而可能导致各实验室形成积压。毛细管电泳的其他优点包括可以利用基因组实验室中常规使用的、有大量安装基础的仪器，且相比于前一代的平板凝胶电泳，STR分析更容易自动化。由于毛细管电泳并不直接检测核苷酸序列，如果STR长度相同，则无法检测到因为序列替换导致的STR微异质性；从而可能丢失重要数据。而且毛细管电泳的装置精密、昂贵且对灰尘和移动敏感。检测窗(低端的噪音和高端的最高限度之间的信号)相对狭窄，为找到“最有效点”需使用耗材昂贵、费时且繁琐的定量PCR进行DNA定量并标准化。

其他方法包括使用杂交技术以确定STR片段长度。例如，在文献WO96/36731中，通过将目标DNA与一组独特的含已知长度串联重复序列的互补探针进行杂交以确定重复数目。如果使用所含重复序列多于目标DNA的探针进行杂交，会形成颈环结构，而使用相同重复数目的探针进行杂交时，不会形成颈环结构。随后使用各种探针的不同荧光标记确定长度，无需进行毛细电泳分离。这是一个多步骤过程，包括使用对S-S键特异的核酸酶进行消化和使用DNA聚合酶进行标记。该方法需要合成固相载体支撑的寡核苷酸阵列，因此无法在溶液中完成。

文献US 6,395,493 B1中公开了一种确定DNA长度多态性的方法，也涉及杂交反应。该文献描述了一种涉及使用硅微芯片的测定，所述硅微芯片由一组成阵列的电极组成，每个电极含有一条独特的“捕捉探针”，用于捕捉感兴趣的各个可能的STR位点上的各个可能的等位基因。例如，为确定TPOX位点(如6-13个重复)上存在可能的八个等位基因中的哪几个，需要八个不同的探针位点。扩增感兴趣的DNA样品，随后使其通过芯片。它会与带互补捕捉探针的电极进行杂交。“捕捉探针”通过结合重复区域和30-40碱基的旁侧区域进而捕捉经PCR扩增的STR等位基因。杂交后，通过简单的调节电场强度对每个电极施加“电子严格化”，未与探针完美匹配的样品会变性并与探针解离。

除去未结合和变性的DNA后，一种“报告探针”混合物会通过芯片。所述“报告探针”包含1-3个重复单元，一些旁侧序列和一个荧光染料标记。该探针会与芯片上捕获的DNA中的STR等位基因杂交并在探针位点生成荧光信号，可通过对该信号的解读了解样品的基因型。即使没有进行基于分子大小的分离操作，这种读取也能够提供了一种与样品中存在的重复数目相匹配的基因型。

在文献US 6,395,493 B1所述的方法中，必须将捕捉探针阵列“印刷”(即固定)在反应容器的表面，DNA随后通过该阵列。由于该方法需要预先印刷或购买特殊的预印刷阵列，读取信号的强度受限于印刷在各电极上的捕捉寡核苷酸的数目。DNA样品的进一步扩增无法增加超过捕捉电极数量的信号。此外，所述方法需要特殊装置在清洗前使未匹配的杂交链变性。而本发明中的方法无需这类特殊装置(参见下文中本发明的优势)。

从文献US 2011/0003290 A1中已知一种使用熔解温度检测(例如目标多核苷酸中的STR位点上的)串联重复数目的方法。该方法中使用了荧光标记的探针寡核苷酸，包含一条至少5个与串联重复序列中的至少一个互补的核苷酸的序列。可选择探针寡核苷酸的长度使得当所选STR位点上存在不同数目的串联重复序列时，探针寡核苷酸所生成的杂交链的熔解温度不同。随后可通过熔解曲线分析确定串联重复序列的数目，其中通过在受控的温度变化下动态测量荧光以确定熔解温度。

发明目的和概述

本发明的一个目的是提供一种推导核酸样品中串联重复数目的方法。

根据第一方面，根据本发明推导出了基因组样品中所选短串联重复序列(STR)上的重复单元数目，实现了所述发明目的。这里所公开的方法包括以下步骤：

a)提供至少：

a1)从包含所选STR的基因组样品中生成的单链目标DNA；

a2)带第一荧光标签的STR探针(P1,P1’)，至少一个STR探针(P1,P1’)为寡核苷酸，包含与单链目标DNA上所选STR的确定数目的重复单元互补的序列；

a3)带第二荧光标签(与第一荧光标签不同)的参考探针(P2)，所述参考探针(P2)为寡核苷酸，包含与单链目标DNA上所选STR的5’或3’旁侧序列互补的序列；

a4)两个寡核苷酸封闭物(B1、B2)，其中第一封闭物(B1)包含与STR的5’旁侧区域序列以及与该5’旁侧区域序列相邻的STR重复单元中的至少一个互补的序列，并且其中第二封闭物(B2)包含与STR的3’旁侧区域序列以及与该3’旁侧区域序列相邻的STR重复单元中的至少一个互补的序列；

b)进行至少以下三个差异杂交实验，每个实验中将一定量的单链目标DNA与以下物质混合：

b1)所述至少一个STR探针(P1,P1’)和所述参考探针(P2)，并允许在第一个差异杂交实验中与单链目标DNA杂交；

b2)所述至少一个STR探针(P1,P1’)、所述参考探针(P2)和所述至少两个封闭物(B1,B2)之一，并允许在第二个差异杂交实验中与单链目标DNA杂交；以及

b3)所述至少一个STR探针(P1,P1’)、所述参考探针(P2)和所述两个封闭物(B1,B2)，并允许在第三个差异杂交实验中与单链目标DNA杂交；

c)测量每个差异杂交实验中连接到所选STR的重复单元上的所述至少一个STR探针(P1,P1’)所提供的荧光强度；

d)测量每个差异杂交实验中连接到单链目标DNA的旁侧序列之一上的所述参考探针(P2)所提供的荧光强度；

e)将每个差异杂交实验中步骤c)中测量的所述至少一个STR探针(P1,P1’)的荧光强度与步骤d)中测量的所述参考探针(P2)的荧光强度相关联，从而确定各差异杂交实验中每个目标DNA链上结合的STR探针寡核苷酸(P1,P1’)的数目，以及

f)比较差异杂交实验中每个目标DNA链上结合的STR探针寡核苷酸(P1,P1’)的数目，用于推导单链目标DNA链上所选STR中重复单元的数目。

根据第二个方面，通过提出使用本文所公开的差异杂交进行STR基因分型的试剂盒，实现了所述发明目的。

本文还公开了本发明的其他特征和优选实施方式。

本发明所述方法的优势包括：

·可使用标准荧光酶标仪代替大型毛细管电泳装置完成重复数目的评估。常规的法医或诊断实验室通常已有这类荧光酶标仪，而甚至更重要的是：这种标准荧光酶标仪的价格仅是毛细管电泳装置的约10％(后者约为200,000美元)。

·能够减少分析时间，比毛细管电泳更快地拿到第一手结果。

·本发明所述方法比常规的分析方法简单，因为该方法不使用酶促反应。

·所述方法是序列特异的(与大小相对)，所以可通过加入额外的探针检测微变体。

·本方法对输入的DNA较不敏感，因为相比于例如毛细管电泳装置所用的检测器和数据分析算法，简单荧光测量(如使用标准荧光酶标仪)的信号动态范围更宽。毛细管电泳分析前需要进行额外的DNA定量步骤以确保信号峰具有高于背景噪音的足够强度，同时也不能过强而超过线性检测范围；应用本发明所述方法进行直接荧光读取时，该“信号窗”通常宽得多。

·本方法更快(不包括样品制备所需时间，如纯化和扩增)，因为其基于反应容器中的直接荧光测量，这是一种即时分析而无需涉及冗长的动力学测量或毛细管电泳。因此，举例来说，一名用户可以在单个384孔酶标板上测量7个不同样品或在1536孔板上测量29个样品上的13个CODIS位点。可在常规酶标仪上在不到一两分钟内完成对这类平板的测量。高通量毛细管电泳装置每次运行能够处理至多16个样品，每次运行时间为1-2小时。

·相比于已知的涉及使用S—S键特异的核酸酶消化和使用DNA聚合酶标记的多步骤方法，本发明所述方法更为简单，仅需进行一些平行杂交实验。

·已知的多步骤方法需要合成固相载体支撑的寡核苷酸阵列或在反应容器表面“印刷”这种捕捉探针阵列，随后使DNA通过该阵列。与之相反，本发明可将DNA结合到任何表面，随后使探针通过DNA；杂交在溶液中完成，无需预印刷或购买专门的预印刷阵列。

·已知的多步骤方法需要能够进行精确温控的特殊装置，用于在清洗前使未匹配的杂交链变性。本发明所述方法无需这种专门的装置。实际上，可将本方法设计为使用淬火探针化学反应(如从分子信标或荧光共振能量转移(FRET)处获得)的同质测定。

附图说明

借助于附图，说明了本发明的方法和试剂盒的优选实施方式，同时不缩小本发明的范围。附图包括：

图1 一种包含多种寡核苷酸用于通过差异杂交进行人CSF1PO STR基因型分析的典型试剂盒的示意性概略图；

图2-11 一些本发明的方法和试剂盒理论上可能获得的杂交结果的示意图，其中包括：

图2 一组A CSF1PO目标DNA，带有2个四核苷酸重复，无封闭寡核苷酸和旁侧寡核苷酸，且不存在与STR探针的杂交；

图3 一组B CSF1PO目标DNA，带有4个四核苷酸重复，1个封闭寡核苷酸，且不存在与STR探针的杂交；

图4 一组C CSF1PO目标DNA，带有7个四核苷酸重复，1个封闭寡核苷酸，并与1个STR探针杂交；

图5 一组G CSF1PO目标DNA，带有12个四核苷酸重复，1个封闭寡核苷酸，并与2个STR探针杂交；

图6 一组J CSF1PO目标DNA，带有16个四核苷酸重复，1个封闭寡核苷酸，并与3个STR探针杂交；

图7 一组J CSF1PO目标DNA，带有16个四核苷酸重复，2个旁侧寡核苷酸，并与4个STR探针杂交；

图8 一组J CSF1PO目标DNA，带有16个四核苷酸重复，2个封闭寡核苷酸，并与2个STR探针杂交；

图9 一组J CSF1PO目标DNA，带有16个四核苷酸重复，1个旁侧寡核苷酸和1个封闭寡核苷酸，并与3个STR探针杂交；以及

图10 一组J CSF1PO目标DNA，带有16个四核苷酸重复，1个封闭寡核苷酸和1个旁侧寡核苷酸，并与3个STR探针杂交；

图11 含有位于带16个四核苷酸重复的一组J CSF1PO目标DNA中的STR片段上的非STR岛序列的目标DNA；带有1个封闭寡核苷酸和1个旁侧寡核苷酸，与3个STR探针杂交；并与插入探针预测杂交，插入探针上含有与该岛序列互补的核苷酸序列；

图12 该图显示了使用FAM标记的16-聚体探针(5’-AGAT)₄与一系列化学合成的含2-16个ATCT重复的单链DNA杂交所获得的实验结果与理论预期的结合，其中包括：

图12A 目标DNA的组A和B；

图12B 目标DNA的组C、D、E和F；以及

图12C 目标DNA的组G、H、I和J；

图13 显示STR测定中等位基因对所获得结果的表格。

具体实施方式

本发明涉及所选STR位点上重复序列数目的检测。根据本发明，重复单元的数目与平行杂交实验的信号强度相关。鉴于此，与重复序列结合的带标记的重复特异性探针数目与存在的重复单元数目正相关。通过比较结合的重复探针信号与重复区域外参考探针按化学计量结合所产生的信号，能够确定每个分子上所结合的重复探针数目并降低所述方法对于所用DNA量的敏感程度。通过在数个平行实验中进行杂交测量(其中平行实验中已知数量的可用重复被封闭而无法进行杂交)，就可以推导出存在的重复序列数目。或者，可以将所述数个实验的信号反应与已知重复数目的模型系统中通过经验得到的结果相比较，以获得高可信度的结果。

STR位点的选择：

本发明所述方法对于鉴定人个体特别有用。但是，STR分析不限于人基因组DNA，也可用于例如动物、植物或微生物的分析。举例来说，本文应提及STR分析用于食品认证或哺乳动物和真核细胞系的质量控制。

对于身份鉴定而言，建议采用各执法机构广泛接受的STR位点。主要的两组位点是13个FBI(美国联邦调查局)CODIS位点和10个FSS(联合王国法医科学服务中心)SGM和SGM plus位点。John M.Butler在《STR标记的法医DNA分型、生物学、技术和遗传》(“Forensic DNA Typing，Biology，Technology，and Genetics of STR Markers”)一书中描述了非人类DNA测试和微生物法医学(埃尔斯威尔学术出版社(Elsevier Academic Press)，第二版，2005；参见第11章，299－330页)。那本书中描述了猫和狗的STR(和引用来源)以及植物STR(如印度大麻(Cannabis Sativa))，书中指出，“正如人类的STR那样，大麻的STR标记具有高度多态性，基因组的独特位点的特异性，且能够解码混合物。一个六核苷酸重复标记在108个经测试的大麻样品中存在范围在3-40个之间的重复单元，且扩增该位点的引物在其他20种经测试的植物中并未生成交叉反应的扩增子(Hsieh等，2003)”。对于微生物法医学，迈出的第一步与生物恐怖主义有关，包括炭疽杆菌(Bacillus anthracis)(炭疽)的基因组测序和HIV病毒毒株的系统发生分析。

在STR系统的多种类型中，四核苷酸重复(核心重复中含有4个重复单元)较二或三核苷酸(2个或3个重复单元)更普遍地应用于基因分型。五和六核苷酸(5个或6个重复单元)重复在人类基因组中较不常见，但也有一些实验室对此进行检测(参见Butler 2005，89页，第3段)。本发明所述方法并不受重复单元中核苷酸的特定数目的限制。

PCR：

使用STR系统时PCR扩增步骤是必需的，因为基因组DNA过于复杂，难以进行杂交测定。可以使用多重PCR，同时处理确定数目的STR位点或STR位点组合。实际上没有STR的最大或最小数目，优选根据经验判断可能的任意数目。学术和商业实验室已鉴定到了许多STR标记，用于疾病和基因位置研究。例如，位于威斯康星州马什菲尔德(Marshfield)的马什菲尔德医学研究基金会(Marshfield Medical Research Foundation，http://research.marshfieldclinic.org/genetics)已经收集了含有分散在23对人类染色体上的超过8000个STR的基因分型数据(参见Butler 2005，86页)。存在许多商业试剂盒，能够完成适当的多重扩增，例如来自应用生物系统公司(Applied Biosystems)、普洛麦格(Promega)和凯杰公司(Qiagen)的试剂盒。但也可使用其他适用于扩增基因组DNA样品中特定序列的方法(如链置换扩增法)从基因组样品中扩增一个或多个所选STR位点。

所用寡核苷酸：

需使用不同寡核苷酸的组合根据本发明对基因组样品中一个或多个所选STR进行分析，所述寡核苷酸为单个STR位点特别设计并用于至少三个不同的杂交实验。根据本发明，这类寡核苷酸是：

-对STR重复序列特异的一个或多个STR探针P1、P1’，

-用于标准化的参考探针P2，

-两个或更多个封闭物B1、B2以及，

-两个或更多个旁侧物F1、F2。

在各杂交实验中，参考探针P2与至少一个STR探针P1,P1’共同使用以进行标准化，用于确定每个目标分子上所结合的STR探针寡核苷酸P1,P1’的数目。此外，可在不同杂交实验中结合STR和参考探针，例如带有封闭物B1,B2中的一个或多个和/或旁侧物F1,F2中的一个或多个。当根据本发明在一个杂交实验中以混合物的形式使用不同寡核苷酸时，根据其熔解温度(T_m)确定优选寡核苷酸，使得杂交温度(即进行杂交实验的温度)下所有所用寡核苷酸的结合均可能发生。相应地，实验的杂交温度应低于所用寡核苷酸的T_m(详细描述请参见下文)。

通过差异杂交进行人类CSF1PO STR基因分型的策略：

CSF1PO是一种短串联重复序列(STR)，已知由位于人类第5号染色体上独特位置上的5-16个连续的5’–ATCT–3’四聚体重复组成。为区分重复数目、推导乃至确定重复单元数目，使用了一种本发明所述全新的杂交方法。所述方法中，为进行演示，将一条FAM标记的16-聚体探针(5’-AGAT-3’)₄与一系列含2-16个5’-ATCT-3’重复的化学合成单链DNA杂交。所述这些5’-ATCT-3’重复中的每条序列均被嵌入一条5’末端生物素化的更长的不相关序列中(参见图1)。在图1中，为进行说明，每个案例中均将单链目标DNA上STR的四核苷酸重复序列表示为一个盒子，而将单链目标DNA上的16个这类四核苷酸5’–ATCT–3’重复序列表示为编号1-16的盒子。将单链目标DNA的5’端标记为B*，表示生物素化。正如生物化学中核酸操纵领域所共知的，这种生物素化能够使目标DNA分子与包被有亲和素的磁珠结合。从5’端至STR起始的DNA片段被称作5’旁侧区域，从STR的3’端到DNA3’端的DNA片段被称作3’旁侧区域。

图1显示了一种包含多种寡核苷酸用于通过差异杂交完成人CSF1PO STR基因型分析的试剂盒的概略图。该试剂盒至少包括一个用于与目标STR杂交的STR探针P1以及用于鉴定相关单链目标DNA并用于标准化STR探针信号的参考探针P2。该方法中，STR探针P1优选含有四核苷酸5’–AGAT–3’的四个重复，并在3’端用第一荧光标签标记(本例中为FAM)。FAM(应用生物系统公司(Applied Biosystems Inc.))是一种荧光素衍生物，也是一种呫吨荧光染料。参考探针P2的构造优选为25-聚体，与图1所示目标DNA的区域(如3’旁侧区域)互补。或者，可将参考探针P2构造成与所选STR的5’旁侧区域互补。还优选用第二荧光标签标记参考探针P2。所述第二荧光标签与STR探针上的第一荧光标签不同，在本例中为花青染料(如Cy5)。

通常，可在STR探针P1和参考探针P2上使用任何能够区分两种探针的可区分标签。所述标签可以是如前文所述的荧光染料；但也可使用如US 5,654,419中所公开的供体-受体荧光对(如FAM-3-TAM或FAM-3-ROX或FAM-4-ROX)(罗丹明衍生物TAM和ROX是应用生物系统公司(Applied Biosystems Inc.)的染料)。即使可能存在一些荧光标签的替代品，仍优选使用荧光，这是因为其能够提供多种颜色，快速且灵敏。尽管如此，仍可以使用任何种类的能够连接到寡核苷酸(如引物)上且能够进行多重化的可测量标签，即放射性、发光、发色、带标记的珠子等。

优选地，所述试剂盒还包括至少两个封闭物(封闭寡核苷酸)B1,B2，用于与目标STR的一个片段和相关单链目标DNA的一个片段杂交。优选地，如图1所示，封闭物(封闭寡核苷酸)B1连接STR的5’端与DNA的5’旁侧区域，并且封闭物(封闭寡核苷酸)B2连接STR的3’端与DNA的3’旁侧区域。该方法特别优选使用25-聚体且与图1所示目标DNA的区域互补的封闭寡核苷酸B1,B2。

优选地，所述试剂盒还包括至少一个旁侧物(旁侧寡核苷酸)F1,F2，用于与目标STR相邻的相关单链目标DNA的一个片段杂交。优选地，如图1所示，旁侧物(旁侧寡核苷酸)F1与STR的5’端的5’旁侧区域向单链目标DNA的5’端的方向杂交；旁侧物(旁侧寡核苷酸)F2与STR的3’端的3’旁侧区域杂交向单链目标DNA的3’端的方向杂交；该方法特别优选使用25-聚体且与图1所示目标DNA的区域互补的旁侧寡核苷酸F1,F2。

重要的是，旁侧物F1,F2在CSF1PO重复序列的邻近区域迅速完成杂交，同时各封闭寡核苷酸B1,B2与CSF1PO序列的12个核苷酸(3个重复)和5’或3’旁侧目标序列的13个核苷酸进行杂交。还需要着重注意的是，在目标DNA的同一5’或3’旁侧区域上只能杂交一个封闭寡核苷酸B1,B2或一个旁侧寡核苷酸F1,F2；因此，在一个特定(平行)实验中能够使用两个封闭寡核苷酸(即B1和B2)、两个旁侧寡核苷酸(即F1和F2)或一个封闭寡核苷酸加一个旁侧寡核苷酸(即B1+F2或F1+B2)。

优选以下试剂盒，所述试剂盒在每个案例中包含一组不同的寡核苷酸用于杂交实验：

a)STR探针P1和参考探针P2(也被称为“XX”)；

b1)STR探针P1，参考探针P2，带有封闭物B1(也被称为“BX”)；

b2)STR探针P1，参考探针P2，带有封闭物B2(也被称为“BX”)；

b3)STR探针P1，参考探针P2，带有封闭物B1和B2(也被称为“BB”)；

c1)STR探针P1，参考探针P2，带有旁侧物F1(也被称为“FX”)；

c2)STR探针P1，参考探针P2，带有旁侧物F2(也被称为“XF”)；

c3)STR探针P1，参考探针P2，带有封闭物F1和F2(也被称为“FF”)；

d)STR探针P1，参考探针P2，带有封闭物B1和封闭物F2(也被称为“BF”)；

e)STR探针P1，参考探针P2，带有封闭物B2和封闭物F1(也被称为“FB”)。

这些封闭寡核苷酸B1,B2和旁侧寡核苷酸F1,F2的多种组合存在时16-聚体CSF1PO特异性STR探针P1的杂交程度取决于目标DNA中存在的四核苷酸重复序列的实际数目，理论上可将目标DNA按期望杂交模式分成A-J 10个不同的组，用于对STR及其四核苷酸重复进行基因分型(参见表1)。

表1中，一个重复对应四个碱基对(bp)；一个16-聚体STR探针P1与4个重复杂交；每个封闭寡核苷酸B1,B2与3个重复杂交且干扰STR探针P1的结合(也可参见图1)。在表1的内容中，“杂交”一栏表示在特定条件下能够结合目标STR序列的STR探针P1的数目。

图2至10显示了使用本发明中方法和试剂盒以及表1中所列探针理论上可能获得的一些杂交结果。

根据图2，预测带2个四核苷酸重复的A组CSF1PO目标DNA与试剂盒a)(仅包含STR探针P1和参考探针P2)孵育后显示未与STR探针P1发生杂交，因为目标DNA的所选STR中没有足够的核苷酸，无法使该STR探针P1寡核苷酸完成稳定且充分的杂交。平行实验中使用额外的封闭物和/或旁侧物不会改变这一结果(参见下文)。

根据图3，预测带4个四核苷酸重复的B组CSF1PO目标DNA与试剂盒b1)(包含STR探针P1，参考探针P2，带有一个封闭物B1)孵育后显示未与STR探针P1发生杂交，因为目标DNA的所选STR中没有足够的核苷酸，无法使该STR探针P1寡核苷酸完成稳定且充分的杂交。在独立实验中额外使用其他封闭物B2(即使用试剂盒b3)或额外使用其他旁侧物F2(即使用试剂盒d)不会改变这一结果。

根据图4，预测带7个四核苷酸重复的C组CSF1PO目标DNA与试剂盒b2)(包含STR探针P1，参考探针P2，带有一个封闭物B2)孵育后显示每条目标DNA链与一个STR探针P1寡核苷酸发生杂交，因为目标DNA的所选STR中有只够使一个STR探针P1完成稳定且充分的杂交的核苷酸。在独立实验中额外使用旁侧物F1(即使用试剂盒e)不会改变这一结果。与之相反，在独立实验中额外使用其他封闭物B1(即使用试剂盒b3)会显著改变这一结果，因为此时目标DNA的所选STR中没有足够的核苷酸，无法使一个STR探针P1完成稳定且充分的杂交。

根据图5，预测带12个四核苷酸重复的G组CSF1PO目标DNA与试剂盒b1)(包含STR探针P1，参考探针P2，带有一个封闭物B1)孵育后显示每条目标DNA链与两个STR探针P1寡核苷酸发生杂交，因为目标DNA的所选STR中有足够使两个STR探针P1完成稳定且充分的杂交的核苷酸。在独立实验中额外使用旁侧物F2(即使用试剂盒d)不会改变在目标DNA链上结合的STR探针P1寡核苷酸的数目，但会增强STR序列的结合能力。与之相反，在独立实验中同时使用封闭物B1和B2(即使用试剂盒b3)会显著改变这一结果，因为此时目标DNA的所选STR中仅有足够使STR探针P1完成一次稳定且充分的杂交的核苷酸。

在图6-10中，讨论了在独立实验中对带16个四核苷酸重复的CSF1PO目标DNA使用不同试剂盒及各实验所预期的结果：

根据图6，预测带16个四核苷酸重复的J组CSF1PO目标DNA与试剂盒b1)(包含STR探针P1，参考探针P2，带有一个封闭物B1)孵育后显示每条目标DNA链与三个STR探针P1寡核苷酸发生杂交，因为目标DNA的所选STR中有足够使三个STR探针P1完成稳定且充分的杂交的核苷酸。在独立实验中额外使用旁侧物F2(即使用试剂盒d)不会改变在目标DNA链上结合的STR探针P1寡核苷酸的数目，但会增强STR序列的结合能力。与之相反，额外使用其他封闭物B2(即在独立实验中使用试剂盒b3)会显著改变这一结果，因为此时因为此时目标DNA的所选STR中仅有足够使两个STR探针P1完成稳定且充分的杂交的核苷酸。

根据图7，预测带16个四核苷酸重复的J组CSF1PO目标DNA与试剂盒c3)(包含STR探针P1，参考探针P2，带有两个旁侧物F1和F2)孵育后显示每条目标DNA链与四个STR探针P1寡核苷酸发生杂交，因为目标DNA的所选STR中正好有足够使四个STR探针P1完成稳定且显著的杂交的核苷酸。

根据图8，预测带16个四核苷酸重复的J组CSF1PO目标DNA与试剂盒b3)(包含STR探针P1，参考探针P2，带有两个封闭物B1和B2)孵育后显示每条目标DNA链与两个STR探针P1寡核苷酸发生杂交，因为目标DNA的所选STR中正好有足够使两个STR探针P1完成稳定且充分的杂交的核苷酸。在特定实验中同时使用封闭物B1,B2，优选不使用旁侧物F1和/或F2，因为在杂交期间其会与封闭物B1和/或B2产生竞争。

根据图9，预测带16个四核苷酸重复的J组CSF1PO目标DNA与试剂盒e)(包含STR探针P1，参考探针P2，带有一个旁侧物F1和一个封闭物B2)孵育后显示每条目标DNA链与三个STR探针P1寡核苷酸发生杂交，因为目标DNA的所选STR中正好有足够使三个STR探针P1完成稳定且充分的杂交的核苷酸。优选地，在特定实验中不使用额外的封闭物B1和/或旁侧物F2，因为在杂交期间其会与旁侧物F1和/或封闭物B2产生竞争。

根据图10，预测带16个四核苷酸重复的J组CSF1PO目标DNA与试剂盒d)(包含STR探针P1，参考探针P2，带有一个封闭物B1和一个旁侧物F2)孵育后显示每条目标DNA链与三个STR探针P1寡核苷酸发生杂交，因为目标DNA的所选STR中正好有足够使三个STR探针P1完成稳定且充分的杂交的核苷酸。优选地，在特定实验中不使用额外的封闭物B2和/或旁侧物F1，因为在杂交期间其会与旁侧物F2和/或封闭物B1产生竞争。

上文所讨论的用作示例选择的CSF1PO STR的各种情形得到了实际实验的支持。图12显示了上述推演的理论预期和实际所得到结果的组合。使用FAM标记的16-聚体探针(5-AGAT)₄与一系列化学合成的含2-16个ATCT重复的单链DNA探针杂交所进行的实验得到了这些结果。应当注意，作为备选和优选，从基因组样品中生成包含所选STR的单链目标DNA。如上文所述，在这一特定位点天然产生的人类重复序列为5-16个重复。

实验：

首先，化学合成了一系列含2-16个ATCT重复的单链DNA。所述这些5’-ATCT-3’重复中的每条序列均被嵌入一条与自然产生的5’和3’旁侧序列对应的更长的不相关序列中。所合成的目标DNA在其5’末端生物素化(参见图1中带有16个四聚体5’-ATCT-3’-STR的目标DNA)。

杂交前，将如图1所示的单链目标DNA链加入洗涤后的包被亲和素的磁珠悬浮液中。结合反应使用0.5mg珠子和80pMole目标DNA。应注意捕捉效率通常高于90％。

除了16-聚体STR探针P1(也如图1所示)以外，每个杂交反应还包括一个Cy5标记的参考探针P2以及两个旁侧物(F1和F2)或两个封闭物(B1和B2)或一个旁侧物加一个封闭物(F1+B2或B1+F2)。相应地，使用上文所定义的试剂盒b3)、c3)、d)或e)进行单链目标DNA的杂交。应注意，作为备选，可使用试剂盒b1)代替试剂盒d)，可使用试剂盒b2)代替试剂盒e)，因为预计可取得相同的结果。

本文所用的参考探针P2、旁侧物F1,F2和封闭物B1,B2都是与图1所示目标DNA的区域互补的25-聚体。旁侧物F1,F2在CSF1PO STR重复序列的邻近区域迅速完成杂交，同时各封闭物B1,B2与CSF1PO序列的12个核苷酸(3个重复)和邻近的旁侧目标序列的13个核苷酸进行杂交。

对于杂交，将160pMole Cy5标记的参考探针P2和160pMole各种封闭物B1,B2和旁侧物F1,F2一起加入之前加载了80pMole特定单链目标DNA的0.5mg亲和素包被的磁珠中。杂交反应首先在65℃下进行5分钟，随后在37℃下在100μl缓冲液A(10mM Hepes pH8.0，50mM NaCl，10mM MgCl₂)中反应15分钟。然后，在磁珠悬浮液中加入160pMole FAM标记的STR探针P1。该STR探针P1与目标DNA的杂交反应在47℃下进行15分钟。去除杂交溶液后，珠子在47℃下100μl新鲜的缓冲液A中孵育15分钟。最后，通过在65℃下在缓冲液B(10mM Hepes pH8.0，15mM NaCl)中孵育10分钟，从洗涤后的珠子上洗脱已结合的探针。收集含洗脱后探针的上清并将其转移至酶标板上，用于在200酶标仪(奥地利格勒迪希(Groedig)的帝肯奥地利有限责任公司(Tecan Austria GmbH))中读取FAM和Cy5荧光。

在图12中图表的横坐标上，显示了各示例(即2-16)中每条目标DNA链上的STR重复单元的数目，并将其分配给表1所定义的各组(即A-J)。对于含有特定数目STR重复单元的每个目标DNA链组，使用试剂盒c3)、e)、d)或b3)所得到的结果以柱状图的形式显示(以此顺序)。或者，可以根据所使用的旁侧寡核苷酸“F”和/或封闭寡核苷酸B将这四个柱状图命名为FF、FB、BF或BB(以此顺序)。每个柱状图上都显示了预计与每条目标DNA链杂交的STR探针P1寡核苷酸的理论数目。在图12中图表的纵坐标上，以垂直柱的形式显示了60个实验中各个实验的相对荧光信号(FAM所测得强度除以Cy5所测得强度的商)。

图12A显示了表1中组A(2-3个STR重复)和B(4-6个STR重复)的目标DNA。如果杂交时目标DNA中STR重复单元的数目至少为4个，那么会发生四聚体STR探针P1与目标DNA的完美匹配。因此可预计，组A的目标DNA不会与STR探针P1发生杂交，而只有使用试剂盒c3)时组B才会与STR探针P1发生杂交。组B中代表使用试剂盒c3)的柱状图高度(显示相对荧光信号)显著高于代表使用试剂盒e)、d)或b3)之一的柱状图高度。然而，组A中也会检测到一些显著的STR探针P1所发生的杂交(这被认为是背景信号：如果与组B的结果比较，会发现只有很低的信号)。因此，认为组A和B所期望的结果得到了清楚的检验。

图12B显示了表1中组C(7个STR重复)、D(8或9个STR重复)、E(10个STR重复)、和F(11个STR重复)的目标DNA。如果杂交时目标DNA中STR重复单元的数目至少为4个(每条目标DNA链与一个STR探针P1寡核苷酸发生杂交)或8个(每条目标DNA链与两个STR探针P1寡核苷酸发生杂交)，那么会发生16-聚体STR探针P1与目标DNA的完美匹配。

因此可预计，使用试剂盒c3)、e)或d)时组C的目标DNA中每条目标DNA链会与一个STR探针P1寡核苷酸发生杂交，而仅使用试剂盒b3)时STR探针P1不会发生杂交。组C中代表使用试剂盒c3)、e)或d)的柱状图高度(表示相对荧光信号)显著高于代表使用试剂盒b3)的柱状图高度。还可预计，使用试剂盒c3)时组D的目标DNA中每条目标DNA链会与两个STR探针P1寡核苷酸发生杂交，使用试剂盒e)或d)时组D的目标DNA中每条目标DNA链会与一个STR探针P1寡核苷酸发生杂交，而仅使用试剂盒b3)时STR探针P1不会发生杂交。组D中代表使用试剂盒c3)的柱状图高度(表示相对荧光信号)大约是代表使用试剂盒e)或d)的柱状图高度的两倍；代表使用试剂盒b3)的柱状图高度(表示相对荧光信号)显著低于代表使用试剂盒e)或d)的柱状图高度。即使使用试剂盒b3)时组D中也会检测到一些显著的STR探针P1所发生的杂交，但如果与其他试剂盒的结果比较，会发现只有很低的信号。因此，认为组C和D所期望的结果得到了清楚的检验。

还可预计，使用试剂盒c3)时组E的目标DNA中每条目标DNA链会与两个STR探针P1寡核苷酸发生杂交，而使用试剂盒e)、d)或b3)时每条目标DNA链会与一个STR探针P1寡核苷酸发生杂交。组E中代表使用试剂盒c3)的柱状图高度(相对荧光信号)大约是代表使用试剂盒e)、d)或b3)的柱状图高度的两倍。因此，认为组E所期望的结果得到了清楚的检验。

还可预计，使用试剂盒c3)、e)或d)时组F的目标DNA中每条目标DNA链会与两个STR探针P1寡核苷酸发生杂交，使用试剂盒b3)时每条目标DNA链会与一个STR探针P1寡核苷酸发生杂交。组F中代表使用试剂盒c3)、e)或d)的柱状图高度(表示相对荧光信号)大约是代表使用试剂盒b3)的柱状图高度的两倍。因此，认为组F所期望的结果得到了清楚的检验。

图12C显示了表1中组G(12-13个STR重复)、H(14个STR重复)、I(15个STR重复)、和J(16个STR重复)的目标DNA。如果杂交时目标DNA中STR重复单元的数目至少为4个(每条目标DNA链与一个STR探针P1寡核苷酸发生杂交)、8个(每条目标DNA链与两个STR探针P1寡核苷酸发生杂交)、12个(每条目标DNA链与三个STR探针P1寡核苷酸发生杂交)或16个(每条目标DNA链与四个STR探针P1寡核苷酸发生杂交)，那么会发生四聚体STR探针P1与目标DNA的完美匹配。

还可预计，使用试剂盒c3)时组G的目标DNA中每条目标DNA链会与三个STR探针P1寡核苷酸发生杂交，使用试剂盒e)或d)时每条目标DNA链会与两个STR探针P1寡核苷酸发生杂交，而使用试剂盒b3)时每条目标DNA链会与一个STR探针P1寡核苷酸发生杂交。组G中代表使用试剂盒e)或d)的柱状图高度(表示相对荧光信号)在各例中基本持平，且是代表使用试剂盒b3)的柱状图高度的两倍。组G中代表使用试剂盒c3)的柱状图高度(表示相对荧光信号)在各例中均显著高于代表使用试剂盒e)或d)的柱状图高度，且大约是代表使用试剂盒b3)的柱状图高度的三倍。因此，认为组G所期望的结果得到了清楚的检验。

还可预计，使用试剂盒c3)时组H的目标DNA中每条目标DNA链会与三个STR探针P1寡核苷酸发生杂交，而使用试剂盒e)、d)或b3)时每条目标DNA链会与两个STR探针P1寡核苷酸发生杂交。组H中代表使用试剂盒e)、d)或b3)的柱状图高度(表示相对荧光信号)基本持平。组H中代表使用试剂盒c3)的柱状图高度(相对荧光信号)显著高于代表使用试剂盒e)、d)或b3)的柱状图高度。因此，认为组H所期望的结果得到了清楚的检验。

可预计，使用试剂盒c3)、e)或d)时组I的目标DNA中每条目标DNA链会与三个STR探针P1寡核苷酸发生杂交，使用试剂盒b3)时每条目标DNA链会与两个STR探针P1寡核苷酸发生杂交。组I中代表使用试剂盒c3)、e)或d)的柱状图高度(表示相对荧光信号)基本持平。组I中代表使用试剂盒b3)的柱状图高度(相对荧光信号)显著低于代表使用试剂盒c3)、e)或d)的柱状图高度。因此，认为组I所期望的结果得到了清楚的检验。

可预计，使用试剂盒c3)时组J的目标DNA中每条目标DNA链会与四个STR探针P1寡核苷酸发生杂交(与图7比较)，使用试剂盒e)或d)时每条目标DNA链会与三个STR探针P1寡核苷酸发生杂交(与图9或10比较)，使用试剂盒b3)时每条目标DNA链会与两个STR探针P1寡核苷酸发生杂交(与图8比较)。组J中代表使用试剂盒e)或d)的柱状图高度(表示相对荧光信号)基本持平，且显著高于代表使用试剂盒b3)的柱状图高度。组J中代表使用试剂盒c3)的柱状图高度(相对荧光信号)显著高于代表使用试剂盒e)或d)的柱状图高度。因此，认为组J所期望的结果得到了清楚的检验。

上述分析是在图12的基础上讨论的，总结了各杂交反应中获得的FAM对Cy5荧光的相对比率。由于每种目标DNA获得了4个比率，可将目标DNA分为A-J10组，从而提供了一种基因分型的指标。STR探针P1的重复数目越多杂交效率越低(具体参见图12C)的原因可能是：较多的重复数目为STR探针P1寡核苷酸与目标重复序列的结合提供了更多种可能的途径。杂交效率的下降可根据所选STR位点预测(如通过使用该STR位点相应的模型系统进行预测)或基于差异杂交实验的结果确定。可通过增加STR探针P1与DNA目标的比率克服这种下降。预计16-聚体STR探针P1的杂交效率大致在25％以下。

下文详细描述了适于进行本发明所述方法的多种STR探针、参考探针、封闭物和旁侧物：

STR探针P1,P1’：

-是一种寡核苷酸，由与所选STR重复单元的序列互补的序列构成；

-互补序列由特定数目n的重复单元构成，

-选择STR探针寡核苷酸的长度以提供在所选各实验杂交条件下足以确保其与单链目标DNA发生稳定杂交的T_m；如果STR是四聚体重复，优选特定数目n为至少4，因为n＝3(长度为12个核苷酸)时会导致T_m过低；优选STR探针核苷酸包含至少15个核苷酸；

-STR探针P1中互补重复单元的数目取决于所选STR的类型和该STR探针所需长度，因为不是所有STR都是简单重复；优选STR探针包含重复单元的完整序列，

-由第一荧光标记(如FAM)进行标记；可根据技术人员的知识将第一荧光标签与STR探针寡核苷酸偶联，例如偶联在寡核苷酸的5’或3’端。

-在需要分析带复杂重复序列的STR时，可使用两个或更多个在它们的序列或所含互补重复单元数目中有所区别的STR探针P1，P1’,…。可在单个杂交实验中实验所述可使用两个或更多个STR探针P1，P1’,…。此时，每个不同的STR探针P1，P1’优选包含一个不同的荧光标签。或者，可在不同杂交实验中实验所述可使用两个或更多个STR探针P1，P1’,…。在这种情况下，不同的STR探针P1，P1’,…可包含相同或不同的荧光标签。

使用两个或多个不同的STR探针P1，P1’,…的优势在于，例如允许测试一种存在于所选STR的变体中的特殊基序是否存在。以下是一个实施例：人类TH01STR位点天然形成的等位基因含有3至13个基序5’-AATG-3’的重复，但偶尔也存在变体，包括含有序列5’-(AATG)₃ATG(AATG)₃-3’的所谓“6.3”等位基因。为检测该TH01特殊序列，可使用额外的与该特殊基序互补(例如由序列5’-(CATT)₂CAT(CATT)₂-3’组成)的STR探针P1’并使用该探针进行相应的杂交实验以确定“6.3”等位基因是否存在。

参考探针P2：

-是一个带第二荧光标签(如Cy5)的寡核苷酸，所述第二荧光标签不同于STR探针P1,P1’的荧光标签；

-用于确定存在且可用于杂交的DNA量，并用于将结合的STR探针P1，P1’所测得的信号相对于结合的参考探针所测得的信号进行标准化。本文中的标准化表示结合的STR探针P1，P1’所测得的荧光强度与参考探针P2所测得的荧光强度的相关性，以此在各不同杂交实验中的获得相对荧光信号。基于此，可确定每个杂交实验中每条目标DNA链所结合的STR探针P1，P1’的数目，并可直接比较不同杂交实验中所测得的信号；

-包含与目标DNA5’或3’旁侧序列互补的序列(优选由上述序列组成)，但不含STR探针P1,P1’、封闭物B1,B2或旁侧物F1,F2的序列；

-可以与旁侧物F1,F2相邻；但优选与旁侧物结合位点间保持一定距离；

-不可涉及用于形成复制子的PCR引物序列；

-没有最小或最大长度；熔解点T_m应足以使结合在实验温度下符合化学计量比。

-用于每个杂交实验。

封闭物B1,B2：

-为检测单链目标DNA上所选STR中的重复单元数目，需要至少两个封闭物B1,B2；每个封闭物均为寡核苷酸；

-在至少三个差异杂交实验的至少两个中与STR探针P1和参考探针P2一起使用，优选平行使用；

-每个封闭物B1,B2包含与所选STR的至少一个重复单元序列互补的序列，该互补序列由特定数目的重复单元组成。优选重复单元的数目取决于所选STR上可能的重复单元的数目、每个重复单元的核苷酸数目以及STR探针P1,P1’的设计。通常，可以存在任何数目的重复单元；

-每个封闭物包含与目标DNA的旁侧区域(5’或3’旁侧区域)之一互补的序列；

-优选地，将用于第一个差异杂交实验的至少两个封闭物B1,B2设计为一对封闭物B1,B2，每个都通过杂交结合到STR的其他旁侧区域，使得在至少一个实验中，封闭物B1,B2能够保护所选STR两端外部区域上的重复序列，使之不结合STR探针P1,P1’。更优选地，第一封闭物B1包含与STR的5’旁侧区域序列以及至少一个与该5’旁侧区域序列相邻的STR重复单元互补的序列，而相应地，第二封闭物B1包含与STR的3’旁侧区域序列以及至少一个与该3’旁侧区域序列相邻的STR重复单元互补的序列；

-在前三个差异杂交实验无法准确推导出所选STR中重复单元数目的情况下，可使用额外的封闭物B3,B4等保护与旁侧序列相邻的所选STR上不同数目的重复单元；每个额外的封闭物均用于额外的、不同的杂交实验，并被设计用于代替最初实验的封闭物B1,B2中的一个。

-不含荧光标签；

-在对照实验中与STR探针寡核苷酸P1一起使用时，会形成竞争性的、更强的结合。

旁侧物F1,F2：

-每个封闭物均是一个寡核苷酸，由与目标DNA链上的所选STR的5’或3’旁侧序列互补的序列组成；

-每个旁侧物F1,F2均用于减少解离并移除反义链后的单链目标DNA的分子内二级结构，因此，当单链目标DNA中存在二级结构时可选择使用一个或多个旁侧物；

-优选将每个旁侧物F1,F1的长度(如25个核苷酸)设计为在所选的实验杂交温度下能够进行杂交(特殊的T_m值并非关键因素)；

-如果是5’旁侧寡核苷酸，则包含与单链DNA上所选STR的5’旁侧序列互补的序列(优选由上述序列组成)；

-可将两个旁侧物F1,F2用作一组3’和5’旁侧寡核苷酸，其中3’旁侧寡核苷酸包含与单链DNA上所选STR的3’旁侧序列互补的序列(优选由上述序列组成)，而5’旁侧寡核苷酸包含与单链DNA上所选STR的5’旁侧序列互补的序列(优选由上述序列组成)；

-不含与重复单元序列互补的序列，不含参考探针P2的序列，但优选包含与封闭物B1,B2之一的旁侧序列部分相同的序列(更优选由上述序列组成)。

-不含荧光标签。

实施本发明所述方法时，通过加入一个或多个封闭物B1,B2会减少能够与STR探针P1,P1’结合的目标DNA的重复单元序列的数目。当封闭寡核苷酸上的重复单元数目已知时，也就知道了封闭寡核苷酸结合后不再能够结合的重复单元数目。在一个特别优选实施方式中，对于目标DNA的STR片段的3’端和5’端，可使用一个封闭寡核苷酸B1,B2或一个旁侧寡核苷酸F1,F2以确保目标DNA保持单链、开放的结构。因此，相比于仅单独使用STR探针P1,P1’和参考探针P2而不使用封闭物B1,B2进行的实验，DNA上可用重复单元的减少优选导致荧光强度的减弱，通过所检测到的结合的STR探针P1,P1’的荧光强度差即可推导出STR上重复单元的数目(比较最大强度_{单独使用 STR探针}与减弱后的强度_{STR 探针+封闭物})。

插入探针P3：

插入探针P3(参见图11)是一种特殊的寡核苷酸探针，用于单链目标DNA的STR重复区域结构(下文中被称作“更复杂的”STR)中非重复核苷酸序列的“岛”。

所述插入探针P3：

-包含一条设计用于在所选测定温度下与STR重复区域中的“岛”特异性结合的特殊序列；基于所选STR中“岛”的性质和序列，可使用一个或多个插入探针P3，P3’；

-含有与所述岛互补的碱基；

-当在单个杂交实验中与至少一个STR探针P1,P1’和参考探针P2共同使用时，优选用第三荧光标签(如Cy3)标记；或者，如在单个实验中插入探针P3未与STR探针P1,P1’共同使用，则可使用第一荧光标签或第三荧光标签标记插入探针P3；

-可含有两个与STR重复序列互补的旁侧序列(如在插入探针P3两端上的两个重复单元)或甚至可含有仅与STR重复序列的一部分互补的序列(位于插入探针P3的一端或两端)；

-用于可找到“岛”的位点；

-含有已知的插入序列；可能的等位基因的特定序列已经公开，NIST的JohnButler维护了一个这类核心位点的数据库，网址为

http://www.cstl.nist.gov/strbase(一个等位基因是CSF1PO)。FBI公开了联合DNA检测系统(Combined DNA Index System，CODIS)数据库的十三个位点。在网上可查到所有十三个位点的STR资料简报(STR Fact Sheets)(更多信息请参见：Butler，J.M.(2006)Genetics and genomics of coreSTR loci used in human identity testing(人类身份测试中使用的核心STR位点的遗传学和基因组学)，J.Forensic Sci.51(2)：253-265)。

通常会对寡核苷酸(封闭物和探针)进行设计，从而能够使用最少数量的探针特异地鉴定每个可能的STR。为实施上文所述实验，从CSF1PO测试系统中选择了多个寡核苷酸(5’-AGAT-3’/5’-ATCT-3’重复序列，其旁侧含有人工合成的序列)。在本发明申请所附序列表中描述了这些寡核苷酸。所述序列表包含：

SEQ ID：NO 1，带有5个AGAT重复的参考目标链(非人工合成)；

SEQ ID：NO 2，针对ATCT重复的16-聚体探针(STR探针P1)；

SEQ ID：NO 3，针对ATCT重复的20-聚体探针；

SEQ ID：NO 4，25-聚体的5’互补寡核苷酸(旁侧寡核苷酸F1)；

SEQ ID：NO 5，25-聚体的5’封闭寡核苷酸(封闭寡核苷酸B1)；

SEQ ID：NO 6，25-聚体的3’互补寡核苷酸(旁侧寡核苷酸F2)；

SEQ ID：NO 7，25-聚体的3’封闭寡核苷酸(封闭寡核苷酸B2)；

SEQ ID：NO 8，25-聚体的3’参考寡核苷酸(参考探针P2)；

SEQ ID：NO 9，带有2个5’-ATCT-3’重复的目标DNA；

SEQ ID：NO 10，带有3个5’-ATCT-3’重复的目标DNA；

SEQ ID：NO 11，带有4个5’-ATCT-3’重复的目标DNA；

SEQ ID：NO 12，带有5个5’-ATCT-3’重复的目标DNA；

SEQ ID：NO 13，带有6个5’-ATCT-3’重复的目标DNA；

SEQ ID：NO 14，带有7个5’-ATCT-3’重复的目标DNA；

SEQ ID：NO 15，带有8个5’-ATCT-3’重复的目标DNA；

SEQ ID：NO 16，带有9个5’-ATCT-3’重复的目标DNA；

SEQ ID：NO 17，带有10个5’-ATCT-3’重复的目标DNA；

SEQ ID：NO 18，带有11个5’-ATCT-3’重复的目标DNA；

SEQ ID：NO 19，带有12个5’-ATCT-3’重复的目标DNA；

SEQ ID：NO 20，带有13个5’-ATCT-3’重复的目标DNA；

SEQ ID：NO 21，带有14个5’-ATCT-3’重复的目标DNA；

SEQ ID：NO 22，带有15个5’-ATCT-3’重复的目标DNA；以及

SEQ ID：NO 23，带有16个5’-ATCT-3’重复的目标DNA。

用于分析任何STR位点的混合物或试剂盒都高度依赖STR位点的序列。但是，为分析一个未知的STR位点，需要进行以下的至少3个差异杂交实验：

实验1：一个STR探针*P1,P1’；一个参考探针*P2；

实验2；一个STR探针*P1,P1’；一个参考探针*P2，一个封闭物B2,B1；

实验3:一个STR探针*P1,P1’；一个参考探针*P2，两个封闭物B1,B2。

星号(*)表示含有一个荧光标签的探针。单个实验中的每个标签必须是不同的。如果一个STR位点含有一个插入(“岛”)，则所有三个实验还应含有一个也带标签的插入探针P3。更复杂的STR还需要一个长度不同的第三STR探针P1”(也带有荧光标签)，用于额外的差异杂交实验和/或使用不同长度封闭物的额外的差异杂交实验。

通过直接比较不同杂交实验中获得的相对信号——即通过直接比较至少三个差异杂交实验中每条目标DNA链上所结合的STR探针P1,P1’寡核苷酸的数目，其中通过差异化使用STR探针P1,P1’和封闭物B1,B2系统地降低了可用重复单元的数目——可推导出所选STR上的重复单元数目。

在无法使用所述至少三个杂交实验推导出所选STR中重复单元确切数目的情况下，需要进行进一步的补充差异杂交实验。这类进一步杂交实验可包括选择性使用一个、两个或更多个额外的封闭物B3,B4，封闭物B3,B4包含与不同数目重复单元(不同于封闭物B1,B2)互补的序列，用于系统地改变目标DNA上可供STR探针寡核苷酸结合的重复单元。或者，这类进一步杂交实验可包括使用额外的、在所含互补重复单元数目上不同(如上文所述)的STR探针P1’，P1”。在一个可选的实施方式中，这类进一步杂交实验可包括使用一个或多个插入探针P3以检测例如一个或多个STR特异的非重复序列。根据待分析的所选STR，可进行全部这类补充杂交实验或其适当组合以分析在由差异化使用STR探针P1,P1’、封闭物B1,B2,B3,B4和/或插入探针P3所造成的不同情况下能够结合目标STR序列的STR探针P1,P1’的数目，从而推导出——如果逐步杂交方法中需要——所选STR中重复单元的确切数目。

例如，为检测包含未知数目简单重复单元的STR，可设计补充后续杂交实验以包括使用额外的根据其序列配置的封闭物B3，B4等，使得在每个实验中，STR探针P1,P1’可结合不同数目的STR重复单元。优选地，可通过相应地增加所用封闭寡核苷酸中与所选STR目标DNA互补的重复单元数目，系统地减少这些补充杂交实验中可用的重复单元数目。优选地，可使用封闭物对B1,B2/B3,B4/等系统地减少初始实验和补充实验中可用的重复单元数目。在一个特别优选的实施方式中，设计所用的封闭物对B1,B2/B3,B4/,…以覆盖所期望的天然形成的重复数目的全部范围。继而可通过比较每个DNA分子上所结合的STR探针P1,P1’寡核苷酸的数目与提供的封闭物配置由这组实验(包括初始的三个杂交实验和可选的补充实验)推导出所选STR中的重复单元数目。或者，或此外，可使用另外的长度不同的STR探针P1’重复这组杂交实验，以相同的方式再次分析并随后将结果相互比较，用于例如确定先前对所选STR中存在的重复单元数目的推导。

在所选用于分析的STR中已知可能天然产生一个或多个稀有等位基因的情况下(如上文所述TH01 X.3等位基因中的5’-ATG-3’岛)，则可使用一个或多个特异结合该岛的插入探针P3进行其他补充实验。如此，可通过一个或多个补充杂交实验检测到这类“岛”的存在。此外，通过比较插入探针P3处获得的荧光信号与参考探针P2处获得的荧光信号，可计算这类岛的数量。

为区分某一特定STR的等位基因，图13给出了一种实施例。观察图13时，应注意所有结果都是以重复信号(结合的STR探针P1的荧光强度)与总DNA信号(结合的参考探针P2的荧光强度)的比值形式显示的。但对于杂合样品，输出的结果代表来自两个等位基因的各自信号的平均值。这使得信号可能出现纯合样品一半的情况(即0.5、1.5、2.5等)。

图13显示了当样品的STR重复数目并非纯合时，预期一组实验中所获得的探针信号比率。对该表格进行以下解释。我们在这里假定由于所检测的样品在人类DNA中是双等位基因的，即所检测的STR位点的两个拷贝中的每个均含有独立数目的STR重复，且当重复数目相等时为纯合，重复数目不等时为杂合。表格顶部是等位基因1上的重复数目(在该实施例中为5至16)，表格左侧从上至下是等位基因2上的重复数目(同样为5至16)。以一组6次测量的形式显示每个等位基因组合的预测探针信号比率：组合使用无封闭物、1个封闭物或2个封闭物与20-聚体或16-聚体STR探针P1,P1’。这些实验中的封闭物每个均可与重复区域两个末端之一的3个末端重复序列(12个核苷酸)杂交并将其“封闭”。因此，对于等位基因1和等位基因2的每个组合，进行了6次信号测量，并在表格中将这六次信号测量的预测比率排成横排显示。例如，对于11个STR重复单元(等位基因1)和15个STR重复单元(等位基因2)的组合，我们预测在使用20-聚体STR探针且无封闭物、16-聚体STR探针且无封闭物、20-聚体STR探针和一个封闭物、16-聚体STR探针和一个封闭物、20-聚体STR探针和两个封闭物以及16-聚体STR探针和两个封闭物的实验中，信号比率分别为2.5:2.5:1.5:2.5:1.0:1.5。表格中对角线上带有下划线的数值表示等位基因1和等位基因2含有相同STR重复单元数目的纯合情况。仍通过每个可能的等位基因组合提供了一种独特的模式。

本发明的序列表如下：

Claims

1.一种推导基因组样品中所选短串联重复序列(STR)中重复单元数目的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供至少：

a1)从包含所选STR的基因组样品中生成的单链目标DNA；

a2)带第一荧光标签的STR探针(P1,P1’)，至少一个STR探针(P1,P1’)为包含与所述单链目标DNA上所选STR上确定数目的重复单元互补的序列的寡核苷酸；

a3)带第二荧光标签的参考探针(P2)，所述第二荧光标签与所述第一荧光标签不同，所述参考探针(P2)为包含与所述单链目标DNA上所选STR的5’或3’旁侧序列互补的序列的寡核苷酸；

a4)两个封闭物(B1,B2)，其为寡核苷酸，其特征在于，第一封闭物(B1)包含与所述STR的5’旁侧区域内序列以及与所述5’旁侧区域相邻的至少一个STR重复单元互补的序列，第二封闭物(B2)包含与所述STR的3’旁侧区域内序列以及与所述3’旁侧区域相邻的至少一个STR重复单元互补的序列；

b)进行至少以下三个差异杂交实验，各实验中将一定量的所述单链目标DNA与以下物质混合：

b1)所述至少一个STR探针(P1,P1’)和所述参考探针(P2)，在第一差异杂交实验中与所述单链目标DNA杂交；

b2)所述至少一个STR探针(P1,P1’)、所述参考探针(P2)和所述至少两个封闭物(B1,B2)其中之一，在第二差异杂交实验中与所述单链目标DNA杂交；以及

b3)所述至少一个STR探针(P1,P1’)、所述参考探针(P2)和所述两个封闭物(B1,B2)，在第三差异杂交实验中与所述单链目标DNA杂交；

c)测量各差异杂交实验中结合到所选STR的重复单元上的所述至少一个STR探针(P1,P1’)所提供的荧光强度；

d)测量各差异杂交实验中结合到所述单链目标DNA的旁侧序列之一上的所述参考探针(P2)所提供的荧光强度；

e)对每个差异杂交实验，将步骤c)中测得的所述至少一个STR探针(P1,P1’)的荧光强度与步骤d)中测得的所述参考探针(P2)的荧光强度相关联，从而确定各差异杂交实验中每个目标DNA链上所结合的STR探针寡核苷酸(P1,P1’)的数目，以及

f)比较各差异杂交实验中每个目标DNA链上所结合的STR探针寡核苷酸(P1,P1’)的数目，用于推导所述单链目标DNA链上所选STR中重复单元的数目。

2.如权利要求1所述的方法，

其特征在于，在步骤a4)中，还包括第三封闭物(B3)，所述第三封闭物(B3)是寡核苷酸，所述第三封闭物包含与所述STR的5’旁侧区域内序列和所述5’旁侧区域相邻的一定数目的STR重复单元互补的序列，所述数目与所述第一封闭物(B1)中的重复单元的数目不同，

且其特征在于，所述方法包含步骤b4)，其中将一定量的所述单链目标DNA与所述至少一个STR探针(P1,P1’)、所述参考探针(P2)和所述第三封闭物(B3)混合，在差异杂交实验中与所述单链目标DNA杂交。

3.如权利要求1或2所述的方法，

其特征在于，在步骤a4)中，还包括第四封闭物(B4)，所述第四封闭物(B4)是寡核苷酸，所述第四封闭物包含与所述STR的3’旁侧区域内序列和所述3’旁侧区域相邻的一定数目的STR重复单元互补的序列，所述数目与所述第二封闭物(B2)中的重复单元的数目不同，

所述方法包含步骤b5)，其中将一定量的所述单链目标DNA与所述至少一个STR探针(P1,P1’)、所述参考探针(P2)和所述第四封闭物(B4)混合，在差异杂交实验中与所述单链目标DNA杂交。

4.如权利要求1所述的方法，

其特征在于，在步骤a4)中，包括至少第三和第四封闭物(B3,B4)，所述第三和第四封闭物为寡核苷酸，所述第三封闭物(B3)包含与所述STR的5’旁侧区域内序列和所述5’旁侧区域相邻的一定数目的STR重复单元互补的序列，所述数目与所述第一封闭物(B1)中的重复单元的数目不同，所述第四封闭物(B4)包含与所述STR的3’旁侧区域内序列和所述3’旁侧区域相邻的一定数目的STR重复单元互补的序列，所述数目与所述第二封闭物(B2)中的重复单元的数目不同，

所述方法包含以下步骤：

b4)将一定量的所述单链目标DNA与所述至少一个STR探针(P1,P1’)、所述参考探针(P2)和所述第三封闭物(B3)混合，在第四差异杂交实验中与所述单链目标DNA进行杂交；

b5)将一定量的所述单链目标DNA与所述至少一个STR探针(P1,P1’)、所述参考探针(P2)和所述第四封闭物(B4)混合，在第五差异杂交实验中与所述单链目标DNA进行杂交；以及

b6)将一定量的所述单链目标DNA与所述至少一个STR探针(P1,P1’)、所述参考探针(P2)和所述第三和第四封闭物(B3,B4)混合，在第六差异杂交实验中与所述单链目标DNA进行杂交。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，所述方法还包含以下步骤：

提供带第三荧光标签的至少一个插入探针(P3)，所述插入探针(P3)是寡核苷酸且包含与所述单链目标DNA上所选STR的重复序列内的非重复核苷酸序列互补的序列；

在另外的不同差异杂交实验或在步骤b1)的杂交实验中使用所述至少一个插入探针(P3)，用于确定所述单链目标DNA上所选STR的重复序列内的重复核苷酸序列是否存在。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤a2)中包括两个STR探针(P1,P1’)，各自的序列分别与所述单链目标DNA上所选STR的不同、确定数目的重复单元互补，在步骤b1)-b3)中使用所述第一STR探针(P1)，进一步的杂交实验则使用所述第二STR探针(P1’)而非所述第一STR探针(P1)。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，所述方法还包含以下步骤：

提供一组旁侧物(F1,F2)，其为寡核苷酸，第一旁侧物F1包含与所述STR的5’旁侧区域内序列互补的序列，第二旁侧物F2包含与所述STR的3’旁侧区域内序列互补的序列；

在那些不使用或只使用一个封闭物(B1,B2)的差异杂交实验中使用所述旁侧物(F1,F2)中的至少一个与所述单链目标DNA上所选STR上未被封闭物(B1,B2)覆盖的5’或3’旁侧区域杂交。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，所述方法还包含以下步骤：提供了一组聚合酶链式反应(PCR)寡核苷酸，用于对带有所述短STR序列的所选基因组样品进行PCR扩增，用所述PCR寡核苷酸组进行PCR以扩增步骤a1)中提供的带有所选STR序列的基因组样品，对扩增后的双链样品DNA进行变性以生成单链DNA，选择并分离单链目标DNA用于所述差异杂交实验。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤a1)中提供的所述基因组样品为人类基因组样品。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述参考探针(P2)在寡核苷酸的3’端用Cy5标记。

11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一个STR探针(P1)在寡核苷酸的3’端用FAM标记。

12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一个STR探针(P1,P1’)由所选STR的互补序列组成。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述参考探针(P2)包含与所述目标DNA的5’或3’旁侧序列互补的序列，所述旁侧序列不含所选STR的序列。

14.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述参考探针(P2)包含与所述目标DNA的5’或3’旁侧序列互补的序列，所述旁侧序列不含所选STR的序列且不含所述旁侧寡核苷酸(F1,F2)的序列。

15.一种用于实施权利要求1所述方法的试剂盒，所述试剂盒包含：

·所述至少一个STR探针(P1,P1’)；

·所述参考探针(P2)，以及

·所述至少两个封闭物(B1,B2)。

16.一种用于实施权利要求4所述方法的试剂盒，所述试剂盒包含：

·所述至少一个STR探针(P1,P1’)；

·所述参考探针(P2)，以及

·所述至少四个封闭物(B1,B2)。

17.如权利要求15或16中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含：

·至少两个旁侧物(F1,F2)，其为寡核苷酸，其特征在于，第一旁侧物F1包含与所述STR的5’旁侧区域内序列互补的序列，且其特征在于，第二旁侧物F2包含与所述STR的3’旁侧区域内序列互补的序列。

18.如权利要求15至17中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含：

·带第三荧光标签的至少一个插入探针(P3)，所述至少一个插入探针(P3)是寡核苷酸，包含与所述单链目标DNA上所选STR的重复序列内的非重复核苷酸序列互补的序列。