JP5258760B2 - メチル化核酸又は非メチル化核酸を増幅する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生物学的試料に存在するメチル化核酸又は非メチル化核酸を増幅する方法に関する。さらには、かかる増幅方法を含む方法であって、生物学的試料に含有可能性のある目的遺伝子及び／又は遺伝子座におけるメチル化及び／又は非メチル化を検出する方法に関する。
本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願特願２００７−１５３０８６号からの優先権を請求する。
本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願特願２００７−１５３０８６号からの優先権を請求する。
哺乳類において、ゲノムＤＮＡ配列中に存在する５’−ＣＧ−３’ＤＮＡ部分（以下、ＣｐＧ部位、又は単にＣｐＧという）では、当該グアニン（Ｇ）の５’側に位置するシトシン（Ｃ）がメチル化される現象が知られている。ＣｐＧのメチル化修飾は、遺伝子発現に影響を及ぼすと考えられている。特にＣｐＧに富む領域（ＣｐＧ島）が遺伝子のプロモーター領域内に存在する場合、ＣｐＧは遺伝子発現に対して重要な影響を及ぼすと考えられている。
通常、染色体における多くのＣｐＧ島はメチル化から保護されている。しかし、何らかの原因により、プロモーター領域に存在するＣｐＧ島がメチル化されると、その遺伝子の転写が抑制される。例えば、ヒト生体内における癌抑制遺伝子において、そのプロモーター領域に存在するＣｐＧ島の異常なメチル化が起こり、当該癌抑制遺伝子の転写が不活性化された場合、細胞増殖の制御が効かなくなり、癌などの細胞増殖性疾患が進行してしまうことになる。
一方、ＣｐＧ島以外の領域では通常、ＣｐＧにおけるシトシンはメチル化されている。しかし、癌及び新生物においては、通常メチル化されているＣｐＧのシトシンが、非メチル化されていることが報告されている。
近年の分子生物学的手法の発展によって、ＤＮＡのメチル化の有無を検出することにより癌や腫瘍の早期発見及び治療をモニタリングすることが可能になってきた。例えば、特表２０００−５１１７７６号公報（特許文献１）、国際公開第０２／３８８０１Ａ１号パンフレット（特許文献２）、及びXiong Z, Laird PW. Nucleic Acids Res. 1997 jun 15;25(12): 2532-4（非特許文献１）には、ＣｐＧ含有核酸中のメチル化を迅速に検出するために、ＰＣＲ法を利用し、癌等を診断する方法が開示されている。これらの方法では、メチル化ＤＮＡを特異的に検出することに重点が置かれている。
さらに具体的には、各種体液、組織又は細胞系から核酸試料を調製し、重亜硫酸塩等により非メチル化シトシンをウラシルに変換する修飾を行い、次いで、（１）非メチル化ＤＮＡとメチル化ＤＮＡとを区別し得る特異的なプライマーによりＰＣＲ法（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ−ＰＣＲ：ＭＳＰ法）で増幅し、メチル化ＤＮＡを検出する方法（特許文献１）と、（２）非メチル化ＤＮＡとメチル化ＤＮＡとを区別しない非特異的なプライマーによりＰＣＲ法で増幅し、そのＰＣＲ増幅産物の内部の塩基配列の違いを認識する制限酵素で処理することによりメチル化ＤＮＡの有無及び／又は割合を検出する方法（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＣＯＢＲＡ法）（非特許文献１）が開示されている。これらの方法により、特定の遺伝子の塩基配列中におけるメチル化ＤＮＡの存在を検出することで、癌や腫瘍の早期発見及び治療をモニタリングすることが可能になる。
また、メチル化ＤＮＡ及び／又は非メチル化ＤＮＡを高感度で検出する方法が開示されている（特開２００７−７４９５０号公報（特許文献３））。ＰＣＲ増幅工程の後、増幅された二本鎖ＤＮＡ断片をエキソヌクレアーゼで処理することにより、一本鎖ＤＮＡ断片を得、ＤＮＡマイクロアレイにより検出を行う方法が開示されている。
ＭＳＰ法やＣＯＢＲＡ法では、核酸試料（ＤＮＡ試料）が組織又は細胞系からではなく、各種体液より得られたものである場合、含有ＤＮＡ量が微量であるため、対象となるＤＮＡが増幅されない場合が多々ある。
一般的に、ＰＣＲ法自体の感度（ＰＣＲ法により増幅産物を得る確率）と、特異度（目的の遺伝子領域のみを増幅する確率）は、プライマーの塩基配列及びＰＣＲ増幅反応の条件によって決まることが知られている。ＰＣＲの感度を上げるためには、ＰＣＲ増幅工程の条件を緩めることが必要であり、この場合ＰＣＲの特異度は減少する。
ＭＳＰ法では、非メチル化ＤＮＡとメチル化ＤＮＡの各々に特異的な配列を持つプライマーを用いて増幅工程を行う。鋳型ＤＮＡ量が少ない場合や、精製度が悪い場合には、例えば各種体液を検体にした場合には、増幅工程の条件を緩くしなければならず、特異度が減少してしまう。よって、検出された増幅産物が真に非メチル化ＤＮＡ又はメチル化ＤＮＡのみから増幅されたものであるかがわからず、問題である。また、非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーとメチル化ＤＮＡに特異的なプライマーの配列は大きく異なるため（例えば、非メチル化ＤＮＡ用のプライマーはＡ及びＴが多く含まれ、メチル化ＤＮＡ用のプライマーはＣ及びＧが多く含まれることになる）、非メチル化ＤＮＡとメチル化ＤＮＡの増幅感度や特異度が異なってしまう。さらに、ＰＣＲ産物の有無のみで非メチル化及びメチル化の有無を判定するため、増幅工程自体のエラーを確認できない。
ＣＯＢＲＡ法ではメチル化ＤＮＡに対する感度の低さが問題になる。各種体液を検体に用いた場合、ＣＯＢＲＡ法では検出できない可能性がある。
特表２０００−５１１７７６号公報
国際公開第０２／３８８０１Ａ１号パンフレット
特開２００７−７４９５０号公報
Xiong Z, Laird PW. Nucleic Acids Res. 1997 jun 15;25(12): 2532-4
本発明の目的は、各種検体について、目的の遺伝子及び／又は遺伝子座の非メチル化核酸又はメチル化核酸の有無を高感度にて検出するための増幅方法、ならびに非メチル化及び／又はメチル化の検出方法を提供することである。
本願発明者らは、上記課題を鑑み鋭意検討した結果、非メチル化ＤＮＡとメチル化ＤＮＡの両方を増幅し得る非特異的プライマーと、非メチル化ＤＮＡ又はメチル化ＤＮＡのいずれかを増幅し得る特異的プライマーを設計して増幅反応を行うことにより、対象となるＤＮＡを正確かつ高感度に増幅することができ、また、プライマーの割合を変化させることにより、メチル化及び非メチル化核酸を任意の比率にて増幅し、検出する方法を発明した。
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．生物学的試料に含有可能性のある目的遺伝子及び／又は遺伝子座に由来するＣｐＧ含有核酸の増幅方法であって、非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別しない第１プライマーと、非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別する第２プライマーとを少なくとも含むプライマーセットを用いて、該ＣｐＧ含有核酸を増幅する工程を含み、第２プライマーが、第１プライマーと実質的に同じプライマー領域を有する、核酸増幅方法。
２．第１プライマーの配列に、少なくとも１つのＣｐＧ部位が含まれており、かつ、該ＣｐＧ部位のシトシンに対応する位置の塩基が、混合塩基（Ｙ）及び／又は混合塩基（Ｒ）及び／又はイノシン酸（Ｉ）で置換されている、前項１に記載の核酸増幅方法。
３．第２プライマーの配列に、少なくとも２つのＣｐＧ部位が含まれており、かつ、該ＣｐＧ部位がメチル化核酸の配列又は非メチル化核酸の配列に特異的に存在する、前項１又は２に記載の核酸増幅方法。
４．増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行われる、前項１〜３のいずれか１に記載の核酸増幅方法。
５．非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別しないプライマーであって、第１プライマー又は第２プライマーと対になって核酸を増幅する機能を有する第３プライマーを、さらに用いる、前項４に記載の核酸増幅方法。
６．第１プライマーと第２プライマーの濃度比が、１０：１〜１：１である、前項１〜５のいずれか１に記載の核酸増幅方法。
７．前記増幅工程の前に、非メチル化シトシンを修飾する試薬に生物学的試料を接触させ、生物学的試料に存在し得る核酸の非メチル化シトシンをウラシルに転換することにより生物学的試料を処理する工程を含む、前項１〜６のいずれか１に記載の方法。
８．前項１〜７のいずれか１に記載の方法を含む、生物学的試料に含有可能性のある目的遺伝子及び／又は遺伝子座における、メチル化及び／又は非メチル化を検出する方法。
９．制限酵素によって増幅断片を処理することを含み、該制限酵素が増幅断片の配列のうちプライマー領域を除く配列に存在するＣＧ又はＴＧを認識する、前項８に記載の検出方法。
１０．非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別しない第１プライマーと、非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別するプライマーであって、第１プライマーと実質的に同じプライマー領域を有する第２プライマーとを、少なくとも含むプライマーセット。
１１．前項１〜９のいずれか１に記載の方法に用いられる、前項１０に記載のプライマーセット。
１２．前項１１に記載のプライマーセットを含む、試薬キット。
１．生物学的試料に含有可能性のある目的遺伝子及び／又は遺伝子座に由来するＣｐＧ含有核酸の増幅方法であって、非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別しない第１プライマーと、非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別する第２プライマーとを少なくとも含むプライマーセットを用いて、該ＣｐＧ含有核酸を増幅する工程を含み、第２プライマーが、第１プライマーと実質的に同じプライマー領域を有する、核酸増幅方法。
２．第１プライマーの配列に、少なくとも１つのＣｐＧ部位が含まれており、かつ、該ＣｐＧ部位のシトシンに対応する位置の塩基が、混合塩基（Ｙ）及び／又は混合塩基（Ｒ）及び／又はイノシン酸（Ｉ）で置換されている、前項１に記載の核酸増幅方法。
３．第２プライマーの配列に、少なくとも２つのＣｐＧ部位が含まれており、かつ、該ＣｐＧ部位がメチル化核酸の配列又は非メチル化核酸の配列に特異的に存在する、前項１又は２に記載の核酸増幅方法。
４．増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行われる、前項１〜３のいずれか１に記載の核酸増幅方法。
５．非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別しないプライマーであって、第１プライマー又は第２プライマーと対になって核酸を増幅する機能を有する第３プライマーを、さらに用いる、前項４に記載の核酸増幅方法。
６．第１プライマーと第２プライマーの濃度比が、１０：１〜１：１である、前項１〜５のいずれか１に記載の核酸増幅方法。
７．前記増幅工程の前に、非メチル化シトシンを修飾する試薬に生物学的試料を接触させ、生物学的試料に存在し得る核酸の非メチル化シトシンをウラシルに転換することにより生物学的試料を処理する工程を含む、前項１〜６のいずれか１に記載の方法。
８．前項１〜７のいずれか１に記載の方法を含む、生物学的試料に含有可能性のある目的遺伝子及び／又は遺伝子座における、メチル化及び／又は非メチル化を検出する方法。
９．制限酵素によって増幅断片を処理することを含み、該制限酵素が増幅断片の配列のうちプライマー領域を除く配列に存在するＣＧ又はＴＧを認識する、前項８に記載の検出方法。
１０．非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別しない第１プライマーと、非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別するプライマーであって、第１プライマーと実質的に同じプライマー領域を有する第２プライマーとを、少なくとも含むプライマーセット。
１１．前項１〜９のいずれか１に記載の方法に用いられる、前項１０に記載のプライマーセット。
１２．前項１１に記載のプライマーセットを含む、試薬キット。
本発明に係る増幅方法によれば、各種検体を用いて、高精度に非メチル化核酸又はメチル化核酸を増幅することができる。さらに、かかる増幅方法は非メチル化又はメチル化核酸に対して、任意の感度を設定できるという利点を有している。例えば、非メチル化の検出が重要な場合であり、かつ、その非メチル化核酸の比率がメチル化核酸に対して非常に小さい場合でも、本方法によれば、当該非メチル化核酸を正確に増幅することが可能である。
核酸のメチル化異常は、増殖性疾患のみならず、そのほかの疾患においても認められる。本発明は、メチル化核酸又は非メチル化核酸を任意の比率にて増幅し、それらを定量的に、あるいは非定量的に算出して検出することを可能にする方法である。したがって、本方法はメチル化異常を効率的かつ高精度で判定（診断）することができ、疾患の診断、治療、及び予防の判定に利用することができ、非常に社会的インパクトの強いものである。
核酸のメチル化異常は、増殖性疾患のみならず、そのほかの疾患においても認められる。本発明は、メチル化核酸又は非メチル化核酸を任意の比率にて増幅し、それらを定量的に、あるいは非定量的に算出して検出することを可能にする方法である。したがって、本方法はメチル化異常を効率的かつ高精度で判定（診断）することができ、疾患の診断、治療、及び予防の判定に利用することができ、非常に社会的インパクトの強いものである。
ＳＭ サイズマーカー
Ｃ コントロール
ＩＵ 非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマー
ＩＭ メチル化ＤＮＡに特異的なプライマー
Ｕ 非メチル化ＰＣＲ産物
Ｍ メチル化ＰＣＲ産物
Ｃ コントロール
ＩＵ 非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマー
ＩＭ メチル化ＤＮＡに特異的なプライマー
Ｕ 非メチル化ＰＣＲ産物
Ｍ メチル化ＰＣＲ産物
本発明は、生物学的試料に含有可能性のある遺伝子及び／又は遺伝子座に由来するＣｐＧ含有核酸の増幅方法である。また、かかる増幅方法を含む、生物学的試料に含有される遺伝子及び／又は遺伝子座のメチル化及び／又は非メチル化を検出する方法である。
本発明において、「生物学的試料」とは、哺乳類等から採取した検体から調製された核酸を含有する試料を示す（以下、単に「試料」という場合もある）。検体とは、血液、血清、糞便、尿、精液、喀痰、唾液、鼻汁、脳脊髄液、涙等の各種体液、又は、脳、結腸、尿生殖器、肺、腎臓、造血組織、乳房、胸腺、精巣、 卵巣、子宮組織等の各種組織、あるいはこれらに含まれる細胞群が挙げられる。好適には、糞便、喀痰、尿等の非侵襲的に得ることのできる検体が挙げられる。さらに、本発明の生物学的試料は、ＤＮＡの精製度が低く、かつ含有ＤＮＡ量が微量であってもよい。検体から生物学的試料を得る方法としては自体公知の方法を用いればよい。例えば、MagExtractor（東洋紡製）やQIAamp Stool DNA Isolation Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）などの市販品を用いる等、自体公知の方法で検体からＤＮＡを抽出してもよいし、糞便を検体とする場合は、国際公開公報ＷＯ２００６／０６４７３７号に記載の前処理方法を用いれば簡便に試料を得ることができる。
得られた生物学的試料を、生物学的試料に存在する遺伝子の全ての非メチル化シトシンを修飾する試薬により、処理することが好ましい。かかる試薬の例として、重亜硫酸塩が挙げられる。重亜硫酸塩処理によると、非メチル化シトシンはウラシルに転換されるが、メチル化シトシンはウラシルに転換されないので、処理後にシトシンが検出されれば、該シトシンはメチル化していると判断することができる。このような非メチル化シトシンの修飾処理は、ＤＮＡメチル化検出用キットの市販品、例えばDNA methylation Kit, EZ（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ）、MethylEasy（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ）、CpGenome DNA Modification Kit（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）等を用いて行うことができる。
本発明において、「生物学的試料に含有可能性のある遺伝子及び／又は遺伝子座」とは、生物学的試料に含まれる可能性のある各種疾患関連遺伝子や、微生物関連遺伝子を示す。例えば、遺伝病等の原因遺伝子、癌組織由来遺伝子、常在菌由来の遺伝子、試料を採取した宿主に感染している微生物（細菌、ウイルスなど）に由来する遺伝子等が挙げられる。具体的には、ＥＰＭ２ＡＩＰ１遺伝子（Genbank Accession No. 9852）、ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子（Genbank Accession No. 9770）、ＳＦＲＰ２遺伝子（Genbank Accession No. 6423）、Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子（Genebank Accession No. 56475）、ＡＰＣ遺伝子（Genbank Accession No. 324）が挙げられる。
本発明において「ＣｐＧ含有核酸」とは、上記遺伝子や遺伝子座から由来する核酸である。ＣｐＧ含有核酸は、完全な遺伝子の配列からなる核酸であってもよいが、増幅対象となる領域を含む核酸であれば、ＤＮＡ断片や、ＲＮＡ断片などの断片であってもよい。ＣｐＧを含有する領域は、例えば、遺伝子のプロモーター領域や、５'領域が挙げられる。具体的にはＥＰＭ２ＡＩＰ遺伝子のプロモーター領域（ｈＭＬＨ１−５'領域）、ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のプロモーター領域、ＳＦＲＰ２遺伝子のプロモーター領域、Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子のプロモーター領域、ＡＰＣ遺伝子のプロモーター領域が挙げられる。ＣｐＧ部位におけるシトシンは、メチル化修飾を受けている場合と受けていない場合がある。本発明では、該シトシンがメチル化修飾を受けている核酸を「メチル化核酸」、該シトシンがメチル化修飾を受けていない核酸を「非メチル化核酸」という。
本発明において「ＣｐＧ含有核酸」とは、上記遺伝子や遺伝子座から由来する核酸である。ＣｐＧ含有核酸は、完全な遺伝子の配列からなる核酸であってもよいが、増幅対象となる領域を含む核酸であれば、ＤＮＡ断片や、ＲＮＡ断片などの断片であってもよい。ＣｐＧを含有する領域は、例えば、遺伝子のプロモーター領域や、５'領域が挙げられる。具体的にはＥＰＭ２ＡＩＰ遺伝子のプロモーター領域（ｈＭＬＨ１−５'領域）、ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のプロモーター領域、ＳＦＲＰ２遺伝子のプロモーター領域、Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子のプロモーター領域、ＡＰＣ遺伝子のプロモーター領域が挙げられる。ＣｐＧ部位におけるシトシンは、メチル化修飾を受けている場合と受けていない場合がある。本発明では、該シトシンがメチル化修飾を受けている核酸を「メチル化核酸」、該シトシンがメチル化修飾を受けていない核酸を「非メチル化核酸」という。
本発明の方法では、非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別しない第１プライマーと、非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別する第２プライマーとを少なくとも含むプライマーセットを用いて、増幅工程を行うことを特徴とする。さらに、第２プライマーは、第１プライマーと実質的に同じプライマー領域を有することを特徴とする。ここで、プライマー領域とは、目的遺伝子及び／又は遺伝子座のＣｐＧ含有核酸の塩基配列の一部であり、プライマーを設計するために選択された領域である。プライマー領域の長さ、すなわちプライマーの大きさは、用いる増幅反応の種類に応じるが、例えばＰＣＲ法を用いるならば、５〜４０ｂｐ、好ましくは１０〜３０ｂｐが好ましい。
本方法にて使用するプライマーは、鋳型ＣｐＧ含有核酸のプライマー領域の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、その３’末端よりＤＮＡ鎖の伸長が可能であるオリゴヌクレオチドからなる。「実質的に相補的」とは、プライマーの塩基配列が、プライマー領域の塩基配列に完全に相補的でなくてもよく、増幅反応の条件下で、鋳型核酸にハイブリダイズするのに十分相補的であればよい。
第１プライマーにおける「非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別しない」とは、第１プライマーが、増幅反応の条件下で、非特異的に、非メチル化核酸にでもメチル化核酸にでもハイブリダイズし得、その後の増幅反応が行われ得ることを意味する。本明細書では、かかる機能を有するプライマーを「非特異的プライマー」と称する。第１プライマーの配列はＣｐＧ部位を含まなくてもよいし、ＣｐＧ部位を含んでもよい。ＣｐＧ部位を含む場合には、該ＣｐＧ部位のシトシンに相補的な塩基が混合塩基（Ｙ）及び／又は混合塩基（Ｒ）及び／又はイノシン酸（Ｉ）で置換されていることが好ましい。なお、第１プライマーの配列には、好ましくは、少なくとも１つのＣｐＧ部位が含まれていることが好ましく、かつ、該ＣｐＧ部位のシトシンに相補的な塩基が混合塩基（Ｙ）及び／又は混合塩基（Ｒ）及び／又はイノシン酸（Ｉ）で置換されていることが好ましい。
第２プライマーにおける「非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別する」とは、第２プライマーが、増幅反応の条件下で、非メチル化核酸もしくはメチル化核酸に特異的にハイブリダイズし得るものであり、したがって、他方には実質的にハイブリダイズしないことを意味する。本明細書では、かかる機能を有するプライマーを「特異的プライマー」と称する。
さらに第２プライマーは、第１プライマーと実質的に同じプライマー領域を有する。「実質的に同じ」とは、完全に同一であることを意味するわけではない。第２プライマーの配列は、第１プライマーの配列の３’末端及び／又は５’末端に、それぞれ１〜８個、好ましくは１〜５個の塩基の付加及び／又は欠失があってもよい。これはプライマー領域の伸張及び／又は短縮があってもよいことを意味する。もちろん、付加及び欠失が全くなくてもよい。さらに好ましくは、両末端の付加及び／又は欠失の和は、５個以下である。
また、第２プライマーの配列には、第１プライマーの配列と比較すると、塩基の相違が１〜８個、好ましくは３〜６個存在する。かかる相違には、上記３’もしくは５’末端における塩基の付加及び／又は欠失によるものが含まれる。例えば、第１プライマーにＣｐＧ部位が含まれない場合は、塩基を付加することにより、第２プライマーにＣｐＧ部位を含ませることが可能である。また、例えば、第１プライマーの混合塩基（Ｙ）及び／又は混合塩基（Ｒ）及び／又はイノシン酸（Ｉ）が、第２プライマーではシトシン（Ｃ）又はチミン（Ｔ）に置換されている場合もある。このように、第１プライマーと第２プライマーのプライマー領域の重複部分に、相違する塩基が存在する場合もある。これらは、第１プライマーが非特異的プライマーであるのに対して、第２プライマーが特異的プライマーであるために生じる、配列の相違である。さらに好ましくは、第２プライマーの配列には、少なくとも２つのＣｐＧ部位が含まれており、かつ、該ＣｐＧ部位はメチル化核酸の配列又は非メチル化核酸の配列に特異的に存在するものである。
さらに第２プライマーは、第１プライマーと実質的に同じプライマー領域を有する。「実質的に同じ」とは、完全に同一であることを意味するわけではない。第２プライマーの配列は、第１プライマーの配列の３’末端及び／又は５’末端に、それぞれ１〜８個、好ましくは１〜５個の塩基の付加及び／又は欠失があってもよい。これはプライマー領域の伸張及び／又は短縮があってもよいことを意味する。もちろん、付加及び欠失が全くなくてもよい。さらに好ましくは、両末端の付加及び／又は欠失の和は、５個以下である。
また、第２プライマーの配列には、第１プライマーの配列と比較すると、塩基の相違が１〜８個、好ましくは３〜６個存在する。かかる相違には、上記３’もしくは５’末端における塩基の付加及び／又は欠失によるものが含まれる。例えば、第１プライマーにＣｐＧ部位が含まれない場合は、塩基を付加することにより、第２プライマーにＣｐＧ部位を含ませることが可能である。また、例えば、第１プライマーの混合塩基（Ｙ）及び／又は混合塩基（Ｒ）及び／又はイノシン酸（Ｉ）が、第２プライマーではシトシン（Ｃ）又はチミン（Ｔ）に置換されている場合もある。このように、第１プライマーと第２プライマーのプライマー領域の重複部分に、相違する塩基が存在する場合もある。これらは、第１プライマーが非特異的プライマーであるのに対して、第２プライマーが特異的プライマーであるために生じる、配列の相違である。さらに好ましくは、第２プライマーの配列には、少なくとも２つのＣｐＧ部位が含まれており、かつ、該ＣｐＧ部位はメチル化核酸の配列又は非メチル化核酸の配列に特異的に存在するものである。
増幅反応は、自体公知の方法を用いることができる。具体的には、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法、Science, 230:1350-1354,1985）やＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence Based Amplification 法、Nature, 350,91-92,1991）及びＬＡＭＰ法（特開2001-242169号公報）等が挙げられ、好ましくはＰＣＲ法を適用することができる。また、プライマーの設計は、増幅反応の種類に応じて適宜変更する必要があり、第１プライマー及び第２プライマーに加えて、他のプライマーを用いることも可能である。
例えば、ＰＣＲ法を用いる場合には、第１プライマー及び第２プライマーに加えて、さらに第３プライマーを用いることができる。第３プライマーは、非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別しないものであり、第１プライマーもしくは第２プライマーと対になって、増幅反応を行うものである。ＰＣＲ反応の場合、第１プライマー若しくは第２プライマーと、第３プライマーによって生成される増幅産物は、約１００ｂｐ〜３００ｂｐが好ましく、さらに約１００ｂｐ〜２００ｂｐが好ましいが、以下の検出方法において、解析可能な産物であれば、これらに限定されないことはいうまでもない。また、第１プライマーと第２プライマーのプライマー領域が実質的に同じであることから、第１プライマーと第３プライマーによる増幅断片と、第２プライマーと第３プライマーによる増幅断片とは、実質的に同じ大きさの断片である。すなわち、これらの増幅断片の大きさの差は、理論上０〜１６ｂｐ、好ましくは０〜１０ｂｐと考えられる。
ここで、増幅反応にＰＣＲ法を用いた場合を例として、本発明の方法に用いるプライマーについて具体的に説明する。なお、各プライマーの塩基配列は、実施例を参照されたい。
ＥＰＭ２ＡＩＰ遺伝子のプロモーター領域（ｈＭＬＨ１−５’領域）について、メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてEPM2AIP-F（配列番号１）、第２プライマーとしてEPM2AIP-IM（配列番号４）、第３プライマーとしてEPM2AIP-R（配列番号２）を用いることができる。また同じｈＭＬＨ１−５’領域について、非メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてEPM2AIP-F（配列番号１）、第２プライマーとしてEPM2AIP-IU（配列番号３）、第３プライマーとしてEPM2AIP-R（配列番号２）を用いることができる。
ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のプロモーター領域について、メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてRASSF2A-R（配列番号６）、第２プライマーとしてRASSF2A-IM（配列番号８）、第３プライマーとしてRASSF2A-F（配列番号５）を用いることができる。また同じＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のプロモーター領域について、非メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてRASSF2A-R（配列番号６）、第２プライマーとしてRASSF2A-IU（配列番号７）、第３プライマーとしてRASSF2A-F（配列番号５）を用いることができる。
ＳＦＲＰ２遺伝子のプロモーター領域について、メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてSFRP2-F（配列番号９）、第２プライマーとしてSFRP2-IM（配列番号１１）、第３プライマーとしてSFRP2-R（配列番号１０）を用いることができる。
Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子のプロモーター領域について、メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてRep-R（配列番号１３）、第２プライマーとしてRep-IM（配列番号１４）、第３プライマーとしてRep-F（配列番号１２）を用いることができる。
ＡＰＣ遺伝子のプロモーター領域について、メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてAPC-R（配列番号１６）、第２プライマーとしてAPC-IM（配列番号１８）、第３プライマーとしてAPC-F2（配列番号１７）を用いることができる。
ＥＰＭ２ＡＩＰ遺伝子のプロモーター領域（ｈＭＬＨ１−５’領域）について、メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてEPM2AIP-F（配列番号１）、第２プライマーとしてEPM2AIP-IM（配列番号４）、第３プライマーとしてEPM2AIP-R（配列番号２）を用いることができる。また同じｈＭＬＨ１−５’領域について、非メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてEPM2AIP-F（配列番号１）、第２プライマーとしてEPM2AIP-IU（配列番号３）、第３プライマーとしてEPM2AIP-R（配列番号２）を用いることができる。
ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のプロモーター領域について、メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてRASSF2A-R（配列番号６）、第２プライマーとしてRASSF2A-IM（配列番号８）、第３プライマーとしてRASSF2A-F（配列番号５）を用いることができる。また同じＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のプロモーター領域について、非メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてRASSF2A-R（配列番号６）、第２プライマーとしてRASSF2A-IU（配列番号７）、第３プライマーとしてRASSF2A-F（配列番号５）を用いることができる。
ＳＦＲＰ２遺伝子のプロモーター領域について、メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてSFRP2-F（配列番号９）、第２プライマーとしてSFRP2-IM（配列番号１１）、第３プライマーとしてSFRP2-R（配列番号１０）を用いることができる。
Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子のプロモーター領域について、メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてRep-R（配列番号１３）、第２プライマーとしてRep-IM（配列番号１４）、第３プライマーとしてRep-F（配列番号１２）を用いることができる。
ＡＰＣ遺伝子のプロモーター領域について、メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてAPC-R（配列番号１６）、第２プライマーとしてAPC-IM（配列番号１８）、第３プライマーとしてAPC-F2（配列番号１７）を用いることができる。
本発明の方法に使用されるプライマーは、従来型のホスホトリエステル法及びホスホジエステル法、又はそれらが自動化された実施態様などの、任意の好適な方法を用いて調製することができる。このような自動化された実施態様の１つでは、出発原料としてジエチルホスホルアミダイトを使用されるが、この化合物は、Beaucageらの報告（Tetrahedron Letters,22:1859-1862,1981）に従って合成可能である。改変固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する方法が、米国特許第4,458,066号に記載されている。
本発明のプライマーには、その配列の末端に、検出のための適当な標識、例えば、蛍光色素、酵素、タンパク、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されたものも含むものとする。本発明において用いられる蛍光色素としては、一般に塩基を標識して、核酸の定量、検出等に用いられるものが好適に使用でき、例えば、ＨＥＸ（4,7,2',4',5',7'-hexachloro-6-carboxyfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、ＮＥＤ（アプライドバイオシステムズ社商品名、黄色蛍光色素）、あるいは、６−ＦＡＭ（アプライドバイオシステムズ社商品名、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ））、ＶＩＣ（アプライドバイオシステムズ社商品名、緑色蛍光色素）、ＰＥＴ（アプライドバイオシステムズ社商品名、赤色蛍光色素）等を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素で塩基を標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用できる（Nature Biotechnology, 14, p303-308 (1996)を参照）。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製 オリゴヌクレオチドＥＣＬ 3'-オリゴラベリングシステム等）。
蛍光物質は非特異的プライマーに付加すればよく、増幅反応にＰＣＲ法を用いる場合は、第１プライマーもしくは第３プライマーのいずれかに蛍光色素を付加することが好ましい。
蛍光物質は非特異的プライマーに付加すればよく、増幅反応にＰＣＲ法を用いる場合は、第１プライマーもしくは第３プライマーのいずれかに蛍光色素を付加することが好ましい。
本発明の方法において、ＰＣＲ法により増幅反応を行う場合の蛍光色素でラベルされたプライマーの具体例を説明する。プライマーの配列については実施例を参照されたい。
ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のプロモーター領域について、メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてRASSF2A-R（配列番号６）、第２プライマーとしてRASSF2A-IM（配列番号８）、第３プライマーとしてRASSF2A-F（配列番号５）を用い、第３プライマーの5'末端に６−ＦＡＭを付加したものを用いることができる。
ＳＦＲＰ２遺伝子のプロモーター領域について、メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてSFRP2-F（配列番号９）、第２プライマーとしてSFRP2-IM（配列番号１１）、第３プライマーとしてSFRP2-R（配列番号１０）を用い、第３プライマーの5'末端にＮＥＤを付加したものを用いることができる。
Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子のプロモーター領域について、メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてRep-R（配列番号１３）、第２プライマーとしてRep-IM（配列番号１４）、第３プライマーとしてRep-F（配列番号１２）を用い、第１プライマーの5'末端にＶＩＣを付加したものを用いることができる。
ＡＰＣ遺伝子のプロモーター領域について、メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてAPC-R（配列番号１６）、第２プライマーとしてAPC-IM（配列番号１８）、第３プライマーとしてAPC-F2（配列番号１７）を用い、第３プライマーの5'末端にＰＥＴを付加したものを用いることができる。
ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のプロモーター領域について、メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてRASSF2A-R（配列番号６）、第２プライマーとしてRASSF2A-IM（配列番号８）、第３プライマーとしてRASSF2A-F（配列番号５）を用い、第３プライマーの5'末端に６−ＦＡＭを付加したものを用いることができる。
ＳＦＲＰ２遺伝子のプロモーター領域について、メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてSFRP2-F（配列番号９）、第２プライマーとしてSFRP2-IM（配列番号１１）、第３プライマーとしてSFRP2-R（配列番号１０）を用い、第３プライマーの5'末端にＮＥＤを付加したものを用いることができる。
Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子のプロモーター領域について、メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてRep-R（配列番号１３）、第２プライマーとしてRep-IM（配列番号１４）、第３プライマーとしてRep-F（配列番号１２）を用い、第１プライマーの5'末端にＶＩＣを付加したものを用いることができる。
ＡＰＣ遺伝子のプロモーター領域について、メチル化核酸の増幅を目的とする場合、第１プライマーとしてAPC-R（配列番号１６）、第２プライマーとしてAPC-IM（配列番号１８）、第３プライマーとしてAPC-F2（配列番号１７）を用い、第３プライマーの5'末端にＰＥＴを付加したものを用いることができる。
本方法では、第１プライマーと第２プライマーの濃度の割合を変化させることにより、所望の割合及び感度で、増幅産物を得ることが可能である。
好ましくは、第１プライマーと第２プライマーの濃度比は、１０：１〜１：１であり、より好ましくは５：１〜１：１、さらに好ましくは３：１〜１：１である。第２プライマーの濃度を増加させると、第２プライマーが特異的に増幅し得る核酸由来の増幅産物の割合が増加する。かかる第２プライマーの効果は、第１プライマーと第２プライマーの濃度比が２：１の場合に、最大に発揮されると考えられる。
好ましくは、第１プライマーと第２プライマーの濃度比は、１０：１〜１：１であり、より好ましくは５：１〜１：１、さらに好ましくは３：１〜１：１である。第２プライマーの濃度を増加させると、第２プライマーが特異的に増幅し得る核酸由来の増幅産物の割合が増加する。かかる第２プライマーの効果は、第１プライマーと第２プライマーの濃度比が２：１の場合に、最大に発揮されると考えられる。
本発明の検出方法において、目的遺伝子及び／又は遺伝子座におけるメチル化核酸又は非メチル化核酸の検出を行うとは、メチル化核酸及び／又は非メチル化核酸の有無の検出、あるいは、メチル化核酸と非メチル化核酸の割合を検出することを意味する。
本発明の検出方法は、上記の増幅方法による増幅産物を（１）適切な制限酵素で処理し、電気泳動やシーケンサなどにより断片の大きさを確認して非メチル化ＤＮＡ及び／又はメチル化ＤＮＡの有無及び／又は量を判定する工程、又は（２）増幅産物のプライマー領域を除く領域の塩基配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレチドを搭載したマイクロアレイにて、非メチル化ＤＮＡ及び／又はメチル化ＤＮＡの有無及び／又は量を判定する工程を含む。かかる検出方法によれば、増幅産物のプライマー領域を除く領域について、非メチル化及び／又はメチル化の検出が可能である。
制限酵素で処理する工程を含む検出方法において用いられる制限酵素は、増幅断片の配列のプライマー領域を除く配列中に存在するＣＧ又はＴＧを認識するものであることが好ましい。遺伝子の種類、増幅産物の配列に応じて制限酵素を選択すればよい。制限酵素による処理時間等の処理条件については、適宜調整可能である。制限酵素による処理時間は、好ましくは５分から１２時間、より好ましくは５分から１５分である。
ＥＰＭ２ＡＩＰ遺伝子のプロモーター領域（ｈＭＬＨ１−５’領域）について、EPM2AIP-F（配列番号１）、EPM2AIP-R（配列番号２）、EPM2AIP-IM（配列番号４）若しくはEPM2AIP-IU（配列番号３）の３つをプライマーセットとして用いて増幅工程を行った場合、制限酵素ＨｈａＩを用いることができる。
ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のプロモーター領域について、RASSF2A-R（配列番号６）、RASSF2A-F（配列番号５）、RASSF2A-IM（配列番号８）若しくはRASSF2A-IU（配列番号７）の３つをプライマーセットとして用いて増幅工程を行った場合、制限酵素ＨｈａＩを用いることができる。
ＳＦＲＰ２遺伝子のプロモーター領域について、SFRP2-F（配列番号９）、SFRP2-IM（配列番号１１）、SFRP2-R（配列番号１０）をプライマーセットとして増幅工程を行った場合、制限酵素ＢｓｓＨＩＩを用いることができる。
Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子のプロモーター領域について、Rep-R（配列番号１３）、Rep-IM（配列番号１４）、Rep-F（配列番号１２）をプライマーセットとして用いて増幅工程を行った場合、ならびに、ＡＰＣ遺伝子のプロモーター領域について、APC-R（配列番号１６）、APC-IM（配列番号１８）、APC-F2（配列番号１７）をプライマーセットとして増幅工程を行った場合、制限酵素ＴａｑＩを用いることができる。
また、複数の遺伝子の増幅産物を同時に制限酵素処理することもできる。ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子およびＳＦＲＰ２遺伝子の増幅産物を同時に制限酵素処理する場合は、制限酵素ＨｈａＩを用いることができる。Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子およびＡＰＣ遺伝子の増幅産物を同時に制限酵素処理する場合は、制限酵素ＴａｑＩを用いることができる。
ＥＰＭ２ＡＩＰ遺伝子のプロモーター領域（ｈＭＬＨ１−５’領域）について、EPM2AIP-F（配列番号１）、EPM2AIP-R（配列番号２）、EPM2AIP-IM（配列番号４）若しくはEPM2AIP-IU（配列番号３）の３つをプライマーセットとして用いて増幅工程を行った場合、制限酵素ＨｈａＩを用いることができる。
ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のプロモーター領域について、RASSF2A-R（配列番号６）、RASSF2A-F（配列番号５）、RASSF2A-IM（配列番号８）若しくはRASSF2A-IU（配列番号７）の３つをプライマーセットとして用いて増幅工程を行った場合、制限酵素ＨｈａＩを用いることができる。
ＳＦＲＰ２遺伝子のプロモーター領域について、SFRP2-F（配列番号９）、SFRP2-IM（配列番号１１）、SFRP2-R（配列番号１０）をプライマーセットとして増幅工程を行った場合、制限酵素ＢｓｓＨＩＩを用いることができる。
Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子のプロモーター領域について、Rep-R（配列番号１３）、Rep-IM（配列番号１４）、Rep-F（配列番号１２）をプライマーセットとして用いて増幅工程を行った場合、ならびに、ＡＰＣ遺伝子のプロモーター領域について、APC-R（配列番号１６）、APC-IM（配列番号１８）、APC-F2（配列番号１７）をプライマーセットとして増幅工程を行った場合、制限酵素ＴａｑＩを用いることができる。
また、複数の遺伝子の増幅産物を同時に制限酵素処理することもできる。ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子およびＳＦＲＰ２遺伝子の増幅産物を同時に制限酵素処理する場合は、制限酵素ＨｈａＩを用いることができる。Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子およびＡＰＣ遺伝子の増幅産物を同時に制限酵素処理する場合は、制限酵素ＴａｑＩを用いることができる。
制限酵素で処理された増幅断片を電気泳動により大きさを確認することにより、非メチル化ＤＮＡ及び／又はメチル化ＤＮＡの有無及び／又は量を判定することができる。電気泳動は自体公知の方法により行うことができる。電気泳動の代わりにシーケンサを用いて、断片の大きさを確認することもできる。シーケンサを用いる場合、増幅反応に用いるプライマーは蛍光色素等により標識されているものを使用することが好ましい。
シーケンサを用いた検出方法では、複数種の遺伝子領域に対して一度に解析を行うことが可能であり、有用である。例えば４種の蛍光色素が区別可能なシーケンサを用いる場合には、各々の蛍光色素を、４種の遺伝子領域に対応したプライマーに付加して増幅反応を行えばよい。また、４種の遺伝子領域由来の増幅産物の塩基長が異なるように、プライマーの設計をする必要がある。増幅産物の塩基長の相違は、少なくとも２ｂｐ、好ましくは１０ｂｐ以上である。反応後の増幅産物は、同時にシーケンサにアプライして解析することが可能である。
シーケンサを用いた検出方法のさらなる利点は、制限酵素反応時間と試料の量を大幅に短縮、削減することが可能である点である。
例えば、シーケンサを用いずに判定を行う場合、制限酵素による増幅物処理時間は、制限酵素の濃度によって変わるが、基本的には８時間以上要することとなる。また、シーケンサを用いない電気泳動による判定では、増幅対象となる各遺伝子ごとに３０分以上の泳動時間を必要とする。例えば、４つの遺伝子をマーカーとして用いて判定を行う場合には、各遺伝子につき電気泳動を行う必要があるため、必要な時間は１２０分（４×３０分）以上である。また電気泳動には、ＰＣＲで増幅反応を行った場合、少なくとも５μＬの増幅反応液を必要とする。
一方、シーケンサを用いて判定を行う場合、シーケンサによる泳動には、ＰＣＲで増幅反応を行った場合の必要な増幅反応液の量は微量であり、例えば０．０２μＬのＰＣＲ増幅反応液で十分である。必要な増幅反応液の量が電気泳動と比較して微量であるため、同等の制限酵素量を用いた場合には、制限酵素処理に有する時間は５分から１０分で十分となる。また、複数の遺伝子をマーカーとした場合でも、一度にシーケンサに泳動することが可能である。よって、１つの試料を４つの遺伝子について判定するのに要する時間は、３０分（１×３０分）である。
シーケンサを用いた検出方法では、複数種の遺伝子領域に対して一度に解析を行うことが可能であり、有用である。例えば４種の蛍光色素が区別可能なシーケンサを用いる場合には、各々の蛍光色素を、４種の遺伝子領域に対応したプライマーに付加して増幅反応を行えばよい。また、４種の遺伝子領域由来の増幅産物の塩基長が異なるように、プライマーの設計をする必要がある。増幅産物の塩基長の相違は、少なくとも２ｂｐ、好ましくは１０ｂｐ以上である。反応後の増幅産物は、同時にシーケンサにアプライして解析することが可能である。
シーケンサを用いた検出方法のさらなる利点は、制限酵素反応時間と試料の量を大幅に短縮、削減することが可能である点である。
例えば、シーケンサを用いずに判定を行う場合、制限酵素による増幅物処理時間は、制限酵素の濃度によって変わるが、基本的には８時間以上要することとなる。また、シーケンサを用いない電気泳動による判定では、増幅対象となる各遺伝子ごとに３０分以上の泳動時間を必要とする。例えば、４つの遺伝子をマーカーとして用いて判定を行う場合には、各遺伝子につき電気泳動を行う必要があるため、必要な時間は１２０分（４×３０分）以上である。また電気泳動には、ＰＣＲで増幅反応を行った場合、少なくとも５μＬの増幅反応液を必要とする。
一方、シーケンサを用いて判定を行う場合、シーケンサによる泳動には、ＰＣＲで増幅反応を行った場合の必要な増幅反応液の量は微量であり、例えば０．０２μＬのＰＣＲ増幅反応液で十分である。必要な増幅反応液の量が電気泳動と比較して微量であるため、同等の制限酵素量を用いた場合には、制限酵素処理に有する時間は５分から１０分で十分となる。また、複数の遺伝子をマーカーとした場合でも、一度にシーケンサに泳動することが可能である。よって、１つの試料を４つの遺伝子について判定するのに要する時間は、３０分（１×３０分）である。
マイクロアレイを用いて増幅産物を捕捉する方法においては、マイクロアレイに搭載されたオリゴヌクレオチドに、検出物質、例えば蛍光物質が付加されていることが好ましい。
上記増幅方法によれば、増幅工程の成功率を上昇させるために、増幅工程の条件を緩めた場合、各プライマーの、当該プライマーの配列に相補的なＤＮＡに対する特異度が減少する可能性がある。しかし、上記（１）や（２）の工程により非メチル化及び／又はメチル化ＤＮＡを認識するため、特異度減少の問題は解消される。また、本発明の検出方法では、増幅産物の有無のみによって非メチル化又はメチル化ＤＮＡの有無を判定するわけではないので、増幅工程のエラーの確認が可能となる。よって、従来例よりも確実に非メチル化及び／又はメチル化ＤＮＡの有無及び／又は量を判定することが可能となる。
また、本方法では、検体として、組織、血液だけでなく、各種体液や排泄物も使用することができる。排泄物などの非侵襲的に得ることが可能な検体は、特定の場所で採取を行う必要がないため、これらを利用可能な本方法は、各種の癌の早期診断などについて、非常に汎用に使用することができ有用である。
また、本方法では、検体として、組織、血液だけでなく、各種体液や排泄物も使用することができる。排泄物などの非侵襲的に得ることが可能な検体は、特定の場所で採取を行う必要がないため、これらを利用可能な本方法は、各種の癌の早期診断などについて、非常に汎用に使用することができ有用である。
したがって、本発明に係る検出方法により、所定の遺伝子及び／又は遺伝子座、例えば癌抑制遺伝子のプロモーター領域についてメチル化の有無を検出することによって、簡便かつ高精度に癌等の細胞増殖性疾患の判定（診断）を行うことができる。遺伝子のプロモーター領域においてＤＮＡのメチル化が起こっている場合、当該遺伝子の発現が抑制される。この遺伝子が癌抑制遺伝子である場合、生体において癌抑制遺伝子の発現が抑制されるため、癌が発生し進行してしまうことになる。
本方法を用いて、前記生物学的試料のメチル化核酸及び非メチル化核酸を検出することにより、細胞増殖性疾患及び／又は炎症性疾患を検査することが可能である。前記細胞増殖性疾患及び／又は炎症性疾患は、低度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、グリア芽細胞腫、髄芽細胞 腫、咽喉癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、膵炎、小腸癌、クローン病、結腸癌、直腸癌、潰瘍性大腸炎、肺癌、腎臓癌、白血病、乳癌、前立腺癌、子宮内膜癌及び神経芽細胞腫よりなる群から選択することができる。
さらに本発明は、上記の増幅方法及び検出方法に用いられるプライマーセットにも及ぶ。当該プライマーセットは、第１プライマー及び第２プライマーを少なくとも含み、さらには第３プライマーを含むセットである。さらに、本発明の増幅反応に必要なプライマーを含んでもよい。また、これらのプライマーは蛍光色素でラベルされていてもよい。
本発明は、上記プライマーセットを含む試薬キットにも及ぶ。試薬キットは、その他必要な試薬、例えば、酵素、緩衝液等を含むことができる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）ＤＮＡ試料の調製
大腸正常粘膜からＤＮＡを抽出した。大腸正常粘膜から抽出されたＤＮＡでは、各遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧ領域は、基本的には非メチル化である。よって、大腸正常粘膜から抽出されたＤＮＡより、非メチル化であることを既に確認済みのＤＮＡを選別し、「非メチル化ＤＮＡ」とした。「メチル化ＤＮＡ」は、この「非メチル化ＤＮＡ」をＳｓｓＩメチルトランスフェラーゼにて処理を行うことによって得た。
各ＤＮＡについて重亜硫酸塩（bisulfite）処理を行った。処理後、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを種々の比率で混合して混合鋳型の試料を作製した。混合鋳型試料は、メチル化ＤＮＡの比率（％）が１００、５０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０となるように調節して作製した。
大腸正常粘膜からＤＮＡを抽出した。大腸正常粘膜から抽出されたＤＮＡでは、各遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧ領域は、基本的には非メチル化である。よって、大腸正常粘膜から抽出されたＤＮＡより、非メチル化であることを既に確認済みのＤＮＡを選別し、「非メチル化ＤＮＡ」とした。「メチル化ＤＮＡ」は、この「非メチル化ＤＮＡ」をＳｓｓＩメチルトランスフェラーゼにて処理を行うことによって得た。
各ＤＮＡについて重亜硫酸塩（bisulfite）処理を行った。処理後、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを種々の比率で混合して混合鋳型の試料を作製した。混合鋳型試料は、メチル化ＤＮＡの比率（％）が１００、５０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０となるように調節して作製した。
（実施例２）
本発明の増幅方法により、試料ＤＮＡの増幅を行い、増幅産物を電気泳動することにより効果について検討を行った。以下、電気泳動による本発明の検出方法をＨｉ−ＳＡ法（Ｈｉｇｈ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｓｓａｙ）とも呼ぶ。
まず、実施例１にて作製した鋳型試料のうち、メチル化ＤＮＡの比率が５０％の試料（非メチル化ＤＮＡ：メチル化ＤＮＡ＝１：１）を用い、Ｈｉ−ＳＡ法における「非特異的プライマー」の効果について、ＥＰＭ２ＡＩＰ遺伝子のプロモーター領域（ｈＭＬＨ１−５’領域）をモデルに、検討を行った。
本発明の増幅方法により、試料ＤＮＡの増幅を行い、増幅産物を電気泳動することにより効果について検討を行った。以下、電気泳動による本発明の検出方法をＨｉ−ＳＡ法（Ｈｉｇｈ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｓｓａｙ）とも呼ぶ。
まず、実施例１にて作製した鋳型試料のうち、メチル化ＤＮＡの比率が５０％の試料（非メチル化ＤＮＡ：メチル化ＤＮＡ＝１：１）を用い、Ｈｉ−ＳＡ法における「非特異的プライマー」の効果について、ＥＰＭ２ＡＩＰ遺伝子のプロモーター領域（ｈＭＬＨ１−５’領域）をモデルに、検討を行った。
ＥＰＭ２ＡＩＰ遺伝子のプロモーター領域（ｈＭＬＨ１−５’領域）を増幅しうるＨｉ−ＳＡ法のプライマーは以下のとおりである。
EPM2AIP-F: 5'-YGGGTAAGTYGTTTTGAYGTAGA （配列番号１）
EPM2AIP-R: 5'-TATACCTAATCTATCRCCRCCTCA （配列番号２）
EPM2AIP-IU: 5'-CGGGTAAGTCGTTTTGACGTAGA （配列番号３）
EPM2AIP-IM: 5'-TGGGTAAGTTGTTTTGATGTAGA （配列番号４）
EPM2AIP-F（配列番号１）とEPM2AIP-R（配列番号２）は非特異的プライマーであり、非メチル化シトシンの存在するＤＮＡにもメチル化シトシンの存在するＤＮＡにもハイブリダイズするように設計されている。この２つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、１５０ｂｐの増幅産物が得られる。
EPM2AIP-IU（配列番号３）は、非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーであり、EPM2AIP-IM（配列番号４）は、メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーである（以下、非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーを「ＩＵ」、メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーを「ＩＭ」と表記することもある）。
EPM2AIP-F: 5'-YGGGTAAGTYGTTTTGAYGTAGA （配列番号１）
EPM2AIP-R: 5'-TATACCTAATCTATCRCCRCCTCA （配列番号２）
EPM2AIP-IU: 5'-CGGGTAAGTCGTTTTGACGTAGA （配列番号３）
EPM2AIP-IM: 5'-TGGGTAAGTTGTTTTGATGTAGA （配列番号４）
EPM2AIP-F（配列番号１）とEPM2AIP-R（配列番号２）は非特異的プライマーであり、非メチル化シトシンの存在するＤＮＡにもメチル化シトシンの存在するＤＮＡにもハイブリダイズするように設計されている。この２つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、１５０ｂｐの増幅産物が得られる。
EPM2AIP-IU（配列番号３）は、非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーであり、EPM2AIP-IM（配列番号４）は、メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーである（以下、非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーを「ＩＵ」、メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーを「ＩＭ」と表記することもある）。
ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（ＱＩＡＧＥＮ社）１５μＬ、試料ＤＮＡ溶液２μＬ、EPM2AIP-F（配列番号１）のプライマー及びEPM2AIP-R（配列番号２）のプライマーを各０．４μＭ（最終濃度）、EPM2AIP-IU（配列番号３）のプライマー又はEPM2AIP-IM（配列番号４）のプライマーを、濃度を変化させて添加し、合計３０μＬのＰＣＲ反応溶液を調製し、増幅反応を行った。EPM2AIP-IU（配列番号３）のプライマー又はEPM2AIP-IM（配列番号４）のプライマーは、最終濃度（μＭ）が下記表１に示す数値となるように変化させて添加した。尚、表中「Ｃ」と表記した系はＩＵ及びＩＭのいずれも加えていない系である。
ＰＣＲ増幅反応は、９５℃を１５分の後、９５℃を２０秒、５９℃を４０秒、７２℃を２０秒を１サイクルとして合計３サイクル、次に９５℃を２０秒、５７℃を３０秒、７２℃を２０秒を１サイクルとして合計７サイクル、その後９５℃を２０秒、５５℃を３０秒、７２℃を２０秒を１サイクルとして合計３５サイクル行い、最後に７２℃を７分間で行った。
ＰＣＲ増幅工程の後、制限酵素ＨｈａＩを用い、３７℃、１２時間処理を行い、２．５％アガロースゲルにて電気泳動を行った。
ＰＣＲ増幅工程の後、制限酵素ＨｈａＩを用い、３７℃、１２時間処理を行い、２．５％アガロースゲルにて電気泳動を行った。
その結果を、図１に示す。図１において、ＳＭはサイズマーカー、各レーンは表１の各系を示す。Ｕは非メチル化ＰＣＲ産物のバンド、Ｍはメチル化ＰＣＲ産物を制限酵素で分解して生成された２つのバンドを示す。
また、ＥＰＭ２ＡＩＰ遺伝子におけるＨｉ−ＳＡ法は合計６回行い、制限酵素にて切断されないＰＣＲ産物の割合（％）を算出した。本実施例において、制限酵素にて切断されなかったＰＣＲ産物は、非メチル化ＤＮＡを鋳型として増幅されたものと考えられる。これらの結果を図２及び表２に示す。なお、非メチル化ＤＮＡを鋳型として増幅された産物を非メチル化ＰＣＲ産物、メチル化ＤＮＡを鋳型として増幅された産物をメチル化ＰＣＲ産物とよぶ。
特異的プライマーの濃度と、検出されうる非メチル化ＰＣＲ産物、メチル化ＰＣＲ産物の検出量を、グラフにて表したものを図２に示す。非メチル化、メチル化を検出するための特異的プライマーの濃度は、Ｈｉ−ＳＡ法の非特異的プライマーの濃度に対し、１／２量までは相加的に効果を示すが、１／２量以上では効果を示さないことが認められる。
以上の結果から、非メチル化ＤＮＡ又はメチル化ＤＮＡを認識する特異的プライマーの割合を変化させることにより、メチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡの双方を、任意の比率にて増幅し、検出することが可能であることがわかった。そして、加える特異的プライマーの効果を得ることが出来るのは、特異的プライマーと非特異的プライマーの濃度比が１：２のときであると推測される。特異的プライマーが非特異的プライマーの濃度の１／２までは、特異的プライマーの濃度と、目的の非メチル化又はメチル化ＤＮＡのＰＣＲ産物の濃度は、相加的な（直線的な）関係が認められた。
以上の結果から、非メチル化ＤＮＡ又はメチル化ＤＮＡを認識する特異的プライマーの割合を変化させることにより、メチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡの双方を、任意の比率にて増幅し、検出することが可能であることがわかった。そして、加える特異的プライマーの効果を得ることが出来るのは、特異的プライマーと非特異的プライマーの濃度比が１：２のときであると推測される。特異的プライマーが非特異的プライマーの濃度の１／２までは、特異的プライマーの濃度と、目的の非メチル化又はメチル化ＤＮＡのＰＣＲ産物の濃度は、相加的な（直線的な）関係が認められた。
（実施例３）
次に、ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のプロモーター領域に対し、実施例２と同様にＨｉ−ＳＡ法プライマーを設定し（図３Ａ）、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡが１：１の試料を用いてＩＵ及びＩＭの効果の確認を行った。なお、図３Ａにおいて、上部の灰色四角は、非翻訳領域のエキソンを示し、その上方の矢印は転写開始部を示す。中央実線上の縦線は、各ＣｐＧ部位を示す。縦線上のひし形は、制限酵素認識部位を示す。下部の太線は、ＣＯＢＲＡ法又はＨｉ−ＳＡ法によるＰＣＲ産物を示す。その下の矢印は、ＩＭプライマーを示す。
また、実施例１にて作製した種々の混合割合のＤＮＡ試料９種を用いて、ＣＯＢＲＡ法とＨｉ−ＳＡ法を行い、Ｈｉ−ＳＡ法の効果の確認を行った。
次に、ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のプロモーター領域に対し、実施例２と同様にＨｉ−ＳＡ法プライマーを設定し（図３Ａ）、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡが１：１の試料を用いてＩＵ及びＩＭの効果の確認を行った。なお、図３Ａにおいて、上部の灰色四角は、非翻訳領域のエキソンを示し、その上方の矢印は転写開始部を示す。中央実線上の縦線は、各ＣｐＧ部位を示す。縦線上のひし形は、制限酵素認識部位を示す。下部の太線は、ＣＯＢＲＡ法又はＨｉ−ＳＡ法によるＰＣＲ産物を示す。その下の矢印は、ＩＭプライマーを示す。
また、実施例１にて作製した種々の混合割合のＤＮＡ試料９種を用いて、ＣＯＢＲＡ法とＨｉ−ＳＡ法を行い、Ｈｉ−ＳＡ法の効果の確認を行った。
（実施例３−１）
ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のプロモーター領域を増幅しうるＨｉ−ＳＡ法プライマーは以下のとおりである。
RASSF2A-F: 5'-TGAAGAGYGAGAGAAAAGAGAGGA （配列番号５）
RASSF2A-R: 5'-TCCAACCAAACTAAACAAACRATAA （配列番号６）
RASSF2A-IU: 5'-CCAACCAAACTAAACAAACAATAACCA （配列番号７）
RASSF2A-IM: 5'-CCAACCAAACTAAACAAACGATAACCG （配列番号８）
RASSF2A-F（配列番号５）とRASSF2A-R（配列番号６）は非特異的プライマーであり、メチル化シトシンの存在するＤＮＡにも非メチル化シトシンの存在するＤＮＡにもハイブリダイズするように設計されており、この２つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、１６０ｂｐの増幅産物が得られる。
RASSF2A-IU（配列番号７）は非メチル化シトシンの存在するＤＮＡのみにハイブリダイズするように設計されており、RASSF2A-IM（配列番号８）はメチル化シトシンの存在するＤＮＡのみにハイブリダイズするように設計されている。
ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のプロモーター領域を増幅しうるＨｉ−ＳＡ法プライマーは以下のとおりである。
RASSF2A-F: 5'-TGAAGAGYGAGAGAAAAGAGAGGA （配列番号５）
RASSF2A-R: 5'-TCCAACCAAACTAAACAAACRATAA （配列番号６）
RASSF2A-IU: 5'-CCAACCAAACTAAACAAACAATAACCA （配列番号７）
RASSF2A-IM: 5'-CCAACCAAACTAAACAAACGATAACCG （配列番号８）
RASSF2A-F（配列番号５）とRASSF2A-R（配列番号６）は非特異的プライマーであり、メチル化シトシンの存在するＤＮＡにも非メチル化シトシンの存在するＤＮＡにもハイブリダイズするように設計されており、この２つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、１６０ｂｐの増幅産物が得られる。
RASSF2A-IU（配列番号７）は非メチル化シトシンの存在するＤＮＡのみにハイブリダイズするように設計されており、RASSF2A-IM（配列番号８）はメチル化シトシンの存在するＤＮＡのみにハイブリダイズするように設計されている。
ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（ＱＩＡＧＥＮ社）１５μＬ、試料ＤＮＡ溶液２μＬ、RASSF2A-F（配列番号５）のプライマー及びRASSF2A-R（配列番号６）のプライマーを各０．４μＭ（最終濃度）、RASSF2A-IU（配列番号７）のプライマー又はRASSF2A-IM（配列番号８）のプライマーを、濃度を変化させて添加し、合計３０μＬのＰＣＲ反応溶液を調製し、増幅反応を行った。RASSF2A-IU（配列番号７）のプライマー又はRASSF2A-IM（配列番号８）のプライマーは、最終濃度（μＭ）が０．８、０．４、０．２、０．１となるように添加した。
ＰＣＲ増幅反応は、９５℃を１５分の後、９５℃を２０秒、５９℃を４０秒、７２℃を２０秒を１サイクルとして合計３サイクル、次に９５℃を２０秒、５７℃を３０秒、７２℃を２０秒を１サイクルとして合計７サイクル、その後９５℃を２０秒、５５℃を３０秒、７２℃を２０秒を１サイクルとして合計３５サイクル行い、最後に７２℃を７分間で行った。
ＰＣＲ増幅工程の後、制限酵素ＨｈａＩを用い、３７℃、１２時間処理を行い、３％アガロースゲルにて電気泳動を行った。図３Ｂにその結果を示す。図３において、ＳＭはサイズマーカー、各レーンは加えた非メチル化又はメチル化特異的プライマーの濃度（μＭ）を示す。Ｕは非メチル化ＰＣＲ産物のバンド、Ｍはメチル化ＰＣＲ産物を制限酵素で分解して生成された２つのバンドを示す。実施例２と同様に、ＩＵ又はＩＭプライマーの効果が認められた。
ＰＣＲ増幅工程の後、制限酵素ＨｈａＩを用い、３７℃、１２時間処理を行い、３％アガロースゲルにて電気泳動を行った。図３Ｂにその結果を示す。図３において、ＳＭはサイズマーカー、各レーンは加えた非メチル化又はメチル化特異的プライマーの濃度（μＭ）を示す。Ｕは非メチル化ＰＣＲ産物のバンド、Ｍはメチル化ＰＣＲ産物を制限酵素で分解して生成された２つのバンドを示す。実施例２と同様に、ＩＵ又はＩＭプライマーの効果が認められた。
（実施例３−２）
次に、メチル化ＤＮＡの検出を目的とし、ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のプロモーター領域についてＣＯＢＲＡ法とＨｉ−ＳＡ法を行った。実施例１にて作製した９種の混合割合のＤＮＡ試料を用いて、ＣＯＢＲＡ法とＨｉ−ＳＡ法のメチル化検出感度の検討を行った。
次に、メチル化ＤＮＡの検出を目的とし、ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のプロモーター領域についてＣＯＢＲＡ法とＨｉ−ＳＡ法を行った。実施例１にて作製した９種の混合割合のＤＮＡ試料を用いて、ＣＯＢＲＡ法とＨｉ−ＳＡ法のメチル化検出感度の検討を行った。
ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のプロモーター領域を増幅しうるＣＯＢＲＡ法プライマーは、Ｈｉ−ＳＡ法と同じRASSF2A-F（配列番号５）とRASSF2A-R（配列番号６）を用いた。本実施例では、メチル化ＤＮＡを検出することを目的とするため、Ｈｉ−ＳＡ法における特異的プライマーは、メチル化特異的プライマーであるRASSF2A-IM（配列番号８）のみを用いた。
ＣＯＢＲＡ法の核酸増幅反応には、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（ＱＩＡＧＥＮ社）１５μＬ、各プライマー０．４μＭ（最終濃度）、各ＤＮＡ試料（実施例１にて調製）２μＬ、合計３０μＬのＰＣＲ反応溶液を用いた。
Ｈｉ−ＳＡ法の核酸増幅反応には、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（ＱＩＡＧＥＮ社）１５μＬ、非特異的プライマー各０．４μＭ（最終濃度）、特異的プライマー０．２μＭ（最終濃度）、各ＤＮＡ試料（実施例１にて調製）２μＬ、合計３０μＬのＰＣＲ反応溶液を用た。
Ｈｉ−ＳＡ法及びＣＯＢＲＡ法ともに、増幅反応は、９５℃を１５分の後、９５℃を２０秒、５９℃を４０秒、７２℃を２０秒を１サイクルとして合計３サイクル、次に９５℃を２０秒、５７℃を３０秒、７２℃を２０秒を１サイクルとして合計７サイクル、その後に９５℃を２０秒、５５℃を３０秒、７２℃を２０秒を１サイクルとして合計３５サイクル、最後に７２℃を７分間行った。
ＰＣＲ増幅工程の後、制限酵素ＨｈａＩを用い、３７℃、１２時間処理を行い、３％アガロースゲルにて電気泳動を行った。
Ｈｉ−ＳＡ法の核酸増幅反応には、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（ＱＩＡＧＥＮ社）１５μＬ、非特異的プライマー各０．４μＭ（最終濃度）、特異的プライマー０．２μＭ（最終濃度）、各ＤＮＡ試料（実施例１にて調製）２μＬ、合計３０μＬのＰＣＲ反応溶液を用た。
Ｈｉ−ＳＡ法及びＣＯＢＲＡ法ともに、増幅反応は、９５℃を１５分の後、９５℃を２０秒、５９℃を４０秒、７２℃を２０秒を１サイクルとして合計３サイクル、次に９５℃を２０秒、５７℃を３０秒、７２℃を２０秒を１サイクルとして合計７サイクル、その後に９５℃を２０秒、５５℃を３０秒、７２℃を２０秒を１サイクルとして合計３５サイクル、最後に７２℃を７分間行った。
ＰＣＲ増幅工程の後、制限酵素ＨｈａＩを用い、３７℃、１２時間処理を行い、３％アガロースゲルにて電気泳動を行った。
ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のプロモーター領域におけるＨｉ−ＳＡ法及びＣＯＢＲＡ法の結果を図３Ｃに示す。図３Ｃにおいて、ＳＭはサイズマーカー、各レーンの数値は試料ＤＮＡにおけるメチル化ＤＮＡの比率（％）を示す。矢印は、メチル化ＰＣＲ産物の分解物を示す。
ＣＯＢＲＡ法は１％のメチル化検出を限界とするが、本実施例のプライマー比率によれば、Ｈｉ−ＳＡ法は０．１％のメチル化検出を可能とする。このように、Ｈｉ−ＳＡ法は、目的とするＤＮＡの非メチル化又はメチル化を、高感度に検出することが可能である。
ＣＯＢＲＡ法は１％のメチル化検出を限界とするが、本実施例のプライマー比率によれば、Ｈｉ−ＳＡ法は０．１％のメチル化検出を可能とする。このように、Ｈｉ−ＳＡ法は、目的とするＤＮＡの非メチル化又はメチル化を、高感度に検出することが可能である。
（実施例４）
実施例３−２と同様に、メチル化ＤＮＡの検出を目的とし、３つの領域についてＣＯＢＲＡ法とＨｉ−ＳＡ法を行った。検討を行った領域は、ＳＦＲＰ２、Ｒｅｐｒｉｍｏ、ＡＰＣ遺伝子のプロモーター領域であり（図４）、これらは大腸癌でメチル化されていることが報告されている遺伝子のプロモーター領域である。図４において、中央の実線は、各遺伝子を示す。上部の灰色四角は、非翻訳領域のエキソン、上部の黒色四角は、翻訳領域のエキソンを示し、四角上部の矢印は転写開始部を示す。中央実線上の縦線は、各ＣｐＧ部位を示す。縦線上のひし形は、制限酵素認識部位を示す。下部の太線は、ＣＯＢＲＡ法又はＨｉ−ＳＡ法のＰＣＲ産物を示す。その下の矢印は、ＩＭプライマーを示す。
実施例１にて作製した１０種類の試料を用いて、ＣＯＢＲＡ法とＨｉ−ＳＡ法のメチル化検出感度の検討を行った。
実施例３−２と同様に、メチル化ＤＮＡの検出を目的とし、３つの領域についてＣＯＢＲＡ法とＨｉ−ＳＡ法を行った。検討を行った領域は、ＳＦＲＰ２、Ｒｅｐｒｉｍｏ、ＡＰＣ遺伝子のプロモーター領域であり（図４）、これらは大腸癌でメチル化されていることが報告されている遺伝子のプロモーター領域である。図４において、中央の実線は、各遺伝子を示す。上部の灰色四角は、非翻訳領域のエキソン、上部の黒色四角は、翻訳領域のエキソンを示し、四角上部の矢印は転写開始部を示す。中央実線上の縦線は、各ＣｐＧ部位を示す。縦線上のひし形は、制限酵素認識部位を示す。下部の太線は、ＣＯＢＲＡ法又はＨｉ−ＳＡ法のＰＣＲ産物を示す。その下の矢印は、ＩＭプライマーを示す。
実施例１にて作製した１０種類の試料を用いて、ＣＯＢＲＡ法とＨｉ−ＳＡ法のメチル化検出感度の検討を行った。
（ｉ）ＳＦＲＰ２遺伝子
ＳＦＲＰ２遺伝子のプロモーター領域を増幅しうるＣＯＢＲＡ法プライマーは以下のとおりである。
SFRP2-F: 5'-GTYGGAGTTTTTYGGAGTTG （配列番号９）
SFRP2-R: 5'-ACCCRCTCTCTTCRCTAAATAC （配列番号１０）
SFRP2-F（配列番号９）とSFRP2-R（配列番号１０）は、メチル化シトシンの存在するＤＮＡにも非メチル化シトシンの存在するＤＮＡにもハイブリダイズするように設計されている。この２つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、１３９ｂｐの増幅産物が得られる。
ＳＦＲＰ２遺伝子のプロモーター領域を増幅しうるＣＯＢＲＡ法プライマーは以下のとおりである。
SFRP2-F: 5'-GTYGGAGTTTTTYGGAGTTG （配列番号９）
SFRP2-R: 5'-ACCCRCTCTCTTCRCTAAATAC （配列番号１０）
SFRP2-F（配列番号９）とSFRP2-R（配列番号１０）は、メチル化シトシンの存在するＤＮＡにも非メチル化シトシンの存在するＤＮＡにもハイブリダイズするように設計されている。この２つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、１３９ｂｐの増幅産物が得られる。
ＳＦＲＰ２遺伝子のプロモーター領域を増幅しうるＨｉ−ＳＡ法プライマーは以下のとおりである。
SFRP2-F: 5'-GTYGGAGTTTTTYGGAGTTG （配列番号９）
SFRP2-R: 5'-ACCCRCTCTCTTCRCTAAATAC （配列番号１０）
SFRP2-IM: 5'-CGGAGTTTTTCGGAGTTGC （配列番号１１）
SFRP2-F（配列番号９）とSFRP2-R（配列番号１０）は、ＣＯＢＲＡ法と同じ非特異的プライマーであり、この２つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、１３９ｂｐの増幅産物が得られる。
SFRP2-IM（配列番号１１）はメチル化シトシンの存在するＤＮＡのみにハイブリダイズするように設計されている。
SFRP2-F: 5'-GTYGGAGTTTTTYGGAGTTG （配列番号９）
SFRP2-R: 5'-ACCCRCTCTCTTCRCTAAATAC （配列番号１０）
SFRP2-IM: 5'-CGGAGTTTTTCGGAGTTGC （配列番号１１）
SFRP2-F（配列番号９）とSFRP2-R（配列番号１０）は、ＣＯＢＲＡ法と同じ非特異的プライマーであり、この２つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、１３９ｂｐの増幅産物が得られる。
SFRP2-IM（配列番号１１）はメチル化シトシンの存在するＤＮＡのみにハイブリダイズするように設計されている。
（ｉｉ）Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子
Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子のプロモーター領域を増幅しうるＣＯＢＲＡ法プライマーは以下のとおりである。
Rep-F: 5'-GGTTTTGTGTTTTATTGYGGAGTG （配列番号１２）
Rep-R: 5'-AAAAATTTCCCAAAAACCTCTCC （配列番号１３）
Rep-F（配列番号１２）とRep-R（配列番号１３）はメチル化シトシンの存在するＤＮＡにも非メチル化シトシンの存在するＤＮＡにもハイブリダイズするように設計されている。この２つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、１３８ｂｐの増幅産物が得られる。
Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子のプロモーター領域を増幅しうるＣＯＢＲＡ法プライマーは以下のとおりである。
Rep-F: 5'-GGTTTTGTGTTTTATTGYGGAGTG （配列番号１２）
Rep-R: 5'-AAAAATTTCCCAAAAACCTCTCC （配列番号１３）
Rep-F（配列番号１２）とRep-R（配列番号１３）はメチル化シトシンの存在するＤＮＡにも非メチル化シトシンの存在するＤＮＡにもハイブリダイズするように設計されている。この２つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、１３８ｂｐの増幅産物が得られる。
Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子のプロモーター領域を増幅しうるＨｉ−ＳＡ法プライマーは以下のとおりである。
Rep-F: 5'-GGTTTTGTGTTTTATTGYGGAGTG （配列番号１２）
Rep-R: 5'- AAAAATTTCCCAAAAACCTCTCC （配列番号１３）
Rep-IM: 5'-AAAAATTTCCCAAAAACCTCTCCGACG （配列番号１４）
Rep-F（配列番号１２）とRep-R（配列番号１３）は、ＣＯＢＲＡ法と同じ非特異的プライマーであり、この２つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、１３８ｂｐの増幅産物が得られる。
Rep-IM（配列番号１４）はメチル化シトシンの存在するＤＮＡのみにハイブリダイズするように設計されている。
Rep-F: 5'-GGTTTTGTGTTTTATTGYGGAGTG （配列番号１２）
Rep-R: 5'- AAAAATTTCCCAAAAACCTCTCC （配列番号１３）
Rep-IM: 5'-AAAAATTTCCCAAAAACCTCTCCGACG （配列番号１４）
Rep-F（配列番号１２）とRep-R（配列番号１３）は、ＣＯＢＲＡ法と同じ非特異的プライマーであり、この２つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、１３８ｂｐの増幅産物が得られる。
Rep-IM（配列番号１４）はメチル化シトシンの存在するＤＮＡのみにハイブリダイズするように設計されている。
（ｉｉｉ）ＡＰＣ遺伝子
ＡＰＣ遺伝子のプロモーター領域を増幅しうるＣＯＢＲＡ法プライマーは以下のとおりである。
APC-F1: 5'-GGTTTTGTGTTTTATTGYGGAGTG （配列番号１５）
APC-R: 5'-CACCAATACAACCACATATCNATCAC （配列番号１６）
APC-F1（配列番号１５）とAPC-R（配列番号１６）はメチル化シトシンの存在するＤＮＡにも非メチル化シトシンの存在するＤＮＡにもハイブリダイズするように設計されている。この２つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、１５６ｂｐの増幅産物が得られる。
ＡＰＣ遺伝子のプロモーター領域を増幅しうるＣＯＢＲＡ法プライマーは以下のとおりである。
APC-F1: 5'-GGTTTTGTGTTTTATTGYGGAGTG （配列番号１５）
APC-R: 5'-CACCAATACAACCACATATCNATCAC （配列番号１６）
APC-F1（配列番号１５）とAPC-R（配列番号１６）はメチル化シトシンの存在するＤＮＡにも非メチル化シトシンの存在するＤＮＡにもハイブリダイズするように設計されている。この２つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、１５６ｂｐの増幅産物が得られる。
ＡＰＣ遺伝子のプロモーター領域を増幅しうるＨｉ−ＳＡ法プライマーは以下のとおりである。
APC-F2: 5'-GGTTTTGTGTTTTATTGNGGAGTG （配列番号１７）
APC-R: 5'-CACCAATACAACCACATATCNATCAC （配列番号１６）
APC-IM: 5'- ACCAATACAACCACATATCGATCACG （配列番号１８）
APC-F2（配列番号１７）とAPC-R（配列番号１６）は、ＣＯＢＲＡ法と同じ非特異的プライマーであり、この２つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、１３８ｂｐの増幅産物が得られる。
APC-IM（配列番号１８）はメチル化シトシンの存在するＤＮＡのみにハイブリダイズするように設計されている。なお、APC-F2（配列番号１７）とAPC-R（配列番号１６）の配列中のNは、イノシン酸（I）である。
APC-F2: 5'-GGTTTTGTGTTTTATTGNGGAGTG （配列番号１７）
APC-R: 5'-CACCAATACAACCACATATCNATCAC （配列番号１６）
APC-IM: 5'- ACCAATACAACCACATATCGATCACG （配列番号１８）
APC-F2（配列番号１７）とAPC-R（配列番号１６）は、ＣＯＢＲＡ法と同じ非特異的プライマーであり、この２つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、１３８ｂｐの増幅産物が得られる。
APC-IM（配列番号１８）はメチル化シトシンの存在するＤＮＡのみにハイブリダイズするように設計されている。なお、APC-F2（配列番号１７）とAPC-R（配列番号１６）の配列中のNは、イノシン酸（I）である。
（ｉｖ）増幅工程
ＣＯＢＲＡ法の核酸増幅反応には、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（ＱＩＡＧＥＮ社）１５μＬ、各プライマー１０ｍＭ（最終濃度）、各ＤＮＡ試料（実施例１にて調製）２μＬ、合計３０μＬのＰＣＲ反応溶液を用いた。
Ｈｉ−ＳＡ法の核酸増幅反応には、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（ＱＩＡＧＥＮ社）１５μＬ、非特異的プライマー各０．４μＭ（最終濃度）、特異的プライマー０．２μＭ（最終濃度）、各ＤＮＡ試料（実施例１にて調製）２μＬ、合計３０μＬのＰＣＲ反応溶液を用た。
ＳＦＲＰ２遺伝子の増幅反応は、Ｈｉ−ＳＡ法及びＣＯＢＲＡ法ともに、９５℃を１５分の後、９５℃を２０秒、５８℃を４０秒、７２℃を２０秒を１サイクルとして合計３サイクル、次９５℃を２０秒、５６℃を３０秒、７２℃を２０秒を１サイクルとして合計８サイクル、９５℃を２０秒、５４℃を３０秒、７２℃を２０秒を１サイクルとして合計１５サイクル、９５℃を２０秒、５２℃を３０秒、７２℃を２０秒を１サイクルとして合計２０サイクル行い、最後に７２℃を７分間行った。
Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子及びＡＰＣ遺伝子の増幅反応は、Ｈｉ−ＳＡ法及びＣＯＢＲＡ法ともに、ＲＡＳＳＦ２Ａと同じ条件（実施例３）で行った。
ＣＯＢＲＡ法の核酸増幅反応には、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（ＱＩＡＧＥＮ社）１５μＬ、各プライマー１０ｍＭ（最終濃度）、各ＤＮＡ試料（実施例１にて調製）２μＬ、合計３０μＬのＰＣＲ反応溶液を用いた。
Ｈｉ−ＳＡ法の核酸増幅反応には、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（ＱＩＡＧＥＮ社）１５μＬ、非特異的プライマー各０．４μＭ（最終濃度）、特異的プライマー０．２μＭ（最終濃度）、各ＤＮＡ試料（実施例１にて調製）２μＬ、合計３０μＬのＰＣＲ反応溶液を用た。
ＳＦＲＰ２遺伝子の増幅反応は、Ｈｉ−ＳＡ法及びＣＯＢＲＡ法ともに、９５℃を１５分の後、９５℃を２０秒、５８℃を４０秒、７２℃を２０秒を１サイクルとして合計３サイクル、次９５℃を２０秒、５６℃を３０秒、７２℃を２０秒を１サイクルとして合計８サイクル、９５℃を２０秒、５４℃を３０秒、７２℃を２０秒を１サイクルとして合計１５サイクル、９５℃を２０秒、５２℃を３０秒、７２℃を２０秒を１サイクルとして合計２０サイクル行い、最後に７２℃を７分間行った。
Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子及びＡＰＣ遺伝子の増幅反応は、Ｈｉ−ＳＡ法及びＣＯＢＲＡ法ともに、ＲＡＳＳＦ２Ａと同じ条件（実施例３）で行った。
ＰＣＲ増幅工程の後、Ｈｉ−ＳＡ法及びＣＯＢＲＡ法ともに、ＳＦＲＰ２の増幅産物には制限酵素ＢｓｓＨＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂ社）を用いて、５０℃、１２時間処理を行い、Ｒｅｐｒｉｍｏ及びＡＰＣの増幅産物には制限酵素ＴａｑＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂ社）を用いて、６５℃、１２時間処理を行った。
各領域におけるＨｉ−ＳＡ法及びＣＯＢＲＡ法の結果を図５に示す。図５において、ＳＭはサイズマーカー、各レーンの数値は試料ＤＮＡにおけるメチル化ＤＮＡの比率（％）を示す。矢印はメチル化ＰＣＲ産物の分解物を示す。
ＳＦＲＰ２遺伝子、Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子及びＡＰＣ遺伝子の各プロモーター領域において、ＣＯＢＲＡ法は０．５〜５％のメチル化検出を限界であったが、Ｈｉ−ＳＡ法はＣＯＢＲＡ法の５〜１０倍の感度を示した。このように、Ｈｉ−ＳＡ法は高感度に目的とするＤＮＡの非メチル化又はメチル化を検出することが可能である。
また、各遺伝子において、異なる種類の制限酵素を使用したが（ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子にはＨｈａＩ（実施例３）、ＳＦＲＰ２遺伝子にはＢｓｓＨＩＩ、Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子及びＡＰＣ遺伝子にはＴａｑＩ）、制限酵素の種類に関係なく同様の効果を示した。以上から、Ｈｉ−ＳＡ法は増幅する遺伝子又は遺伝子座の部位や、制限酵素の効果に関係なく、使用することができると予測される。すなわち、Ｈｉ−ＳＡ法は普遍的に成立し得ると考えられる。特異的プライマーの濃度及び配列を変更することにより、任意の感度にて、目的とするＤＮＡの非メチル化及び／又はメチル化を検出することが可能であると考えられる。
ＳＦＲＰ２遺伝子、Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子及びＡＰＣ遺伝子の各プロモーター領域において、ＣＯＢＲＡ法は０．５〜５％のメチル化検出を限界であったが、Ｈｉ−ＳＡ法はＣＯＢＲＡ法の５〜１０倍の感度を示した。このように、Ｈｉ−ＳＡ法は高感度に目的とするＤＮＡの非メチル化又はメチル化を検出することが可能である。
また、各遺伝子において、異なる種類の制限酵素を使用したが（ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子にはＨｈａＩ（実施例３）、ＳＦＲＰ２遺伝子にはＢｓｓＨＩＩ、Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子及びＡＰＣ遺伝子にはＴａｑＩ）、制限酵素の種類に関係なく同様の効果を示した。以上から、Ｈｉ−ＳＡ法は増幅する遺伝子又は遺伝子座の部位や、制限酵素の効果に関係なく、使用することができると予測される。すなわち、Ｈｉ−ＳＡ法は普遍的に成立し得ると考えられる。特異的プライマーの濃度及び配列を変更することにより、任意の感度にて、目的とするＤＮＡの非メチル化及び／又はメチル化を検出することが可能であると考えられる。
（実施例５）
次に、Ｈｉ−ＳＡ法を用いて、ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子をマーカーとして、大腸癌患者１４例から得られた糞便及び、大腸内視鏡検査にて大腸に新生物を認めなかった患者１４例から得られた糞便を対象として、検討を行った。
糞便検体の核酸修飾処理は、特開２００６−１６６７１２号公報（特願２００４−３５９４７１号）の方法により行い、得られた試料を用いてＨｉ−ＳＡ法を行った。Ｈｉ−ＳＡ法は、実施例３の方法と同様に行った。
次に、Ｈｉ−ＳＡ法を用いて、ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子をマーカーとして、大腸癌患者１４例から得られた糞便及び、大腸内視鏡検査にて大腸に新生物を認めなかった患者１４例から得られた糞便を対象として、検討を行った。
糞便検体の核酸修飾処理は、特開２００６−１６６７１２号公報（特願２００４−３５９４７１号）の方法により行い、得られた試料を用いてＨｉ−ＳＡ法を行った。Ｈｉ−ＳＡ法は、実施例３の方法と同様に行った。
結果を図６に示す。図６において、各レーンの番号は試料番号を示す。ＳＭはサイズマーカーを示し、矢印はメチル化ＰＣＲ産物の分解物を示し、Ｍはメチル化が検出されたことを示す。
ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のメチル化は、大腸患者からの糞便検体１４例中６例（４３％）に、健常者からの糞便検体は１４例中０例（０％）に検出された。
ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のメチル化は、大腸患者からの糞便検体１４例中６例（４３％）に、健常者からの糞便検体は１４例中０例（０％）に検出された。
（実施例６）ＤＮＡ試料の調製
大腸正常粘膜からＤＮＡを抽出した。大腸正常粘膜から抽出されたＤＮＡでは、各遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧ領域は、基本的には非メチル化である。よって、大腸正常粘膜から抽出されたＤＮＡより、非メチル化であることを既に確認済みのＤＮＡを選別し、「非メチル化ＤＮＡ」とした。「メチル化ＤＮＡ」は、この「非メチル化ＤＮＡ」をＳｓｓＩメチルトランスフェラーゼにて処理を行うことによって得た。
各ＤＮＡについて重亜硫酸塩（bisulfite）処理を行った。処理後、非メチル化ＤＮＡのみの試料をＵ（非メチル化ＤＮＡのコントロール）とし、メチル化ＤＮＡをＭ（メチル化ＤＮＡのコントロール）とした。
大腸正常粘膜からＤＮＡを抽出した。大腸正常粘膜から抽出されたＤＮＡでは、各遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧ領域は、基本的には非メチル化である。よって、大腸正常粘膜から抽出されたＤＮＡより、非メチル化であることを既に確認済みのＤＮＡを選別し、「非メチル化ＤＮＡ」とした。「メチル化ＤＮＡ」は、この「非メチル化ＤＮＡ」をＳｓｓＩメチルトランスフェラーゼにて処理を行うことによって得た。
各ＤＮＡについて重亜硫酸塩（bisulfite）処理を行った。処理後、非メチル化ＤＮＡのみの試料をＵ（非メチル化ＤＮＡのコントロール）とし、メチル化ＤＮＡをＭ（メチル化ＤＮＡのコントロール）とした。
（実施例７）
本発明の増幅方法により試料ＤＮＡの増幅を行い、増幅産物をシーケンサにアプライして非メチル化増幅産物および／またはメチル化増幅産物の検出を行った。プライマーは蛍光物質が付加されたものを用いた。かかる蛍光物質を用いた方法を、蛍光Ｈｉ−ＳＡ法とも呼ぶ。
実施例３および実施例４にて用いたＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子、ＳＦＲＰ２遺伝子、Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子、ＡＰＣ遺伝子において、実施例６にて作製した試料を用いて、蛍光Ｈｉ−ＳＡ法を行った。各遺伝子の領域について、以下の蛍光物質が付加されたプライマーを用いた。
（ｉ）ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子
RASSF2A-F: 5'-FAM-TGAAGAGYGAGAGAAAAGAGAGGA （配列番号５）
RASSF2A-R: 5'-TCCAACCAAACTAAACAAACRATAA （配列番号６）
RASSF2A-IM: 5'-CCAACCAAACTAAACAAACGATAACCG （配列番号８）
（ｉｉ）ＳＦＲＰ２遺伝子
SFRP2-F: 5'-GTYGGAGTTTTTYGGAGTTG （配列番号９）
SFRP2-R: 5'-NED-ACCCRCTCTCTTCRCTAAATAC （配列番号１０）
SFRP2-IM: 5'-CGGAGTTTTTCGGAGTTGC （配列番号１１）
（ｉｉｉ）Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子
Rep-F: 5'-GGTTTTGTGTTTTATTGYGGAGTG （配列番号１２）
Rep-R: 5'-VIC-AAAAATTTCCCAAAAACCTCTCC （配列番号１３）
Rep-IM: 5'-AAAAATTTCCCAAAAACCTCTCCGACG （配列番号１４）
（ｉｖ）ＡＰＣ遺伝子
APC-F2: 5'-PET-GGTTTTGTGTTTTATTGNGGAGTG （配列番号１７）
APC-R: 5'-CACCAATACAACCACATATCNATCAC （配列番号１６）
APC-IM: 5'- ACCAATACAACCACATATCGATCACG （配列番号１８）
本発明の増幅方法により試料ＤＮＡの増幅を行い、増幅産物をシーケンサにアプライして非メチル化増幅産物および／またはメチル化増幅産物の検出を行った。プライマーは蛍光物質が付加されたものを用いた。かかる蛍光物質を用いた方法を、蛍光Ｈｉ−ＳＡ法とも呼ぶ。
実施例３および実施例４にて用いたＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子、ＳＦＲＰ２遺伝子、Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子、ＡＰＣ遺伝子において、実施例６にて作製した試料を用いて、蛍光Ｈｉ−ＳＡ法を行った。各遺伝子の領域について、以下の蛍光物質が付加されたプライマーを用いた。
（ｉ）ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子
RASSF2A-F: 5'-FAM-TGAAGAGYGAGAGAAAAGAGAGGA （配列番号５）
RASSF2A-R: 5'-TCCAACCAAACTAAACAAACRATAA （配列番号６）
RASSF2A-IM: 5'-CCAACCAAACTAAACAAACGATAACCG （配列番号８）
（ｉｉ）ＳＦＲＰ２遺伝子
SFRP2-F: 5'-GTYGGAGTTTTTYGGAGTTG （配列番号９）
SFRP2-R: 5'-NED-ACCCRCTCTCTTCRCTAAATAC （配列番号１０）
SFRP2-IM: 5'-CGGAGTTTTTCGGAGTTGC （配列番号１１）
（ｉｉｉ）Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子
Rep-F: 5'-GGTTTTGTGTTTTATTGYGGAGTG （配列番号１２）
Rep-R: 5'-VIC-AAAAATTTCCCAAAAACCTCTCC （配列番号１３）
Rep-IM: 5'-AAAAATTTCCCAAAAACCTCTCCGACG （配列番号１４）
（ｉｖ）ＡＰＣ遺伝子
APC-F2: 5'-PET-GGTTTTGTGTTTTATTGNGGAGTG （配列番号１７）
APC-R: 5'-CACCAATACAACCACATATCNATCAC （配列番号１６）
APC-IM: 5'- ACCAATACAACCACATATCGATCACG （配列番号１８）
蛍光Ｈｉ−ＳＡ法の核酸増幅反応には、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（ＱＩＡＧＥＮ社）１５μＬ、非特異的プライマー各０．４μＭ（最終濃度）、特異的プライマー０．２μＭ（最終濃度）、各ＤＮＡ試料（実施例６にて調製）２μＬ、合計３０μＬのＰＣＲ反応溶液を用いた。増幅反応は、実施例４に従った。
ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子およびＳＦＲＰ２遺伝子の増幅産物を１μＬずつ混合し、制限酵素ＨｈａＩにより、３７℃で１０時間、処理を行った。Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子およびＡＰＣ遺伝子の増幅産物を１μＬずつ混合し、制限酵素ＴａｑＩにより、６５℃で１０時間、処理を行った。このＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子およびＳＦＲＰ２遺伝子の増幅産物を１μＬずつ混合して制限酵素ＨｈａＩにて処理を行ったものを１μＬ、ならびに、Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子およびＡＰＣ遺伝子の増幅産物を１μＬずつ混合して制限酵素ＴａｑＩにて処理を行ったものを１μＬずつ採り、超純水９８μＬを加えて１００μＬとし、かかる溶液から１μＬをシーケンサ（ABI 310R Genetic Analyzer）にアプライした。データの取得にはプレローディングも含め、約１時間必要であった。検出感度の比較のために、各増幅産物（ＰＣＲ反応液１０μＬ）について３％アガロースゲルにて電気泳動を行った。
結果を図７に示す。各々ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子、ＳＦＲＰ２遺伝子、Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子、ＡＰＣ遺伝子の結果を示す。各々の領域について、上段はコントロール（非メチル化ＤＮＡのみの試料）を用いて増幅反応を行った結果、下段はメチル化ＤＮＡを用いて増幅反応を行った結果を示す。また、左の波形はシーケンサの結果であり、右の写真は電気泳動の結果を示す。ＳＭはサイズマーカー、白色矢頭は非メチル化ＰＣＲ産物であり、灰色矢頭はメチル化ＰＣＲ産物の分解物を示す。
シーケンサを用いた蛍光Ｈｉ−ＳＡ法では、電気泳動を用いたＨｉ−ＳＡ法よりも高感度に、メチル化ＤＮＡもしくは非メチル化ＤＮＡを検出可能であることがわかった。
（実施例８）
蛍光物質でラベルされたプライマーを用いたＨｉ−ＳＡ法により、大腸腺腫患者および大腸癌患者から得られた糞便を対象として検討を行った。糞便検体の核酸修飾処理は、特開２００６−１６６７１２号公報（特願２００４−３５９４７１号）の方法により行った。マーカーとして実施例７に記載の４つの領域を使用して、実施例７の方法と同様に蛍光Ｈｉ−ＳＡ法を行った。
蛍光物質でラベルされたプライマーを用いたＨｉ−ＳＡ法により、大腸腺腫患者および大腸癌患者から得られた糞便を対象として検討を行った。糞便検体の核酸修飾処理は、特開２００６−１６６７１２号公報（特願２００４−３５９４７１号）の方法により行った。マーカーとして実施例７に記載の４つの領域を使用して、実施例７の方法と同様に蛍光Ｈｉ−ＳＡ法を行った。
結果を図８に示す。各患者の波形は、上段から、ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子、Ｒｅｐｒｉｍｏ遺伝子、ＳＦＲＰ２遺伝子、ＡＰＣ遺伝子の結果を示す。各々の領域について、白色矢頭は非メチル化ＰＣＲ産物であり、灰色矢頭はメチル化ＰＣＲ産物の分解物を示す。これらの結果から、シーケンサを用いた場合でも、糞便検体中のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを高感度に検出可能であることがわかった。
以上説明したように、本発明の方法は、増幅する遺伝子及び／又は遺伝子座の部位や、制限酵素に関係なく、実施することができる。また、特異的プライマーの濃度及び配列を変更することにより、感度を任意に上昇させて、目的とする核酸の非メチル化又はメチル化を検出することが可能である。したがって、本発明の方法によれば、正確かつ高感度に、メチル化又は非メチル化の有無を検出をすることができ、また、メチル化核酸及び／又は非メチル化核酸を定量的に検出することも可能となる。
また、本発明の検査方法は、生体検体、特に糞便検体から大腸に存在する癌を判定することが可能である。実施例に示した遺伝子プロモーター領域のメチル化の有無は、正常粘膜組織由来ＤＮＡ又は大腸癌組織由来ＤＮＡのメチル化の有無の検出を糞便から本方法により検出可能であることを示した。このように非侵襲ＤＮＡ材料として実用的に利用可能であるということは、各種疾患の診断上有用であるばかりではなく、操作的に多数検体の処理が可能なことから、正常集団を対象とした大腸癌等の各種検診への応用も可能である。また、糞便は、ＤＮＡの抽出及び精製が難しいことが知られていることから、本発明の方法は、糞便のみならず、様々な生体検体を用いての応用が可能であると考えられる。よって本方法は、大腸癌の診断のみではなく、広く各種、各臓器に存在する癌や新生物に対しての診断への応用が可能であり、また、その新生物をある程度予測できるものと考えられる。
また、本発明の検査方法は、生体検体、特に糞便検体から大腸に存在する癌を判定することが可能である。実施例に示した遺伝子プロモーター領域のメチル化の有無は、正常粘膜組織由来ＤＮＡ又は大腸癌組織由来ＤＮＡのメチル化の有無の検出を糞便から本方法により検出可能であることを示した。このように非侵襲ＤＮＡ材料として実用的に利用可能であるということは、各種疾患の診断上有用であるばかりではなく、操作的に多数検体の処理が可能なことから、正常集団を対象とした大腸癌等の各種検診への応用も可能である。また、糞便は、ＤＮＡの抽出及び精製が難しいことが知られていることから、本発明の方法は、糞便のみならず、様々な生体検体を用いての応用が可能であると考えられる。よって本方法は、大腸癌の診断のみではなく、広く各種、各臓器に存在する癌や新生物に対しての診断への応用が可能であり、また、その新生物をある程度予測できるものと考えられる。
Claims (7)
- 生物学的試料に含有可能性のある目的遺伝子及び／又は遺伝子座に由来するＣｐＧ含有核酸の増幅方法を含む、目的遺伝子及び／又は遺伝子座におけるメチル化及び／又は非メチル化を検出する方法であって、
非メチル化シトシンを修飾する試薬に生物学的試料を接触させ、生物学的試料に存在し得る核酸の非メチル化シトシンをウラシルに転換することにより生物学的試料を処理する工程、
前記工程により処理された生物学的試料中の核酸を、非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別しない第１プライマーと、非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別する第２プライマーと、非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別しない第３プライマーからなるプライマーセットを用いて、増幅する工程、および
制限酵素によって増幅断片を処理する工程
を含み、
前記増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行われ、
第２プライマーが、第１プライマーと実質的に同じプライマー領域を有しており、
第３プライマーが第１プライマー及び第２プライマーと対になって核酸を増幅する機能を有しており、第１プライマーと第３プライマーによる増幅断片と、第２プライマーと第３プライマーによる増幅断片とが実質的に同じ大きさの増幅断片であり、
前記制限酵素が増幅断片の塩基配列のうち、プライマー領域を除く塩基配列に存在するＣＧ又はＴＧを認識する、
メチル化及び／又は非メチル化を検出する方法。 - 第１プライマーの配列に、少なくとも１つのＣｐＧ部位が含まれており、かつ、該ＣｐＧ部位のシトシンに対応する位置の塩基が、混合塩基（Ｙ）及び／又は混合塩基（Ｒ）及び／又はイノシン酸（Ｉ）で置換されている、請求項１に記載のメチル化及び／又は非メチル化を検出する方法。
- 第２プライマーの配列に、少なくとも２つのＣｐＧ部位が含まれており、かつ、該ＣｐＧ部位がメチル化核酸の配列又は非メチル化核酸の配列に特異的に存在する、請求項１又は２に記載のメチル化及び／又は非メチル化を検出する方法。
- 第１プライマーと第２プライマーの濃度比が、１０：１〜１：１である、請求項１〜３のいずれか１に記載のメチル化及び／又は非メチル化を検出する方法。
- 以下の（１）プライマーセット及び（２）制限酵素を含む、試薬キット：
（１）非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別しない第１プライマーと、
非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別するプライマーであって、第１プライマーと実質的に同じプライマー領域を有する第２プライマーと、
非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別しないプライマーであって、第１プライマー及び第２プライマーと対になって核酸を増幅する機能を有する第３プライマーからなり、
非メチル化シトシンを修飾する試薬に生物学的試料を接触させて処理された生物学的試料中の核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅するために用いられ、
第１プライマーと第３プライマーによる増幅断片と、第２プライマーと第３プライマーによる増幅断片とが実質的に同じ大きさの増幅断片である、プライマーセット；
（２）プライマーセットにより増幅された増幅断片の塩基配列のうち、プライマー領域を除く塩基配列に存在するＣＧ又はＴＧを認識する、制限酵素。 - 請求項１〜４のいずれか１に記載の方法に用いられる、請求項５に記載の試薬キット。
- さらに、生物学的試料に存在し得る核酸の非メチル化シトシンを修飾する試薬を含む、請求項５または６に記載の試薬キット。
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| JP2000511776A (ja) * | 1996-06-03 | 2000-09-12 | ザ ジョーンズ ホプキンス ユニバーシティー スクール オブ メディシン | メチル化特異的検出 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JPN6012052926; Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，Ｖｏｌ．１３２（２００６）ｐ．７３５-７４３ * |
| JPN6012052928; Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｖｏｌ．８７（２００６）ｐ．４６-５６ * |
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