CN101796185B

CN101796185B - 扩增甲基化核酸或非甲基化核酸的方法

Info

Publication number: CN101796185B
Application number: CN200880018223.3A
Authority: CN
Inventors: 永坂岳司; 松原长秀; 屉本博美; 田中纪章
Original assignee: BIO DIXAM [ LLC
Current assignee: BIO DIXAM [ LLC; Bio Dixam LLC
Priority date: 2007-06-08
Filing date: 2008-06-03
Publication date: 2014-04-30
Anticipated expiration: 2028-06-03
Also published as: WO2008149855A1; EP2154247A4; CN101796185A; US8673563B2; CA2687171A1; EP2154247A1; US20110097714A1; JPWO2008149855A1; JP5258760B2

Abstract

本发明的课题在于，提供能够将生物学试样中存在的甲基化核酸和非甲基化核酸两者扩增，进而能够适当调节甲基化核酸和/或非甲基化核酸的扩增率的基因扩增方法。该课题通过如下的扩增方法解决，即，使用与甲基化和非甲基化核酸都能杂交的非特异性引物、及与甲基化或非甲基化核酸特异性杂交的特异性引物的扩增方法；进而，通过使这些引物的混合率发生变化而使甲基化核酸或非甲基化核酸的扩增率发生变化的扩增方法。

Description

扩增甲基化核酸或非甲基化核酸的方法

技术领域

本发明涉及扩增存在于生物学试样中的甲基化核酸或非甲基化核酸的方法。进而，涉及包含该扩增方法的方法，该方法检测生物学试样中可能含有的目标基因和/或基因位点中的甲基化和/或非甲基化。

本申请基于作为参照而援引于此的日本专利申请特愿2007-153086号请求优先权。

背景技术

在哺乳类中，在存在于基因组DNA序列中的5’-CG-3’DNA部分(以下，称为CpG部位，或简单称之为CpG)中，已知位于该鸟嘌呤(G)的5’侧的胞嘧啶(C)被甲基化的现象。CpG的甲基化修饰被认为会对基因表达产生影响。特别是在富含CpG的区域(CpG岛)存在于基因的启动子区域内时，CpG被认为会对基因表达产生重要影响。

通常，染色体中的多数CpG岛因甲基化而被保护。但是，由于某些原因，如果存在于启动子区域的CpG岛被甲基化，则该基因的转录受到抑制。例如，在人体内的抑癌基因中，发生存在于其启动子区域的CpG岛的异常甲基化，该抑癌基因的转录被钝化时，细胞增殖的控制变得无效，从而导致癌等细胞增殖性疾病发生。

另一方面，在CpG岛以外的区域中，通常CpG中的胞嘧啶被甲基化。但是，有报道称，在癌和瘤中，通常被甲基化的CpG的胞嘧啶被非甲基化。

随着近年来的分子生物学方法的发展，通过检测DNA的有无甲基化来对癌、肿瘤的早期发现和治疗进行监控逐渐成为可能。例如，在日本特表2000-511776号公报(专利文献1)、国际公开第02/38801A1号公开文本(专利文献2)和Xiong Z，Laird PW.Nucleic Acids Res.1997jun 15；25(12)：2532-4(非专利文献1)中，公开了为了迅速检测出含CpG核酸中的甲基化，利用PCR法，诊断癌等的方法。对于这些方法，重点置于特异性地检测出甲基化DNA方面。

进而，具体来说，公开有：由各种体液、组织或细胞系制备核酸试样，利用重亚硫酸盐等进行将非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的修饰，然后，(1)通过能够区分非甲基化DNA和甲基化DNA的特异性引物用PCR法(Methylation-Specific-PCR：MSP法)进行扩增，检测出甲基化DNA的方法(专利文献1)；以及(2)通过不区分非甲基化DNA和甲基化DNA的非特异性引物用PCR法进行扩增，用识别该PCR扩增产物内部碱基序列的不同的限制酶进行处理，从而检测出甲基化DNA的有无和/或比例的方法(Combined Bisulfite RestrictionAnalysis：COBRA法)(非专利文献1)。通过采用这些方法检测出特定的基因碱基序列中的甲基化DNA的存在，能够对癌、肿瘤的早期发现和治疗进行监控。

另外，公开了以高灵敏度检测出甲基化DNA和/或非甲基化DNA的方法(日本特开2007-74950号公报(专利文献3))。公开了在PCR扩增工序之后，用核酸外切酶处理已扩增的双链DNA片段，得到单链DNA片段，通过DNA微阵列进行检测的方法。

对于MSP法、COBRA法，核酸试样(DNA试样)并不是来自组织或细胞系、而是由各种体液而得的试样时，含有DNA量为微量，因此成为对象的DNA不被扩增的情况很多。

一般地说，已知PCR法本身的灵敏度(通过PCR法得到扩增产物的概率)和特异性(仅扩增目标基因区域的概率)取决于引物的碱基序列和PCR扩增反应的条件。为了提高PCR的灵敏度，有必要放宽PCR扩增工序的条件，这时PCR的特异性减小。

对于MSP法，使用对非甲基化DNA和甲基化DNA分别具有特异性序列的引物进行扩增工序。在模板DNA量少时或纯化度差时，例如以各种体液为样本时，必须放宽扩增工序的条件，而导致特异性减小。因此，不知道检测出的扩增产物是否真的仅由非甲基化DNA或甲基化DNA扩增而得，成为问题。另外，由于对非甲基化DNA的特异性引物和对甲基化DNA的特异性引物的序列大为不同(例如，非甲基化DNA用的引物多含A和T，甲基化DNA用的引物多含C和G)，而导致非甲基化DNA和甲基化DNA的扩增灵敏度、特异性不同。进而，由于仅以PCR产物的有无来判断有无非甲基化和甲基化，因此无法确认扩增工序自身的错误。

对于COBRA法，对甲基化DNA的灵敏度低成为问题。将各种体液用于样本时，有可能无法用COBRA法检测出。

专利文献1：日本特表2000-511776号公报

专利文献2：国际公开第02/38801A1号公开文本

专利文献3：日本特开2007-74950号公报

非专利文献1：Xiong Z，Laird PW.Nucleic Acids Res.1997 jun15；25(12)：2532-4

发明内容

本发明的目的在于，提供用于对各种样本高灵敏度地检测出目标基因和/或基因位点有无非甲基化核酸或甲基化核酸的扩增方法，以及非甲基化和/或甲基化的检测方法。

本申请发明人等鉴于上述课题进行了深入研究，结果发明了，通过对能够扩增非甲基化DNA和甲基化DNA两者的非特异性引物、以及能够扩增非甲基化DNA或甲基化DNA中的任一者的特异性引物进行设计来进行扩增反应，从而能够正确且高灵敏度地扩增成为对象的DNA，并且，通过使引物的比例变化，从而以任意比率扩增甲基化和非甲基化核酸，进行检测的方法。

即，本发明如下构成。

1.一种核酸扩增方法，是来源于生物学试样中可能含有的目标基因和/或基因位点的含CpG核酸的扩增方法，包含使用引物组来扩增该含CpG核酸的工序，所述引物组至少含有不区分非甲基化核酸和甲基化核酸的第1引物、以及区分非甲基化核酸和甲基化核酸的第2引物，第2引物具有与第1引物实质相同的引物区域。

2.前项1所述的核酸扩增方法，在第1引物的序列中含有至少1个CpG部位，并且，与该CpG部位的胞嘧啶对应的位置的碱基被混合碱基(Y)和/或混合碱基(R)和/或肌苷酸(I)取代。

3.前项1或2所述的核酸扩增方法，在第2引物的序列中含有至少2个CpG部位，并且，该CpG部位在甲基化核酸的序列或非甲基化核酸的序列中特异性存在。

4.前项1～3中任一项所述的核酸扩增方法，扩增通过聚合酶链反应(PCR)进行。

5.前项4所述的核酸扩增方法，进一步使用第3引物，所述第3引物是不区分非甲基化核酸和甲基化核酸的引物，具有与第1引物或第2引物成对地扩增核酸的功能。

6.前项1～5中任一项所述的核酸扩增方法，第1引物和第2引物的浓度比为10∶1～1∶1。

7.前项1～6中任一项所述的核酸扩增方法，在上述扩增工序之前，包含如下工序：使生物学试样与修饰非甲基化胞嘧啶的试剂接触，将能够存在于生物学试样中的核酸的非甲基化胞嘧啶转换为尿嘧啶，从而对生物学试样进行处理。

8.一种检测生物学试样中可能含有的目标基因和/或基因位点中的甲基化和/或非甲基化的方法，包含前项1～7中任一项所述的方法。

9.前项8所述的检测方法，包含利用限制酶处理扩增片段，该限制酶识别扩增片段的序列中除引物区域以外的序列中存在的CG或TG。

10.一种引物组，至少含有不区分非甲基化核酸和甲基化核酸的第1引物，以及区分非甲基化核酸和甲基化核酸、且具有与第1引物实质相同的引物区域的第2引物。

11.前项10所述的引物组，用于前项1～9中任一项所述的方法。

12.一种试剂盒，含有前项11所述的引物组。

根据本发明的扩增方法，可以使用各种样本，高精度地扩增非甲基化核酸或甲基化核酸。进而，该扩增方法具有可以对非甲基化或甲基化核酸设定任意的灵敏度这样的优点。例如，即使在非甲基化的检测重要、且该非甲基化核酸的比率相对于甲基化核酸来说非常小的情况下，根据本方法，也能够正确地扩增该非甲基化核酸。

核酸的甲基化异常不仅在增殖性疾病中得到确认，在其他疾病中也得到确认。本发明是能够以任意比率扩增甲基化核酸或非甲基化核酸，并将它们定量性或非定量性地算出而进行检测的方法。因此，本方法能够有效且高精度地判断(诊断)甲基化异常，可以用于疾病的诊断、治疗和预防的判断，是对社会产生极其深远的影响的方法。

附图说明

图1是表示实施例2的结果的照片。

图2是表示由实施例2的结果算出的各体系的非甲基化PCR产物比例的曲线图。

图3(A)是RASSF2A基因的启动子区域的示意图。(B)是表示实施例3-1的结果的照片。(C)是表示实施例3-2中的COBRA法和Hi-SA法的结果的照片。

图4是SFRP2、Reprimo和APC基因的启动子区域的示意图。

图5是实施例4的结果的照片。

图6是实施例5的结果的照片。

图7是实施例6的结果的图。

图8是实施例7的结果的图。

符号说明

SM尺寸标记物

C对照

IU对非甲基化DNA的特异性引物

IM对甲基化DNA的特异性引物

U非甲基化PCR产物

M甲基化PCR产物

具体实施方式

本发明是来源于生物学试样中可能含有的目标基因和/或基因位点的含CpG核酸的扩增方法。另外，是包含该扩增方法、检测生物学试样中含有的基因和/或基因位点的甲基化和/或非甲基化的方法。

本发明中，所谓“生物学试样”，是指含有由从哺乳类等采集的样本制备的核酸的试样(以下，有时也简称为“试样”)。所谓样本，可以举出血液、血清、粪便、尿、精液、痰、唾液、鼻涕、脑脊髓液、眼泪等各种体液，或者脑、结肠、泌尿生殖器、肺、肾脏、造血组织、乳房、胸腺、睾丸、卵巢、子宫组织等各种组织，或者它们所含的细胞群。优选可以举出粪便、痰、尿等能够非侵害性获得的样本。进而，本发明的生物学试样的DNA纯化度可以低，并且含有DNA的量可以是微量。作为从样本获得生物学试样的方法可以使用本身公知的方法。例如，可以使用MagExtractor(东洋纺制)、QIAamp Stool DNA Isolation Kit(QIAGEN公司)等的市售品等，采用本身公知的方法从样本提取DNA，以粪便为样本时，使用国际公开公报WO2006/064737号中记载的前处理方法即可简便地得到试样。

优选通过修饰生物学试样中存在的基因的全部非甲基化胞嘧啶的试剂对得到的生物学试样进行处理。作为该试剂的例子，可以举出重亚硫酸盐。通过重亚硫酸盐处理，非甲基化胞嘧啶转换为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不被转换为尿嘧啶，因此只要在处理后检测出胞嘧啶，就可以判断该胞嘧啶为甲基化。这样的非甲基化胞嘧啶的修饰处理可以使用DNA甲基化检测用试剂盒的市售品，例如DNA methylation Kit，EZ(ZYMO RESEARCH)，MethylEasy(Human Genetic Signatures)，CpGenome DNA Modification Kit(CHEMICON)等进行。

本发明中，所谓“生物学试样中可能含有的基因和/或基因位点”，是指生物学试样中可能含有的各种疾病相关基因、微生物相关基因。例如，可以举出遗传病等的致病基因、来源于癌组织的基因，来源于固有菌的基因、来源于采集试样的宿主所感染的微生物(细菌、病毒等)的基因等。具体可以举出EPM2AIP1基因(Genbank登录号9852)、RASSF2A基因(Genbank登录号9770)、SFRP2基因(Genbank登录号6423)、Reprimo基因(Genebank登录号56475)、APC基因(Genbank登录号324)。

本发明中，所谓“含CpG核酸”，是来源于上述基因、基因位点的核酸。含CpG核酸可以是由完整的基因序列构成的核酸，只要包含成为扩增对象的区域的核酸，也可以是DNA片段或RNA片段等片段。含有CpG的区域可以举出例如基因的启动子区域、5’区域。具体可以举出EPM2AIP基因的启动子区域(hMLH1-5’区域)、RASSF2A基因的启动子区域、SFRP2基因的启动子区域、Reprimo基因的启动子区域、APC基因的启动子区域。CpG部位中的胞嘧啶有受到甲基化修饰的情况和未受甲基化修饰的情况。本发明中，将该胞嘧啶受到甲基化修饰的核酸称为“甲基化核酸”，将该胞嘧啶未受甲基化修饰的核酸称为“非甲基化核酸”。

本发明的方法中，其特征在于，使用引物组来进行扩增工序，所述引物组至少含有不区分非甲基化核酸和甲基化核酸的第1引物、以及区分非甲基化核酸和甲基化核酸的第2引物。进而，其特征还在于，第2引物具有与第1引物实质相同的引物区域。这里，所谓引物区域，是指目标基因和/或基因位点的含CpG核酸的碱基序列的一部分，是为了设计引物而选择的区域。引物区域的长度、即引物的大小根据使用的扩增反应的种类而定，例如如果使用PCR法，则优选为5～40bp，更优选10～30bp。

本方法中使用的引物，具有与模板含CpG核酸的引物区域的碱基序列实质上互补的碱基序列，由从其3’末端能够延伸DNA链的低聚核苷酸构成。所谓“实质上互补”，是指引物的碱基序列可以与引物区域的碱基序列不完全互补，只要在扩增反应的条件下，对于与模板核酸进行杂交而言为足够的互补即可。

所谓第1引物的“不区分非甲基化核酸和甲基化核酸”，是指第1引物在扩增反应的条件下，无论是与非甲基化核酸还是与甲基化核酸均能非特异性地进行杂交，能够进行其后的扩增反应。本说明书中，将具有该功能的引物称为“非特异性引物”。第1引物的序列可以不含CpG部位，也可以含有CpG部位。含有CpG部位时，与该CpG部位的胞嘧啶互补的碱基优选被混合碱基(Y)和/或混合碱基(R)和/或肌苷酸(I)取代。此外，第1引物的序列中，优选含有至少1个CpG部位，并且，与该CpG部位的胞嘧啶互补的碱基优选被混合碱基(Y)和/或混合碱基(R)和/或肌苷酸(I)取代。

所谓第2引物的“区分非甲基化核酸和甲基化核酸”，是指第2引物在扩增反应的条件下，能够与非甲基化核酸或者甲基化核酸特异性进行杂交的引物，因此，意味着与另一者实质上不杂交。本说明书中，将具有该功能的引物称为“特异性引物”。

进而，第2引物具有与第1引物实质相同的引物区域。所谓“实质相同”，并不意味着完全相同。第2引物的序列可以在第1引物的序列的3’末端和/或5’末端分别附加和/或缺失1～8个、优选1～5个碱基。这意味着引物区域可以延伸和/或缩短。当然，可以完全没有附加和缺失。进一步优选两末端的附加和/或缺失的和为5个以下。

另外，对于第2引物的序列，与第1引物的序列相比，碱基不同存在1～8个，优选存在3～6个。该不同中包括上述3’或5’末端中的碱基的附加和/或缺失。例如，第1引物中不含CpG部位时，通过附加碱基，能够使第2引物中含有CpG部位。另外，例如，第1引物的混合碱基(Y)和/或混合碱基(R)和/或肌苷酸(I)对于第2引物来说有时可以被胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)取代。这样，也有在第1引物和第2引物的引物区域的重复部分中存在不同的碱基的情况。这些是由于第1引物为非特异性引物、而与此相对第2引物为特异性引物而产生的序列差异。进一步优选在第2引物的序列中含有至少2个CpG部位，并且该CpG部位在甲基化核酸的序列或非甲基化核酸的序列中特异性存在。

扩增反应可以使用本身公知的方法。具体可以举出聚合酶链反应法(PCR法，Science，230：1350-1354，1985)、NASBA法(基于核酸序列的扩增(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)法，Nature，350，91-92，1991)和LAMP法(日本特开2001-242169号公报)等，可以优选使用PCR法。另外，引物的设计有必要根据扩增反应的种类而适当变化，除了第1引物和第2引物以外，还可以使用其他引物。

例如，使用PCR法时，除了第1引物和第2引物以外，还可以进一步使用第3引物。第3引物不区分非甲基化核酸和甲基化核酸，与第1引物或第2引物成对，进行扩增反应。PCR反应时，由第1引物或第2引物、与第3引物生成的扩增产物优选约为100bp～300bp，进一步优选约为100bp～200bp，当然，在以下的检测方法中，只要是能够解析的产物，就并不限于这些。另外，由于第1引物和第2引物的引物区域实质相同，因此由第1引物第3引物得到的扩增片段以及由第2引物和第3引物得到的扩增片段是实质上同样大小的片段。即，可以认为这些扩增片段的大小的差理论上为0～16bp，优选为0～10bp。

这里，以扩增反应使用PCR法时为例，对本发明的方法中使用的引物进行具体说明。应说明的是，各引物的碱基序列请参照实施例。

对于EPM2AIP基因的启动子区域(hMLH1-5’区域)，以甲基化核酸的扩增为目的时，作为第1引物，可以使用EPM2AIP-F(序列编号1)，作为第2引物，可以使用EPM2AIP-IM(序列编号4)，作为第3引物，可以使用EPM2AIP-R(序列编号2)。而对于相同的hMLH1-5’区域，以非甲基化核酸的扩增为目的时，作为第1引物，可以使用EPM2AIP-F(序列编号1)，作为第2引物，可以使用EPM2AIP-IU(序列编号3)，作为第3引物，可以使用EPM2AIP-R(序列编号2)。

对于RASSF2A基因的启动子区域，以甲基化核酸的扩增为目的时，作为第1引物，可以使用RASSF2A-R(序列编号6)，作为第2引物，可以使用RASSF2A-IM(序列编号8)，作为第3引物，可以使用RASSF2A-F(序列编号5)。而对于相同的RASSF2A基因の启动子区域，以非甲基化核酸的扩增为目的时，作为第1引物，可以使用RASSF2A-R(序列编号6)，作为第2引物，可以使用RASSF2A-IU(序列编号7)，作为第3引物，可以使用RASSF2A-F(序列编号5)。

对于SFRP2基因的启动子区域，以甲基化核酸的扩增为目的时，作为第1引物，可以使用SFRP2-F(序列编号9)，作为第2引物，可以使用SFRP2-IM(序列编号11)，作为第3引物，可以使用SFRP2-R(序列编号10)。

对于Reprimo基因的启动子区域，以甲基化核酸的扩增为目的时，作为第1引物，可以使用Rep-R(序列编号13)，作为第2引物，可以使用Rep-IM(序列编号14)，作为第3引物，可以使用Rep-F(序列编号12)。

对于APC基因的启动子区域，以甲基化核酸的扩增为目的时，作为第1引物，可以使用APC-R(序列编号16)，作为第2引物，可以使用APC-IM(序列编号18)，作为第3引物，可以使用APC-F2(序列编号17)。

本发明的方法中使用的引物可以使用以往型的磷酸三酯法和磷酸二酯法、或者它们被自动化的实施方式等任意的合适方法进行制备。对于这样的自动化的实施方式之一，作为起始原料使用二乙基亚磷酰胺，该化合物可以按照Beaucage等的报道(Tetrahedron Letters，22：1859-1862，1981)合成。在改变固体支持体上合成低聚核苷酸的方法记载于美国专利第4458066号。

本发明的引物还包括在其序列末端附加了用于检测的适当标记，例如荧光色素、酶、蛋白、放射性同位素、化学发光物质、生物素等的引物。作为本发明中使用的荧光色素，可以优选使用一般将碱基标记，用于核酸的定量、检测等的荧光色素，可以举出例如HEX(4，7，2’，4’，5’，7’-六氯-6-羧基荧光素，绿色荧光色素)、荧光黄(fluorescein)、NED(Applied Biosystems公司商品名，黄色荧光色素)、或者6-FAM(Applied Biosystems公司商品名，黄绿色荧光色素)、若丹明(rhodamin)或其衍生物(例如，四甲基若丹明(TMR))、VIC(AppliedBiosystems公司商品名，绿色荧光色素)、PET(Applied Biosystems公司商品名，红色荧光色素)等，但并不限于这些。用荧光色素标记碱基的方法可以使用公知的标记法中合适的方法(参照NatureBiotechnology，14，p303-308(1996))。另外，还可以使用市售的荧光标记试剂盒(例如，Amersham Pharmacia公司制低聚核苷酸ECL3’-低聚标记体系等)。

荧光物质可以附加到非特异性引物中，在扩增反应使用PCR法时，优选在第1引物或第3引物中的任一者中附加荧光色素。

本发明的方法中，对采用PCR法进行扩增反应时的用荧光色素标记的引物的具体例进行说明。对于引物的序列请参照实施例。

对于RASSF2A基因的启动子区域，以甲基化核酸的扩增为目的时，作为第1引物，可以使用RASSF2A-R(序列编号6)，作为第2引物，可以使用RASSF2A-IM(序列编号8)，作为第3引物，可以使用RASSF2A-F(序列编号5)、在第3引物的5’末端中附加了6-FAM的引物。

对于SFRP2基因的启动子区域，以甲基化核酸的扩增为目的时，作为第1引物，可以使用SFRP2-F(序列编号9)，作为第2引物，可以使用SFRP2-IM(序列编号11)，作为第3引物，可以使用SFRP2-R(序列编号10)、在第3引物的5’末端中附加了NED的引物。

对于Reprimo基因的启动子区域，以甲基化核酸的扩增为目的时，作为第1引物，可以使用Rep-R(序列编号13)，作为第2引物，可以使用Rep-IM(序列编号14)，作为第3引物，可以使用Rep-F(序列编号12)、在第1引物的5’末端中附加了VIC的引物。

对于APC基因的启动子区域，以甲基化核酸的扩增为目的时，作为第1引物，可以使用APC-R(序列编号16)，作为第2引物，可以使用APC-IM(序列编号18)，作为第3引物，可以使用APC-F2(序列编号17)、在第3引物的5’末端中附加了PET的引物。

本方法中，通过使第1引物和第2引物的浓度比例发生变化，能够以所需的比例和灵敏度得到扩增产物。

优选第1引物和第2引物的浓度比为10∶1～1∶1，更优选为5∶1～1∶1，进一步优选为3∶1～1∶1。使第2引物的浓度增加时，来源于第2引物能够特异性扩增的核酸的扩增产物的比例增加。该第2引物的效果认为在第1引物和第2引物的浓度比为2∶1时得到最大发挥。

本发明的检测方法中，所谓进行目标基因和/或基因位点中的甲基化核酸或非甲基化核酸的检测，是指检测有无甲基化核酸和/或非甲基化核酸，或者检测甲基化核酸和非甲基化核酸的比例。

本发明的检测方法包括如下工序：将由上述扩增方法得到的扩增产物(1)用合适的限制酶进行处理，通过电泳、序列分析仪等确认片段的大小，判断非甲基化DNA和/或甲基化DNA的有无和/或量的工序；(2)用搭载了由与扩增产物的除引物区域以外的区域的碱基序列互补的序列构成的核苷酸的微阵列，判断非甲基化DNA和/或甲基化DNA的有无和/或量的工序。根据该检测方法，能够对扩增产物的除引物区域以外的区域检测出非甲基化和/或甲基化。

在包含用限制酶进行处理的工序的检测方法中使用的限制酶，优选识别在扩增片段序列的除了引物区域的序列中存在的CG或TG。可以根据基因的种类、扩增产物的序列选择限制酶。对于用限制酶进行处理的时间等处理条件，可以适当进行调整。用限制酶进行处理的时间优选为5分钟至12小时，更优选5分钟至15分钟。

对于EPM2AIP基因的启动子区域(hMLH1-5’区域)，使用EPM2AIP-F(序列编号1)、EPM2AIP-R(序列编号2)、EPM2AIP-IM(序列编号4)或EPM2AIP-IU(序列编号3)三者作为引物组进行扩增工序时，可以使用限制酶HhaI。

对于RASSF2A基因的启动子区域，使用RASSF2A-R(序列编号6)、RASSF2A-F(序列编号5)、RASSF2A-IM(序列编号8)或RASSF2A-IU(序列编号7)三者作为引物组进行扩增工序时，可以使用限制酶HhaI。

对于SFRP2基因的启动子区域，使用SFRP2-F(序列编号9)、SFRP2-IM(序列编号11)、SFRP2-R(序列编号10)作为引物组进行扩增工序时，可以使用限制酶BssHII。

对于Reprimo基因的启动子区域，使用Rep-R(序列编号13)、Rep-IM(序列编号14)、Rep-F(序列编号12)作为引物组进行扩增工序时；以及对于APC基因的启动子区域，使用APC-R(序列编号16)、APC-IM(序列编号18)、APC-F2(序列编号17)作为引物组进行扩增工序时，可以使用限制酶TaqI。

另外，还可以对多个基因扩增产物同时进行限制酶处理。对RASSF2A基因和SFRP2基因的扩增产物同时进行限制酶处理时，可以使用限制酶HhaI。对Reprimo基因和APC基因的扩增产物同时进行限制酶处理时，可以使用限制酶TaqI。

通过采用电泳确认用限制酶处理后的扩增片段的大小，可以判定非甲基化DNA和/或甲基化DNA的有无和/或量。电泳可以通过本身公知的方法进行。还可以使用序列分析仪来代替电泳，确认片段的大小。使用序列分析仪时，用于扩增反应的引物优选使用通过荧光色素等标记的引物。

使用序列分析仪的检测方法中，能够对多种基因区域一次性进行解析，是有用的。例如使用能够区分4种荧光色素的序列分析仪时，可以将各个荧光色素附加到与4种基因区域对应的引物中进行扩增反应。另外，为了使来源于4种基因区域的扩增产物的碱基长度不同，有必要进行引物的设计。扩增产物的碱基长度不同至少为2bp，优选10bp以上。反应后的扩增产物可以同时应用于序列分析仪而进行解析。

使用序列分析仪的检测方法的另一优点在于，能够大幅缩短、减少限制酶反应时间和试样量。

例如，不使用序列分析仪进行判定时，用限制酶得到扩增物的处理时间根据限制酶的浓度而变化，基本需要8小时以上。另外，对于采用不使用序列分析仪的电泳进行判定时，对每个成为扩增对象的各基因需要30分钟以上的泳动时间。例如，使用4个基因作为标记进行判定时，由于必须对各基因进行电泳，因此需要的时间为120分钟(4×30分钟)以上。此外，对于电泳，用PCR进行扩增反应时，至少需要5μL的扩增反应液。

另一方面，使用序列分析仪进行判定时，在采用序列分析仪进行的泳动中，用PCR进行扩增反应时所必需的扩增反应液的量为微量，例如使用0.02μL的PCR扩增反应液就足够了。由于必需的扩增反应液的量与电泳相比为微量，因此使用同等的限制酶量时，限制酶处理需要的时间为5分钟至10分钟就足够了。另外，即使在使用多个基因作为标记时，也能用序列分析仪一次性地进行泳动。因此，对于1个试样的4个基因进行判定所需要的时间为30分钟(1×30分钟)。

在使用微阵列捕捉扩增产物的方法中，优选在搭载于微阵列的低聚核苷酸中附加检测物质、例如荧光物质。

根据上述扩增方法，在为了提高扩增工序的成功率而放宽扩增工序的条件时，各引物对于与该引物的序列互补的DNA的特异性有可能减少。但是，由于通过上述(1)、(2)的工序识别非甲基化和/或甲基化DNA，因此特异性减少的问题得到消除。另外，通过本发明的检测方法，由于并非仅以有无扩增产物来判断有无非甲基化或甲基化DNA，因此能够确认扩增工序的错误。因此，能够比现有例更可靠地判定非甲基化和/或甲基化DNA的有无和/或量。

另外，对于本方法，作为样本，不仅可以使用组织、血液，还可以使用各种体液、排泄物。由于排泄物等能够非侵害性获得的样本无需在特定场所进行采集，因此能够利用它们的本方法对于各种癌的早期诊断等可以非常通用地使用，是有用的。

因此，通过本发明的检测方法，通过对规定基因和/或基因位点、例如抑癌基因的启动子区域检测有无甲基化，能够简便且高精度地进行癌等细胞增殖性疾病的判定(诊断)。当基因的启动子区域中发生DNA的甲基化时，该基因的表达受到抑制。当该基因为抑癌基因时，由于机体中抑癌基因的表达受到抑制，因此导致癌产生并发展。

使用本方法，通过检测上述生物学试样的甲基化核酸和非甲基化核酸，能够检测细胞增殖性疾病和/或炎症性疾病。上述细胞增殖性疾病和/或炎症性疾病可以选自低度星形细胞瘤、未分化星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、咽喉癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、胰腺癌、胰腺炎、小肠癌、克罗恩病、结肠癌、直肠癌、溃疡性大肠炎、肺癌、肾癌、白血病、乳癌、前列腺癌、子宫内膜癌和神经母细胞瘤。

进而，本发明还涉及上述扩增方法和检测方法中使用的引物组。该引物组是至少含有第1引物和第2引物、可进一步含有第3引物的组。进而，可以含有本发明的扩增反应所必需的引物。另外，这些引物可以用荧光色素进行标记。

本发明还涉及包含上述引物组的试剂盒。试剂盒可以含有其他需要的试剂，例如酶、缓冲液等。

实施例

以下，通过实施例说明本发明，但本发明不受它们的限定。

(实施例1)DNA试样的制备

从大肠正常粘膜提取DNA。对于从大肠正常粘膜提取出的DNA，各基因的启动子区域的CpG区域基本上为非甲基化。因此，由从大肠正常粘膜提取出的DNA筛选已确认为非甲基化的DNA，作为“非甲基化DNA”。“甲基化DNA”通过将该“非甲基化DNA”用SssI甲基转移酶进行处理而得到。

对于各DNA进行重亚硫酸盐(bisulfite)处理。处理后，将甲基化DNA和非甲基化DNA以各种比率混合制成混合模板的试样。混合模板试样以将甲基化DNA的比率(％)调节为100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0的方式制成。

(实施例2)

通过本发明的扩增方法进行试样DNA的扩增，将扩增产物进行电泳，从而对其效果进行研究。以下，将采用电泳进行的本发明的检测方法也称为Hi-SA法(高灵敏度分析，High-Sensitive Assay)。

首先，使用实施例1中制作的模板试样中甲基化DNA的比率为50％的试样(非甲基化DNA∶甲基化DNA＝1∶1)，对于Hi-SA法的“非特异性引物”的效果，以EPM2AIP基因的启动子区域(hMLH1-5’区域)为模型进行研究。

能够扩增EPM2AIP基因的启动子区域(hMLH1-5’区域)的Hi-SA法的引物如下所示。

EPM2AIP-F：5’-YGGGTAAGTYGTTTTGAYGTAGA(序列编号1)

EPM2AIP-R：5’-TATACCTAATCTATCRCCRCCTCA(序列编号2)

EPM2AIP-IU：5’-CGGGTAAGTCGTTTTGACGTAGA(序列编号3)

EPM2AIP-IM：5’-TGGGTAAGTTGTTTTGATGTAGA(序列编号4)

EPM2AIP-F(序列编号1)和EPM2AIP-R(序列编号2)为非特异性引物，设计为既与存在非甲基化胞嘧啶的DNA杂交又与存在甲基化胞嘧啶的DNA杂交。通过这2个引物，无论有无甲基化胞嘧啶，都得到150bp的扩增产物。

EPM2AIP-IU(序列编号3)是对非甲基化DNA的特异性引物，EPM2AIP-IM(序列编号4)是对甲基化DNA的特异性引物(以下，有时也将对非甲基化DNA的特异性引物记为“IU”，将对甲基化DNA的特异性引物记为“IM”)。

添加HotStarTaq(QIAGEN公司)15μL、试样DNA溶液2μL、EPM2AIP-F(序列编号1)的引物和EPM2AIP-R(序列编号2)的引物各0.4μM(最终浓度)，使EPM2AIP-IU(序列编号3)的引物或EPM2AIP-IM(序列编号4)的引物浓度变化而添加，制备合计30μL的PCR反应溶液，进行扩增反应。EPM2AIP-IU(序列编号3)的引物或EPM2AIP-IM(序列编号4)的引物以最终浓度(μM)为下述表1所示的数值的方式变化而添加。此外，表中记为“C”的体系为没有添加IU和IM任一者的体系。

[表1]

PCR扩增反应如下进行：以95℃进行15分钟，然后以95℃20秒、59℃40秒、72℃20秒为1个循环合计进行3个循环，然后以95℃20秒、57℃30秒、72℃20秒为1个循环合计进行7个循环，然后以95℃20秒、55℃30秒、72℃20秒为1个循环合计进行35个循环，最后在72℃进行7分钟。

PCR扩增工序后，使用限制酶HhaI，在37℃进行12小时处理，用2.5％琼脂凝胶进行电泳。

将其结果示于图1。在图1中，SM表示尺寸标记物，各列表示表1的各体系。U表示非甲基化PCR产物的条带，M表示将甲基化PCR产物用限制酶分解而生成的2个条带。

另外，EPM2AIP基因的Hi-SA法合计进行6次，算出没有被限制酶切断的PCR产物的比例(％)。在本实施例中，没有被限制酶切断的PCR产物可以认为是以非甲基化DNA为模板而扩增的产物。将这些结果示于图2和表2。应说明的是，将以非甲基化DNA为模板而扩增的产物称为非甲基化PCR产物，将以甲基化DNA为模板而扩增的产物称为甲基化PCR产物。

[表2]

将特异性引物的浓度、以及能检测出的非甲基化PCR产物、甲基化PCR产物的检测量以曲线表示的图示于图2。可以确认，用于检测非甲基化、甲基化的特异性引物的浓度，相对于Hi-SA法的非特异性引物的浓度，直到1/2量为止显示出加性效果，但在1/2量以上不显示效果。

由以上结果可知，通过使识别非甲基化DNA或甲基化DNA的特异性引物的比例变化，能够以任意比率扩增甲基化DNA和非甲基化DNA两者并进行检测。此外，能够获得相加的特异性引物的效果可以推测为是特异性引物和非特异性引物的浓度比为1∶2时。直到特异性引物为非特异性引物的浓度的1/2为止，特异性引物的浓度和目标非甲基化或甲基化DNA的PCR产物的浓度可以确认为相加性(直线性)关系。

(实施例3)

然后，对于RASSF2A基因的启动子区域，与实施例2同样地设定Hi-SA法引物(图3A)，甲基化DNA和非甲基化DNA使用1∶1的试样进行IU和IM效果的确认。应说明的是，在图3A中，上部的灰色方块表示非翻译区域的外显子，其上方的箭头表示转录开始部。中央实线上的竖线表示各CpG部位。竖线上的菱形表示限制酶识别部位。下部的粗线表示由COBRA法或Hi-SA法得到的PCR产物。其下的箭头表示IM引物。

另外，使用实施例1中制作的各种混合比例的9种DNA试样，进行COBRA法和Hi-SA法，进行Hi-SA法效果的确认。

(实施例3-1)

能够扩增RASSF2A基因的启动子区域的Hi-SA法引物如下所示。

RASSF2A-F：5’-TGAAGAGYGAGAGAAAAGAGAGGA(序列编号5)

RASSF2A-R：5’-TCCAACCAAACTAAACAAACRATAA(序列编号6)

RASSF2A-IU：5’-CCAACCAAACTAAACAAACAATAACCA(序列编号7)

RASSF2A-IM ：5’-CCAACCAAACTAAACAAACGATAACCG(序列编号8)

RASSF2A-F(序列编号5)和RASSF2A-R(序列编号6)为非特异性引物，设计为既与存在甲基化胞嘧啶的DNA杂交又与存在非甲基化胞嘧啶的DNA杂交，通过这2个引物，无论有无甲基化胞嘧啶，都得到160bp的扩增产物。

RASSF2A-IU(序列编号7)设计为仅与存在非甲基化胞嘧啶的DNA杂交，RASSF2A-IM(序列编号8)设计为仅与存在甲基化胞嘧啶的DNA杂交。

添加HotStarTaq(QIAGEN公司)15μL、试样DNA溶液2μL、RASSF2A-F(序列编号5)的引物和RASSF2A-R(序列编号6)的引物各0.4μM(最终浓度)，使RASSF2A-IU(序列编号7)的引物或RASSF2A-IM(序列编号8)的引物浓度变化而添加，制备合计30μL的PCR反应溶液，进行扩增反应。RASSF2A-IU(序列编号7)的引物或RASSF2A-IM(序列编号8)的引物以最终浓度(μM)为0.8、0.4、0.2、0.1的方式添加。

PCR扩增工序后，使用限制酶HhaI，在37℃进行12小时处理，用3％琼脂凝胶进行电泳。图3B中示出其结果。图3中，SM表示尺寸标记物，各列表示加入的非甲基化或甲基化特异性引物的浓度(μM)。U表示非甲基化PCR产物的条带，M表示将甲基化PCR产物用限制酶分解而生成的2个条带。与实施例2同样地确认了IU或IM引物的效果。

(实施例3-2)

然后，为了检测甲基化DNA，对于RASSF2A基因的启动子区域进行COBRA法和Hi-SA法。使用实施例1中制作的9种混合比例的DNA试样，进行COBRA法和Hi-SA法的甲基化检测灵敏度的研究。

能够扩增RASSF2A基因的启动子区域的COBRA法引物与Hi-SA法同样使用RASSF2A-F(序列编号5)和RASSF2A-R(序列编号6)。本实施例中，由于以检测甲基化DNA为目的，因此Hi-SA法中的特异性引物仅使用作为甲基化特异性引物的RASSF2A-IM(序列编号8)。

COBRA法的核酸扩增反应中，使用HotStarTaq(QIAGEN公司)15μL、各引物0.4μM(最终浓度)、各DNA试样(实施例1中制备)2μL、合计30μL的PCR反应溶液。

Hi-SA法的核酸扩增反应中，使用HotStarTaq(QIAGEN公司)15μL、非特异性引物各0.4μM(最终浓度)、特异性引物0.2μM(最终浓度)、各DNA试样(实施例1中制备)2μL、合计30μL的PCR反应溶液。

Hi-SA法和COBRA法的扩增反应均如下进行：以95℃进行15分钟，然后以95℃20秒、59℃40秒、72℃20秒为1个循环合计进行3个循环，然后以95℃20秒、57℃30秒、72℃20秒为1个循环合计进行7个循环，然后以95℃20秒、55℃30秒、72℃20秒为1个循环合计进行35个循环，最后在72℃进行7分钟。

PCR扩增工序后，使用限制酶HhaI，在37℃进行12小时处理，用3％琼脂凝胶进行电泳。

将RASSF2A基因的启动子区域的Hi-SA法和COBRA法的结果示于图3C。在图3C中，SM表示尺寸标记物，各列的数值表示试样DNA中的甲基化DNA的比率(％)。箭头表示甲基化PCR产物的分解物。

COBRA法以1％的甲基化检测为检测限，但根据本实施例的引物比率，Hi-SA法能够进行0.1％的甲基化检测。这样，Hi-SA法能够高灵敏度地检测出作为目标的DNA的非甲基化或甲基化。

(实施例4)

与实施例3-2同样，以甲基化DNA的检测为目的，对3个区域进行了COBRA法和Hi-SA法。进行研究的区域是SFRP2、Reprimo、APC基因的启动子区域(图4)，这些是在大肠癌中报道被甲基化的基因的启动子区域。图4中，中央的实线表示各基因。上部的灰色方块表示非翻译区域的外显子，上部的黑色方块表示翻译区域的外显子，方块上方的箭头表示转录开始部。中央实线上的竖线表示各CpG部位。竖线上的菱形表示限制酶识别部位。下部的粗线表示由COBRA法或Hi-SA法得到的PCR产物。其下的箭头表示IM引物。

使用实施例1中制作的10种试样，进行COBRA法和Hi-SA法的甲基化检测灵敏度的研究。

(i)SFRP2基因

能够扩增SFRP2基因的启动子区域的COBRA法引物如下所示。

SFRP2-F：5’-GTYGGAGTTTTTYGGAGTTG(序列编号9)

SFRP2-R：5’-ACCCRCTCTCTTCRCTAAATAC(序列编号10)

SFRP2-F(序列编号9)和SFRP2-R(序列编号10)设计为既与存在甲基化胞嘧啶的DNA杂交又与存在非甲基化胞嘧啶的DNA杂交。通过这2个引物，无论有无甲基化胞嘧啶，都得到139bp的扩增产物。

能够扩增SFRP2基因的启动子区域的Hi-SA法引物如下所示。

SFRP2-F：5’-GTYGGAGTTTTTYGGAGTTG(序列编号9)

SFRP2-R：5’-ACCCRCTCTCTTCRCTAAATAC(序列编号10)

SFRP2-IM：5’-CGGAGTTTTTCGGAGTTGC(序列编号11)

SFRP2-F(序列编号9)和SFRP2-R(序列编号10)为与COBRA法相同的非特异性引物，通过这2个引物，无论有无甲基化胞嘧啶，都得到139bp的扩增产物。

SFRP2-IM(序列编号11)设计为仅与存在甲基化胞嘧啶的DNA杂交。

(ii)Reprimo基因

能够扩增Reprimo基因的启动子区域的COBRA法引物如下所示。

Rep-F：5’-GGTTTTGTGTTTTATTGYGGAGTG(序列编号12)

Rep-R：5’-AAAAATTTCCCAAAAACCTCTCC(序列编号13)

Rep-F(序列编号12)和Rep-R(序列编号13)设计为既与存在甲基化胞嘧啶的DNA杂交又与存在非甲基化胞嘧啶的DNA杂交。通过这2个引物，无论有无甲基化胞嘧啶，都得到138bp的扩增产物。

能够扩增Reprimo基因的启动子区域的Hi-SA法引物如下所示。

Rep-F：5’-GGTTTTGTGTTTTATTGYGGAGTG(序列编号12)

Rep-R：5’-AAAAATTTCCCAAAAACCTCTCC(序列编号13)

Rep-IM：5’-AAAAATTTCCCAAAAACCTCTCCGACG(序列编号14)

Rep-F(序列编号12)和Rep-R(序列编号13)为与COBRA法相同的非特异性引物，通过这2个引物，无论有无甲基化胞嘧啶，都得到138bp的扩增产物。

Rep-IM(序列编号14)设计为仅与存在甲基化胞嘧啶的DNA杂交。

(iii)APC基因

能够扩增APC基因的启动子区域的COBRA法引物如下所示。

APC-F1：5’-GGTTTTGTGTTTTATTGYGGAGTG(序列编号15)

APC-R：5’-CACCAATACAACCACATATCNATCAC(序列编号16)

APC-F1(序列编号15)和APC-R(序列编号16)设计为既与存在甲基化胞嘧啶的DNA杂交又与存在非甲基化胞嘧啶的DNA杂交。通过这2个引物，无论有无甲基化胞嘧啶，都得到156bp的扩增产物。

能够扩增APC基因的启动子区域的Hi-SA法引物如下所示。

APC-F2：5’-GGTTTTGTGTTTTATTGNGGAGTG(序列编号17)

APC-R：5’-CACCAATACAACCACATATCNATCAC(序列编号16)

APC-IM：5’-ACCAATACAACCACATATCGATCACG(序列编号18)

APC-F2(序列编号17)和APC-R(序列编号16)为与COBRA法相同的非特异性引物，通过这2个引物，无论有无甲基化胞嘧啶，都得到138bp的扩增产物。

APC-IM(序列编号18)设计为仅与存在甲基化胞嘧啶的DNA杂交。应说明的是，APC-F2(序列编号17)和APC-R(序列编号16)的序列中的N为肌苷酸(I)。

(iv)扩增工序

COBRA法的核酸扩增反应中，使用HotStarTaq(QIAGEN公司)15μL、各引物10mM(最终浓度)、各DNA试样(实施例1中制备)2μL、合计30μL的PCR反应溶液。

对于SFRP2基因的扩增反应，Hi-SA法和COBRA法均如下进行：以95℃进行15分钟，然后以95℃20秒、58℃40秒、72℃20秒为1个循环合计进行3个循环，然后以95℃20秒、56℃30秒、72℃20秒为1个循环合计进行8个循环，然后以95℃20秒、54℃30秒、72℃20秒为1个循环合计进行15个循环，以95℃20秒、52℃30秒、72℃20秒为1个循环合计进行20个循环，最后在72℃进行7分钟。

对于Reprimo基因和APC基因的扩增反应，Hi-SA法和COBRA法均以与RASSF2A相同的条件(实施例3)进行。

PCR扩增工序后，对于Hi-SA法和COBRA法均进行如下操作：对SFRP2的扩增产物，使用限制酶BssHII(New England Bio Lab公司)，在50℃进行12小时处理，对Reprimo和APC的扩增产物，使用限制酶TaqI(New England Bio Lab公司)，在65℃，进行12小时处理。

将各区域的Hi-SA法和COBRA法的结果示于图5。图5中，SM表示尺寸标记物，各列的数值表示试样DNA中的甲基化DNA的比率(％)。箭头表示甲基化PCR产物的分解物。

SFRP2基因、Reprimo基因和APC基因的各启动子区域中，COBRA法以0.5～5％的甲基化检测为检测限，但Hi-SA法显示出COBRA法5～10倍的灵敏度。这样，Hi-SA法能够高灵敏度地检测出作为目标的DNA的非甲基化或甲基化。

另外，虽然在各基因中使用了不同种类的限制酶(对RASSF2A基因使用HhaI(实施例3)，对SFRP2基因使用BssHII，对Reprimo基因和APC基因使用TaqI)，但与限制酶的种类无关显示出同样的效果。由以上可以预测，Hi-SA法可以与扩增的基因或基因位点的部位、限制酶的效果无关地使用。即，可以认为Hi-SA法能够普遍成立。可以认为，通过改变特异性引物的浓度和序列，能够以任意的灵敏度检测出作为目标的DNA的非甲基化和/或甲基化。

(实施例5)

然后，使用Hi-SA法，以RASSF2A基因为标记，以由大肠癌患者14例得到的粪便和由在大肠内窥镜检查中大肠中没有发现瘤的患者14例得到的粪便为对象，进行研究。

粪便样本的核酸修饰处理通过特开2006-166712号公报(特愿2004-359471号)的方法进行，使用得到的试样进行Hi-SA法。Hi-SA法与实施例3的方法同样地进行。

将结果示于图6。在图6中，各列的编号表示试样编号。SM表示尺寸标记物，箭头表示甲基化PCR产物的分解物，M表示检测出了甲基化。

对于RASSF2A基因的甲基化，来源于大肠患者的粪便样本在14例中检测出6例(43％)，来源于健康者的粪便样本在14例中检测出0例(0％)。

(实施例6)DNA试样的制备

对于各DNA进行重亚硫酸盐(bisulfite)处理。处理后，将仅为非甲基化DNA的试样作为U(非甲基化DNA的对照)，将甲基化DNA作为M(甲基化DNA的对照)。

(实施例7)

通过本发明的扩增方法进行试样DNA的扩增，将扩增产物应用于序列分析仪进行非甲基化扩增产物和/或甲基化扩增产物的检测。引物使用附加有荧光物质的引物。将使用该荧光物质的方法也称为荧光Hi-SA法。

在实施例3和实施例4中使用的RASSF2A基因、SFRP2基因、Reprimo基因、APC基因中，使用实施例6中制作的试样，进行荧光Hi-SA法。对于各基因的区域，使用以下的附加有荧光物质的引物。

(i)RASSF2A基因

RASSF2A-F：5’-FAM-TGAAGAGYGAGAGAAAAGAGAGGA(序列编号5)

RASSF2A-R：5’-TCCAACCAAACTAAACAAACRATAA(序列编号6)

RASSF2A-IM：5’-CCAACCAAACTAAACAAACGATAACCG(序列编号8)

(ii)SFRP2基因

SFRP2-F：5’-GTYGGAGTTTTTYGGAGTTG(序列编号9)

SFRP2-R：5’-NED-ACCCRCTCTCTTCRCTAAATAC(序列编号10)

SFRP2-IM：5’-CGGAGTTTTTCGGAGTTGC(序列编号11)

(iii)Reprimo基因

Rep-F：5’-GGTTTTGTGTTTTATTGYGGAGTG(序列编号12)

Rep-R：5’-VIC-AAAAATTTCCCAAAAACCTCTCC(序列编号13)

Rep-IM：5’-AAAAATTTCCCAAAAACCTCTCCGACG(序列编号14)

(iv)APC基因

APC-F2：5’-PET-GGTTTTGTGTTTTATTGNGGAGTG(序列编号17)

APC-R：5’-CACCAATACAACCACATATCNATCAC(序列编号16)

APC-IM：5’-ACCAATACAACCACATATCGATCACG(序列编号18)

荧光Hi-SA法的核酸扩增反应中，使用HotStarTaq(QIAGEN公司)15μL、非特异性引物各0.4μM(最终浓度)、特异性引物0.2μM(最终浓度)、各DNA试样(实施例6中制备)2μL、合计30μL的PCR反应溶液。扩增反应按照实施例4进行。

将RASSF2A基因和SFRP2基因的扩增产物各1μL混合，用限制酶HhaI，在37℃进行10小时处理。将Reprimo基因和APC基因的扩增产物各1μL混合，用限制酶TaqI，在65℃进行10小时处理。采集将RASSF2A基因和SFRP2基因的扩增产物各1μL混合并用限制酶HhaI进行了处理的产物1μL、以及将Reprimo基因和APC基因的扩增产物各1μL混合并用限制酶TaqI进行了处理的产物1μL，加入超纯水98μL制成100μL，由该溶液取出1μL应用于序列分析仪(ABI 310R GeneticAnalyzer)。数据的获取包括预载在内约需1小时。为了比较检测灵敏度，对各扩增产物(PCR反应液10μL)用3％琼脂凝胶进行电泳。

将结果示于图7。表示各RASSF2A基因、SFRP2基因、Reprimo基因、APC基因的结果。对于各区域，上段表示使用对照(仅为非甲基化DNA的试样)进行扩增反应的结果，下段表示使用甲基化DNA进行扩增反应的结果。另外，左面的波形为序列分析仪的结果，右面的照片为电泳的结果。SM表示尺寸标记物，白色箭头表示非甲基化PCR产物，灰色箭头表示甲基化PCR产物的分解物。

对于使用序列分析仪的荧光Hi-SA法，可知比使用电泳的Hi-SA法灵敏度高，能够检测出甲基化DNA或非甲基化DNA。

(实施例8)

通过使用以荧光物质标记的引物的Hi-SA法，以由大肠腺瘤性息肉病患者和大肠癌患者得到的粪便为对象进行研究。粪便样本的核酸修饰处理通过特开2006-166712号公报(特愿2004-359471号)的方法进行。作为标记物使用实施例7中记载的4个区域，与实施例7的方法同样地进行荧光Hi-SA法。

将结果示于图8。各患者的波形从上段开始表示RASSF2A基因、Reprimo基因、SFRP2基因、APC基因的结果。对于各区域，白色箭头表示非甲基化PCR产物，灰色箭头表示甲基化PCR产物的分解物。由这些结果可知，即使是使用序列分析仪时，也能够高灵敏度地检测出粪便样本中的甲基化DNA和非甲基化DNA。

产业上的可应用性

如以上说明所述，本发明的方法可以与扩增的基因和/或基因位点的部位、限制酶无关地实施。另外，通过改变特异性引物的浓度和序列，使灵敏度任意上升，能够检测出作为目标的核酸的非甲基化或甲基化。因此，根据本发明的方法，能够正确且高灵敏度地检测出有无甲基化或非甲基化，另外，还能够定量地检测出甲基化核酸和/或非甲基化核酸。

另外，本发明的检查方法能够由机体样本、尤其是由粪便样本来判定大肠中存在的癌。实施例中示出的基因启动子区域的甲基化的有无表示，能够通过本方法由粪便检测来源于正常粘膜组织的DNA或来源于大肠癌组织的DNA的甲基化的有无。像这样能够在实用上利用非侵害性DNA材料，不仅在各种疾病的诊断上有用，而且能够在操作上处理多个样本，因此能够进行以正常群体为对象的对大肠癌等的各种诊断的应用。另外，已知粪便难以进行DNA的提取和精制，因此可以认为，本发明的方法不仅能够使用粪便、还能够实现使用各种机体样本的应用。因此，本方法不仅能够应用于大肠癌的诊断，还能够应用于对广泛的各种存在于各脏器的癌、瘤的诊断，另外，还可以认为能对该瘤进行某种程度的预测。

IP0923681P

序列表

<110>Bio-Dixam，LLC.

<120>扩增甲基化核酸或非甲基化核酸的方法

<130>GP08-1015

<160>18

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>基于EPM2AIP基因而设计的DNA

<400>1

ygggtaagty gttttgaygt aga 23

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>基于EPM2AIP基因而设计的DNA

<400>2

tatacctaat ctatcrccrc ctca 24

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>基于EPM2AIP基因而设计的DNA

<400>3

cgggtaagtc gttttgacgt aga 23

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>基于EPM2AIP基因而设计的DNA

<400>4

tgggtaagtt gttttgatgt aga 23

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>基于RASSF2A基因而设计的DNA

<400>5

tgaagagyga gagaaaagag agga 24

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>基于RASSF2A基因而设计的DNA

<400>6

tccaaccaaa ctaaacaaac rataa 25

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>基于RASSF2A基因而设计的DNA

<400>7

ccaaccaaac taaacaaaca ataacca 27

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>基于RASSF2A基因而设计的DNA

<400>8

ccaaccaaac taaacaaacg ataaccg 27

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>基于SFRP2基因而设计的DNA

<400>9

gtyggagttt ttyggagttg 20

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>基于SFRP2基因而设计的DNA

<400>10

acccrctctc ttcrctaaat ac 22

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>基于SFRP2基因而设计的DNA

<400>11

cggagttttt cggagttgc 19

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>基于Reprimo基因而设计的DNA

<400>12

ggttttgtgt tttattgygg agtg 24

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>基于Reprimo基因而设计的DNA

<400>13

aaaaatttcc caaaaacctc tcc 23

<210>14

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>基于Reprimo基因而设计的DNA

<400>14

aaaaatttcc caaaaacctc tccgacg 27

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>基于APC基因而设计的DNA

<400>15

ggttttgtgt tttattgygg agtg 24

<210>16

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>基于APC基因而设计的DNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>n stands for inosinic acid

<400>.16

caccaataca accacatatc natcac 26

<210>17

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>基于APC基因而设计的DNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(18)

<223>n stands for inosinic acid

<400>17

ggttttgtgt tttattgngg agtg 24

<210>18

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>基于APC基因而设计的DNA

<400>18

accaatacaa ccacatatcg atcacg 26

Claims

1.一种试剂盒，其特征在于，含有：

1)由第1引物、第2引物、以及第3引物构成的引物组，其中，

第1引物为不区分非甲基化核酸和甲基化核酸的引物，

第2引物为区分非甲基化核酸和甲基化核酸、且具有与第1引物实质相同的引物区域的引物，以及

第3引物为不区分甲基化核酸和非甲基化核酸、而具有与第1引物或第2引物成对地扩增核酸的功能的引物；

该引物组被用于通过聚合酶链反应(PCR)来扩增含CpG核酸，所述含CpG核酸是通过使生物学试样与修饰非甲基化胞嘧啶的试剂接触而能够存在于被处理的生物学试样中的，

所述修饰非甲基化胞嘧啶的试剂将能够存在于生物学试样中的含CpG核酸的非甲基化胞嘧啶转换为尿嘧啶；

2)限制酶，所述限制酶识别扩增片段的序列中除引物区域以外的序列中存在的CG或TG。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，在第1引物的序列中含有至少1个CpG部位，并且与该CpG部位的胞嘧啶对应的位置的碱基，被混合碱基Y和/或混合碱基R和/或肌苷酸I取代。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，在第2引物的序列中含有至少2个CpG部位，并且，该CpG部位在甲基化核酸的序列或非甲基化核酸的序列中特异性存在。

4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，第1引物和第2引物的浓度比为10：1～1：1。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，第1引物和第2引物的浓度比为10：1～1：1。