JP5043320B2 - メチル化dna及び/又は非メチル化dnaの検出方法 - Google Patents
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Description
を含む、メチル化DNA及び/又は非メチル化DNAの検出用キット。
1.本発明の概要
本発明は、bisulfite処理及びPCR法と、DNAマイクロアレイを用いた検出法とを組合せたメチル化DNA及び/又は非メチル化DNAの検出方法であり、ハイブリダイゼーション溶液(DNAマイクロアレイと接触させる溶液)の調製に用いるDNA断片として、PCR後の増幅断片(二本鎖DNA断片)の一方の鎖を分解及び/又は除去して得られる一本鎖DNA断片を用いることを特徴とするものである。
2.メチル化DNA及び/又は非メチル化DNAの検出方法
本発明の検出方法は、メチル化DNA及び/又は非メチル化DNAを検出する方法であって、下記の工程を含むことを特徴とする。
工程(b):前記被験試料中の核酸を増幅して二本鎖DNA断片を得る工程
工程(c):前記二本鎖DNA断片の一方の鎖を分解及び/又は除去して一本鎖DNA断片とする工程
工程(d):前記一本鎖DNA断片を、当該断片とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブが搭載されたDNAマイクロアレイに接触させる工程
以下に、本発明の検出方法の詳細を各工程ごとに説明する。
本工程では、被験試料中の核酸に非メチル化シトシンを修飾する試薬を接触させる。
(2) 工程(b)について
本工程では、工程(a)における試薬の接触後、被験試料中の核酸を増幅して二本鎖DNA断片を得る。
(3) 工程(c)について
本工程では、工程(b)における増幅で得られた二本鎖DNA断片の一方の鎖を分解及び/又は除去して一本鎖DNA断片とする。
(4) 工程(d)について
本工程では、工程(c)で得られた一本鎖DNA断片を、当該断片とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブ(キャプチャープローブ)が搭載されたDNAマイクロアレイに接触させる。
(ii) 前記配列体を包埋し、ブロック体を製造する工程
(iii) オリゴヌクレオチドプローブを含むゲル前駆体重合性溶液を前記ブロック体の各中空繊維の中空部に導入して重合反応を行い、プローブを含むゲル状物を中空部に保持させる工程
(iv) 中空繊維の長手方向と交差する方向で切断して、ブロック体を薄片化する工程
中空繊維に使用される材料としては、限定はされないが、例えば、特開2004-163211号公報等に記載の材料が好ましく挙げられる。
検出後は、例えば以下の処理により、メチル化率(メチレーションレベル)を算出してメチル化DNAの存在割合を評価することができる。すなわち、まず下記式(I):
M/(M+U) (I)により、「メチル化DNA用プローブのスポットにおける蛍光強度(M)」と「非メチル化DNA用プローブのスポットにおける蛍光強度(U)」との和に対する「上記蛍光強度(M)」の比の値を求め、予め作成しておいた検量線からメチル化率を求めることができる(詳しくは実施例参照)。なお、この評価方法が採用できるのは、工程(b)におけるプライマーセットとして、非メチル化DNAを修飾試薬(工程(a))で処理した核酸と、メチル化DNAとを共に増幅し得るプライマーを用いた場合である。
(5) 本発明の検出方法の用途
本発明の検出方法は、例えば、腫瘍の良悪性の判定方法に好ましく利用できる。詳しくは、本発明の検出方法により得られた検出結果から、腫瘍組織及び正常組織に由来するそれぞれの染色体DNAについてメチル化の割合を比較することにより、腫瘍の良性又は悪性を判定することができる。
3.メチル化DNA及び/又は非メチル化DNAの検出用キット
本発明のキットは、下記(a)〜(d)の構成成分を含むことを特徴とするものである。なお、各構成成分の詳細については、前述した説明が同様に適用できる。
(b) メチル化シトシンを含むDNA及び前記修飾された塩基を含む核酸を共に増幅し得るプライマーセットであって、一方のプライマーは5’末端がリン酸化されたものである当該セット
(c) λエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素
(d) 前記(b)のプライマーセットを用いて増幅された二本鎖DNA断片を前記(c)の酵素で処理して得られる一本鎖DNA断片とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブが搭載されたDNAマイクロアレイ
本発明のキットは、前述した本発明の検出方法、腫瘍の良悪性の判定方法、腫瘍の性質の判定方法、腫瘍の発生リスクの判定方法のいずれにも有効に用いることができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
貫通孔型のDNAマイクロアレイを、以下の手順で製造した。
DNAマイクロアレイに搭載するオリゴヌクレオチドプローブ(キャプチャープローブ)として、下記配列番号1〜8に示す配列情報をもつ5'末端ビニル化核酸分子を用いた。これら核酸分子の調製方法を以下に示す。
「p16-M」
5'-GCCGCCCGCTACCTACTCTACCCCTCTCCGCAACCGCCGAACGCACTCGATCCG-3'(配列番号1)
「p16-U」
5'-ACCACCCACTACCTACTCTACCCCTATCCACAACCACCAAACACACTCAATCCA-3'(配列番号2)
「LOX-M」
5'-GCCAAACGCCCGAAACCGCCGACGACTCGCGCGAAAACTACTATTAACCGACGACG-3'(配列番号3)
「LOX-U」
5'-ACCAAACACCCAAAACCACCAACAACTCACACAAAAACTACTATTAACCAACAACA-3'(配列番号4)
「RUNX3-M」
5'-GCCCCAACGTCAAAAAACTACGACCCGAAAAAAAACGACAAAAACGCCTTCCGTAAAACCCGAACG-3'(配列番号5)
「RUNX3-U」
5'-ACCCCAACATCAAAAAACTACAACCCAAAAAAAAACAACAAAAACACCTTCCATAAAACCCAAACA-3'(配列番号6)
「TIG1-M」
5'-GCTCCGAACCCGTATCTATCGAATACCGAACCAACTTTCCTACGTCCATACAACCCCGCCGACAACG-3'(配列番号7)
「TIG1-U」
5'-ACTCCAAACCCATATCTATCAAATACCAAACCAACTTTCCTACATCCATACAACCCCACCAACAACA-3'(配列番号8)
(2) 中空繊維束(中空繊維配列体)の製造
図1に示す配列固定器具を利用して中空繊維束(中空繊維配列体)を製造した。なお、図1中のx、y、zは互いに直交する3次元軸であり、x軸は上記中空繊維の長手方向と一致する。
次に、下記表1に示す配合割合(プローブに関しては濃度)で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液を調製した。当該溶液は、先に調製したプローブの種類ごとに調製した。
上記(3)で得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向に厚さ0.25mmで200枚スライスし、得られた薄片シートをDNAマイクロアレイとした。
2.メチル化DNA及び非メチル化DNAの検出
(1) 被験試料の調製
合計26名の患者(男性及び女性)から、胃の上皮の腫瘍組織及び正常組織をそれぞれ採取した。採取した組織サンプルは、実験に用いるまで-80℃で保存しておいた。DNAの抽出はSepaGene(三光純薬社製)を用いて行い、被験試料とした。
(i) 1.0μg 0μg 0%
(ii) 0.75μg 0.25μg 25%
(iii) 0.5μg 0.5μg 50%
(vi) 0.25μg 0.75μg 75%
(v) 0μg 1.0μg 100%
(2) 重亜硫酸塩(bisulfite)処理
被験試料のゲノムDNA(染色体DNA)におけるメチル化されていないシトシンを全てウラシルに変換するため、CpGenomeTM DNA Modification Kit(CHEMICON#S7820)を用いてbisulfite処理を行った。
・20mM NaOH/90% EtOH溶液:
900μlの98%エタノールに、93.4μlの滅菌水と6.6μlの3M NaOHを加えて混合した。
・CpGenomeTM DNA Modification Kitに付属のReagent II溶液:
20mlの滅菌水に1μlのβ-メルカプトエタノールを加えて混合した(1液とする)。
以下の(i)〜(viii)のPCRプライマー(Bex社;配列番号9〜16)を購入した。奇数番号のプライマー「(i),(iii),(v),(vii)」は5'末端がcy5で蛍光標識化されており、偶数番号のプライマー「(ii),(iv),(vi),(viii)」は5'末端がリン酸化(P)されている。すべて20μMの溶液となるように調製した。なお、(iv),(vi),(vii),(viii)のプライマーは、配列中にイノシン(I)を含む。
cy5-GGTTAATTTGGTAAAAGGAGTGATG(配列番号9)
(ii) LOX-R-p:
P-TTATTCTCCCATTAAATCTACTAAC(配列番号10)
(iii) cy5-P16-F:
cy5-AGAAAGAGGAGGGGTTGGTTGGTTATTAGA(配列番号11)
(iv) p16-IR-p:
P-CAACCAATCAACCIAAAACTCCATACTACT(配列番号12)
(v) cy5-RUNX3-F:
cy5-GGGTAAATGTTAGAAATTTGTTTAGAA(配列番号13)
(vi) RUNX3-IR-p:
P-TTACAAAAATCACAAACCCIAAACAACAAAAACT(配列番号14)
(vii) cy5-TIG1-IF:
cy5-TGGGTTIGGATTAGGGAGTAGGTAG(配列番号15)
(viii) TIG1-IR-p:
P-AAAAACCCACCACIACCTTATTTCC(配列番号16)
各プライマーを以下の配合で混合し、マルチプレックス用プライマーmixを調製した。
滅菌水 600μl
合計 1000μl
Multiplex PCRは、QIGEN Multiplex PCR kit(QIGEN社)を用い、GeneAmp9700(アプライドバイオシステムズ社、50μl,maxモード)により、以下の反応液組成及び反応条件で行った。
<反応液組成>
テンプレート(bisulfite処理済ゲノムDNA) 2.5μl
マルチプレックス用プライマーmix 10μl
マルチプレックスマスターMix 25μl
滅菌水 12.5μl
合計 50μl
<反応条件>
以下に概略を示すが、特に、サイクル条件については、解離:94℃(30sec)→アニーリング:55℃(1min)→合成:72℃(30sec)を1サイクルとして計10サイクル行い、続いて、解離:94℃(30sec)→アニーリング:60℃(1min)→合成:72℃(30sec)を1サイクルとして40サイクル行い、計50サイクル行った。
精製して得られたPCR産物(二本鎖DNA断片)を、Strandaseキット(NovaGen社)を使用して一本鎖DNA断片とした。具体的には、下記の反応液組成で、37℃で20分間インキュベートして酵素処理を行い、その後75℃で10分間加熱して酵素を不活性化させた。
10×buffer 2μl
Strandase 4μl
滅菌水 4.7μl
合計 20μl
上記酵素処理後の反応液を、QIAGEN PCR MinElute purification kit(QIAGEN社)を用いてカラム精製し、10μl、1回で溶出した。以下に具体的な手順(a)〜(h)を説明する。
以下のように各溶液を混合し、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。
20×SSC 5μl
20%SDS 1μl
滅菌水 78μl
合計 100μl
100μlのハイブリダイゼーション溶液を、前記1.で製造したDNAマイクロアレイに接触させ(アプライし)、65℃で16時間ハイブリダイゼーション反応を行った。
ハイブリダイゼーション反応後、以下の手順(a)〜(d)でDNAマイクロアレイを洗浄した。
上記洗浄後、三菱レイヨン社製の冷却CCD式蛍光検出装置(型番:0060304)を用い、下記検出条件で、各スポットの蛍光シグナルを測定した。
<検出条件>
中心励起波長 :630nm
蛍光フィルター:Cy5フィルター
露光時間 :200 msec
(8) メチル化率
被験試料の検出結果に基づき、下記式(I)により、「メチル化DNA用プローブのスポットにおける蛍光強度(M)」と「非メチル化DNA用プローブのスポットにおける蛍光強度(U)」との和に対する「上記蛍光強度(M)」の比の値を算出した。その結果を下記表4に示す。
LOX: メチル化率(%)=107.99×[M/(M+U)] (R2=0.9687)
RUNX3: メチル化率(%)=94.018×[M/(M+U)] (R2=0.9522)
TIG1: メチル化率(%)=101.28×[M/(M+U)] (R2=0.9707)
表4に示した各値を上記関係式に代入してメチル化率(%)を算出し、また、算出したメチル化率に応じて、更に5段階に分けて評価した。具体的には、レベル1:20%未満;レベル2:20%以上、40%未満;レベル3:40%以上、60%未満;レベル4:60%以上、80%未満;レベル5:80%以上に分けて評価した。その結果を下記表5に示す。
以下の2種の二本鎖DNAを合成した。すなわち、メチル化DNAのモデル核酸として、TIG1のプロモーター領域の塩基配列を含むDNAを合成し、非メチル化DNAをbisulfite処理した核酸のモデル核酸として、メチル化DNAのモデル核酸のうちシトシン(C)がチミン(T)に変換されたDNAを合成した。なお、PCRの鋳型としてはウラシル(U)とチミン(T)は同等である。但し、後者のDNAにおいてCがTに変換されているのは、センス鎖に相当する方の鎖である。
TIG1-Mcon1
5'-TGGGTTCGGATTAGGGAGTAGGTAGTCGTTGTCGGCGGGGTTGTATGGACGTAGGAAAGTTGGTTCGGTATTCGATAGATACGGG-3' (配列番号17)
TIG1-Mcon2
5'-AAAAACCCACCACGACCTTATTTCCGCGAACGCCGACACTACCCGCTCCGAACCCGTATCTATCGAATACCGAACCAACTTTCCT-3'(配列番号18)
TIG1-Ucon1
5'-TGGGTTTGGATTAGGGAGTAGGTAGTTGTTGTTGGTGGGGTTGTATGGATGTAGGAAAGTTGGTTTGGTATTTGATAGATATGGG-3'(配列番号19)
TIG1-Ucon2
5'-AAAAACCCACCACAACCTTATTTCCACAAACACCAACACTACCCACTCCAAACCCATATCTATCAAATACCAAACCAACTTTCCT-3'(配列番号20)
以下の反応液組成で混合後、94℃で2分間加熱し、室温で30分間放置して冷却することにより、TIG1-Mcon1とTIG1-Mcon2、及び、TIG1-Ucon1とTIG1-Ucon2を、図3に示すようにアニールさせた。
TIG1-Mcon2(又はTIG1-Ucon2) 5μl
Second Strand Buffer 30μl
(インビトロジェン社)
滅菌水 103μl
合計 143μl
上記反応後の溶液を氷上に置き、以下の反応液組成で、混合後16℃で2時間インキュベートした。その後、反応系にT4 polymerase(インビトロジェン社)を2μl添加し、さらに16℃で15分間インキュベートすることにより、アニール部分の両側の一本鎖DNAについて相補鎖を合成し、2種の二本鎖DNA(「M」又は「U」と称する)を合成した。
5'-TGGGTTIGGATTAGGGAGTAGGTAG-3'(配列番号21)
Rプライマー:
5'-AAAAACCCACCACIACCTTATTTCC-3'(配列番号22)
<反応液組成>
テンプレート(M又はU) 1μl
10×buffer 5μl
2.5mM dNTP 4μl
HotStarTaq 0.5μl
Fプライマー(20μM) 1μl
Rプライマー(20μM) 1μl
滅菌水 37.5μl
合計 50μl
<反応条件>
94℃で10分間加熱後、「解離:94℃(30sec)→アニーリング:50℃(30sec)→合成:72℃(30sec)」を1サイクルとして計35サイクル行い、次いで72℃で5分間加熱した後、4℃で冷却した。
U:1.999(A260)= 99.9ng/μl
2.モデル核酸の増幅
次いで、上記2種の二本鎖DNAを、それぞれ個別に、同じPCRプライマーセットを用いて増幅した。
cy5-TGGGTTIGGATTAGGGAGTAGGTAG(配列番号23)
Rプライマー:
P-AAAAACCCACCACIACCTTATTTCC (配列番号24)
<反応液組成>
テンプレート(M又はU)(10pg/μl) 1μl
10×buffer 5μl
2.5mM dNTP 4μl
HotStarTaq 0.5μl
Fプライマー(20μM) 1μl
Rプライマー(20μM) 1μl
滅菌水 37.5μl
合計 50μl
<反応条件>
94℃で10分間加熱後、「解離:94℃(30sec)→アニーリング:50℃(30sec)→合成:72℃(30sec)」を1サイクルとして計35サイクル行い、次いで72℃で5分間加熱した後、4℃で冷却した。
3.増幅断片の一本鎖化
得られた増幅断片の一方の鎖を分解して、2種の一本鎖化されたDNAを得た。詳しくは、Strandaseキット(NovaGen社)を使用し、増幅断片においてリン酸化されている方の鎖をStrandaseにより分解した。
(前記カラム精製後の溶出液)
10×buffer 2μl
Strandase 4μl
滅菌水 4.7μl
合計 20μl
反応後の液を、QIAGEN PCR MinElute精製キット(QIGEN社)でカラム精製し、10μl、1回で溶出した。そのうち2μlとり吸光度を測定したところ、下記のとおりであった。これらを希釈して、一本鎖化したM及びU(それぞれ「Mss」及び「Uss」と称する)ともに5ng/μlの溶液とした。
Uss:0.982(A260)=32.4ng/μl
Mss及びUssをアジレント バイオアナライザーで電気泳動した結果、いずれの断片についても一本のバンドが確認された(図5参照)。
4.一本鎖のモデル核酸の調製
上記一本鎖化DNAとは別に、一本鎖のモデル核酸として、以下の2種の一本鎖DNAを合成した。すなわち、上記2種の一本鎖化DNA(Mss及びUss)の一部の塩基配列からなる一本鎖DNAを合成した。詳しくは、cy5-TIG1-M1は、Mssの一部の塩基配列からなり、cy5-TIG1-U1は、Ussの一部の塩基配列からなる。なお、これら一部の塩基配列とは、検出時に用いるDNAマイクロアレイに搭載するプローブの塩基配列と完全相補な配列である。また、いずれの合成一本鎖DNAも、5'末端がcy5で蛍光標識化されている。
cy5-CGTTGTCGGCGGGGTTGTATGGACGTAGGAAAGTTGGTTCGGTATTCGATAGATACGGGTTCGGAGC(配列番号25)
cy5-TIG1-U1:
cy5-TGTTGTTGGTGGGGTTGTATGGATGTAGGAAAGTTGGTTTGGTATTTGATAGATATGGGTTTGGAGT(配列番号26)
5.各種検出サンプル、及びハイブリダイゼーション溶液の調製
調製した一本鎖化DNA(Mss及びUss)及び合成一本鎖DNA(cy5-TIG1-M1及びcy5-TIG1-U1)を用いて、下記表6及び表7に示す配合割合で各種検出サンプルを調製した。
20%SDS 1μl
滅菌水 90μl
合計 96μl
合成一本鎖DNAを用いた各検出サンプル(10μl)には、以下の混合溶液を加えて、合計100μlのハイブリダイゼーション溶液を調製した。
20%SDS 1μl
滅菌水 84μl
合計 90μl
6.ハイブリダイゼーション
上記検出サンプルごとに、100μlのハイブリダイゼーション溶液を、実施例1の1.で製造したDNAマイクロアレイに接触させ(アプライし)、65℃で16時間ハイブリダイゼーション反応を行った。
7.蛍光標識の検出、及びメチル化率の算出
上記洗浄後、三菱レイヨン社製の冷却CCD式蛍光検出装置(型番:0060304)を用い、実施例1の2.(7)と同様の検出条件で、各スポットの蛍光シグナルを測定した。なお、各スポットでの蛍光シグナルの強さが検出サンプルごとに異なる様子を図6(a)の写真に示した。
〔比較例1〕
Uds:2.522(A260)=126.1ng/μl
Mds及びUdsをアジレント バイオアナライザーで電気泳動した結果、いずれの断片についても一本のバンドが確認された(図5参照)。
20%SDS 1μl
滅菌水 86μl
合計 92μl
上記各検出サンプルについて、実施例2の6.及び7.と同様にして、ハイブリダイゼーション、蛍光標識の検出、及びメチル化率の算出を行った。その結果をプロットしたグラフを図7に示す。なお、各スポットでの蛍光シグナルの強さが検出サンプルごとに異なる様子を図6(b)の写真に示した。
21 多孔板
31 中空繊維
41 板状物
配列番号2:合成DNA
配列番号3:合成DNA
配列番号4:合成DNA
配列番号5:合成DNA
配列番号6:合成DNA
配列番号7:合成DNA
配列番号8:合成DNA
配列番号9:合成DNA
配列番号10:合成DNA
配列番号11:合成DNA
配列番号12:合成DNA
配列番号13:合成DNA
配列番号14:合成DNA
配列番号15:合成DNA
配列番号16:合成DNA
配列番号17:合成DNA
配列番号18:合成DNA
配列番号19:合成DNA
配列番号20:合成DNA
配列番号21:合成DNA
配列番号22:合成DNA
配列番号23:合成DNA
配列番号24:合成DNA
配列番号25:合成DNA
配列番号26:合成DNA
Claims (3)
- メチル化DNA及び/又は非メチル化DNAを検出する方法であって、
(a) 被験試料中の核酸に非メチル化シトシンを修飾する試薬を接触させる工程と、
(b) メチル化シトシンを含むDNA及び前記修飾された塩基を含む核酸を共に増幅し得る標識化したPCRプライマーセットを用い、前記被験試料中の核酸を増幅して二本鎖DNA断片を得る工程と、
(c) 前記二本鎖DNA断片の一方の鎖を分解及び/又は除去して一本鎖DNA断片とする工程と、
(d) 前記一本鎖DNA断片を、当該断片とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブが搭載されたDNAマイクロアレイに接触させ、当該プローブに結合したDNA断片の検出強度を測定する工程と、
(e)予め作成した検量線から、前記検出強度に基づいて、メチル化率を算出する工程と
を含み、
前記検量線は、シトシンが完全にメチル化された核酸と完全にメチル化されていない核酸とを配合し、メチル化率が0%、25%、50%、75%及び100%に調製された配合サンプル用いて、前記(a)〜(d)と同様の工程を行うことにより作成された、R2値が0.9465以上のものである、
前記方法。 - (a) 非メチル化シトシンを修飾する試薬、
(b) メチル化シトシンを含むDNA及び前記修飾された塩基を含む核酸を共に増幅し得る標識化したPCRプライマーセットであって、一方のプライマーは5’末端がリン酸化されたものである当該セット、
(c) λエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、
(d) 前記(b)のプライマーセットを用いて増幅された二本鎖DNA断片を前記(c)の酵素で処理して得られる一本鎖DNA断片とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブが搭載されたDNAマイクロアレイ、並びに
(e) シトシンが完全にメチル化された核酸と完全にメチル化されていない核酸とを配合し、メチル化率が0%、25%、50%、75%及び100%に調製された、検量線作成用の配合サンプル
を含む、請求項1に記載の方法に用いるための、メチル化DNA及び/又は非メチル化DNAの検出用キット。 - 請求項1に記載の方法により得られた検出結果から、腫瘍組織及び正常組織に由来するそれぞれの染色体DNAについてメチル化の割合を比較することを含む、良性又は悪性腫瘍の検出を補助する方法。
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