JP6290202B2 - ヌクレオチド変異体を検出するためのヌクレアーゼ保護方法 - Google Patents

Description

関連出願への相互参照
本願は、２０１２年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／６６６，４５６号、および２０１３年５月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／８２９，１０２号の利益を主張し、この米国仮特許出願の双方の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。

分野
本開示は、特に、ヌクレアーゼ保護方法を活用して、標的核酸分子内の１つまたは複数のヌクレオチド変異体を検出するための方法に関する。

背景
多くの疾患または障害は、タンパク質発現もしくはタンパク質活性の破壊、または細胞過程の制御異常もしくは細胞の制御不能な成長および増殖をもたらす細胞シグナル伝達経路の破壊を特徴とする。これらの破壊は、特定のタンパク質の活性もしくは発現に影響を及ぼす遺伝子変化（また、変異とも呼ばれる）または他の変化により引き起こされることが多い。多くの障害のための診断および／または処置の選択は、特定の障害を有することが知られているかまたは特定の障害を有することが疑われる被験体に由来する試料中の特定の遺伝子変化の同定を含む。

ヒト疾患の発症および進行に関与している変異および分子署名を検出するための診断検査および診断法の持続的な開発が必要とされている。このような方法および診断検査はとりわけ、新たな薬物のスクリーニングのほか、治療のために患者を選択し、標的とする治療に対する患者の応答性をモニタリングする方法の開発を容易とする。

要旨
本明細書では、ヌクレアーゼ保護アッセイを活用して、標的核酸内のヌクレオチド変異体の存在を検出するための方法が開示される。一例では、方法は、試料を、少なくとも２つのプローブと接触させるステップであって、第１のプローブが、標的核酸内のヌクレオチド変異体の位置（複数可）において、野生型（非変異体）ヌクレオチド（複数可）と相補的なヌクレオチド（複数可）を含み、第２のプローブが、標的核酸内のヌクレオチド変異体の位置（複数可）において、変異体ヌクレオチド（複数可）と相補的なヌクレオチド（複数可）を含むステップを含む。試料を、少なくとも２つのプローブと、プローブが標的核酸にハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させ、ハイブリダイズした核酸分子とハイブリダイズしなかった核酸分子との混合物を生成する。混合物は、一本鎖核酸分子に特異的なヌクレアーゼと、ハイブリダイズしなかった核酸分子（または核酸分子のハイブリダイズしなかった部分）を除去するのに十分な条件下で接触させる。次いで、ヌクレアーゼ処理後に残存する少なくとも２つのプローブの存在および／または量を検出し、これにより、試料中の変異体および／または非変異体の標的核酸の存在を検出する。

本願は特定の実施形態形態において例えば以下の項目を提供する：
（項目１）
試料中の標的核酸内のヌクレオチド変異体の存在を検出する方法であって、
該試料を、ヌクレオチド変異体を含む該標的核酸分子と相補的な少なくとも２つのプローブと、該第１のプローブおよび該第２のプローブが該標的核酸にハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させて、ハイブリダイズした核酸分子とハイブリダイズしなかった核酸分子との混合物を生成するステップであって、
該第１のプローブは、該標的核酸分子のヌクレオチド変異体における野生型と相補的であり、該標的核酸分子のヌクレオチド変異体の位置は、該第１のプローブの末端から少なくとも２塩基であり、
該第２のプローブは、該標的核酸分子のヌクレオチド変異体の第１の変異体と相補的であり、該標的核酸のヌクレオチド変異体の位置は、該第２のプローブのａｎから少なくとも２塩基であるステップと；
ハイブリダイズした核酸分子とハイブリダイズしなかった核酸分子との該混合物を、一本鎖核酸分子に特異的なヌクレアーゼと、該ハイブリダイズしなかった核酸分子を除去するのに十分な条件下で接触させるステップと；
該混合物中の、該プローブのうちの１つまたは複数の存在を検出して、これにより、該試料中の該ヌクレオチド変異体の存在を検出するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記ヌクレオチド変異体の位置が、各プローブの末端から２〜６塩基である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ヌクレオチド変異体の位置が、各プローブの末端から３塩基である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記第１のプローブおよび前記第２のプローブの各々が、検出可能な標識を含む、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記第１のプローブおよび前記第２のプローブが末端で標識されている、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記標的核酸分子のヌクレオチド変異体の位置が、前記第１のプローブの５’末端から少なくとも２塩基であり、前記検出可能な標識が、該第１のプローブの５’末端にあり、
該標的核酸分子のヌクレオチド変異体の位置が、前記第２のプローブの３’末端から少なくとも２塩基であり、該検出可能な標識が、該第２のプローブの３’末端にある、
項目５に記載の方法。
（項目７）
前記標的核酸分子のヌクレオチド変異体の位置が、前記第１のプローブの３’末端から少なくとも２塩基であり、前記検出可能な標識が、該第１のプローブの３’末端にあり、
該標的核酸分子のヌクレオチド変異体の位置が、前記第２のプローブの５’末端から少なくとも２塩基であり、該検出可能な標識が、該第２のプローブの５’末端にある、
項目５に記載の方法。
（項目８）
前記第１のプローブおよび前記第２のプローブの各々が、前記検出可能な標識を５’末端に含む、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記第１のプローブおよび前記第２のプローブの各々が、前記検出可能な標識を３’末端に含む、項目５に記載の方法。
（項目１０）
前記検出可能な標識が、ハプテン、蛍光分子、酵素、または放射性同位元素を含む、項目４から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記検出可能な標識が、ビオチンを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記混合物中の、前記プローブのうちの１つまたは複数の存在を検出するステップが、該プローブを、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼにコンジュゲートされたアビジンまたはストレプトアビジンと接触させることを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記第１のプローブおよび前記第２のプローブが、異なる検出可能な標識を含む、項目４から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記第１のプローブおよび前記第２のプローブが、同じ検出可能な標識を含む、項目４から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記試料を、前記標的核酸分子のヌクレオチド変異体における第２の変異体と相補的な第３のプローブおよび該第３のプローブの末端における検出可能な標識と、該第３のプローブが該標的核酸にハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップであって、該標的核酸のヌクレオチド変異体の位置が、該第３のプローブの標識された末端から少なくとも２塩基であるステップをさらに含む、項目４から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記試料を、前記標的核酸分子のヌクレオチド変異体における第３の変異体と相補的な第４のプローブおよび該第４のプローブの末端における検出可能な標識と、該第４のプローブが該標的核酸にハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップであって、該標的核酸のヌクレオチド変異体の位置が、該第４のプローブの標識された末端から少なくとも２塩基であるステップをさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記少なくとも２つのプローブが前記標的核酸にハイブリダイズするのに十分な前記条件が、該少なくとも２つのプローブを、前記試料と、約５０℃で約１６時間にわたりインキュベートすることを含む、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記少なくとも２つのプローブの各々が、１８〜７５ヌクレオチドを含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記少なくとも２つのプローブ各々が、約５０℃〜約７０℃の融解温度（Ｔ _ｍ ）を有する、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記少なくとも２つのプローブ各々が約６０℃のＴ _ｍ を有する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記少なくとも２つのプローブの各々が、２０〜４１ヌクレオチドを含む、項目１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記プローブのうちの少なくとも１つが、１つまたは複数の改変ヌクレオチドを含む、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記１つまたは複数の改変ヌクレオチドが、ロックト核酸、ペプチド核酸、非天然ヌクレオチド、またはこれらの２つ以上の組合せを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
一本鎖核酸分子に特異的な前記ヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼを含む、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記ハイブリダイズしなかった核酸分子を除去するのに十分な前記条件が、ハイブリダイズした核酸分子とハイブリダイズしなかった核酸分子との前記混合物を、前記Ｓ１ヌクレアーゼと、約６０℃で約２時間にわたり、または約５０℃で約１時間にわたり接触させることを含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記混合物中の、前記プローブのうちの１つまたは複数の存在を検出するステップが、配列決定、核酸増幅、または質量分析を含む、項目１から３または１７から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記混合物中の、前記プローブのうちの１つまたは複数の存在を検出するステップが、キャピラリー電気泳動を含む、項目４から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記混合物中の、前記プローブのうちの１つまたは複数の存在を検出するステップが、
該混合物を、複数の空間的に離れた領域を含む表面であって、各領域が、少なくとも１つのアンカーであって、該アンカーに特異的に結合する第１の部分および該プローブのうちの１つに特異的に結合する第２の部分を含む二官能性リンカーと会合させたアンカーを含む表面と、該プローブが該二官能性リンカーの該第２の部分に特異的に結合するのに十分な条件下で接触させることと；
前記検出可能な標識の存在を検出することと
を含む、項目４から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記混合物中の、前記プローブのうちの１つまたは複数の存在を検出するステップが、
該混合物を、表面の亜集団を含む表面の集団であって、表面の各亜集団が、少なくとも１つのアンカーであって、該アンカーに特異的に結合する第１の部分および該プローブのうちの１つに特異的に結合する第２の部分を含む二官能性リンカーと会合させたアンカーを含む表面の集団と、該プローブが該二官能性リンカーの該第２の部分に特異的に結合するのに十分な条件下で接触させることと；
前記検出可能な標識の存在を検出することと
を含む、項目４から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
表面の前記集団が、ビーズまたはマイクロ流体チャネルの集団を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
表面の前記集団が、
実質的に類似する第１のアンカーが安定的に結合している第１の表面、および実質的に類似する第２のアンカーが結合している第２の表面であって、該第１のアンカーと第２のアンカーは実質的に互いに異なる、第１の表面および第２の表面と；
該第１のアンカーと相補的な第１の部分および前記第１のプローブと相補的な第２の部分を有する第１の二官能性リンカーと；
該第２のアンカーと相補的な第１の部分および前記第２のプローブと相補的な第２の部分を有する第２の二官能性リンカーと
を含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記アンカーが、前記二官能性リンカーに特異的に結合する第１の領域と、スペーサー分子を含む第２の領域とを含む、項目２８から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記スペーサー分子を含む前記第２の領域が、前記第１の領域と前記表面との間にある、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記試料を溶解させるステップをさらに含む、項目１から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記試料が、組織、固定された組織、腫瘍生検、細胞、血液、体液、または単離核酸を含む、項目１から３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記単離核酸が、ＲＮＡまたはｍＲＮＡを含む、項目３５に記載の方法。
本開示の上記の特色および他の特色は、付属の図面を参照しながら進められる以下の詳細な記載から明らかとなる。

図１Ａは、試料中の非変異体（野生型）または変異体の標的核酸の存在を検出するための例示的なヌクレアーゼ保護アッセイを示す概略図である。この例示的な方法では、変異体位置は、プローブのそれぞれの末端の近くにあり（例えば、末端から約２〜８塩基）、プローブ配列は、変異体位置の領域においてのみ重複している（本明細書におけるいくつかの例で「オフセット」プローブまたは「コンペティマー」プローブと呼ぶ）。非変異体プローブは、プローブの３’末端の近くにあり、プローブの３’末端に検出可能な標識（Ｄ）を含む変異体位置に非変異体（野生型）ヌクレオチド（Ｎ）と相補的なヌクレオチド（ｃＮ）を含む。変異体プローブは、プローブの５’末端の近くにあり、プローブの５’末端に検出可能な標識（Ｄ）を含む変異体位置に変異体ヌクレオチド（Ｖ）と相補的なヌクレオチド（ｃＶ）を含む。２つのプローブは、標的核酸（例えば、存在する場合、標的変異体形態および／または標的非変異体形態）へのハイブリダイゼーションについて競合し、プローブのハイブリダイゼーションは、重複領域（検出可能な標識を含む）において相互に排他的である。標的変異体形態が試料中に存在する場合、変異体プローブは、ハイブリダイズし、ヌクレアーゼ消化から保護され、標識は検出されるが、非変異体プローブの３’部分は、ハイブリダイズせず、標識を含むミスマッチ部分は、ヌクレアーゼにより切断され、その後に検出されない。標的非変異体が試料中に存在する場合、非変異体プローブは、ハイブリダイズし、ヌクレアーゼ消化から保護され、標識は検出されるが、変異体プローブの５’部分は、ハイブリダイズせず、検出可能な標識を含むミスマッチ部分は、ヌクレアーゼにより切断され、その後に検出されない。標的変異体形態および非変異体形態の両方が試料中に存在する場合、両方のプローブが、試料中に存在する変異体標的形態と非変異体標的形態との比と同様の比で保護され、両方が検出される。下部の囲みは、表面に結合させた異なるアンカーを有するマイクロアレイを用いる例示的な検出方法を示す。各アンカーは、アンカーと相補的な部分および変異体プローブ（左）と相補的な部分または非変異体プローブ（右）と相補的な部分を有するプログラム可能な二官能性リンカーに結合する。ヌクレアーゼ処理の後、プローブがアレイにハイブリダイズされ、標識が検出される。 図１Ｂは、試料中の非変異体（野生型）または変異体の標的核酸の存在を検出するためのさらなる例示的なヌクレアーゼ保護アッセイを示す概略図である。この例示的な方法では、変異体位置は、プローブのそれぞれの末端の近くにあり（例えば、末端から約２〜８塩基）、プローブの配列は、変異体位置（複数可）を除いて同じである（「重複」プローブ）。非変異体プローブは、プローブの５’末端の近くにあり、プローブの５’末端に検出可能な標識（Ｄ）を含む変異体位置に非変異体または野生型ヌクレオチド（Ｎ）と相補的なヌクレオチド（ｃＮ）を含む。変異体プローブは、プローブの５’末端の近くにあり、プローブの５’末端に検出可能な標識（Ｄ）を含む変異体位置に変異体ヌクレオチド（Ｖ）と相補的なヌクレオチド（ｃＶ）を含む。２つのプローブは、標的核酸（例えば、存在する場合、標的変異体形態および／または標的非変異体形態）へのハイブリダイゼーションについて競合し、プローブのハイブリダイゼーションは、相互に排他的である。標的変異体形態が試料中に存在する場合、変異体プローブは、ハイブリダイズし、ヌクレアーゼ消化から保護され、標識は検出されるが、非変異体プローブの少なくとも５’部分は、ハイブリダイズせず、検出可能な標識を含むミスマッチ部分は、ヌクレアーゼにより切断され、その後に検出されない。標的非変異体形態が試料中に存在する場合、非変異体プローブは、ハイブリダイズし、ヌクレアーゼ消化から保護され、標識は検出されるが、変異体プローブの少なくとも５’部分は、ハイブリダイズせず、検出可能な標識を含むミスマッチ部分は、ヌクレアーゼにより切断され、その後に検出されない。標的変異体形態および非変異体形態の両方が試料中に存在する場合、両方のプローブが、試料中に存在する変異体形態と非変異体形態との比と同様の比で保護され、両方が検出される。 図２は、変異体位置がプローブのそれぞれの末端から３塩基にある、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する例示的な非変異体および変異体「オフセット」（「コンペティマー」）プローブを示す概略図である。非変異体プローブ（ｗｔプローブ；配列番号１１）は、非変異体標的ＲＮＡ（配列番号１２）に完全にハイブリダイズし、ヌクレアーゼ切断から保護されるが、変異体プローブ（ＳＮＰプローブ；配列番号１３）は、ミスマッチのため末端において完全にはハイブリダイズせず、ヌクレアーゼ切断を受けやすい（上パネル）。変異体プローブ（ＳＮＰプローブ）は、変異体標的ＲＮＡ（配列番号１４）に完全にハイブリダイズし、ヌクレアーゼ切断から保護されるが、非変異体プローブ（ｗｔプローブ）は、ミスマッチのため末端において完全にはハイブリダイズせず、ヌクレアーゼ切断を受けやすい（下パネル）。 図３は、アッセイの線形性および感度を示す、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異体プローブ（配列番号１０）の様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物（ＩＶＴ）コピー数での平均シグナル強度を示すグラフである。 図４Ａは、ＩＶＴ混合物および表示細胞系におけるＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍプローブに関する野生型（上）および変異体（下）プローブシグナルを示すグラフの対である。 図４Ｂは、ＩＶＴ混合物および表示細胞系におけるＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒプローブに関する野生型（上）および変異体（下）プローブシグナルを示すグラフの対である。 図５は、同じウェルにおいて検出されたＢＲＡＦ Ｖ６００野生型およびＶ６００Ｅ変異体ＩＶＴの様々な比における平均シグナル強度を示すグラフである。総ＩＶＴは、２００ｆＭで一定に保たれた。 図６は、表示細胞系からの細胞溶解物中のＶ６００野生型プローブおよびＶ６００Ｅプローブの平均シグナル強度を示すグラフである。 図７は、表示細胞系からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）細胞ペレット中のＶ６００野生型プローブおよびＶ６００Ｅプローブの平均シグナル強度を示すグラフである。 図８ＡおよびＢは、転移性（ｍｅｔ）または原発性（ｐｒｉ）黒色腫からのＦＦＰＥ試料中のＶ６００野生型プローブおよびＶ６００Ｅプローブの平均シグナル強度を示すグラフの対である。 図８ＡおよびＢは、転移性（ｍｅｔ）または原発性（ｐｒｉ）黒色腫からのＦＦＰＥ試料中のＶ６００野生型プローブおよびＶ６００Ｅプローブの平均シグナル強度を示すグラフの対である。

配列
本明細書で列挙される核酸配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２で定義されるとおり、ヌクレオチド塩基のための標準的な文字による略記法を使用して示す。各核酸配列の一方の鎖だけを示すが、相補的な鎖も、表示される鎖に対する任意の参照により含まれるものと理解される。

配列番号１および２は、それぞれ、例示的なＫＲＡＳ Ｑ６１Ｈ野生型プローブおよび変異体プローブである。

配列番号３および４は、それぞれ、例示的なＥＧＦＲ Ｄ７６１Ｙ野生型プローブおよび変異体プローブである。

配列番号５および６は、それぞれ、例示的なＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ野生型プローブおよび変異体プローブである。

配列番号７および８は、それぞれ、例示的なＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ野生型プローブおよび変異体プローブである。

配列番号９および１０は、それぞれ、例示的なＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ野生型プローブおよび変異体プローブである。

配列番号１１は、例示的なＥＧＦＲ野生型（非変異体プローブ）である。

配列番号１２は、例示的なＥＧＦＲ非変異体核酸である。

配列番号１３は、例示的なＥＧＦＲ ＳＮＰ（変異体）プローブである。

配列番号１４は、例示的なＥＧＦＲ変異体核酸である。

配列番号１５および１６は、それぞれ、例示的なＢＲＡＦ Ｖ６００野生型およびＶ６００Ｅ変異体プローブである。

詳細な説明
本明細書では、ヌクレアーゼ保護アッセイを活用して、標的核酸内のヌクレオチド変異体の存在および／または量を検出するための方法が開示される。野生型（非変異体）ヌクレオチド（複数可）または変異体ヌクレオチド（複数可）と相補的なヌクレオチド（複数可）を、アッセイで活用されるプローブ内に組み入れる。非変異体配列が試料中に存在する場合、非変異体プローブは、標的核酸と完全にハイブリダイズし、ヌクレアーゼ消化から保護される。変異体配列が試料中に存在する場合、非変異体プローブは、変異体の標的核酸とハイブリダイズするが、標的との１つまたは複数の「ミスマッチ」を含み、ヌクレアーゼ消化を受けやすい。同様に、変異体配列が試料中に存在する場合、変異体プローブは、標的核酸と完全にハイブリダイズし、ヌクレアーゼ消化から保護される。非変異体配列が試料中に存在する場合、変異体プローブは、非変異体の標的核酸とハイブリダイズするが、標的との１つまたは複数の「ミスマッチ」を含み、ヌクレアーゼ消化を受けやすい。

理論に束縛されずに述べると、ハイブリダイズしたプローブの末端は「ブリーズする（ｂｒｅａｔｈｅ）」、例えば、末端塩基がそれらのマッチする塩基にハイブリダイズするのは、ハイブリダイゼーションのオン／オフ動態に起因して、一部の時間に過ぎないと考えられる。理論的には、これにより、プローブの末端塩基は、プローブが標的核酸に完全にマッチする場合であっても、少なくとも一部の時間にわたり、ヌクレアーゼ切断を受けやすくなる。したがって、プローブの末端または末端近傍における変異体ヌクレオチドの配置により、プローブが標的と完全にマッチする場合であっても、プローブを、結果としてヌクレアーゼ切断を受けやすくし得る。いくつかの例では、例えば、プローブが短い（例えば、１８塩基未満）場合、プローブに沿った任意の位置におけるミスマッチは、ミスマッチを含むプローブが、ヌクレアーゼ消化に反応しやすくなるように、ハイブリッドを、完全にマッチするプローブと比べて不安定化させうると考えられる。

本明細書で開示される方法では、変異体ヌクレオチドまたは非変異体ヌクレオチドの位置（複数可）は、プローブに対して内側にある、すなわち、変異体ヌクレオチドまたは非変異体ヌクレオチドの位置（複数可）は、プローブの末端にはない。理論に束縛されずに述べると、プローブに対して内側におけるミスマッチの存在は、末端塩基が標的と完全に相補的な場合であっても、プローブの末端においてハイブリダイズした塩基の「ブリージング（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）」に起因して、末端塩基を不安定化させると考えられる。驚くべきことに、不安定化の程度は、少なくともＳ１ヌクレアーゼがマッチした塩基のほか、ミスマッチした塩基（複数可）も切断するのに十分であることが判明した。この不安定化は、試料中の標的核酸内の変異体の存在を検出するためのプローブの末端（５’末端または３’末端）から少なくとも２〜８塩基（例えば、３〜６塩基）の位置に変異体ヌクレオチドの位置（複数可）の配置を可能とする。したがって、開示される方法は、試料中の変異体の特定の配列の検出（野生型との差違の存在だけでない）のほか、変異体の標的核酸と非変異体の標的核酸との混合物を含む試料の特異性の改善、信頼性、および定量化も可能とする。

Ｉ．略号
ＢＲＡＦ：ｖ−Ｒａｆマウス肉腫ウイルスがん遺伝子相同体Ｂ１
ＥＧＦＲ：上皮成長因子受容体
ＦＦＰＥ：ホルマリン固定パラフィン包埋
ＩＶＴ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物
ＫＲＡＳ：Ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子相同体
ＳＮＰ：一塩基多型
ＳＮＶ：一塩基変異体
および、別途、本明細書、特許請求の範囲、および要約を通して提示されるもの。

ＩＩ．用語
別段に言及しない限り、技術用語は、従来の用法に従い使用する。分子生物学における一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ刊、２０００年（ＩＳＢＮ ０１９８７９２７６Ｘ）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ刊、１９９４年（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）；Ｒｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ， Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．刊、１９９５年（ＩＳＢＮ ０４７１１８６３４１）；およびＧｅｏｒｇｅ Ｐ． Ｒｅｄｅｉ、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２版、２００３年（ＩＳＢＮ： ０−４７１−２６８２１−６）において見出すことができる。

用語および方法についての以下の説明は、本開示についてより十分に記載し、当業者が本開示を実施するための指針とするために提示される。単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、文脈により別段であることが明らかに指示されない限り、１つまたは複数を指す。例えば、「細胞を含む」という用語は、単数または複数の細胞を含み、「少なくとも１つの細胞を含む」という語句と同義であると考える。本明細書で使用される「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」とは、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味するが、さらなる要素を除外しない。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、すべての目的で、参照によりそれらの全体において組み込まれる。利益相反の場合は、用語の説明を含む本明細書により管理する。

本明細書で記載される方法および材料と同様または同等の方法および材料を使用して、開示される技術を実施するかまたは試験しうるが、下記では、適する方法および材料が記載される。材料、方法、および例は、例示的なものであるに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。
本開示の多様な実施形態の総括を容易とするため、以下の特殊な用語の説明が提示される。

〜に十分な条件：所望の活性を可能とする任意の環境、例えば、２つの核酸分子の間（プローブと標的核酸との間、またはプローブと二官能性リンカー（「プログラミング」リンカー）との間など）の特異的な結合もしくはハイブリダイゼーションを可能とする任意の環境、またはヌクレアーゼにより結合しなかった核酸の除去（または消化）を可能とする任意の環境。

接触させる：直接物理的に会合させること；固体形態および液体形態の両方を含む。例えば、接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、溶液中の核酸プローブおよび生物学的試料でおこりうる。

検出する：作用物質（シグナル、特定のヌクレオチド、アミノ酸、核酸分子、および／または生物など）が存在するのか、存在しないのかを決定すること。いくつかの例では、これは、定量化をさらに含みうる。例えば、開示される方法およびプローブの特定の例における使用は、試料中の標的核酸内のヌクレオチド変異体の検出および／または同定を可能とする。

検出可能な標識：その分子の検出を容易とするために、別の分子（核酸分子またはヌクレオチドなど）に、直接的または間接的にコンジュゲートさせた化合物または組成物。標識の特殊で非限定的な例は、蛍光部分および蛍光発生部分、発色部分、ハプテン、アフィニティータグ、ならびに放射性同位元素を含む。標識は、直接的に検出可能な（例えば、光学的に検出可能な）場合もあり、間接的に検出可能な（例えば、検出可能になる１つまたは複数のさらなる分子との相互作用を介して）場合もある。下記では、本明細書で開示されるプローブの文脈における例示的な標識について記載される。核酸を標識するための方法、および多様な目的に有用な標識の選択における指針は、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１年）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８７年、および改定を含む）において論じられている。

ハイブリダイゼーション：二重鎖分子（また、ハイブリダイゼーション複合体とも称する）を形成する、相補的な一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの能力。核酸ハイブリダイゼーション技法を使用して、核酸プローブと、それが標的とするようにデザインされた核酸との間のハイブリダイゼーション複合体を形成することができる。

「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」とは、オリゴヌクレオチド（またはその類似体）と核酸標的（ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡなどのＤＮＡまたはＲＮＡ標的）との間で、安定的で特異的な結合が生じるのに十分な程度の相補性を指し示す用語である。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的配列と１００％相補的である必要はない。本明細書ではまた、特異的なハイブリダイゼーションを「特異的な結合」とも称する。

特定の程度の厳密性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）を結果としてもたらすハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション法の性質およびハイブリダイズさせる核酸配列の組成および長さに応じて変化する。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（Ｎａ^＋濃度など）が、ハイブリダイゼーションの厳密性を決定する。特定の程度の厳密性を達成するためのハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ（９および１１章）において論じられている。

融解温度（Ｔ_ｍ）：ＴＭ_５０としてもまた公知である。混合物中の核酸分子のうちの半分が二本鎖であり、核酸分子のうちの半分が一本鎖である温度。いくつかの例では、例えば、オリゴヌクレオチド（プローブなど）に言及する場合のＴ_ｍとは、オリゴヌクレオチドおよびその相補体のうちの５０％が二重鎖である温度である。当業者には、ＤＮＡまたはＲＮＡについてのＴ_ｍを決定するための方法が公知である。

ヌクレアーゼ：ホスホジエステル結合を切断する酵素。エンドヌクレアーゼとは、ヌクレオチド鎖内の内部のホスホジエステル結合を切断する酵素である（ヌクレオチド鎖の末端において、ホスホジエステル結合を切断するエキソヌクレアーゼとは対照的に）。エンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼまたは他の部位特異的エンドヌクレアーゼ（配列特異的な部位においてＤＮＡを切断する）、ＤＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、緑豆（Ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＴ１、ＲＮアーゼＩ、ＲＮアーゼＰｈｙＭ、ＲＮアーゼＵ２、ＲＮアーゼＣＬＢ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、およびアプリン酸／アピリミジン酸（ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ）エンドヌクレアーゼが挙げられる。エキソヌクレアーゼとしては、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、およびＢａｌ ３１ヌクレアーゼが挙げられる。特定の例では、ヌクレアーゼとは、Ｓ１ヌクレアーゼ、緑豆ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＴ１など、一本鎖核酸に特異的である。

ヌクレオチド変異体：標的核酸内の１つまたは複数の塩基における核酸配列の変化など、核酸配列の変化（ｃｈａｎｇｅ）または変化（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）（１つまたは複数のヌクレオチドの置換、挿入、重複、および／または欠失を含む）。ヌクレオチド変異体は、個体または異なる民族集団および地理的位置の間で一般に見出されるバリエーション（ＤＮＡ配列の差違）であって、異なる配列を有する一方で、機能的に同等な遺伝子産物を生成するバリエーションでありうる。上記用語はまた、機能的に同等ではない遺伝子産物をもたらしうる配列の変異体も指す場合がある。ヌクレオチド変異体という用語はまた、機能の変化を有し得る遺伝子産物を生成することができる対立遺伝子および／もしくは変異、遺伝子産物を生成することができない対立遺伝子および／もしくは変異、不活性遺伝子産物を生成することができる対立遺伝子および／もしくは変異、または異常な比率で生成されるか、不適切な組織内で生成されるか、もしくは不適切な刺激に応答して生成される活性遺伝子産物を生成することができる対立遺伝子および／もしくは変異として分類されうるバリエーションも包含する。いくつかの非限定的な例では、ヌクレオチド変異体は、一塩基変異体（ＳＮＶ）または一塩基多型（ＳＮＰ）である。

ヌクレオチド変異体は、例えば、バリエーションが存在するヌクレオチドの位置（複数可）（例えば、「ヌクレオチド変異体の位置（複数可）」）により言及することもでき、ヌクレオチドバリエーションにより引き起こされる核酸配列またはアミノ酸配列の変化により言及することもでき、バリエーションと関連付けられる、核酸分子またはタンパク質の他のいくつかの特徴の変化により言及することもできる。

プローブ：標的核酸分子（例えば、標的ＤＮＡ核酸分子または標的ＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）核酸分子）とハイブリダイズすることが可能であり、直接的または間接的に検出することが可能な核酸分子。したがって、プローブは、検出を可能とし、いくつかの例では、ｍＲＮＡなど、標的核酸分子の定量化も可能とする。いくつかの例では、プローブは、検出可能な標識を含む。

試料：生物学的検体は、被験体から得られるＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む）、タンパク質、またはこれらの組合せを含有する。例としては、細胞、細胞溶解物、染色体調製物、末梢血、尿、唾液、組織生検（腫瘍生検またはリンパ節生検など）、細針吸引物、手術検体、骨髄、羊水穿刺試料、および剖検材料が挙げられるがこれらに限定されない。一例では、試料としては、ｍＲＮＡなどのＲＮＡが挙げられる。特定の例では、試料を直接使用する（例えば、新鮮試料または凍結試料）か、または、例えば、固定（例えば、ホルマリンを使用する）および／もしくは蝋中に包埋すること（ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料など）により使用前に操作することができる。

被験体：ヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、獣医学の被験体）など、任意の多細胞脊椎動物。

表面（または基材）：不溶性であるか、または後続の反応により不溶性としうる、任意の固体支持体または固体材料。当業者には、多数かつ様々な固体支持体が公知であり、限定なしに述べると、ニトロセルロース、反応トレーのウェルの壁面、マルチウェルプレート、試験管、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、膜、および微粒子（ラテックス粒子など）が挙げられる。検出用試薬によるアクセスを可能とするのに十分な多孔性、および捕捉試薬（例えば、オリゴヌクレオチド）を固定化するのに適する表面アフィニティーを有する、任意の適切な多孔性材料がこの用語により想定される。例えば、ニトロセルロースの多孔性構造は、多種多様な試薬、例えば、捕捉試薬のための、優れた吸収および吸着の品質を有する。ナイロンも、同様の特徴を保有し、また適する。微小孔性構造も、水和状態においてゲル構造を伴う材料と同様に有用である。

有用な固体支持体のさらなる例としては、寒天、アガロース、架橋アルギン酸、変性グアーガムおよび架橋グアーガム、とりわけ、硝酸およびカルボン酸によるセルロースエステル、混合セルロースエステル、およびセルロースエーテルなど、天然のポリマー性炭水化物、およびそれらの合成により改変されるか、架橋されるか、または置換された誘導体；タンパク質など、窒素を含有する天然のポリマー、および架橋ゼラチンまたは変性ゼラチンを含む誘導体；ラテックスおよびゴムなど、天然の炭化水素ポリマー；ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニルおよびその部分的に加水分解された誘導体を含むビニルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、上記のポリコンデンセートのコポリマーおよびターポリマー、例えばポリエステル、ポリアミドおよび、ポリウレタンまたはポリエポキシドなどの他のポリマーなどの、適切な多孔性構造を伴い調製されうる合成ポリマー；硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウムを含む、アルカリ土類金属およびマグネシウムの硫酸塩または炭酸塩、アルカリ金属およびアルカリ土類金属、アルミニウム、ならびにマグネシウムのケイ酸塩、ならびに粘土、アルミナ、滑石、カオリン、ゼオライト、シリカゲル、またはガラスなど、アルミニウムまたはケイ素の酸化物または水和物などの多孔性無機材料（これらの材料は、上記のポリマー性材料と共にフィルターとして使用することができる）；ならびに既存の天然ポリマー上における合成ポリマーの重合化を開始することにより得られるグラフトコポリマーなど、上記のクラスの混合物またはコポリマーが挙げられる。

標的核酸：核酸分子、例えば、対象のＤＮＡまたはＲＮＡの定義された領域または特定の部分。標的核酸配列が標的ｍＲＮＡである例では、このような標的は、その特定の配列または機能により定義することもでき、その遺伝子名またはタンパク質名により定義することもでき、このような標的を他の核酸中から固有の形で識別する他の任意の手段により定義することもできる。

いくつかの例では、標的核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）の変化は、疾患または状態「と関連する」。すなわち、標的核酸配列の検出を使用して、疾患または状態に関する試料の状態を推定することができる。例えば、標的核酸配列は、第１の形態が、疾患または状態の非存在と相関し、第２の（または異なる）形態が、疾患または状態の存在と相関するように、２つ（それより多く）の識別可能な形態で存在しうる。２つの異なる形態は、ヌクレオチド多型（例えば、ＳＮＶ）もしくはヌクレオチド変異によるなど、定性的に識別可能な場合もあり、かつ／または２つの異なる形態は、試料中に存在する標的核酸配列のコピー数によるなど、定量的に識別可能な場合もある。

ＩＩＩ．ヌクレオチド変異体を検出するためのヌクレアーゼ保護方法
本明細書では、１つまたは複数の標的核酸内のヌクレオチド変異体を検出するための方法が開示される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法は、マルチプレックス化することができる。例えば、いくつかの実施形態では、同じ反応物中の２つ以上（２、３、４、５、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上など）の異なる変異体を検出することができる。いくつかの例では、２つ以上の変異体は、同じ標的核酸内または遺伝子内にある。他の例では、２つ以上の変異体は、異なる標的核酸内にある。これは、下記のＩＶ節でより詳細に論じられる。

開示される方法は、標的核酸（標的ＲＮＡなど）とのハイブリダイゼーション後における、変異体プローブおよび／または非変異体（野生型）プローブのヌクレアーゼ保護を含みうる。いくつかの実施形態では、方法は、一方のプローブが、野生型（非変異体）配列との完全なハイブリッドを形成し、第２のプローブが、変異体配列との完全なハイブリッドを形成する、少なくとも２つのプローブを含む。プローブは、それらが、いくつかの実施形態では、プローブの末端から約２〜８塩基（約３〜６塩基など）である変異体ヌクレオチドの位置（複数可）を含む領域において特に、標的核酸上の同じ部位への結合について競合するようにデザインする。プローブは、標的核酸の同じ鎖、例えば、同じＲＮＡ鎖または二本鎖分子の同じ１つの鎖に結合し、標的核酸上の同じ部位への結合について競合する。理論に束縛されずに述べると、標的核酸との完全なマッチを形成するプローブは、標的核酸との１つまたは複数のミスマッチを含むプローブの少なくとも一部を凌駕し、これらを除外すると考えられる。したがって、完全なマッチを形成するプローブは、ヌクレアーゼ消化に対して耐性となり、その後に検出する（直接的または間接的に）ことができる。１つまたは複数のミスマッチを含むプローブは、少なくとも部分的に一本鎖となり、ヌクレアーゼにより消化され、検出されるこのプローブの量を減少させる。代替的に、ヌクレアーゼによる処理を免れたプローブを検出する代わりに、例えば、下記のＩＶ節で（例えば、ＩＶ（Ｂ）節で）記載される１つまたは複数の検出法を活用して、プローブにハイブリダイズした標的核酸鎖（ＲＮＡ鎖またはＤＮＡ鎖など）を検出することもできる。したがって、本明細書の全体でプローブの検出について言及するが、保護される標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）はそれの代わりとなりうることが十分に理解される。標的核酸がＲＮＡである例では、標的核酸を、検出前にＤＮＡに転換することができる。

いくつかの実施形態では、非変異体プローブと変異体プローブとは、一方のプローブの３’末端および他方のプローブの５’末端において重複する。このような「オフセット」（または「コンペティマー」）プローブによるアッセイの例示的な概略を、図１Ａに示す。変異体ヌクレオチドの位置（複数可）は、プローブの重複末端（例えば、一方のプローブの３’末端から約２〜８塩基、および他方のプローブの５’末端から約２〜８塩基）に近接する。いくつかの実施形態では、非変異体プローブは、プローブの３’末端の近傍の変異体位置（複数可）において、非変異体（野生型）ヌクレオチド（複数可）と相補的なヌクレオチド（複数可）を含み、変異体プローブは、プローブの５’末端の近傍の変異体位置（複数可）において、変異体ヌクレオチド（複数可）と相補的なヌクレオチド（複数可）を含む。他の実施形態では、非変異体プローブは、プローブの５’末端の近傍の変異体位置（複数可）において、非変異体（野生型）ヌクレオチド（複数可）と相補的なヌクレオチド（複数可）を含み、変異体プローブは、プローブの３’末端の近傍の変異体位置（複数可）において、変異体ヌクレオチド（複数可）と相補的なヌクレオチド（複数可）を含む。標的核酸の変異体形態が、試料中に存在する場合、変異体プローブが、標的核酸との完全なマッチを形成し、ヌクレアーゼ消化から保護されるのに対し、非変異体プローブの末端は、変異体プローブとの競合によりハイブリダイゼーションから除外され（部分的にまたは完全に）、除外された末端は、一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼによる消化を受けやすい。標的核酸の非変異体形態が、試料中に存在する場合、非変異体プローブが、標的核酸との完全なマッチを形成し、一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼによる消化から保護されるのに対し、変異体プローブの末端は、非変異体プローブとの競合によりハイブリダイゼーションから除外され（完全にまたは部分的に）、除外された末端は、ヌクレアーゼ消化を受けやすい。一部の実施形態では、ミスマッチ領域をヌクレアーゼで消化することにより、標識を除去し、ミスマッチプローブからのシグナルを減少させるように、プローブが末端で標識されている。非変異体の標的核酸と変異体の標的核酸との混合物が、試料中に存在する場合、非変異体プローブおよび変異体プローブのいずれもが、試料中の対応する非変異体核酸および変異体核酸の量に比例する量で、ヌクレアーゼ消化から保護される。したがって、いくつかの例では、開示される方法は、半定量的または定量的である。ヌクレアーゼ処理後に試料中に存在するプローブを検出する方法については、下記のＩＶ節で論じる。

他の実施形態では、プローブは、それらの長さの大半（なおまたは全体）に沿って、非変異体プローブおよび変異体プローブの両方の同じ末端（両方の５’末端または両方の３’末端）の近傍（例えば、末端から約２〜８塩基）の変異体ヌクレオチドの位置（複数可）と重複する。このような「重複」プローブによるアッセイの例示的な概略を、図１Ｂに示す。いくつかの実施形態では、各プローブは、異なる検出可能な標識で標識される。標的核酸の変異体形態が、試料中に存在する場合、変異体プローブが、標的核酸との完全なマッチを形成し、一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼによる消化から保護されるのに対し、非変異体プローブは、変異体プローブとの競合によりハイブリダイゼーションから除外され（完全にまたは部分的に）、一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼによる消化を受けやすい。標的核酸の非変異体形態が、試料中に存在する場合、非変異体プローブが、標的核酸との完全なマッチを形成し、ヌクレアーゼ消化から保護されるのに対し、変異体プローブは、非変異体プローブとの競合によりハイブリダイゼーションから除外され（完全にまたは部分的に）、ヌクレアーゼ消化を受けやすい。一部の実施形態では、ミスマッチ領域をヌクレアーゼで消化することにより、標識を除去し、ミスマッチプローブからのシグナルを減少させるように、プローブが末端で標識されている。非変異体の標的核酸と変異体の標的核酸との混合物が、試料中に存在する場合、非変異体プローブおよび変異体プローブのいずれもが、試料中の対応する非変異体核酸および変異体核酸の量に比例する量で、ヌクレアーゼ消化から保護される。したがって、いくつかの例では、開示される方法は、半定量的または定量的である。ヌクレアーゼ処理後に試料中に存在するプローブを検出する方法については、下記のＩＶ節で論じる。

いくつかの実施形態では、方法は、試料（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなどの核酸を含む試料など）を、ヌクレオチド変異体を含む標的核酸分子と相補的な少なくとも２つのプローブと、プローブの各々が標的核酸にハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップと、ハイブリダイズした核酸とハイブリダイズしなかった核酸との混合物を生成するステップとを含む。いくつかの実施形態では、プローブのうちの一方（第１のプローブなど）は、ヌクレオチド変異体についての非変異体配列と相補的であり、ヌクレオチド変異体の位置は、プローブの末端から少なくとも２塩基であり、他方のプローブ（第２のプローブなど）は、ヌクレオチド変異体についての変異体配列と相補的であり、ヌクレオチド変異体の位置は、プローブの末端から少なくとも２塩基である。ハイブリダイゼーション後、結果として得られる混合物を、ヌクレアーゼ（一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼ、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼなど）で処理して、ハイブリダイズしなかった核酸分子（または核酸分子のハイブリダイズしなかった部分）を除去する。

いくつかの例では、標的核酸は、変異体核酸の位置（複数可）において、複数の可能な配列を含みうる。非限定的な例として述べると、標的核酸は、非変異体核酸内のヌクレオチドの位置において、「Ｃ」を含むことが可能であり、変異体核酸内の同じヌクレオチドの位置において、「Ｇ」を含むことが可能である。しかし、いくつかの状況では、標的核酸は、第２の変異体配列、例えば、第２の変異体核酸内の同じヌクレオチドの位置において、「Ａ」を含みうる。したがって、さらなる例では、開示される方法は、試料を、変異体ヌクレオチドの位置（複数可）において、第２の変異体と相補的な第３のプローブであって、非変異体プローブおよび変異体プローブと異なる第３のプローブと接触させるステップをさらに含む。なおさらなる例では、方法は、試料を、変異体ヌクレオチドの位置（複数可）において、第３の変異体と相補的な第４のプローブであって、非変異体プローブ、変異体プローブ、および第２の変異体プローブと異なる第４のプローブと接触させるステップを含みうる。このようにして、複数の変異体が潜在的に存在する場合であっても、開示される方法を使用して、試料中に存在する変異体配列を特異的に検出する（例えば、各プローブ上で、異なる検出可能な標識を活用して）ことができる。他の例では、変異体プローブは、すべての可能な変異体核酸の混合物を含みうる（例えば、変異体プローブは、１つまたは複数の位置において縮重している）。非限定的な例では、非変異体プローブが、変異体ヌクレオチドの位置において、「Ｃ」を含む一方で、変異体プローブは、変異体ヌクレオチドの位置において、「Ａ」、「Ｇ」、および「Ｔ」の混合物を含む。このようにして、特定の変異体配列は同定されないが、非変異体の標的核酸または変異体の標的核酸の存在は検出することができる。

少なくともいくつかの場合には、試料は、変異体の標的核酸と非変異体（野生型）の標的核酸との混合物を含みうる。例えば、試料は、それらのうちのいくつかが、変異体の標的核酸を含み、それらのうちの他のものが、非変異体の標的核酸を含む、細胞の混合物を含みうる（腫瘍細胞および非腫瘍細胞を含む試料など）。他の例では、試料は、一方の対立遺伝子が、変異体の標的核酸を含み、他方の対立遺伝子が、非変異体の標的核酸を含む細胞を含みうる。開示される方法は、ヌクレアーゼ処理後に検出される、変異体プローブの量の、非変異体プローブの量に対する比を決定することにより、試料中に存在する変異体の標的核酸および非変異体（野生型）の標的核酸の相対量を決定するのに使用することができる。例えば、試料が、５０％の変異体の標的核酸および５０％の非変異体の標的核酸を含む場合、ハイブリダイズした（そして保護された）プローブの半分は非変異体プローブとなり、ハイブリダイズした（そして保護された）プローブの半分は非変異体プローブとなり、結果として、検出される変異体プローブの、非変異体プローブに対する約５０／５０の比がもたらされる。

他の例では変異体の標的核酸の、非変異体の標的核酸に対する、変化する比（変異体ＩＶＴおよび非変異体ＩＶＴなど）を使用して、検量線を作成することができる。一例では、検量線は、以下の、非変異体ＩＶＴの、変異体ＩＶＴに対する比：１００／０、９０／１０、８０／２０、６０／４０、５０／５０、４０／６０、２０／８０、１０／９０、および０／１００を使用して作成する。ＩＶＴの各混合物により得られる、非変異体プローブに由来するシグナルの、変異体プローブに由来するシグナルに対する比を決定する。次いで、試料中で得られる、非変異体プローブに由来するシグナルの、変異体プローブに由来するシグナルに対する比を計算し、検量線と比較して、試料中の変異体の標的核酸の存在および相対量を決定することができる。

いくつかの例では、同じ数の変異体の核酸分子および非変異体の核酸分子が試料中に存在する場合であっても、ハイブリダイゼーション効率の差違、ヌクレアーゼに対する反応しやすさ、または検出効率の差違は、変異体プローブと非変異体プローブとの対に由来する、異なるレベルのシグナルをもたらしうる。この問題に取り組むために、標的核酸と相補的であるが、変異体核酸の位置の上流または下流においてであり、変異体プローブおよび非変異体プローブと重複しない参照プローブをアッセイに含ませる。参照プローブは、それが変異体核酸（複数可）を含むのであれ、非変異体核酸（複数可）を含むのであれ、試料中に存在する標的核酸の総量を測定しうる。非変異体プローブによるシグナルの、参照プローブによるシグナルに対する比を決定し、変異体プローブによるシグナルの、参照プローブによるシグナルに対する比を決定する。すると、これらの比は、試料中に存在する非変異体の標的核酸と変異体の標的核酸との比率を反映する。いくつかの例では、参照プローブの配列を、変異体プローブの配列および非変異体プローブの配列を有するＩＶＴに組み込む。したがって、ＩＶＴは、実際の標的核酸のモデルを反映し、例えば、特異的なアッセイのために、より正確な検量線を構築するのに使用することができる。

さらなる例では、ＩＶＴを使用して、各プローブから均等なシグナルが得られるように、アッセイ条件を調整することができる。例えば、標的核酸と関連しない共通の核酸配列を、すべてのＩＶＴに組み込むことができる。この「共通」配列は、さらなるプローブにより検出され、各ＩＶＴの濃度は、共通プローブに由来するシグナルに基づく均等なシグナルを提供するように調整することができる。代替的に、各ＩＶＴの濃度を物理的に調整する代わりに、補正係数を計算することもできる。ＩＶＴ濃度が均等となったら、または、補正係数を使用して、ＩＶＴ濃度の任意の不均等について正規化した後では、変異体プローブおよび非変異体プローブにより測定されるシグナルの任意の差違は、ハイブリダイゼーションおよび／または検出の効率の差違に起因するものであり、シグナルを、単なる相対シグナルについての測定値ではなく、変異体の標的核酸および非変異体の標的核酸の絶対数についての測定値を生成するように補正することができる。

Ａ．反応条件
開示される方法では、試料を、少なくとも２つのプローブと、プローブの各々が試料中に存在する標的核酸にハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させる。他の物質または分子との非特異的ハイブリダイゼーションを最小化しながら、核酸（例えば、非変異体プローブまたは変異体プローブ）が、別の核酸（例えば、標的ＲＮＡ）と、選択される厳密性の条件下でハイブリダイズすることを可能とする特色（長さ、塩基組成および相補性の程度など）は、本開示に基づき決定することができる。プローブの特徴については、下記でより詳細に論じる。典型的に、プローブの核酸配列は、プローブが、選択される厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすること、例えば、約３７℃以上（約３７℃、４２℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃以上など）におけるハイブリダイゼーションを可能とするのに十分な、その対応する標的核酸に対する相補性を有する。様々でありうるハイブリダイゼーション反応のパラメータの中には、塩濃度、緩衝液、ｐＨ、温度、インキュベーション時間、ホルムアミドなど、変性剤の量および種類がある。

いくつかの例では、核酸（例えば、少なくとも２つのプローブ）を、例えば、６倍濃度のＳＳＰＥ−Ｔ（０．９ＭのＮａＣｌ、６０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、６ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）または溶解緩衝液（下記で記載される）などの適切な緩衝液中に約１０ｐＭ〜約１０ｎＭ（約３０ｐＭ〜５ｎＭ、または約１００ｐＭ〜約１ｎＭなど）の範囲の濃度で、試料に添加することができる。いくつかの例では、各プローブを、少なくとも３０ｐＭ、少なくとも５０ｐＭ、少なくとも８０ｐＭ、少なくとも１００ｐＭ、少なくとも１５０ｐＭ、少なくとも２００ｐＭ、少なくとも３００ｐＭ、少なくとも４００ｐＭ、少なくとも５００ｐＭ、少なくとも１ｎＭ、または少なくとも１０ｎＭなど、少なくとも１０ｐＭの最終濃度で試料に添加する。一例では、各プローブを、約１６７ｐＭの最終濃度で試料に添加する。別の例では、各プローブを、約３０ｐＭの最終濃度で試料に添加する。さらなる例では、各プローブを、約１ｎＭの最終濃度で試料に添加する。

試料中の核酸は、変性させ（例えば、約９５℃〜約１０５℃で約５〜１５分間にわたり）、少なくとも２つのプローブに、約３７℃〜約６５℃の範囲（約３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、または６５℃など）の温度、例えば、約５０℃で、約１〜２４時間の間にわたり（例えば、少なくとも約２〜約２０時間、約４〜約２０時間、約１２〜約１８時間、約１６時間、または一晩にわたり）ハイブリダイズさせる。いくつかの例では、少なくとも２つのプローブを、試料と、少なくとも約３７℃、少なくとも約４０℃、少なくとも約４５℃、少なくとも約５０℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約６０℃、または少なくとも約６５℃の温度でインキュベートする。非限定的な一例では、少なくとも２つのプローブを、試料と、約５０℃でインキュベートする。

いくつかの実施形態では、方法は、核酸の精製を含まない（例えば、核酸の精製は、試料をプローブと接触させる前に実施せず、かつ／または核酸の精製は、試料をプローブと接触させた後に実施しない）。いくつかの例では、方法は、核酸増幅を含まない（例えば、核酸の増幅は、試料をプローブと接触させる前に実施せず、かつ／または核酸の増幅は、試料をプローブと接触させた後に実施しない）。いくつかの例では、細胞の溶解を除き、試料の前処理が要請されない。いくつかの例では、細胞の溶解および試料のプローブとの接触は、逐次的に行う。他の例では、細胞の溶解および試料のプローブとの接触を、同時に行い、いくつかの非限定的な例では、いかなるステップも介在させずに行う。

開示される方法では、少なくとも２つのプローブの、試料とのハイブリダイゼーション後において、結果として得られる、ハイブリダイズした核酸分子とハイブリダイズしなかった核酸分子との混合物を、一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼ（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と、ハイブリダイズしなかった（一本鎖）核酸分子を除去するのに十分な条件下で接触させる。いくつかの例では、１つまたは複数のプローブのうちの一部（例えば、プローブの５’末端または３’末端における約１〜１０ヌクレオチド）だけが一本鎖であり、ヌクレアーゼによる消化を受けやすい。

１つまたは複数のヌクレアーゼによる処理は、試料中に存在する標的核酸にハイブリダイズしたプローブ以外の核酸分子（またはこれらの部分）を破壊する。例えば、試料が、細胞抽出物または細胞溶解物を含む場合、対象の標的核酸以外のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡ、および対象の標的核酸の部分であって、相補的なプローブ配列にハイブリダイズしない部分などの望ましくない核酸は、このステップで実質的に破壊することができる。試料中に存在するハイブリダイズした複合体の性質および所望されない核酸の性質に応じて、膵臓ＲＮアーゼ、緑豆ヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ＲＮアーゼＡ、リボヌクレアーゼＴ１、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、ＲＮアーゼＣＬＢ、ＲＮアーゼＰｈｙＭ、ＲＮアーゼＵ２などを含む、様々なヌクレアーゼのうちのいずれかを使用することができる。当業者は、適切なヌクレアーゼを選択することができる。特定の例では、ヌクレアーゼは、一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼ、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼである。本明細書で開示されるいくつかの方法の実施形態における一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼは、このような一本鎖分子の、それらが所望されないバックグラウンドまたは交差反応性（例えば、偽陽性シグナル）をもたらしうる後続の反応ステップからの除去を可能とする。Ｓ１ヌクレアーゼは、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ（型番：Ｍ５７６１）；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ（型番：１８００１−０１６）；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ、ＭＤ（型番：ＥＮ０３２１）、および他から市販されている。当技術分野では、これらの酵素のための反応条件が周知であり、経験的に最適化することができる。

いくつかの例では、適切な緩衝液中で希釈したＳ１ヌクレアーゼを、ハイブリダイズした核酸とハイブリダイズしなかった核酸との混合物に添加し、約３７℃〜約６５℃（約３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、または６５℃など）、例えば、約５０℃〜約６０℃でインキュベートする。Ｓ１ヌクレアーゼは、混合物中に存在する、ハイブリダイズしなかった（一本鎖）核酸分子（またはこれらの部分）を消化するのに十分な量、例えば、約５〜１００Ｕ／μｌの反応物（例えば、約８Ｕ／μｌ〜約８０Ｕ／μｌ、約１０Ｕ／μｌ〜約５０Ｕ／μｌ、または約２０Ｕ／μｌ〜約４０Ｕ／μｌ）で添加する。いくつかの例では、約４００〜４０００単位（ｕｎｉｔ）のＳ１ヌクレアーゼを、５０μｌの反応物に添加する。非限定的な一例では、約２０００単位のＳ１ヌクレアーゼを、５０μｌの反応物に添加する。ヌクレアーゼと、ハイブリダイズした核酸とハイブリダイズしなかった核酸との混合物を、約５０℃〜６０℃（約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０℃など）で、約１０〜１８０分間（例えば、約１０〜６０分間、約６０〜９０分間、約９０〜１２０分間、または約９０〜１８０分間）にわたりインキュベートする。インキュベーション時間は、ヌクレアーゼ処理の温度に応じて調整することができる。いくつかの例では、ハイブリダイズした核酸とハイブリダイズしなかった核酸との混合物を、Ｓ１ヌクレアーゼと共に、６０℃で約２時間にわたりインキュベートする。他の例では、ハイブリダイズした核酸とハイブリダイズしなかった核酸との混合物を、Ｓ１ヌクレアーゼと共に、５０℃で約１時間にわたりインキュベートする。なおさらなる例では、ハイブリダイズした核酸とハイブリダイズしなかった核酸との混合物を、Ｓ１ヌクレアーゼと共に、３７℃で約９０分間にわたりインキュベートする。当業者は、ヌクレアーゼ消化に適切な時間および温度を選択することができる。ヌクレアーゼ処理の後、例えば、停止溶液（例えば、ＥＤＴＡおよびＮａＯＨを含む溶液）を添加し、約８０〜９５℃で（約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５℃など）約１０〜２０分間（例えば、約１５分間）にわたり試料を加熱することにより反応を停止させる。ヌクレアーゼ反応を停止させるためのさらなる日常的な方法を、当業者は同定することができる。

試料は必要に応じて、ハイブリダイズしなかった材料を他の形で除去し、かつ／または残存する酵素を不活化もしくは除去するように処理する（例えば、フェノール抽出、沈殿、カラム濾過などにより）ことができる。いくつかの例では、試料は必要に応じて、標的核酸（標的ＲＮＡなど）を、その相補的なプローブから解離させるように処理する（例えば、塩基による加水分解および加熱を使用して）。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズした標的は、例えば、ヌクレアーゼまたは化学的処理により分解し、プローブが標的にハイブリダイズした量に直接比例してプローブを後に残すことができる。代替的に、試料は、標的の（一本鎖の）ハイブリダイズした部分、またはハイブリダイズした標的とプローブとにより形成される二重鎖を後に残してさらに解析するように処理することもできる。

Ｂ．プローブ
開示される方法は、標的核酸分子内のヌクレオチド変異体の存在を検出するステップを含む。標的核酸分子および標的核酸内のヌクレオチド変異体に基づき、本明細書で呈示される判定基準を、当業者の知見と組み合わせて使用して、プローブを、開示される方法における使用のためにデザインすることができる。

開示される方法では、プローブは、野生型（非変異体）ヌクレオチド（または複数のヌクレオチド）または変異体ヌクレオチド（または複数のヌクレオチド）と相補的なヌクレオチド（または複数のヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、変異体ヌクレオチドの位置（複数可）は、プローブの末端（５’末端または３’末端など）である。他の実施形態では、変異体ヌクレオチドの位置（複数可）は、プローブの５’末端または３’末端から少なくとも２塩基（プローブの末端から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８塩基以上など）である。「プローブの末端から２塩基」であるヌクレオチドの位置への言及は、プローブの末端から２番目のヌクレオチドを指し、「プローブの末端から３塩基」であるヌクレオチドの位置への言及は、プローブの末端から３番目のヌクレオチドを指すなどである（すなわち、末端のヌクレオチドは、プローブの「末端から１塩基」である）。図２は、変異体ヌクレオチドの位置が、プローブの末端から３塩基である「オフセット」プローブの例示的なセットを例示する。いくつかの例では、変異体ヌクレオチドの位置が、プローブの末端から２〜８塩基、例えば、プローブの５’末端から２、３、４、５、６、７、もしくは８塩基、またはプローブの３’末端から２、３、４、５、６、７、もしくは８塩基である。非限定的な一例では、変異体ヌクレオチドの位置が、プローブの末端（５’末端または３’末端）から３塩基である。非限定的な別の例では、変異体ヌクレオチドの位置が、プローブの末端（５’末端または３’末端）から４塩基である。いくつかの例では、変異体ヌクレオチドの位置（複数可）のうちの最適の位置は、特定の変異体の周囲の配列関係（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｎｔｅｘｔ）の影響を受ける可能性がある。当業者は、本開示の教示を活用して、プローブを作製し、変異体ヌクレオチド（複数可）の位置を変化させながらプローブを調べて、最適の位置を決定することができる。

プローブ−標的間のハイブリダイゼーションの特異性に影響を及ぼす因子としては、プローブの長さ、融解温度、自己相補性、および反復配列または非固有配列の存在が挙げられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、１９９２年（および２０００年版に対する増補）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４版、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９９年を参照されたい。

本明細書で開示されるプローブは、標的核酸分子と相補的であり、ヌクレオチド変異体の位置を含む、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５以上の連続ヌクレオチド（標的核酸分子と相補的な約６〜７５、１０〜６０、１５〜５０、１８〜４５、２０〜４２、または２３〜４１の連続ヌクレオチドなど）を含むように選択することができる。本開示の方法を実施するのに使用しうる特定の長さのプローブとしては、標的核酸分子と相補的であり、ヌクレオチド変異体の位置を含む、少なくとも６、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上隣接ヌクレオチドを有するプローブが挙げられる。特定の非限定的な例では、開示される方法で使用されるプローブは、１５〜７５（１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、または７５など）ヌクレオチドの長さである。

特定の程度のハイブリダイゼーション（厳密性）を結果としてもたらす条件は、ハイブリダイゼーション方法の性質およびハイブリダイズさせる核酸配列の組成および長さに応じて変化する。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（Ｎａ^＋濃度など）は、ハイブリダイゼーションの厳密性を決定する。いくつかの例では、開示される方法で活用されるプローブの融解温度（Ｔ_ｍ、混合物中の核酸分子のうちの半分が二本鎖であり、核酸分子のうちの半分が一本鎖である温度）は、約２３℃〜７０℃（例えば、約２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０℃）など、少なくとも約３７℃、少なくとも約４２℃、少なくとも約４５℃、少なくとも約５０℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、少なくとも約７０℃、少なくとも約７５℃、または少なくとも約８０℃など、少なくとも約２３℃である。一例では、開示される方法で活用されるプローブのＴ_ｍは、約６０℃〜約７０℃である。特定の非限定的な例では、開示される方法で活用されるプローブのＴ_ｍは、約６０℃である。いくつかの例では、プローブのＴ_ｍは、約５９℃〜約６２℃（約５９．１、５９．２、５９．３、５９．４、５９．５、５９．６、５９．７、５９．８、５９．９、６０．０、６０．１、６０．２、６０．３、６０．４、６０．５、６０．６、６０．７、６０．８、６０．９、６１．０、６１．１、６１．２、６１．３、６１．４、６１．５、６１．６、６１．７、６１．８、または６１．９℃など）である。当業者には、プローブのＴ_ｍを計算する方法が公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、２００１年、１０章を参照されたい）。プローブのＴ_ｍを計算するためのツールはまた、ワールドワイドウェブ（Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ）上でも（ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｓｅｒｖ／ｔｏｏｌｓ／ｂｉｏｍａｔｈ／ｃａｌｃ１１．ｈｔｍなど）入手可能である。いくつかの実施形態では、「塩基スタッキング」法を使用して、プローブのＴ_ｍを計算する。いくつかの例では、試料中の非変異体ヌクレオチドおよび／または変異体ヌクレオチドの同時的な検出を容易とするために、プローブは、各々のＴ_ｍが同じであるかまたは同様となるように選択する。例えば、プローブは、Ｔ_ｍが互いから少なくとも２．５℃以内（互いから２．４℃、２．３℃、２．２℃、２．１℃、２．０℃、１．９℃、１．８℃、１．７℃、１．６℃、１．５℃、１．４℃、１．３℃、１．２℃、１．１℃、１．０℃、０．９℃、０．８℃、０．７℃、０．６℃、０．５℃、０．４℃、０．３℃、０．２℃、０．１℃以内またはそれ未満など）となるように選択することができる。

いくつかの例では、本明細書で開示されるプローブは、１つまたは複数の合成塩基または代替塩基（イノシンなど）を含む。他の例では、本明細書で開示されるプローブは、１つまたは複数のロックト核酸（例えば、米国特許第６，７９４，４９９号を参照されたい）または１つまたは複数のペプチド核酸など、１つまたは複数の改変ヌクレオチドまたは核酸類似体を含む。改変ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、合成ヌクレオチド、または代替ヌクレオチドを、プローブ内の１つまたは複数の位置（１、２、３、４、５カ所以上の位置など）において使用することができる。いくつかの例では、プローブ内で１つまたは複数の改変ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを使用することにより、プローブのＴ_ｍを、同じ長さおよび組成のプローブであって、改変核酸を含まないプローブのＴ_ｍと比べて上昇させることができる。当業者は、所望のＴ_ｍを有するプローブを得るように、このような改変ヌクレオチドを含むプローブをデザインすることができる。また、１つまたは複数の位置（１、２、３、４、５カ所以上の位置など）において縮重しているプローブ、例えば、プローブ内の指定された位置においてヌクレオチド（２、３、または４ヌクレオチドなど）の混合物を含むプローブも提供される。

Ｃ．ヌクレオチド変異体
変異体配列および非変異体配列と相補的なプローブ（例えば、上記のＢ部において論じた特性を有するプローブ）をデザインし、合成しうる限りにおいて、開示される方法を使用して、任意の種類のヌクレオチド変異体（例えば、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、挿入、重複、および／または欠失）を検出することができる。変異体配列は、タンパク質コード配列の一部である場合もあり、核酸配列によりコードされる１つまたは複数のアミノ酸の変化を結果としてもたらす（例えば、１つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入、または欠失をもたらす）場合もあり、アミノ酸配列の変化を結果としてもたらさないヌクレオチド変異体など、「サイレント」変化の場合もある。ヌクレオチドはまた、非翻訳領域またはイントロンを含むがこれらに限定されない、ヌクレオチドの非コード領域に置くことも可能である。

いくつかの実施形態では、ヌクレオチド変異体は、野生型配列または非変異体配列と比較した、１つまたは複数のヌクレオチドの置換である。ヌクレオチド変異体は、変異体が、１つだけのヌクレオチドにより非変異体配列から変化する配列である、一塩基多型（ＳＮＰ、例えば、標的核酸がＤＮＡである場合）または一塩基変異体（ＳＮＶ、例えば、標的核酸がＲＮＡである場合）でありうる。この種類のヌクレオチド変異体の非限定的な例は、以下：
非変異体：ＡＣＴＧＡＣＴＧ
変異体：ＡＣＴＧＣＣＴＧ
の通りである。

他の例では、変異体は、２つ以上のヌクレオチドにより非変異体配列から変化する配列である。変異体配列は、２つ、３つ、４つ、５つ以上の隣接ヌクレオチドの置換（例えば、２〜５、２〜１０、または２〜１５隣接ヌクレオチドなど、少なくとも２つの隣接ヌクレオチド、少なくとも３つ、少なくとも１０、または少なくとも１５の隣接ヌクレオチドの置換）により、非変異体配列から変化しうる。この種類のヌクレオチド変異体の非限定的な例は、以下：
非変異体：ＡＣＴＧＡＣＴＧＡ
変異体：ＡＣＴＧＣＴＴＧＡ
の通りである。

他の例では、変異体配列は、２つ、３つ、４つ、５つ以上の非隣接ヌクレオチドなど、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの非隣接ヌクレオチドの置換（例えば、各置換は、少なくとも１つのヌクレオチドにより、他の置換から隔てられている）により、非変異体配列から変化しうる。この種類のヌクレオチド変異体の非限定的な例は、以下：
非変異体：ＡＣＴＧＡＣＴＧＡ
変異体：ＡＡＴＧＣＣＴＧＡ
の通りである。

他の実施形態では、ヌクレオチド変異体は、野生型配列または非変異体配列と比較した、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失である。例えば、ヌクレオチド変異体は、標的核酸のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の隣接ヌクレオチドの欠失（例えば、１〜５、１〜１０、または１〜１５隣接ヌクレオチドなど、少なくとも１つの隣接ヌクレオチド、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも１０、または少なくとも１５の隣接ヌクレオチドの欠失）でありうる。この種類のヌクレオチド変異体の非限定的な例は、以下：
非変異体：ＡＣＴＧＡＣＴＧＡ
変異体：ＡＣＴＧＡ−ＴＧＡ
の通りである。

いくつかの例では、ヌクレオチド変異体は、コドンの欠失など、３つの隣接ヌクレオチドの欠失である。この種類のヌクレオチド変異体の非限定的な例は、以下：
非変異体：ＡＣＴＧＡＣＴＧＡ
変異体：ＡＣＴ−−−ＴＧＡ
の通りである。

他の例では、変異体配列は、２つ、３つ、４つ、５つ以上の非隣接ヌクレオチドなど、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、または少なくとも１５の非隣接ヌクレオチドの欠失を含みうる。この種類のヌクレオチド変異体の非限定的な例は、以下：
非変異体：ＡＣＴＧＡＣＴＧＡ
変異体：ＡＣ−ＧＡＣ−ＧＡ
の通りである。

さらなる実施形態では、ヌクレオチド変異体は、野生型配列または非変異体配列と比較した、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入である。例えば、ヌクレオチド変異体は、標的核酸のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の隣接ヌクレオチドの挿入（例えば、１〜５、１〜１０、または１〜１５隣接ヌクレオチドなど、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、または少なくとも１５の隣接ヌクレオチドの挿入）でありうる。この種類のヌクレオチド変異体の非限定的な例は、以下：
非変異体：ＡＣＴＧＡ−ＣＴＧ
変異体：ＡＣＴＧＡＧＣＴＧ
の通りである。

他の例では、変異体配列は、２つ、３つ、４つ以上の非隣接ヌクレオチドの挿入（２〜５、２〜１０、または２〜１５の非隣接ヌクレオチドなど、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの非隣接ヌクレオチドの挿入など）を含みうる。この種類のヌクレオチド変異体の非限定的な例は、以下：
非変異体：ＡＣＴ−ＧＡ−ＣＴ
変異体：ＡＣＴＴＧＡＧＣＴ
の通りである。

他の例では、ヌクレオチド変異体は、野生型配列または非変異体配列と比較した、１つまたは複数のヌクレオチドの重複である。例えば、ヌクレオチド変異体は、標的核酸のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の隣接ヌクレオチドの重複（例えば、１〜５、１〜１０、３〜５、または１〜１５の隣接ヌクレオチドなど、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、または少なくとも１５の隣接ヌクレオチドの重複）でありうる。この種類のヌクレオチド変異体の非限定的な例は、以下：
非変異体：ＡＣＴ−−ＧＡＣＴ
変異体：ＡＣＴＣＴＧＡＣＴ
の通りである。

当業者は、本明細書で開示される方法を活用して検出されうるさらなるヌクレオチド変異体であって、上記で記載した種類のヌクレオチド変異体のうちの１つまたは複数の組合せを含むヌクレオチド変異体を同定しうる。

方法の特定の非限定的な例（下記の実施例で記載される例など）では、アミノ酸置換を結果としてもたらす一塩基変異体を検出する。いくつかの例では、ヌクレオチド変異体は、ＫＲＡＳのコード配列内にある。一例では、変異体は、ＫＲＡＳコード配列のヌクレオチド１８３において、Ａ＞Ｃ置換を含み、この結果として、アミノ酸６１において、Ｇｌｎ＞Ｈｉｓ置換（Ｑ６１Ｈ）をもたらす。別の例では、変異体は、ＫＲＡＳコード配列のヌクレオチド３５において、Ｇ＞Ａ置換を含み、この結果として、アミノ酸１２において、Ｇｌｙ＞Ａｓｐ置換（Ｇ１２Ｄ）をもたらす。他の例では、ヌクレオチド変異体は、ＥＧＦＲのコード配列内にある。一例では、変異体は、ＥＧＦＲコード配列のヌクレオチド２５２７において、Ｇ＞Ｔ置換を含み、この結果として、アミノ酸７６１において、Ａｓｐ＞Ｔｙｒ置換（ｓｕｂｓｔａｔｉｏｎ）（Ｄ７６１Ｙ）をもたらす。別の例では、変異体は、ＥＧＦＲコード配列のヌクレオチド２６１５において、Ｃ＞Ｔ置換を含み、この結果として、アミノ酸７９０において、Ｔｈｒ＞Ｍｅｔ置換（Ｔ７９０Ｍ）をもたらす。さらなる例では、変異体は、ＥＧＦＲコード配列のヌクレオチド２８１９において、Ｔ＞Ｇ置換を含み、この結果として、アミノ酸８５８において、Ｌｅｕ＞Ａｒｇ置換（Ｌ８５８Ｒ）をもたらす。別の例では、変異体は、ＢＲＡＦコード配列のヌクレオチド１７９９において、Ｔ＞Ａ置換を含み、この結果として、アミノ酸６００において、Ｖａｌ＞Ｇｌｕ置換（Ｖ６００Ｅ）をもたらす。これらの変異体を検出するのに使用しうる例示的なプローブセットを、下記の表２および９（配列番号１〜１０および１５〜１６）に提示する。本明細書で開示される方法を使用して検出されうる例示的な変異体を、表１に示す。当業者は、多様な疾患および障害と関連する変異体を含む、さらなる対象の変異体を同定することができる。例えば、がんと関連する変異体は、ワールドワイドウェブ上のｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｃｅｎｓｕｓにおいて入手可能である。

ＩＶ．検出方法
ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ処理の後、混合物中に残存するプローブは、当技術分野で公知であるか、またはその後に開発された任意の適切な方法により検出することができる。いくつかの例では、プローブは、捕捉法（例えば、アレイ上または複数のビーズ上のプローブの捕捉）または別の形でプローブの配列を検出する方法を活用して検出する。このような方法では、少なくとも２つのプローブの少なくとも一部は、例えば、例示的な図１Ａに示される「オフセット」プローブまたは「コンペティマー」プローブなどの「オフセット」プローブまたは「コンペティマー」プローブを活用してプローブの特異的な捕捉および識別を可能とする、異にする配列を有する。他の例では、プローブは、プローブの配列特異的捕捉を要請しない方法により、例えば、各プローブ上の示差的な、検出可能な標識を活用することにより検出する。このような例では、プローブは、例示的な図１Ｂに示される配列など、同じ配列（ヌクレオチド変異体の位置（複数可）を除き）を有する場合もあり、例示的な図１Ａに示される配列など、異にする配列を含む場合もある。これらの方法は典型的に、例えば、異なるプローブを、アレイ上の異なるスポット、マルチウェルプレートの異なるウェル、異なるビーズ上、異なるフローチャネル内などにおいて検出する、マルチプレックス法、または、単一のアッセイにおける複数の変異体の検出を可能とする。複数のヌクレオチド変異体は、単一の核酸標的（例えば、ＲＮＡ）内に存在させる（−ｎｎｎＶ^１ｎｎｎｎｎｎｎ_ｘｎｎｎｎｎｎｎＶ^２ｎｎｎｎ−［配列中、Ｖ^１とＶ^２とは、各変異体部位において、コンペティマープローブの対を可能とするのに十分なスペースを置いている］など）こともでき、特定の遺伝子により、各々が対応する位置において異なるヌクレオチドを有する複数のｍＲＮＡ変異体（例えば、ＥＧＦＲ Ｇ７１９（野生型）、ＥＧＦＲ Ｇ７１９Ｃ、ＥＧＦＲ Ｇ７１９Ｓ、および／またはＥＧＦＲ Ｇ７１９Ａ；またはＫＲＡＳ Ｇ１２（野生型）、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、および／またはＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓ）を発現させることもでき、異なる位置において異なるヌクレオチドを有する複数のｍＲＮＡ変異体（例えば、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒおよび／またはＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍと併せた、上記のＥＧＦＲの７１９位形態のうちの１つまたは複数）を発現させることもでき、複数の異なる遺伝子に由来する変異体（例えば、上記のＫＲＡＳ形態のうちの１もしくは複数と併せた、上記のＥＧＦＲ形態のうちの１もしくは複数、および／または１もしくは複数のＢＲＡＦ形態（例えば、Ｖ６００Ｅ）と併せた、上記のＥＧＦＲ形態のうちの１もしくは複数）を発現させることもでき、上記のすべての組合せを単一のアッセイにおいて共検出することもできる。同じ標的核酸または異なる標的核酸に由来するさらなる変異体または変異体の組合せも選択することができる。当業者は、本明細書で開示される方法を、単一のアッセイにおいて所望の数の変異体を検出するのに適合させることができる。

Ａ．配列特異的リンカーを活用するプローブの検出
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ処理の後、試料を、複数の空間的に離れた領域を含む表面であって、領域の各々が、二官能性リンカー（また、「プログラミングリンカー」とも称する）と会合させた少なくとも１つのアンカーを含む表面と接触させる。代替的に、ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ処理の後、試料を、複数の表面であって、各表面が二官能性リンカーと会合させた少なくとも１つのアンカーを含む表面と接触させる。例えば、表面は、ビーズの亜集団の各々が、二官能性リンカーと会合させた少なくとも１つのアンカーを含む、ビーズの集団でありうる。例えば、第１の亜集団が、第１の二官能性リンカーと会合させた少なくとも１つのアンカーを含みうる一方で、第２の亜集団は、第２の二官能性リンカーと会合させた少なくとも１つの異なるアンカーを含みうるなどである。別の例では、表面は、複数のチャネルを有するフローセルなどのフローセルであって、チャネルの亜集団の各々が、二官能性リンカーと会合させた少なくとも１つのアンカーを含むフローセルでありうる。例えば、第１の亜集団が、第１の二官能性リンカーと会合させた少なくとも１つのアンカーを含みうる一方で、第２の亜集団は、第２の二官能性リンカーと会合させた少なくとも１つの異なるアンカーを含みうるなどである。

例示的な方法は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、国際特許公開ＷＯ９９／０３２６６３号；ＷＯ００／０３７６８３号；ＷＯ００／０３７６８４号；ＷＯ００／０７９００８号；ＷＯ０３／００２７５０号；およびＷＯ０８／１２１９２７号；ならびに米国特許第６，２３８，８６９号；同第６，４５８，５３３号；および同第７，６５９，０６３号において開示されている。また、Ｍａｒｔｅｌら、Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．、２００２年、１巻（１−１号）：６１〜７１頁；Ｍａｒｔｅｌら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ ａｎｄ Ｉｍａｇｉｎｇ、２００２年、３巻：３５〜４３頁；Ｍａｒｔｅｌら、Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｑ． ＬｕおよびＭ． Ｗｅｉｎｅｒ編、Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎａｔｉｃｋ（２００２年）；Ｓｅｌｉｇｍａｎｎ， Ｂ．、ＰｈａｒｍａｃｏＧｅｎｏｍｉｃｓ、２００３年、３巻：３６〜４３頁；Ｍａｒｔｅｌら、「Ａｒｒａｙ Ｆｏｒｍａｔｓ」ｉｎ 「Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｕ．Ｒ． ＭｕｌｌｅｒおよびＤ． Ｎｉｃｏｌａｕ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｓａｗａｄａら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ、２０巻：１５０６〜１５１３頁；Ｂａｋｉｒら、Ｂｉｏｒｇ． ＆ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ、１７巻：３４７３〜３４７９頁；Ｋｒｉｓら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１４４巻：１２５６〜１２６６頁；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、８７巻：９７９〜９９７頁；Ｒｉｍｓｚａら、Ｂｌｏｏｄ、２００８年１０月１５日、１１２巻（８号）：３４２５〜３４３３頁；Ｐｅｃｈｈｏｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２７巻、１０３８〜１０４２頁も参照されたい。これらのすべては、参照により本明細書に完全に組み込まれる。

アンカーと二官能性リンカーとは、ハイブリダイゼーション、アニーリング、共有結合、または他の結合によって会合させる。二官能性リンカーは、アンカーの少なくとも一部に特異的に結合する（例えば、相補的である）第１の部分、およびアッセイに含められるプローブのうちの一方の少なくとも一部（またはプローブに結合した標的の領域）に特異的に結合する（例えば、相補的である）第２の部分を含む。いくつかの例では、ヌクレアーゼを不活化するように試料を処理し（例えば、９５℃で１５〜３０分間にわたりインキュベートし）、アンカー（複数可）および二官能性リンカー（複数可）を含む表面と接触させる前に中和する。試料を、表面（例えば、アレイ、ビーズ、またはフローセル）と共に、プローブがアンカーと会合させた二官能性リンカーに特異的に結合する（例えば、ハイブリダイズする）のに十分な期間にわたりインキュベートする。いくつかの例では、試料の、表面とのインキュベーションは、プローブの、二官能性リンカーへのハイブリダイゼーション（「プローブの捕捉」）を可能とするように、約３７℃〜約６５℃で（例えば、５０℃など、約４５℃〜約６０℃、または約５０℃〜約６０℃）約１〜７２時間にわたる（例えば、約３〜１８時間、約１２〜２４時間、約１６〜２４時間、約２４〜７２時間、約２４〜４８時間、約３６〜７２時間、または一晩にわたる）。

いくつかの実施形態では、開示される方法は、ヌクレアーゼステップ後においてプローブを捕捉するのに活用される、二官能性リンカーと会合させた、表面上の（例えば、アレイ、ビーズ、またはフローセル上の）アンカーを含む。いくつかの例では、アンカーは、約８〜１５０ヌクレオチド（例えば、約１５〜１００、２０〜８０、２５〜７５、または２５〜５０、例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０ヌクレオチドなど）の長さのオリゴヌクレオチドである。非限定的な一例では、アンカーは、約２５ヌクレオチドの長さである。いくつかの例では、アンカーは、二官能性リンカーの第１の部分に特異的に結合する第１の部分、および表面とアンカーの第１の部分との間のスペーサーとして作用する第２の部分を含む。いくつかの例では、アンカーの第２の部分は、約６〜６０炭素原子またはヌクレオチド（約６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、３０、３６、４２、４８、５４、または６０炭素原子またはヌクレオチドなど）の長さである。他の例では、アンカーの第２の部分は、約５〜１００炭素原子またはヌクレオチド（約１０〜５０、１５〜４０、２０〜３０、または約２５炭素原子またはヌクレオチドなど）の長さである。

開示される方法のアンカーのための塩基組成は、アンカーと二官能性リンカーとの対合の熱力学的安定性を高くするような塩基組成である。いくつかの例では、アンカーのための塩基組成百分率は、約３０〜４０％のＧ、３０〜４０％のＣ、１０〜２０％のＡ、および１０〜２０％のＴである。いくつかの例では、アンカー内の近接塩基の頻度（ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）は、Ｇ−ＧまたはＣ−Ｃの近接塩基を最小化して、Ｇカルテットの形成により媒介される副反応を低減する。

開示される方法における使用のアンカーをデザインおよび合成する方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ９８／２４０９８号において記載されている。いくつかの例では、互いと実質的に類似しないアンカーのセットが所望される。類似しないアンカーのセットを得るための例示的なアルゴリズムは、以下の通りである。
１）セットのサイズを定義する。いくつかの実施形態では、１６、２４、３６、４８、４９、６４、８１、９６、および１００が有用なサイズを構成する。
２）アンカーセットの全体的な配列構造を定義する。上記で記載した長さおよび塩基組成を使用して、このようなパラメータを定義する。一般に、Ｇ塩基およびＣ塩基の数は、Ａ塩基およびＴ塩基の数と同等とする。この同等性は、最終セットの配置の（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎａｌ）多様性を最適化する。したがって、このようなセットは、式Ｇ_ｎＣ_ｎＡ_ｍＴ_ｍにより記載される。
３）ｍおよびｎにより定義されるセット構造について、乱数発生器を援用して、ランダムな配列異性体のセットをもたらす。
４）ランダムな配列セットの１つのメンバーを選択して、セットのエレメント＃１として使用する。
５）セットのメンバー間で許容される最大の類似性を定義する。類似性は、局所ペアワイズ塩基比較との関連で定義する。例えば、同一な長さｎの２つのオリゴマー鎖を、５’ 末端および３’末端が合うように整列させる場合、ミスマッチの欠如は、１〜ｎ位のすべてにおいて、２つの鎖内の塩基が同一である状況を指す。完全なミスマッチは、１〜ｎ位のすべてにおいて、２つの鎖内の塩基が異なる状況を指す。例えば、有用な最大の類似性は、１６マーの捕捉プローブである１６のセット内で、１０カ所以上のミスマッチでありうる。
６）ランダムな配列セットの第２のメンバーを選択し、エレメント＃１に対するその類似性を決定する。エレメント＃２が、エレメント＃１に対して許容される最大未満の類似性を保有する場合、エレメント＃２は、セット内に保持される。エレメント＃２が、許容される最大を超える類似性を保有する場合、エレメント＃２は棄却され、新たな配列を比較のために選び出す。このプロセスは、第２のエレメントを決定するまで繰り返す。
７）逐次的な様式で、ランダムな配列セットのさらなるメンバーであって、既に選択されたすべてのエレメントに関する非類似性の制限を満たすメンバーを選び出す。

開示される方法で使用されうる表面（または基材）のうちのいくつかは、商業的供給元から容易に入手可能である。いくつかの実施形態では、表面は、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣｏｓｔａｒまたはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより販売されている改変プレート（例えば、ガンマ線照射プレート）などの９６ウェルマイクロ滴定プレート、３８４ウェルマイクロ滴定プレート、または１５３６ウェルマイクロ滴定プレートである。他の実施形態では、基材は、１つまたは複数のビーズ（サイズまたは色により、例えば、フローサイトメトリーにより鑑別することができるビーズの集団など）を含む。いくつかの実施形態では、基材は、フローセル（複数のチャネルを有するフローセルなど）を含む。代替的に、次には、圧痕または「くぼみ」を含むウェルを含む表面を、アルミニウムまたは鉄鋼などの物質のマイクロマシニングにより鋳型を調製し、次いで、プラスチックまたは同様の材料を鋳型に微量注入して、構造物を形成することにより形成することもできる。代替的に、ガラス、プラスチック、セラミックなどからなる構造物をアセンブルすることもできる。セパレーターは、例えば、３つの片を結合したときに、各小孔が検査ウェルの壁面を形成するように、全体にわたり間隔を置いた小孔を有する材料、例えば、シリコーンの片でありうる。サブディバイダーは、例えば、スクリーンまたは微細な網目状の形態に成形された材料、例えば、シリコーンの薄片でありうる。いくつかの例では、ベースは、例えば、典型的には生化学アッセイに使用されるマイクロプレートの下層部分の形状をした材料（例えば、ガラスまたはプラスチック）の平坦な片である。ベースの上部表面は、平坦とすることもでき、サブディバイダーの形状により整列され、十分な部分分割をもたらす圧痕により形成することもでき、各試料ウェル内のウェルにより形成することもできる。３つの片は、標準的な手順、例えば、シリコンウェハーのアセンブリーにおいて使用される手順により結合することができる。

表面に適する材料としては、ガラス、シリカ、金、銀、ゲルまたはポリマー、ニトロセルロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリビニルピロリジン、ポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）、ポリビニリデンジフルオリド、ポリフルオロエチレン−プロピレン、ポリエチレンビニルアルコール、ポリメチルペンテン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリスルホン、ヒドロキシル化二軸延伸ポリプロピレン、アミノ化二軸延伸ポリプロピレン、チオール化二軸延伸ポリプロピレン、エチレンアクリル酸、エチレンメタクリル酸（ｔｈｙｌｅｎｅ ｍｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、およびこれらのコポリマーのブレンド（米国特許第５，９８５，５６７号を参照されたい）が挙げられるがこれらに限定されない。

一般に、表面を形成するのに使用しうる材料の適切な特徴としては、活性化すると、支持体の表面が、オリゴヌクレオチドなどの生体分子を、表面に共有結合によって（または不可逆的に）結合させることが可能であるように、表面の活性化に適すること；「インサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）」における生体分子の合成に適すること；オリゴヌクレオチドまたはタンパク質により占有されていない支持体上の領域が非特異的な結合に適さないように、または、非特異的な結合が生じる場合は、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質を除去することなく、このような材料を表面からたやすく除去しうるように、化学的に不活性であることが挙げられる。

本開示に従い、アンカーを配置するための多種多様なアレイフォーマットを用いることができる。１つの適切なフォーマットは、離れたセルの二次元パターン（６４×６４アレイによる４０９６個の四角など）を含む。当業者により十分に理解される通り、スロット（方形）アレイおよび円形アレイを含むがこれらに限定されない他のアレイフォーマットも、使用に同等に適する（米国特許第５，９８１，１８５号を参照されたい）。いくつかの例では、アレイは、マルチウェルプレートである。

オリゴヌクレオチドアンカー、二官能性リンカー、またはプローブは、従来の技術により、例えば、市販のオリゴヌクレオチド合成器により合成することもでき、かつ／またはそのように合成された部分断片を併せてライゲーションすることにより合成することもできる。このような方法により信頼できる形で合成するには長すぎる核酸は、従来の手順を使用する増幅手順により生成することができる。

一実施形態では、オリゴヌクレオチドアンカーなど、あらかじめ形成された核酸アンカーを、フォトリソグラフィーまたはシルクスクリーンによる化学的結合、インクジェット技術による処理、キャピラリーチップ、スクリーンチップ、または流体チャネルチップ、電極アレイを使用する電気化学的パターン形成、ピンまたはクイル（ｑｕｉｌｌ）による接触、または変性に続くフィルターへのベーキングまたはＵＶ照射（例えば、Ｒａｖａら（１９９６年）、米国特許第５，５４５，５３１号；Ｆｏｄｏｒら（１９９６年）、米国特許第５，５１０，２７０号；Ｚａｎｚｕｃｃｈｉら（１９９７年）、米国特許第５，６４３，７３８号；Ｂｒｅｎｎａｎ（１９９５年）、米国特許第５，４７４，７９６号；ＰＣＴ ＷＯ９２／１００９２号；ＰＣＴ ＷＯ９０／１５０７０号を参照されたい）を含む、従来の様々な技法のうちのいずれかにより、検査領域の表面上または表面内に位置させることができる。アンカーは、検査領域の表面上に配置することもでき、例えば、ポリアクリルアミドゲルパッドの場合は、アンカーのうちのいくつかが表面から突出し、リンカーとの相互作用に利用可能となるような様式で表面内に包埋することもできる。一実施形態では、あらかじめ形成されたオリゴヌクレオチドアンカーを、５’末端において、遊離アミノ基により誘導体化し、５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８．５、および１ｍＭのＥＤＴＡなどの緩衝液中に、経験により日常的に決定される濃度（例えば、約１μＭ）で溶解させ、Ｐｉｘｕｓ ｎａｎｏｊｅｔ分注器（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、約１０．４ナノリットルの液滴で、その上面が未使用の、乾燥させたＤＮＡ Ｂｉｎｄ プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）の上面である、検査ウェル内の具体的な位置に分配する。別の実施形態では、あらかじめ形成されたオリゴヌクレオチドアンカーは、３’末端において、遊離アミノ基により誘導体化され、７つの炭素によるスペーサーを含む。アンカーオリゴヌクレオチドは、ｐＨ８．５の０．５Ｍリン酸緩衝液中に２０μＭで溶解させ、Ｆａｌｃｏｎ １１７２プレート上にコンタクトプリントし、加湿チャンバー内でキャピラリーピンを使用してガンマ照射（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）する。オリゴヌクレオチド結合および蒸発の相対速度に応じて、調製の間におけるウェル内の水分を制御することが要請される場合もある。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドアンカーは、例えば、成長するオリゴヌクレオチド鎖の光活性化脱保護（例えば、部位指向型「マスク」の使用を伴う）など、従来の方法を使用して、検査領域の表面上で直接合成することもでき、ナノジェット分注器を使用する、脱活性化化合物のナノリットル単位の液滴をパターン化分注する（ｐａｔｔｅｒｎｅｄ ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ）ことにより、検査領域の表面上で直接合成することもできる。例えば、単一のヌクレオチドを施される、すべての成長するオリゴヌクレオチドの脱保護を行い、次いで、表面にわたり、ヌクレオチドを付加することができる。別の実施形態では、従来の方法を使用して、オリゴヌクレオチドアンカーを、オリゴヌクレオチドの３’末端を介して表面に結合させる。

当業者は、いくつかの例では、本明細書で提示される方法のうちのいずれかを使用する検出、なおまたは本明細書で記載される完全なヌクレアーゼ保護は、適切にプログラムされたコンピュータまたは他の装置により実施され、例えば、自動化されることを十分に理解する。

Ｂ．代替的な配列特異的方法を活用するプローブの検出
いくつかの実施形態では、試料中のプローブは、ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ処理の後、ハイスループットプラットフォームなど、代替的な方法を活用して検出する。いくつかの例では、プローブは、従来のマイクロアレイ解析またはハイブリッドの捕捉を活用して検出する。いくつかの実施形態では、プローブは、検出可能な標識を含まず、間接的な検出法が活用される。当業者には、このような方法が公知であり、下記で記載される方法を含むがこれらに限定されない。本開示における使用のための検出法はまた、将来的に開発される新規の検出法も含むことを理解されたい。

一例では、プローブは、ビーズアレイなど、ビーズベースのアッセイを活用して検出する。ビーズベースのアッセイの一例では、ＱＢＥＡＤアッセイなど、Ｘ−ＭＡＰ（登録商標）ビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を活用する。いくつかの例では、プローブを、Ｘ−ＭＡＰ（登録商標）ビーズ上または他のビーズ上で、ビーズに会合させたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション（例えば、約５０℃で約１〜２４時間にわたるハイブリダイゼーション）により捕捉する。プローブ内に含ませた検出可能な標識は、例えば、フローサイトメトリー（Ｌｕｍｉｎｅｘ ２００、Ｆｌｅｘｍａｐ ３Ｄ、または他の適する計器などを活用する）または他の適切な検出系（ビオチン／ストレプトアビジンなど）により検出することができる。

別の例では、プローブは、標準的なマイクロアレイを活用して検出する。このようなアレイの一例は、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎマイクロアレイ（Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）である。いくつかの例では、プローブを、プローブに特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含むアレイにハイブリダイズさせる。存在させる場合は、プローブ内に含ませた検出可能な標識を検出することができる。

さらなる例では、プローブは、「バーコード」アッセイにより検出する。このようなアッセイの一例は、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）である。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ処理の後、プローブを、１つまたは複数のカラーコードタグ（「バーコード」）を含むオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。カラーコードタグの検出は、試料中に含まれるプローブの同定をもたらす。例えば、ＷＯ０７／０７６１２８２号；ＷＯ０７／０７６１２９号；ＷＯ０７／１３９７６６号を参照されたい。

一例では、プローブは、フローセル技術を使用して検出する。例示的なフローセルは、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）から入手可能である。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ処理の後、プローブを、フローセルのチャネル内の対応するプローブまたは二官能性リンカーにハイブリダイズさせる。次いで、電気化学的検出、ＨＰＬＣ、または質量分析など、日常的な方法を使用して、プローブの存在を検出することができる。

他の例では、プローブは、質量分析により検出する。さらなる例では、全長プローブおよび標識の存在は、それらのサイズに基づき、少なくとも部分的にヌクレアーゼにより消化されたプローブから鑑別することができる。他の例では、質量分析を使用して、プローブを、それらのサイズおよび配列組成に基づき、検出および鑑別することができる。なおさらなる例では、プローブ（またはプローブにハイブリダイズした標的の領域）は、シーケンシング（例えば、サンガーシーケンシング、ピロシーケンシング、可逆的色素ターミネーターシーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング）、ライゲーションを介するシーケンシング（ＳＯＬｉＤシーケンシング）、半導体ベースのシーケンシング、Ｈｅｌｉｏｓｃｏｐｅ（商標）シーケンシング、単一分子シーケンシング、またはナノポアシーケンシング）により検出する。いくつかの例では、プローブは、プローブの５’末端および／または３’末端において、１つまたは複数のフランキング配列を含む。フランキング配列（複数可）は、試料中に存在する核酸分子内に見出されない配列（少なくとも１２ヌクレオチドの配列など）を有する複数の隣接ヌクレオチドを含み、プローブを配列決定するためのユニバーサルプライマーとしてもまた活用されうる、ユニバーサルハイブリダイゼーション配列および／またはユニバーサル増幅配列を提供する。このユニバーサルハイブリダイゼーション配列および／またはユニバーサル増幅配列は、増幅プライマーの少なくとも一部と相補的な配列を有する場合、同じ増幅プライマーを使用して、異なる標的核酸分子に特異的なプローブを増幅しうるので、マルチプレックス法を可能とする。なおさらなる例では、プローブは、ｅＳｅｎｓｏｒ（登録商標）技術（ＧｅｎＭａｒｋ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により検出する。

Ｃ．示差標識を活用するプローブの検出
開示される方法のいくつかの実施形態では、試料を、それらの各々が異なる検出可能な標識を含む、少なくとも２つのプローブ（下記のＶ節において論じられているプローブなど）と接触させる。各プローブ内の異なる検出可能な標識の存在は、検出されるプローブの配列に関わらず、標識（およびこれによるプローブ）の存在の検出を可能とする。したがって、このような検出法は、プローブが、変異体ヌクレオチドの位置（複数可）を除き、同じ配列を含むアッセイにおいて活用することができる。このような検出法はまた、プローブが、変異体ヌクレオチドの位置（複数可）を含む重複領域を除き、異なる配列を含むアッセイにおいても活用することができる。

いくつかの実施形態では、方法において活用される少なくとも２つのプローブは各々、異なるハプテン（ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、またはジニトロフェニルなど）で標識される。ヌクレアーゼ処理の後、各プローブの存在および／または量は、標識の各々を検出することにより決定することができる。いくつかの例では、各標識は、各標識の存在により、異なる有色生成物の生成が結果としてもたらされる、適切な比色アッセイにより検出する。非限定的な一例では、一方のプローブは、ビオチンで標識し、ビオチンで標識されたプローブを、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたアビジンまたはストレプトアビジンと接触させることにより検出することができ、他方のプローブは、ジゴキシゲニンで標識し、ジゴキシゲニンで標識されたプローブを、アルカリホスファターゼにコンジュゲートさせた抗ジゴキシゲニン抗体と接触させることにより検出することができる。ビオチンで標識されたプローブの存在および／または量は、発色性基質（ＴＭＢ、ＤＡＢ、またはＡＢＴＳなど）の、西洋ワサビペルオキシダーゼによる、有色生成物（例えば、青色の生成物）への転換により決定する。ジゴキシゲニンで標識されたプローブの存在および／または量は、発色性基質の、アルカリホスファターゼによる、異なる有色生成物（赤色の生成物など）への転換により検出する。当業者は、混合物中に存在する複数の標識されたプローブを検出および鑑別するのに適切な標識、酵素、および基質の組合せを選択することができる。

他の実施形態では、方法において活用される少なくとも２つのプローブは各々、異なる蛍光標識で標識される。ヌクレアーゼ処理後に残存する各プローブの存在および／または量は、混合物中に残存する蛍光標識（複数可）を検出することにより決定することができる。蛍光標識を検出および識別する任意の方法であって、現在公知であるかまたは将来的に開発される任意の方法を使用することができる。いくつかの例では、ヌクレアーゼ消化後において、混合物を、電気泳動（キャピラリー電気泳動など）により分離し、蛍光標識は、例えば、レーザー誘導型蛍光検出を活用して検出する。適切な電気泳動システムおよび検出システム、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒまたは３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が市販されている。他の例では、配列ベースの方法（上記で記載した方法など）によりプローブを捕捉し、それらの異なる蛍光標識の特異的な発光波長により鑑別する。

さらなる実施形態では、各プローブは、ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとの組合せが各プローブについて異なる、ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアで標識される。いくつかの例では、アクセプターフルオロフォアは、ヌクレオチド変異体の位置に最も近接するプローブの末端にある。プローブがハイブリダイズしない場合、アクセプターフルオロフォアは、ヌクレアーゼにより除去され、シグナルは検出されない（またはシグナルの低減が検出される）。プローブがハイブリダイズする場合、アクセプターフルオロフォアは、ヌクレアーゼから保護され、シグナルが検出される。他の例では、アクセプターフルオロフォアはクエンチャーであり、クエンチャーは、ヌクレオチド変異体の位置に最も近接するプローブの末端にある。プローブがハイブリダイズしない場合、クエンチャーは、ヌクレアーゼにより除去され、ドナーフルオロフォアに由来するシグナルが検出される。プローブがハイブリダイズする場合、クエンチャーは、ヌクレアーゼから保護され、ドナーフルオロフォアに由来するシグナルは検出されない。

異なる形で標識されたプローブを検出するさらなる方法は、フローサイトメトリーを含む。例えば、異なる蛍光標識で標識されたプローブは、ビーズ上で捕捉し、フローサイトメトリーにおけるそれらの発光スペクトルにより鑑別することができる。

Ｄ．シーケンシングによるプローブの検出
いくつかの例では、ヌクレアーゼ保護を耐え抜くプローブまたはプローブにハイブリダイズした標的の領域は、シーケンシングにより検出することができる。当技術分野では、核酸をシーケンシングする方法が日常的である。

Ｖ．検出可能な標識
いくつかの例では、開示されるプローブは、１つまたは複数の検出可能な標識を含む。当技術分野では、検出可能な標識が周知である。「検出可能な標識」とは、試料中のプローブ（例えば、結合したプローブまたはハイブリダイズしたプローブ）の存在または濃度を指し示す、検出可能なシグナルを生成するのに使用しうる分子または材料である。したがって、標識された核酸分子は、試料中の標的核酸配列（例えば、１つまたは複数の非変異体ヌクレオチドまたは変異体ヌクレオチドを有する標的核酸）の存在または濃度についての指標を提供する。例を提示するが、本開示は、特定の標識の使用に限定されるものではない。

いくつかの例では、開示される方法で活用されるプローブの各々は、同じ検出可能な標識で標識される。他の例では、少なくとも一方のプローブは、方法において活用される少なくとも１つの他方のプローブとは異なる検出可能な標識で標識される。例えば、少なくとも一方のプローブ（例えば、「野生型」プローブまたは「非変異体」プローブ）は、フルオロフォア（Ｃｙ−３（商標）など）で標識し、少なくとも一方のプローブ（例えば、「変異体」プローブ）は、異なるフルオロフォア（Ｃｙ−５（商標）など）で標識することができる。さらなるプローブを、方法に含める場合、それらは、第１のプローブおよび第２のプローブのうちの１つと同じ検出可能な標識で標識することもでき、第１のプローブおよび第２のプローブとは異なる検出可能な標識で標識することもできる。

１つまたは複数の核酸分子（開示されるプローブなど）と会合させた標識は、直接的に検出することもでき、間接的に検出することもできる。標識は、任意の公知の機構またはいまだ発見されていない機構であって、光子（ラジオ周波数、マイクロウェーブ周波数、赤外周波数、可視光周波数、および紫外周波数の光子を含む）の吸収、発光、および／または散乱を含む機構により検出することができる。検出可能な標識は、有色分子および有色材料、蛍光分子および蛍光材料、燐光分子および燐光材料、ならびに発光分子および発光材料、１つの物質を別の物質に転換して、検出可能な差違をもたらす触媒（酵素など）（無色の物質を有色の物質に転換することもしくはこの逆による、または沈殿物を生成させるかもしくは試料の濁度を増大させることによるなど）、ハプテン、放射性核種、ならびに常磁性分子または常磁性材料および磁性分子または磁性材料を含む。さらなる検出可能な標識は、ラマン（光散乱）標識（例えば、Ｎａｎｏｐｌｅｘ（登録商標）ｂｉｏｔａｇｓ；Ｏｘｏｎｉｃａ、Ｂｕｃｋｓ、ＵＫ）を含む。

非限定的な例では、プローブは、ハプテン分子（ニトロ芳香族化合物（例えば、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）など）、ビオチン、フルオレセイン、またはジゴキシゲニン）に共有結合によって結合させたｄＮＴＰで標識される。当技術分野では、ハプテンおよび他の標識をｄＮＴＰにコンジュゲートする（例えば、標識されたプローブへの組込みを容易とするように）ための方法が周知である。手順の例については、例えば、米国特許第５，２５８，５０７号、同第４，７７２，６９１号、同第５，３２８，８２４号、および同第４，７１１，９５５号を参照されたい。標識は、リン酸（例えば、αリン酸、βリン酸、またはγリン酸）または糖など、ｄＮＴＰ上の任意の位置において、ｄＮＴＰに、直接的または間接的に結合することができる。いくつかの例では、標識された核酸分子の検出は、ハプテンで標識されたプローブ（複数可）を、一次抗ハプテン抗体と接触させることにより達成することができる。一例では、一次抗ハプテン抗体（マウス抗ハプテン抗体など）を、酵素で直接標識する。別の例では、酵素にコンジュゲートさせた二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）（ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体など）を、シグナルの増幅に使用する。他の例では、ハプテンは、ビオチンであり、ハプテン標識されたプローブを、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの酵素にコンジュゲートさせたアビジンまたはストレプトアビジンと接触させることにより検出する。

検出可能な標識のさらなる例としては、蛍光分子（または蛍光色素）が挙げられる。当業者には、多数の蛍光色素が公知であり、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から選択することができる（例えば、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ − Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを参照されたい）。核酸分子（プローブなど）に結合させ（例えば、化学的にコンジュゲートし）うる特定のフルオロフォアの例は、とりわけ、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジン、ならびにアクリジンおよびイソチオシアン酸アクリジンなどの誘導体、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ ＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ、クマリン、および７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、Ｃｏｕｍａｒｉｎ １２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（７−ａｍｉｎｏ−４−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（Ｃｏｕｍａｒｉｎ １５１）などの誘導体；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５’’−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアン酸（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシン、ならびにエオシンおよびイソチオシアン酸エオシンなどの誘導体；エリトロシン、ならびにエリトロシンＢおよびイソチオシアン酸エリトロシンなどの誘導体；エチジウム；フルオレセイン、ならびに５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、およびＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、６−カルボキシ−フルオレセイン（ＨＥＸ）、およびＴＥＴ（テトラメチルフルオレセイン）などの誘導体；２’，７’−ジフルオロフルオレセイン（ＯＲＥＧＯＮ ＧＲＥＥＮ（登録商標）色素）；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーン（Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ）イソチオシアン酸塩；４−メチルウンベリフェロン；オルト−クレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローズアニリン；Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレン、ならびにピレン、酪酸ピレンおよび１−ピレン酪酸スクシンイミジルなどの誘導体；Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ３Ｂ−Ａ）；ローダミン、および６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、イソチオシアン酸ローダミンＸ、ローダミングリーン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン、およびイソチオシアン酸テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）；スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、およびスルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）色素）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；イソチオシアン酸テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）などの誘導体；リボフラビン；ロゾール酸およびテルビウムキレート誘導体；ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｒｅｄ ６４０；Ｃｙ５．５；およびＣｙ５６−カルボキシフルオレセイン；ホウ素ジピロメテンジフルオリド（ＢＯＤＩＰＹ）；アクリジン；スチルベン；Ｃｙ３；Ｃｙ５、ＶＩＣ（登録商標）色素（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；ＬＣ Ｒｅｄ ６４０；ＬＣ Ｒｅｄ ７０５；ならびにＹａｋｉｍａ ｙｅｌｌｏｗなど、Ｎａｚａｒｅｎｋｏらに対する米国特許第５，８６６，３６６号において提示されている。フルオロフォアのさらなる例としては、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）６７０、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）５７０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ ５９０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ ６１０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１５、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ ６３５、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ５２０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ ５４０、およびＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ ５６０（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）が挙げられる。他の適切なフルオロフォアとしては、当業者に公知のフルオロフォア、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から入手可能なフルオロフォアが挙げられる。

他の適切なフルオロフォアとしては、約６１７ｎｍで発光するチオール反応性のユーロピウムキレート（ＨｅｙｄｕｋおよびＨｅｙｄｕｋ、Ａｎａｌｙｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２４８巻：２１６〜２７頁、１９９７年；Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７４巻：３３１５〜２２頁、１９９９年）のほか、ＧＦＰ、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ（商標）、ジエチルアミノクマリン、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、４，７−ジクロロローダミン、およびキサンテン（Ｌｅｅらに対する米国特許第５，８００，９９６号において記載されるとおりの）、およびこれらの誘導体が挙げられる。例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なフルオロフォアであり、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）シリーズの色素（例えば、米国特許第５，６９６，１５７号、同第６，１３０，１０１号、および同第６，７１６，９７９号において記載されているとおりの）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）シリーズの色素（ホウ素ジピロメテンジフルオリド色素、例えば、米国特許第４，７７４，３３９号、同第５，１８７，２８８号、同第５，２４８，７８２号、同第５，２７４，１１３号、同第５，３３８，８５４号、同第５，４５１，６６３号、および同第５，４３３，８９６号において記載されているとおりの）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（登録商標）色素（米国特許第５，１３２，４３２号において記載されているスルホン化ピレンのアミン反応性誘導体）、およびＭａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ（登録商標）色素（米国特許第５，８３０，９１２号）が挙げられる、当業者に公知の他のフルオロフォアもまた、使用することができる。

特定の例では、フルオロフォアを、ドナーフルオロフォアまたはアクセプターフルオロフォアとして使用する。「アクセプターフルオロフォア」とは、例えば、約４００〜９００ｎｍの範囲の（約５００〜８００ｎｍの範囲などの）エネルギーを、ドナーフルオロフォアから吸収するフルオロフォアである。アクセプターフルオロフォアは一般に、ドナーフルオロフォアの最大吸光波長より通常少なくとも１０ｎｍ長い（少なくとも２０ｎｍ長いなど）波長の光を吸収し、約４００〜９００ｎｍの範囲の波長で蛍光発光の最大値をとる。アクセプターフルオロフォアは、ドナーにより発せられるエネルギーが、アクセプターを励起させうるように、ドナーフルオロフォアの発光と重複する励起スペクトルを有する。理想的には、アクセプターフルオロフォアは、核酸分子に結合させることが可能である。

特定の例では、アクセプターフルオロフォアは、Ｄａｂｃｙｌ、ＱＳＹ７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）、ＱＳＹ３３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲ（登録商標）色素（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ＢＨＱ０、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、およびＢＨＱ３など）、ＥＣＬＩＰＳＥ（商標）Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはＩＯＷＡ ＢＬＡＣＫ（登録商標）色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）など、ダーククエンチャーである。クエンチャーは、ドナーフルオロフォアの発光を低減する場合もあり、消光させる場合もある。このような例では、ドナーフルオロフォアと十分に近接する場合の、アクセプターフルオロフォアに由来する発光シグナルの増大を検出する（またはドナーフルオロフォアから著しく離れている場合の、アクセプターフルオロフォアに由来する発光シグナルの減少を検出する）代わりに、クエンチャーがドナーフルオロフォアから著しく離れている場合の、ドナーフルオロフォアに由来する発光シグナルの増大（またはクエンチャーであるアクセプターフルオロフォアと十分に近接する場合の、ドナーフルオロフォアに由来する発光シグナルの減少）を検出することができる。

「ドナーフルオロフォア」とは、エネルギーをアクセプターフルオロフォアに移動させ、これにより、アクセプターに由来する検出可能な蛍光シグナルを生成することが可能なフルオロフォアまたは発光分子である。ドナーフルオロフォアは一般に、約３００〜９００ｎｍ、例えば、約３５０〜８００ｎｍの範囲において吸収する化合物である。ドナーフルオロフォアは、所望の、例えば、約１０^３Ｍ^−１ｃｍ^−１を超える励起波長における大きなモル吸光係数を有する。

上記で記載した蛍光色素に加えて、蛍光標識は、半導体ナノ結晶、例えば、ＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴ（商標）（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得られる）；また、米国特許第６，８１５，０６４号；同第６，６８２，５９６号；および同第６，６４９，１３８号も参照されたい）などの蛍光ナノ粒子でありうる。半導体ナノ結晶は、サイズ依存的な光学特性および／または電気特性を有する極微粒子である。半導体ナノ結晶を、一次エネルギー源で照射すると、半導体ナノ結晶において使用される半導体材料のバンドギャップに対応する周波数の二次的なエネルギー放射が生じる。この放射は、特定の波長の有色光または蛍光として検出することができる。例えば、米国特許第６，６０２，６７１号では、スペクトル特性の異なる半導体ナノ結晶が記載されている。半導体ナノ結晶は、例えば、Ｂｒｕｃｈｅｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１巻：２０１３〜２０１６頁、１９９８年；Ｃｈａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１巻：２０１６〜２０１８頁、１９９８年；および米国特許第６，２７４，３２３号において記載されている技法により、様々な生体分子（ｄＮＴＰおよび／または核酸を含む）または基材にカップリングすることができる。

多様な組成の半導体ナノ結晶の形成は、例えば、米国特許第６，９２７，０６９号；同第６，９１４，２５６号；同第６，８５５，２０２号；同第６，７０９，９２９号；同第６，６８９，３３８号；同第６，５００，６２２号；同第６，３０６，７３６号；同第６，２２５，１９８号；同第６，２０７，３９２号；同第６，１１４，０３８号；同第６，０４８，６１６号；同第５，９９０，４７９号；同第５，６９０，８０７号；同第５，５７１，０１８号；同第５，５０５，９２８号；同第５，２６２，３５７号；および米国特許公開第２００３／０１６５９５１号のほか、ＰＣＴ公開第９９／２６２９９号（１９９９年５月２７日公開）において開示されている。それらの異なるスペクトル特性に基づき同定可能である、半導体ナノ結晶の個別の集団を作製することができる。例えば、それらの組成、サイズ、またはサイズおよび組成に基づき、異なる色の光を発する半導体ナノ結晶を作製することができる。例えば、サイズ（５６５ｎｍ、６５５ｎｍ、７０５ｎｍ、または８００ｎｍの発光波長）に基づき、異なる波長の光を発し、本明細書で開示されるプローブ内の蛍光標識として適切な量子ドットは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から入手可能である。

さらなる標識としては、例えば、放射性同位元素（^３Ｈなど）、Ｇｄ^３＋など、放射性金属イオンまたは常磁性金属イオンの、ＤＯＴＡキレートおよびＤＰＴＡキレートなどの金属キレート、およびリポソームが挙げられる。

核酸分子（プローブなど）と共に使用しうる、検出可能な標識としてはまた、酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、またはβ−ラクタマーゼが挙げられる。検出可能な標識が酵素を含む場合、色原体、蛍光性化合物、または発光性化合物を、酵素と組み合わせて使用して、検出可能なシグナルを生成することができる（多数のこのような化合物が、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから市販されている）。発色性化合物の特定の例としては、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）、ファーストレッド、ファーストブルー、ブロモクロロインドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ＡＰ Ｏｒａｎｇｅ、ＡＰ ｂｌｕｅ、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸］（ＡＢＴＳ）、ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルーおよびテトラゾリウムバイオレットが挙げられる。

代替的に、酵素を、金属組織学的検出スキームにおいて使用することもできる。金属組織学的検出法としては、水溶性の金属イオンおよび酵素の酸化還元不活性の基質と組み合わせた、アルカリホスファターゼなどの酵素の使用が挙げられる。基質は、酵素により、酸化還元活性の作用物質に転換され、酸化還元活性の作用物質は、金属イオンを還元し、検出可能な沈殿物を形成させる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１００９７６号、ＰＣＴ公開第２００５／００３７７７号、および米国特許出願公開第２００４／０２６５９２２号を参照されたい）。金属組織学的検出法としてはまた、水溶性の金属イオン、酸化剤、および還元剤を伴う酸化還元酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）の使用も挙げられ、ここでもまた、検出可能な沈殿物を形成する（例えば、米国特許第６，６７０，１１３号を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、プローブの５’末端または３’末端（例えば、プローブは、末端標識されたプローブである）において、プローブに結合させるか、またはプローブに組み込む。他の実施形態では、検出可能な標識は、「コンペティマー」プローブのハイブリダイゼーションにより置き換えられうるか、またはプローブ末端の近傍における、ハイブリダイズした塩基の「ブリージング」に起因して末端塩基を不安定化させるミスマッチの存在に起因して一本鎖でありうるか、一本鎖であるか、または一本鎖である可能性がある、任意のヌクレオチドの位置において、プローブに結合させるか、またはプローブに組み込む。いくつかの例では、検出可能な標識は、ヌクレオチド変異体の位置（複数可）から２塩基以内において、プローブに結合させるか、またはプローブへと組み込む。非限定的な一例では、ヌクレオチド変異体の位置が、プローブの末端から３番目の塩基である場合、検出可能な標識は、プローブの同じ末端の最初の５つの塩基のうちの１つまたは複数において存在させることができる。

ＶＩ．試料
開示される方法において使用するためのの試料は、核酸（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸断片、改変核酸、合成核酸など）を含む任意の検体を含む。いくつかの例では、開示される方法は、試料を分析する前に試料を得るステップを含む。いくつかの例では、開示される方法は、腫瘍を有する被験体を選択するステップを含み、次いで、いくつかの例では、ヌクレオチド変異体を含む１つまたは複数の標的核酸をさらに選択して、被験体の腫瘍に基づき検出する、例えば、被験体についての、または１もしくは複数の治療の選択についての診断または予後診断を決定するステップを含む。他の例では、開示される方法は、障害もしくは状態（遺伝性遺伝子障害、例えば、嚢胞性線維症、網膜色素変性、筋ジストロフィー、または疾患感受性遺伝子変異体、例えば、ＢＲＣＡ１変異もしくはＢＲＣＡ２変異など）を有するか、これを有することが疑われるか、またはこれを発症する可能性がある被験体を選択するステップを含み、次いで、いくつかの例では、ヌクレオチド変異体を含む１つまたは複数の標的核酸をさらに選択して、被験体の公知であるかまたは疑われる状態に基づき検出する、例えば、被験体についての、または１もしくは複数の治療の選択についての診断または予後診断を決定するステップを含む。

例示的な試料としては、限定せずに述べると、細胞（哺乳動物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞など）、ウイルス、細胞の溶解物、血液スメア、細胞遠心分離調製物、細胞学スメア、体液（例えば、血液、血清、血漿、唾液、痰、尿など）、組織試料（例えば、組織生検または腫瘍生検、組織移植片、異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｐｈ））、細針吸引物、組織切片（例えば、クリオスタット組織切片および／またはパラフィン包埋組織切片）、口腔内スワブ、子宮頸部スワブ、および／または環境試料（食品試料、水試料、土壌試料、空気フィルター試料、または水フィルター試料など）が挙げられる。他の例では、試料としては、被験体に由来する単離核酸（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなど）、例えば、被験体に由来する細胞、細胞の溶解物、血液スメア、細胞学スメア、体液、組織生検、細針吸引物、および／または組織切片から単離された核酸が挙げられる。当技術分野では、試料を被験体から得る方法が公知である。例えば、体液試料、組織試料、または細胞試料を得る方法は、日常的である。また、核酸を試料から単離する方法も日常的である。例示的な試料は、正常細胞または正常組織から得ることもでき、新生物細胞または新生物組織から得ることもできる。新生物とは、１つまたは複数の細胞が、分化の喪失、成長速度の増大、周囲組織への浸潤を伴う特徴的な退生を被り、細胞は転移が可能でありうる生物学的状態である。特定の例では、生物学的試料としては、新生物細胞を含有する試料などの腫瘍試料が挙げられる。

例示的な新生物細胞または組織は、肺がん（例えば、肺扁平上皮癌などの非小細胞肺がん）、乳癌（例えば、小葉癌および腺管癌）、副腎皮質がん、エナメル上皮腫、膨大部がん、膀胱がん、骨がん、子宮頸部がん、胆管腫、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、神経膠腫、顆粒細胞腫（ｇｒａｎｕｌａｒ ｃａｌｌ ｔｕｍｏｒ）、頭頸部がん、肝細胞がん、胞状奇胎、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、骨髄腫、神経芽腫、口腔がん、骨軟骨腫、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、石灰化上皮腫、前立腺がん、腎細胞がん、唾液腺腫瘍、軟組織腫瘍、スピッツ母斑、扁平上皮がん、奇形様がん（ｔｅｒａｔｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、および甲状腺がんを含む充実性腫瘍内に含まれ得るか、または充実性腫瘍から単離することができる。例示的な新生物細胞はまた、急性白血病（急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病）を含む白血病、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性形態および高悪性度形態）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、および骨髄異形成を含む血液がんに含まれ得るか、または血液がんから単離することもできる。

例えば、細胞材料を含有する腫瘍に由来する試料は、腫瘍の全部または一部の外科的切除により、細針吸引物を腫瘍から回収することによるほか、当技術分野で公知の他の方法によっても得ることができる。いくつかの例では、組織試料または細胞試料を、基材に適用し、解析して、１つまたは複数のヌクレオチド変異体の存在または非存在を決定する。開示される方法において有用な固体支持体には、生物学的試料を担持することだけが必要であり、必要に応じて、しかし有利に、試料中の成分（例えば、タンパク質配列および／または核酸配列）の簡便な検出を可能とする。例示的な支持体としては、顕微鏡用スライド（例えば、ガラス製の顕微鏡用スライドまたはプラスチック製の顕微鏡用スライド）、カバースリップ（例えば、ガラス製のカバースリップ、またはプラスチック製のカバースリップ）、組織培養ディッシュ、マルチウェルプレート、膜（例えば、ニトロセルロース膜またはポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜）、またはＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップが挙げられる。

開示される方法は、高感度かつ特異的であり、限定数の細胞しか含有しない試料中の標的核酸内のヌクレオチド変異体の検出を可能とする。例えば、標的核酸内の１つまたは複数のヌクレオチド変異体の存在は、１００個という少数の細胞（５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、５０，０００個以上の細胞など、１００個以上の細胞を含む試料など）で検出することができる。いくつかの例では、標的核酸（変異体の標的核酸など）の発現は、約１０００〜１００，０００個の細胞（例えば、約１０００〜５０，０００、１０００〜１５，０００、１０００〜１０，０００、１０００〜５０００、３０００〜５０，０００、６０００〜３０，０００、または１０，０００〜５０，０００個の細胞）で検出することができる。他の例では、標的核酸内の１つまたは複数のヌクレオチド変異体の存在は、約１〜１０００個の細胞（約１〜５００個の細胞、約１〜２５０個の細胞、約１〜１００個の細胞、約１〜５０個の細胞、約１〜２５個の細胞、または約１個の細胞など）で検出することができる。他の例では、開示される方法は、試料中または反応物（典型的には３０μｌの反応物など）中の標的核酸内の１つまたは複数のヌクレオチド変異体のうちの約１０，０００コピーという少数のヌクレオチド変異体（１０，０００コピー以上、例えば、約１５，０００、２５，０００、５０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、５００，０００コピー以上など）の検出を可能とする。他の例では、標的核酸内の１つまたは複数のヌクレオチド変異体の約１０，０００〜２５０，０００コピー（約１０，０００〜１００，０００コピー、約１５，０００〜１５０，０００コピー、約２０，０００〜２００，０００コピーまたは約１００，０００〜２５０，０００コピーなど）の存在を、試料中で検出することができる。

本明細書で記載される試料は、当技術分野で現在公知であるかまたは将来的に開発される任意の方法を使用して調製することができる。いくつかの例では、試料中の細胞を、水溶液中で（例えば、溶解緩衝液を使用して）溶解させるかまたは透過処理する。水溶液または溶解緩衝液としては、洗浄剤（ドデシル硫酸ナトリウムなど）、および１つまたは複数のカオトロピック剤（ホルムアミド、グアニジンＨＣｌ、グアニジンイソチオシアン酸塩、または尿素など）が挙げられる。溶液はまた、緩衝液（例えば、ＳＳＣ）も含有しうる。いくつかの例では、溶解緩衝液は、約１５％〜２５％のホルムアミド（ｖ／ｖ）、約０．０１％〜０．１％のＳＤＳ、および約０．５〜６倍濃度のＳＳＣ（例えば、約３倍濃度のＳＳＣ）を含む。緩衝液は必要に応じて、ｔＲＮＡ（例えば、約０．００１〜約２．０ｍｇ／ｍｌ）またはリボヌクレアーゼ阻害剤も含みうる。溶解緩衝液はまた、Ｐｈｅｎｏｌ ＲｅｄなどのｐＨ指示薬、ＥＤＴＡ（例えば、約１ｍＭ以下）、および／またはプロテイナーゼＫ（例えば、約０．１〜２ｍｇ／ｍｌ）も含みうる。特定の例では、溶解緩衝液は、２０％のホルムアミド、３倍濃度のＳＳＣ（７９．５％）、０．０５％のＳＤＳ、１μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ、および１ｍｇ／ｍｌのＰｈｅｎｏｌ Ｒｅｄを含む。細胞を、水溶液中で、細胞を溶解させるかまたは透過処理するのに十分な期間（約１分間〜約６０分間、例えば、約５分間〜約２０分間、または約１０分間など）にわたり、十分な温度（約２２℃〜約１１５℃、例えば、約３７℃〜約１０５℃、または約９０℃〜約１００℃など）でインキュベートする。いくつかの例では、溶解は、約９５℃で実施する。いくつかの例では、溶解ステップは、試料を約９５℃で約５〜１５分間にわたりインキュベートして、試料中のＲＮＡは変性させるが、ゲノムＤＮＡは変性させないことを含む。他の例では、溶解ステップは、試料を約１０５℃で約５〜１５分間にわたりインキュベートして、試料中のＲＮＡおよびゲノムＤＮＡのいずれも変性させることを含む。

いくつかの例では、さらなる精製を伴わずに、粗細胞の溶解を直接使用する（「溶解だけ」による試料調製）。細胞は、開示されるプローブのうちの１つまたは複数の存在下で溶解させることもでき、これらの非存在下で溶解させることもできる。細胞をプローブの非存在下で溶解させる場合、１つまたは複数のプローブは、粗溶解物に、後で添加することができる。他の例では、開示されるプローブのうちの１つまたは複数と接触させる前に、核酸を、細胞の溶解物から単離する。いくつかの例では、単離核酸（ＲＮＤまたはＤＮＡなど）を、溶解緩衝液に添加し、次いで、１つまたは複数のプローブを後で添加する。

他の例では、組織試料は、組織を媒体中で固定および包埋することにより調製されるか、または、例えば、固体支持体上の細胞をスメアリングまたは遠心分離することにより、固体支持体（スライドガラスなど）上の単層として調製される細胞懸濁物を含む。他の例では、細胞の集団（組織試料から得られる細胞または培養された細胞など）を沈降させることにより細胞ペレットを調製する。細胞ペレットは、解析のための包埋媒体中で、さらに固定および包埋することができる。さらなる例では、凍結させたばかりの（例えば、固定されていない）組織または組織切片を、本明細書で開示される方法において使用することができる。特定の例では、ＦＦＰＥ組織切片を、開示される方法において使用する。

いくつかの例では、包埋媒体を使用する。包埋媒体とは、後日の解析のために、組織および／または細胞を包埋して、それらを保存する一助となる不活性の材料である。包埋はまた、組織試料を薄い切片にスライスすることも可能とする。包埋媒体としては、パラフィン、セロイジン、ＯＣＴ（商標）化合物、寒天、プラスチック、またはアクリル樹脂が挙げられる。多くの包埋媒体は、疎水性であり、したがって、不活性材料は、主に親水性試薬を活用する解析の前に除去する必要がありうる。本明細書では、脱パラフィンまたは脱蝋という用語を、任意の種類の包埋媒体の、生物学的試料からの部分的または完全な除去を指すように広く使用する。例えば、パラフィン包埋組織切片は、トルエン、キシレン、リモネン、または他の適する溶媒などの有機溶媒中を通過させることにより脱蝋する。他の例では、パラフィン包埋組織試料を、加熱された鉱物油またはＮＯＲＰＡＲ（登録商標）（ＥｘｘｏｎＭｏｂｉｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を重層し、パラフィンを、加熱および静かに反転することにより、有機相に分配する。さらなる例では、パラフィン包埋組織切片を直接（例えば、脱蝋ステップを伴わずに）活用する。

組織は、潅流を含む任意の適切なプロセスにより、または固定剤中に浸漬することにより固定することができる。固定剤は、架橋剤（アルデヒド、例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、およびグルタルアルデヒドのほか、非アルデヒド架橋剤など）、酸化剤（例えば、金属イオンおよび金属錯体、例えば、四酸化オスミウムおよびクロム酸など）、タンパク質変性剤（例えば、酢酸、メタノール、およびエタノール）、未知の機構による固定剤（例えば、塩化第二水銀、アセトン、およびピクリン酸）、組合せ試薬（例えば、カルノア固定剤、メタカン、ブアン液、Ｂ５固定剤、ロスマン液、およびジャンドル液）、マイクロウェーブ、およびその他の固定剤（例えば、排除体積固定および蒸気固定）として分類することができる。固定剤中には、緩衝剤、洗浄剤、タンニン酸、フェノール、金属塩（塩化亜鉛、硫酸亜鉛、およびリチウム塩など）、およびランタンなどの添加剤もまた含ませることができる。

組織試料または細胞試料の調製において最も一般的に使用される固定剤は、一般にホルマリン溶液の形態にあるホルムアルデヒドである（緩衝液中の４％のホルムアルデヒドは、１０％の緩衝ホルマリンと称する）。一例では、固定剤は、１０％の中性緩衝ホルマリンである。

ＶＩＩ．アッセイ出力
いくつかの実施形態では、開示される方法は、試料中の１つまたは複数の核酸（１つまたは複数の非変異体核酸または変異体核酸など）の存在または量を決定するステップを含む。検査の結果は、検査結果についての情報を提供する閲覧可能な出力により、使用者（科学者、臨床医、もしくは他の保健従事者、検査室関係者、または患者など）に提供される。いくつかの例では、出力は、紙による出力（例えば、書面による出力または印字による出力）、スクリーン上の表示、グラフ式の出力（例えば、グラフ、図表、または他の図）、または聴覚的出力でありうる。一例では、出力は、試料中に検出される（または検出されない）非変異体核酸および／または変異体核酸の存在または量（正規化量または比など）についての定性的指標または定量的指標を含む表またはグラフである。他の例では、出力は、基材上に存在するシグナルのマップまたは画像（例えば、アレイからの蛍光または発光のデジタル画像）である。別の例では、出力は、核酸配列である。いくつかの例では、出力は、適切にプログラムされたコンピュータまたは他の装置により提供される。

いくつかの例では、出力は、試料中の非変異体核酸または変異体核酸の量などの（試料中の非変異体核酸の変異体核酸に対する比または非変異体核酸および／または変異体核酸の百分率を含むがこれらに限定されない）数値である。さらなる例では、出力は、グラフ表示、例えば、試料中の非変異体核酸または変異体核酸の値（量または相対量など）を、標準曲線上に指し示すグラフである。いくつかの例では、出力は、例えば、物理的手段、聴覚的手段、または電子的手段（例えば、郵便物、電話、ファックス送信、電子メール、または電子的医療記録への連絡）を介して出力を提供することにより、使用者に連絡される。

出力は、定量的情報（例えば、特定の非変異体核酸または変異体核酸の量、試料中の非変異体核酸の変異体核酸に対する比、または対照試料もしくは対照値と比べた非変異体核酸または変異体核酸の量）を提供することも可能であり、定性的情報（例えば、特定の非変異体核酸または変異体核酸の存在または非存在の決定）を提供することも可能である。いくつかの例では、出力は、細胞数、組織面積、組織または細胞の量、核酸のμｇ数、試料の体積（例えば、血液の体積）、またはウイルス力価、真菌力価、または細菌力価と比べた、変異体核酸または非変異体核酸の量として表す。さらなる例では、出力は、対照と比べた増大もしくは減少、または対照と比べた無変化の同定など、試料中の非変異体核酸または変異体核酸の相対量に関する定性的情報も提供しうる。他の例では、出力は、試料中の変異体核酸または非変異体核酸の、対照もしくはハウスキーピング遺伝子と比べた相対量、または変異体核酸の位置から上流もしくは下流の標的核酸の領域と比べた相対量も提供しうる。

本開示を、以下の非限定的実施例によりさらに例示する。

（実施例１）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物におけるヌクレオチド変異体の検出
この実施例では、定量的ヌクレアーゼ保護アッセイ法を用いるＩＶＴにおける一塩基変異体の検出について記載する。

プローブセットは、ＫＲＡＳまたは上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）におけるヌクレオチド変異体を検出するように設計した。プローブの配列を表２に示す。野生型プローブは、ビオチンで各々３’末端標識したものであり、変異体プローブは、ビオチンで各々５’末端標識したものであった。

^ａ３’ｂＳｈは、プローブがビオチンで３’末端標識したものであることを示し、５’ｂＳｈは、プローブがビオチンで５’末端標識したものであることを示す。変異体ヌクレオチドの位置は、各プローブにおいて太字と下線により示す。

各野生型配列または変異体配列の合成ＩＶＴ ｍＲＮＡを合成した。各ＩＶＴを溶解緩衝液で所望の濃度に希釈し、２５μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに加え、その後、５μｌのビオチン化プローブミックス（溶解緩衝液中１ｎＭ）および７０μｌの変性油を加えた。各ビオチン化プローブの最終濃度は、１６７ｐＭであった。プレートを９５℃で１０〜１５分間加熱し、次いで５０℃で約１６時間（一夜）インキュベートして、ＩＶＴ−プローブハイブリダイゼーションをもたらした。ハイブリダイゼーションの後、５０単位（ｕｎｉｔ）のＳ１ヌクレアーゼ（２０μｌのＳ１ヌクレアーゼ緩衝液中）を加え、プレートを振とうしながら５０℃で６０〜９０分間インキュベートして、非結合ＩＶＴおよびプローブを消化した。各ウェルの全内容物を１ウェル当たり１０μｌの停止溶液を含む新たな９６ウェルプレートに移すことにより、Ｓ１ヌクレアーゼ反応を停止させた。このプレートを９０℃で１５分間インキュベートし、室温で約１５分間冷却した。反応物は、１０μｌの中和溶液を加えることにより中和し、次いでプログラムＡｒｒａｙＰｌａｔｅ（商標）に移した。

ＡｒｒａｙＰｌａｔｅ（商標）は、アンカーと相補的な配列およびプローブの１つと相補的な配列を含む「プログラミングリンカー」に結合するように改変された各ウェルにスポットされた１６種の独特の「アンカー」オリゴヌクレオチドの４×４グリッドを含んでいた。ＡｒｒａｙＰｌａｔｅ（商標）中の反応物を５０℃で約１６時間（一夜）インキュベートして、プログラミングリンカーへのプローブのハイブリダイゼーションをもたらした。ＡｒｒａｙＰｌａｔｅ（商標）を洗浄し、次いでアビジン−ペルオキシダーゼとともに３７℃で１時間インキュベートした。最終洗浄の後、化学発光基質（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を各ウェルに加え、ＨＴＧ’ｓ Ｏｍｉｘ Ｉｍａｇｅｒで画像を取得した。

すべてのプローブについて、シグナルは、１ウェル当たり最小で１５，０００コピー（１ｆＭ）のＩＶＴで検出することができた（表３）。アッセイは、１ウェル当たり１５００万コピー（１ｐＭ）のＩＶＴから１５，０００コピー（１ｆＭ）のＩＶＴまでの３桁にわたりＲ平方値が＞０．９００で線形性を示した（図３）。アッセイはまた、変動係数（ＣＶ）が一般的に１５％未満で良好な再現性を示した（表４）。
（実施例２）
試料中の野生型核酸および変異体核酸の検出
この実施例では、競合的定量的ヌクレアーゼ保護アッセイ法を用いる同じ試料中の野生型核酸および変異体核酸の検出について記載する。

該方法は、各ＳＮＰに対する野生型プローブおよび変異体プローブの両方の混合物を単一ウェルに加え、アッセイに野生型ＩＶＴおよび変異体ＩＶＴの混合物も含めたことを除いて、実施例１で記載したように実施した。

あるいは、出発試料は、野生型ＩＶＴおよび変異体ＩＶＴの混合物をスパイクした肺ＦＦＰＥ試料であった。この場合、ＦＦＰＥ試料をスライドからこすり落として、遠心管に入れ、溶解緩衝液および変性油を加え、試料を１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。試料を９５℃で１５分間インキュベートし、室温で５〜１０分間冷却した。ＩＶＴおよび１００μｌの溶解緩衝液につき２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを加え、試料を振とうしながら５０℃で３０〜６０分間インキュベートした。この時点で、２５μｌの試料を９６ウェルプレートに移し、実施例１におけるプロトコールに従った。

変異体プローブは、高レベルの検出特異性を示した（表５〜８）。野生型ＩＶＴおよび変異体ＩＶＴの混合物について、１６％の変異体ＩＶＴが存在した場合に、シグナル強度において有意差（ｐ＜０．０５）がすべてのプローブセットについて認められた。一部のプローブセット（Ｄ７６１ＹおよびＬ８５８Ｒ）は、わずか６％の変異体ＩＶＴが存在した場合に、強度において有意差を示した（表６）。野生型ＩＶＴおよび変異体ＩＶＴの混合物をスパイクした肺ＦＦＰＥについて、１６％の変異体ＩＶＴが肺ＦＦＰＥに存在した場合に、シグナル強度において有意差（ｐ＜０．０５）がすべてのプローブについて認められた。一部のプローブセット（Ｑ６１Ｈ、Ｄ７６１Ｙ、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ）は、わずか６％の変異体ＩＶＴが存在した場合に、強度において有意差を示した（表８）。

（実施例３）
細胞系における変異体の検出
この実施例では、定量的ヌクレアーゼ保護アッセイ法を用いるＫＲＡＳ変異および／またはＥＧＦＲ変異を含むことが公知の細胞系からの試料中の変異体の検出について記載する。

出発試料は、１つまたは複数のＥＧＦＲ変異を含むことが公知の細胞系（Ｈ１９７５細胞および１１−１８細胞）ならびに公知のＥＧＦＲ変異を含まない細胞系（Ａ５４９細胞）からの細胞であった。２５μｌの溶解緩衝液中２０，０００個の細胞を９６ウェルプレートに移し、実施例１におけるプロトコールに従った。野生型ＥＧＦＲ ＩＶＴと変異体ＥＧＦＲ ＩＶＴとの様々な比率からなる標準曲線も同じプレート上で実施して、定量対照の役割を果たした。

Ａ５４９細胞系（ヒト肺癌、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１８５）は、公知のＥＧＦＲ変異を有さず（Ｔｒａｃｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６４巻、７２４１〜７２４４頁、２００４年）、したがって、野生型細胞対照としての役割を果たしうる。Ｈ１９７５（ヒト肺腺癌、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−５９０８）細胞系は、対立遺伝子の約５０−５０混合でＴ７９０ＭおよびＬ８５８Ｒ ＥＧＦＲ変異の両方を有すると報告されている（Ｓｏｒｄｅｌｌａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５巻：１１６３〜１１６７頁、２００４年）。１１−１８細胞系は、Ｌ８５８Ｒ ＥＧＦＲ変異を有するが、Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異は有さないことが報告されている（Ｎａｇａｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６５巻、７２７６〜７２８２頁、２００５年）。アッセイにより、Ａ５４９細胞系がＥＧＦＲ Ｔ７９０およびＬ８５８について野生型であることが示された（図４ＡおよびＢ）。Ｈ１９７５細胞系は、約５０％のＴ７９０Ｍおよび５０％のＬ８５８Ｒを発現し（図４ＡおよびＢ）、１１−１８細胞系は、Ｔ７９０について野生型であるが、約５０％のＬ８５８Ｒを発現した（図４ＡおよびＢ）。細胞系試料中で発現した変異体ＲＮＡの量は、細胞系試料と同じ条件下で評価した、野生型ＩＶＴと変異体ＩＶＴとの比の滴定から推定した。

（実施例４）
複数の試料型におけるＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異体の検出
この実施例では、ＩＶＴ、細胞溶解物、細胞ペレットおよびＦＦＰＥ黒色腫試料におけるＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異体の検出について記載する。

プローブセットは、ＢＲＡＦのＶ６００Ｅ変異体を検出するように設計した。プローブの配列を表９に示す。野生型プローブは、ビオチンで３’末端標識したものであり、変異体プローブは、ビオチンで５’末端標識したものであった。
^ａ３’ｂＲは、プローブがビオチンで３’末端標識したものであることを示し、５’ｂＲは、プローブがビオチンで５’末端標識したものであることを示す。変異体ヌクレオチドの位置は、各プローブにおいて太字と下線により示す。

様々な量の混合されたＢＲＡＦ野生型ＩＶＴおよびＶ６００Ｅ ＩＶＴの検出は、実施例２で記載したように行った。ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ ＳＮＰに対する野生型プローブおよび変異体プローブの両方の混合物を単一ウェルに加え、アッセイにＶ６００野生型ＩＶＴもしくはＶ６００Ｅ ＩＶＴのいずれか単独で、または野生型ＩＶＴおよび変異体ＩＶＴの混合物としても含めた。総ＩＶＴ濃度は、２００ｆＭで一定に保った。Ｖ６００Ｅ変異は、総転写物量のわずか５％が存在した場合でさえ検出することができた（図５）。

ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅの存在は、定量的ヌクレアーゼ保護アッセイ法を用いて、変異を含むことが公知の細胞系の細胞溶解物においてアッセイした。細胞溶解物を５０，０００個の細胞から調製し、Ｓ１ヌクレアーゼ反応を６０℃で行わせたことを除いて、実施例３で記載したプロトコールに従った。出発試料は、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異体について異型接合性であることが公知である結腸がん細胞系（ＨＴ−２９およびＣＯＬＯ−２０５；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／〜／ｍｅｄｉａ／ＰＤＦｓ／Ｃｕｌｔｕｒｅ％２０Ｇｕｉｄｅｓ／Ｃｅｌｌ＿Ｌｉｎｅｓ＿ｂｙ＿Ｇｅｎｅ＿Ｍｕｔａｔｉｏｎ．ａｓｈｘ）ならびにＢＲＡＦアミノ酸６００において野生型の扁平上皮癌細胞系（ＲＰＭＩ−２６５０）からの細胞であった。Ｖ６００ｗｔおよびＶ６００Ｅプローブを用いて、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異体および野生型の両方が公知の異型接合性細胞系において検出されたが、ＲＰＭＩ−２６５０細胞系においては野生型のみが検出された（図６）。

固定細胞ペレットも調製し、試料としてアッセイに用いた。細胞ペレットは、８〜１５×１０^６個の細胞を遠心分離し、上清を除去し、１〜４ｍｌのＰＢＳ中で再ペレット化することにより調製した。細胞ペレットを冷１０％中性緩衝ホルマリンで少なくとも４時間固定した。次いで細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。Ｓｈａｎｄｏｎ ＣＹＴＯＢＬＯＣＫ（登録商標）細胞ブロック調製システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、細胞ブロックを調製した。手短に述べると、１〜２滴の試薬＃２を１５ｍｌコニカルチューブ中のペレット化細胞に添加し、ボルテックスした。次に、１〜２滴の試薬＃１を細胞と混合した。ゲル化細胞ブロックをカセットに移し、７０％アルコールに入れた。ＦＦＰＥ細胞ペレットブロックをミクロトームで５μｍ切片に切断した。細胞ペレットの面積は、約１ｃｍ^２であった。溶解緩衝液（２５μＬ）を各５μｍ切片に加えた。次いで上の実施例２で記載したように試料を９５℃に加熱し、プロテイナーゼＫで処理した。この実験では、試料を１ウェル当たり１枚の５μｍ切片の濃度で試験した。実施例１におけるプロトコールに従ってヌクレアーゼ保護アッセイを行った。野生型ＢＲＡＦ Ｖ６００のみがＲＰＭＩ−２６５０細胞に検出されたが、野生型およびＶ６００Ｅ変異体の両方がＣＯＬＯ−２０５細胞に検出された（図７）。ＨＴ−２９細胞ペレットにはいずれも検出されなかった。これは、この細胞ペレットの試料調製における問題に起因する可能性があった。

Ｓ１ヌクレアーゼ反応を６０℃で行わせたことを除いて、実施例１で記載したプロトコールを用いて、原発性または転移性黒色腫の一連の５２個のＦＦＰＥ試料をＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異の存在について試験した。ＦＦＰＥ試料は、実施例２におけるプロトコールを用いて調製した。試料のうちの４個について、判定を行うのに不十分なシグナルが存在していた。ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異は、十分なシグナルを有する４８個の試料のうちの２６個（５４％）において同定された（図８Ａ〜Ｂ）。これは、黒色腫におけるＢＲＡＦ変異の公表された頻度（Ｄａｖｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４１７巻、９４９〜９５４頁、２００２年）と一致している。

本開示の原理を適用することができる多くの可能な実施形態を考慮して、例示した実施形態は、例にすぎないことを認識すべきであり、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲により定義される。したがって、これらの特許請求の範囲内および精神の範囲内にあるすべてを本発明として請求する。

Claims (34)

1. 試料中の標的核酸分子内のヌクレオチド変異体の存在を検出する方法であって、
   第１のプローブおよび第２のプローブが該標的核酸分子にハイブリダイズするのに十分な条件下で、該試料を少なくとも２つのプローブと接触させて、ハイブリダイズした核酸分子とハイブリダイズしなかった核酸分子との混合物を生成するステップであって、
   該第１のプローブは、該標的核酸分子のヌクレオチド変異体における野生型と相補的であり、該標的核酸分子のヌクレオチド変異体の位置は、該第１のプローブの３’末端から２〜６塩基であり、
   該第２のプローブは、該標的核酸分子のヌクレオチド変異体の第１の変異体と相補的であり、該標的核酸のヌクレオチド変異体の位置は、該第２のプローブの５’末端から２〜６塩基であり、かつ
   該第１のプローブと該第２のプローブが、該第１のプローブの３’末端および該第２のプローブの５’末端で該変異体の位置の領域においてのみ重複しているか；または
   該第１のプローブは、該標的核酸分子のヌクレオチド変異体における野生型と相補的であり、該標的核酸分子のヌクレオチド変異体の位置は、該第１のプローブの５’末端から２〜６塩基であり、
   該第２のプローブは、該標的核酸分子のヌクレオチド変異体の第１の変異体と相補的であり、該標的核酸のヌクレオチド変異体の位置は、該第２のプローブの３’末端から２〜６塩基であり、かつ
   該第１のプローブと該第２のプローブが、該第１のプローブの５’末端および該第２のプローブの３’末端で該変異体の位置の領域においてのみ重複している、ステップと；
   ハイブリダイズした核酸分子とハイブリダイズしなかった核酸分子との該混合物を、一本鎖核酸分子に特異的なヌクレアーゼと、該ハイブリダイズしなかった核酸分子を除去するのに十分な条件下で接触させるステップと；
   該混合物中の、該プローブのうちの１つまたは複数の存在を検出して、これにより、該試料中の該ヌクレオチド変異体の存在を検出するステップと
   を含む方法。
2. 前記ヌクレオチド変異体の位置が、前記第１のプローブの５’末端および前記第２のプローブの３’末端から２〜６塩基であるか；または
   前記ヌクレオチド変異体の位置が、前記第１のプローブの３’末端および前記第２のプローブの５’末端から２〜６塩基である、請求項１に記載の方法。
3. 前記ヌクレオチド変異体の位置が、前記第１のプローブの５’末端および前記第２のプローブの３’末端から３塩基であるか；または
   前記ヌクレオチド変異体の位置が、前記第１のプローブの３’末端および前記第２のプローブの５’末端から３塩基である、請求項２に記載の方法。
4. 前記第１のプローブおよび前記第２のプローブの各々が、検出可能な標識を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記第１のプローブおよび前記第２のプローブが末端で標識されている、請求項４に記載の方法。
6. 前記標的核酸分子のヌクレオチド変異体の位置が、前記第１のプローブの５’末端から２〜６塩基であり、前記検出可能な標識が、該第１のプローブの５’末端にあり、
   該標的核酸分子のヌクレオチド変異体の位置が、前記第２のプローブの３’末端から２〜６塩基であり、前記検出可能な標識が、該第２のプローブの３’末端にある、
   請求項５に記載の方法。
7. 前記標的核酸分子のヌクレオチド変異体の位置が、前記第１のプローブの３’末端から２〜６塩基であり、前記検出可能な標識が、該第１のプローブの３’末端にあり、
   該標的核酸分子のヌクレオチド変異体の位置が、前記第２のプローブの５’末端から２〜６塩基であり、前記検出可能な標識が、該第２のプローブの５’末端にある、
   請求項５に記載の方法。
8. 前記検出可能な標識が、ハプテン、蛍光分子、酵素、または放射性同位元素を含む、請求項４から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記検出可能な標識が、ビオチンを含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記混合物中の、前記プローブのうちの１つまたは複数の存在を検出するステップが、該プローブを、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼにコンジュゲートされたアビジンまたはストレプトアビジンと接触させることを含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記第１のプローブおよび前記第２のプローブが、異なる検出可能な標識を含む、請求項４から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記第１のプローブおよび前記第２のプローブが、同じ検出可能な標識を含む、請求項４から１０のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記試料を、前記標的核酸分子のヌクレオチド変異体における第２の変異体と相補的な第３のプローブおよび該第３のプローブの５’末端における検出可能な標識と、該第３のプローブが該標的核酸にハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップであって、該標的核酸のヌクレオチド変異体の位置が、該第３のプローブの標識された５’末端から２〜６塩基であり、かつ、前記第１のプローブと該第３のプローブが、該第１のプローブの３’末端および該第３のプローブの５’末端で該変異体の位置の領域においてのみ重複しているステップをさらに含むか；または
    前記試料を、前記標的核酸分子のヌクレオチド変異体における第２の変異体と相補的な第３のプローブおよび該第３のプローブの３’末端における検出可能な標識と、該第３のプローブが該標的核酸にハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップであって、該標的核酸のヌクレオチド変異体の位置が、該第３のプローブの標識された３’末端から２〜６塩基であり、かつ、前記第１のプローブと該第３のプローブが、該第１のプローブの５’末端および該第３のプローブの３’末端で該変異体の位置の領域においてのみ重複しているステップをさらに含む、請求項４から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記試料を、前記標的核酸分子のヌクレオチド変異体における第３の変異体と相補的な第４のプローブおよび該第４のプローブの５’末端における検出可能な標識と、該第４のプローブが該標的核酸にハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップであって、該標的核酸のヌクレオチド変異体の位置が、該第４のプローブの標識された５’末端から２〜６塩基であり、かつ、前記第１のプローブと該第４のプローブが、該第１のプローブの３’末端および該第４のプローブの５’末端で該変異体の位置の領域においてのみ重複しているステップをさらに含むか；または
    前記試料を、前記標的核酸分子のヌクレオチド変異体における第３の変異体と相補的な第４のプローブおよび該第４のプローブの３’末端における検出可能な標識と、該第４のプローブが該標的核酸にハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップであって、該標的核酸のヌクレオチド変異体の位置が、該第４のプローブの標識された３’末端から２〜６塩基であり、かつ、前記第１のプローブと該第４のプローブが、該第１のプローブの５’末端および該第４のプローブの３’末端で該変異体の位置の領域においてのみ重複しているステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記少なくとも２つのプローブが前記標的核酸にハイブリダイズするのに十分な前記条件が、該少なくとも２つのプローブを、前記試料と、約５０℃で約１６時間にわたりインキュベートすることを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記少なくとも２つのプローブの各々が、１８〜７５ヌクレオチドを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記少なくとも２つのプローブ各々が、約５０℃〜約７０℃の融解温度（Ｔ_ｍ）を有する、請求項１６に記載の方法。
18. 前記少なくとも２つのプローブ各々が約６０℃のＴ_ｍを有する、請求項１７に記載の方法。
19. 前記少なくとも２つのプローブの各々が、２０〜４１ヌクレオチドを含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記プローブのうちの少なくとも１つが、１つまたは複数の改変ヌクレオチドを含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記１つまたは複数の改変ヌクレオチドが、ロックト核酸、ペプチド核酸、非天然ヌクレオチド、またはこれらの２つ以上の組合せを含む、請求項２０に記載の方法。
22. 一本鎖核酸分子に特異的な前記ヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼを含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記ハイブリダイズしなかった核酸分子を除去するのに十分な前記条件が、ハイブリダイズした核酸分子とハイブリダイズしなかった核酸分子との前記混合物を、前記Ｓ１ヌクレアーゼと、約６０℃で約２時間にわたり、または約５０℃で約１時間にわたり接触させることを含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記混合物中の、前記プローブのうちの１つまたは複数の存在を検出するステップが、配列決定、核酸増幅、または質量分析を含む、請求項１から３または１５から２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記混合物中の、前記プローブのうちの１つまたは複数の存在を検出するステップが、キャピラリー電気泳動を含む、請求項４から２３のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記混合物中の、前記プローブのうちの１つまたは複数の存在を検出するステップが、
    該混合物を、複数の空間的に離れた領域を含む表面であって、各領域が、少なくとも１つのアンカーであって、該アンカーに特異的に結合する第１の部分および該プローブのうちの１つに特異的に結合する第２の部分を含む二官能性リンカーと会合させたアンカーを含む表面と、該プローブが該二官能性リンカーの該第２の部分に特異的に結合するのに十分な条件下で接触させることと；
    前記検出可能な標識の存在を検出することと
    を含む、請求項４から２３のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記混合物中の、前記プローブのうちの１つまたは複数の存在を検出するステップが、
    該混合物を、表面の亜集団を含む表面の集団であって、表面の各亜集団が、少なくとも１つのアンカーであって、該アンカーに特異的に結合する第１の部分および該プローブのうちの１つに特異的に結合する第２の部分を含む二官能性リンカーと会合させたアンカーを含む表面の集団と、該プローブが該二官能性リンカーの該第２の部分に特異的に結合するのに十分な条件下で接触させることと；
    前記検出可能な標識の存在を検出することと
    を含む、請求項４から２３のいずれか一項に記載の方法。
28. 表面の前記集団が、ビーズまたはマイクロ流体チャネルの集団を含む、請求項２７に記載の方法。
29. 表面の前記集団が、
    実質的に類似する第１のアンカーが安定的に結合している第１の表面、および実質的に類似する第２のアンカーが結合している第２の表面であって、該第１のアンカーと第２のアンカーは実質的に互いに異なる、第１の表面および第２の表面と；
    該第１のアンカーと相補的な第１の部分および前記第１のプローブと相補的な第２の部分を有する第１の二官能性リンカーと；
    該第２のアンカーと相補的な第１の部分および前記第２のプローブと相補的な第２の部分を有する第２の二官能性リンカーと
    を含む、請求項２８に記載の方法。
30. 前記アンカーが、前記二官能性リンカーに特異的に結合する第１の領域と、スペーサー分子を含む第２の領域とを含む、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記スペーサー分子を含む前記第２の領域が、前記第１の領域と前記表面との間にある、請求項３０に記載の方法。
32. 前記試料を溶解させるステップをさらに含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記試料が、組織、固定された組織、腫瘍生検、細胞、血液、体液、または単離核酸を含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記単離核酸が、ＲＮＡまたはｍＲＮＡを含む、請求項３３に記載の方法。