CN104603290A - 用于检测核苷酸变异的核酸酶保护方法 - Google Patents

Abstract

本文公开的是利用核酸酶保护测定来检测靶核酸中核苷酸变异的存在的方法。所述方法包括在足以使探针与靶核酸杂交的条件下，使样品与至少两种探针接触，其中第一探针与靶核酸中核苷酸变异位置处的野生型(非变异)核苷酸互补，第二探针与靶核酸中核苷酸变异位置处的变异核苷酸互补，产生杂交的和未杂交的核酸的混合物。在足以移除未杂交的核酸分子(或核酸分子的未杂交部分)的条件下，使所述混合物与特异性针对单链核酸分子的核酸酶接触。然后检测所述至少两种探针的存在，从而检测所述样品中变异和/或非变异靶核酸的存在。

Description

用于检测核苷酸变异的核酸酶保护方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2012年6月29日提交的美国临时申请61/666,456和于2013年5月30日提交的美国临时申请61/829,102的优先权，所述临时申请的全文以引用的方式纳入本说明书。

技术领域

本公开内容涉及检测靶核酸分子中的一种或多种核苷酸变异的方法，特别是利用核酸酶保护方法。

背景技术

许多疾病或紊乱的特征在于破坏蛋白质表达或活性、或破坏细胞信号通路而导致对细胞过程的异常控制或导致细胞的不受控生长和增殖。这些破坏通常是由遗传改变(也称为突变)或影响特定蛋白活性或表达的其他改变引起。许多疾病的诊断和/或治疗方法的选择包括鉴别来自已知或疑似患特定疾病的受试者的样本中特定的遗传改变。

需要持续开发诊断测试和方法，用于检测人类疾病的发生和发展中涉及的突变和分子特征。此类方法和诊断测试尤其将有助筛选于新药物，以及开发选择用于治疗的患者并监测患者对靶向治疗的反应的方法。

发明内容

本说明书公开的是利用核酸酶保护测定来检测靶核酸中核苷酸变异的存在的方法。在一个实施例中，所述方法包括使样品与至少两种探针接触，其中所述第一探针包括与靶核酸中的核苷酸变异位置处的野生型(非变异)核苷酸互补的核苷酸，所述第二探针包括与靶核酸中的核苷酸变异位置处的变异核苷酸互补的核苷酸。使所述样品与所述至少两种探针在足以使所述探针与所述靶核酸杂交的条件下接触，产生杂交的和未杂交的核酸分子的混合物。使所述混合物与特异性针对单链核酸分子的核酸酶接触，接触条件为足以移除未杂交核酸分子(或核酸分子的未杂交部分)的条件。然后检测核酸酶处理后剩余的至少两个探针的存在和/或数量，从而检测所述样品中变异和/或非变异靶核酸的存在。

根据以下具体说明，本公开内容的前述和其他特征将更加显而易见，所述具体说明是参照附图进行的。

附图说明

图1A是示出了用于检测样品中非变异(野生型)或变异靶核酸的存在的示例性核酸酶保护测定的示意图。在此示例性方法中，所述变异位置位于每个探针末端的附近(例如，距末端约2-8个碱基)，并且所述探针序列仅在变异位置的区域内重叠(在本文的一些实例中被称为“偏移(offset)”或“竞争物(competimer)”探针)。所述非变异探针在变异位置处包括与所述非变异(野生型)核苷酸(N)互补的核苷酸(cN)，所述变异位置位于所述探针3’端附近并且在该探针的3’端包括可检测标记(D)。所述变异探针在变异位置处包括与所述变异核苷酸(V)互补的核苷酸(cV)，所述变异探针位于所述探针5’端附近并且在该探针的5’端包括可检测标记(D)。这两种探针竞争杂交至靶核酸(例如，如果存在的话，所述靶变异形式和/或所述靶非变异形式)，并且探针杂交在重叠区域(其包括可检测标记)是相互排斥的。如果样品中存在所述靶变异形式，所述变异探针将杂交、被保护免受核酸酶消化，并且所述标记将被检测，而非变异探针的3’部分将不会杂交，并且错配部分(包括标记)将被核酸酶切割且随后不会被检测到。如果样品中存在所述靶非变异形式，则所述非变异探针将杂交、将被保护免受核酸酶消化，并且所述标记将被检测，而变异探针的5’部分将不会杂交，并且错配部分(包括可检测标记)将被核酸酶切割且随后不会被检测到。如果样品中同时存在靶变异和非变异形式，两种探针将以与样品中存在的变异和非变异靶形式的比例相似的比例受到保护，并且都将被检测。底部的框示出了利用具有连接于表面的不同锚的微阵列的示例性检测方法。每个锚均结合一个可编程的双功能接头，所述双功能接头具有与所述锚互补的一部分以及与变异探针(左)互补的一部分或与非变异探针(右)互补的一部分。在核酸酶处理之后，探针与该阵列杂交并检测所述标记。

图1B是用于检测样品中非变异(野生型)或变异靶核酸的存在的其他示例性核酸酶保护测定的示意图。在此示例性方法中，所述变异位置位于每个探针末端的附近(例如，距末端约2-8个碱基)，并且除了变异位置以外所述探针序列是相同的(“重叠”探针)。所述非变异探针在变异位置处包括与所述非变异或野生型核苷酸(N)互补的核苷酸(cN)，所述变异位置位于所述探针5’端附近并且在该探针的5’端包括可检测标记(D)。所述变异探针在变异位置处包括与所述变异核苷酸(V)互补的核苷酸(cV)，所述变异位置位于所述探针5’端附近并且在该探针的5’端包括可检测标记(D)。所述两种探针竞争杂交至所述靶核酸(例如，如果存在的话，所述靶变异形式和/或所述靶非变异形式)，并且探针杂交是相互排斥的。如果样品中存在所述靶变异形式，所述变异探针将杂交、将被保护免受核酸酶消化，并所述标记将被检测，而至少所述非变异探针的5’部分将不会杂交，并且错配部分(包括可检测标记)将被核酸酶切割且随后不会被检测到。如果样品中存在所述靶非变异形式，所述非变异探针将杂交、将被保护免受核酸酶消化，并且所述标记将被检测，而至少所述变异探针的5’部分将不会杂交，并且错配部分(包括可检测标记)将被核酸酶切割且随后不会被检测到。如果样品中同时存在靶变异和非变异形式，两种探针将以与样品中存在的变异和非变异形式的比例相似的比例受到保护，并且都将被检测。

图2是示出了表皮生长因子受体(EGFR)的示例性非变异和变异“偏移”(“竞争物”)探针的示意图，其中所述变异位置距离每个探针末端3个碱基。所述非变异探针(wt探针；SEQ ID NO:11)将与所述非变异靶RNA(SEQ ID NO:12)完全杂交，并且被保护免受核酸酶切割，而所述变异探针(SNP探针；SEQ ID NO:13)由于错配将无法在末端完全杂交，并且将容易被核酸酶切割(上图)。所述变异探针(SNP探针)将与所述变异靶RNA(SEQ ID NO:14)完全杂交，并且被保护免受核酸酶切割，而所述非变异探针(wt-探针)由于错配将无法在末端完全杂交，并且将容易被核酸酶切割(下图)。

图3是示出了KRAS G12D变异探针(SEQ ID NO:10)在不同体外转录物(IVT)拷贝数时的平均信号强度的图，表明所述测定的线性度和敏感度。

图4A是示出了在IVT混合物和指定细胞系中，EGFR T790M探针的野生型(上)和变异(下)探针信号的两张图。

图4B是示出了在IVT混合物和指定细胞系中，EGFR L858R探针的野生型(上)和变异(下)探针信号的两张图。

图5是示出了在相同孔中检测到的BRAF V600野生型与V600E变异IVT的不同比例下的平均信号强度的图。总IVT保持为200fM不变。

图6是示出了在来自所示细胞系的细胞裂解物中，V600野生型和V600E探针的平均信号强度的图。

图7是示出了在来自所示细胞系的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的细胞沉淀中，V600野生型和V600E探针的平均信号强度的图。

图8A和B是示出了在来自转移性(met)或原发性(pri)黑色素瘤的FFPE样品中，V600野生型和V600E探针的平均信号强度的两张图。

序列表

本文列出的核酸序列是用37C.F.R.1.822中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写示出的。仅示出每个核酸序列的一条链，但应该理解对所示出的链的任何引用都包含互补链。

SEQ ID NOs:1和2分别是示例性的KRAS Q61H野生型和变异探针。

SEQ ID NOs:3和4分别是示例性的EGFR D761Y野生型和变异探针。

SEQ ID NOs:5和6分别是示例性的EGFR T790M野生型和变异探针。

SEQ ID NOs:7和8分别是示例性的EGFR L858R野生型和变异探针。

SEQ ID NOs:9和10分别是示例性的KRAS G12D野生型和变异探针。

SEQ ID NO:11是示例性的EGFR野生型(非变异)探针。

SEQ ID NO:12是示例性的EGFR非变异核酸。

SEQ ID NO:13是示例性的EGFR SNP(变异)探针。

SEQ ID NO:14是示例性的EGFR变异核酸。

SEQ ID NOs:15和16分别是示例性的BRAF V600野生型和V600E变异探针。

具体实施方式

本文公开的是利用核酸酶保护测定检测靶核酸中核苷酸变异的存在和/或数量的方法。在所述测定中使用的探针包括与野生型(非变异)或变异核苷酸互补的核苷酸。如果样品中存在非变异序列，所述非变异探针将与靶核酸完全杂交并被保护免受核酸酶消化。如果样品中存在变异序列，所述非变异探针将与该变异靶核酸杂交，但会包括一个或多个与靶的“错配”并容易被核酸酶消化。类似地，如果样品中存在变异序列，所述变异探针将与靶核酸完全杂交并被保护免受核酸酶消化。如果样品中存在非变异序列，所述变异探针将与非变异靶核酸杂交，但会包含一个或多个与靶的“错配”并容易被核酸酶消化。

不局限于理论，可认为杂交探针的末端“呼吸”，例如，由于杂交的开/关动力学，末端碱基仅在部分时间里与其配对碱基杂交。这在理论上使探针的末端碱基至少在部分时间里容易被核酸酶切割，即使该探针与所述靶核酸完全匹配。因此，即使该探针与所述靶完全匹配，将变异核苷酸置于探针末端或附近将导致其易被核酸酶切割。在一些实例中，例如，如果探针较短(例如，少于18个碱基)，可认为相对于完全匹配的探针，探针上任何位置的错配均能够使杂交物不稳定，使得包含所述错配的探针对核酸酶消化是敏感的。

在本文所公开的方法中，所述变异或非变异核苷酸位置在所述探针的内部，即，它们不在所述探针的末端。不局限于理论，可认为由于在探针末端的杂交碱基的“呼吸”，存在位于所述探针内部的错配将使末端碱基不稳定，即便所述末端碱基与所述靶完全互补。出乎意料的是，已发现不稳定的程度足够使至少S1核酸酶切割配对碱基和错配碱基。这种不稳定允许变异核苷酸位于距离探针末端(5’端或3’端)至少2-8个碱基处(例如3-6个碱基)，以检测样品中的靶核酸中变异体的存在。因此，所公开的方法允许检测样品中变异体的具体序列(不只是存在与野生型之间的差异)，以及对包括变异和非变异靶核酸的混合物的样品的改进的特异性、可靠性和定量。

I.缩写

BRAF    v-Raf小鼠肉瘤病毒癌基因同系物B1

EGFR    表皮生长因子受体

FFPE    福尔马林固定石蜡包埋

IVT     体外转录产物

KRAS    V-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同系物

SNP     单核苷酸多态性

SNV     单核苷酸变异

以及如说明书、权利要求书和摘要中所另外阐述的。

II.术语

除非另作说明，技术术语均根据传统用法使用。分子生物学中常用术语的定义记载于下列文献中：Benjamin Lewin，Genes VIIpublished by Oxford University Press，2000(ISBN 019879276X)；Kendrew et al.(eds.)，TheEncyclopedia of Molecular Biology，published by Blackwell Publishers，1994(ISBN 0632021829)；Robert A.Meyers(ed.)，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，published by Wiley，John & Sons，Inc.，1995(ISBN 0471186341)；and George P. Rédei，Encyclopedic Dictionary of Genetics，Genomics，and Proteomics，2nd Edition，2003(ISBN：0-471-26821-6)。

提供以下对术语和方法的解释以更好地描述本公开内容并指导本领域普通技术人员实施本公开内容。单数形式“一”、“一个”和“所述”指的是一个或一个以上，除非文中清楚地另作说明。例如，术语“包括一个细胞”包括一个或多个细胞，其被认为等同于短语“包括至少一个细胞”。本文中所使用的“包括(comprise)”意思是“包含(include)”。因此，“包括A或B”意思是“包括A、B或A和B”，不排除其他要素。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献以全部目的通过引用的方式全文纳入本说明书。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括术语解释)为准。

尽管与本文所述方法和材料类似或等同的方法和材料能够被用来实施或测试所公开的技术，以下描述了适合的方法和材料。所述材料、方法和实施例仅为举例说明，而不应成为限制。

为了帮助理解本公开内容的多个实施方案，提供了以下对特定术语的解释：

足以…的条件：允许所需活性的任何环境，例如，允许两个核酸分子(如探针和靶核酸或者探针和双功能(“编程的”)接头)之间的特异性结合或杂交的环境，或允许核酸酶移除(或消化)未结合的核酸的环境。

接触：处于直接物理联系的放置；包括以固体和液体形式。例如，接触可发生在体外，在溶液中的核酸探针和生物样品之间。

检测：确定一种物质(如信号、特定的核苷酸、氨基酸、核酸分子和/或生物)是否存在。在一些实例中，检测还包括定量。例如，在具体的实施例中，使用所公开的方法和探针允许检测和/或鉴别样品中靶核酸中的核苷酸变异。

可检测标记：一种化合物或组合物，其直接或间接与另一个分子(如核酸分子或核苷酸)缀合以帮助检测该分子。标记的具体的、非限制性实例包括荧光和产生荧光的部分、显色部分、半抗原、亲和标签和放射性同位素。所述标记可被直接检测(例如，光学可检测)或间接检测(例如，通过与一种或多种可被检测的其他分子相互作用)。下文记载了本文中公开探针的上下文中的示例性标记。以下文献讨论了标记核酸的方法，以及可用于多种用途的标记的选择指导：例如，Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3^rdEd.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)和Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associatesand Wiley-Intersciences(1987,包括更新)。

杂交：互补的单链DNA、RNA或DNA/RNA杂交形成双链分子(又称为“杂交复合物”)的能力。核酸杂交技术可被用于在核酸探针和所述探针被设计靶向的靶核酸之间形成杂交复合物。

“特异性杂交”和“特异性互补”是表明互补的充分程度的术语，使得在寡核苷酸(或其类似物)和核酸靶(如DNA或RNA靶，如mRNA或miRNA)之间形成稳定且特异的结合。要实现特异性杂交，该寡核苷酸或寡核苷酸类似物并不需要与其靶序列100％互补。本文中，特异性杂交也被称为“特异性结合”。

根据所述杂交方法的性质和所述杂交核酸序列的组成和长度，导致特定严格性程度的杂交条件可不同。通常，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(如Na⁺浓度)将确定杂交严格性。在Sambrook et al.,(1989)Molecular Cloning,second edition,Cold Spring HarborLaboratory,Plainview,NY(第9、11章)中，讨论了关于获得特定严格性程度的杂交条件的计算。

解链温度(T_m)：又被称为TM₅₀。在该温度下，混合物中一半核酸分子是双链，且一半核酸分子是单链。在一些实例中，例如当提及寡核苷酸(如探针)时，T_m是50％的寡核苷酸及其互补物处于双链体时的温度。用于确定DNA或RNA的T_m的方法对本领域技术人员而言是已知的。

核酸酶：切割磷酸二酯键的酶。内切核酸酶是一种切割核苷酸链内部的磷酸二酯键的酶(相比之下，外切核酸酶切割核苷酸链末端的磷酸二酯键)。内切核酸酶包括限制性内切核酸酶或其他位置特异性内切核酸酶(其在序列特定位置切割DNA)，如DNase I、S1核酸酶、绿豆核酸酶、核糖核酸酶A、核糖核酸酶T1、RNase I、RNase PhyM、RNase U2、RNase CLB、微球菌核酸酶和脱嘌呤/脱嘧啶内切核酸酶。外切核酸酶包括外切核酸酶III、外切核酸酶VII和Bal 31核酸酶。在特定实例中，核酸酶是特异性针对单链核酸，如S1核酸酶、绿豆核酸酶、核糖核酸酶A或核糖核酸酶T1。

核苷酸变异：核酸序列中的变化或改变，例如靶核酸中一个或多个碱基处的核酸序列变化(包括取代、插入、重复和/或缺失一个或多个核苷酸)。所述核苷酸变异可以是通常在不同个体之间或不同种族和地域之间被发现的变异(DNA序列差异)，所述变异尽管具有不同的序列，但产生功能上等价的基因产物。该术语还可指这样的序列变异，其导致功能上不等价的基因产物。术语“核苷酸变异”还包括能够被归类为等位基因和/或突变的变异，所述变异能够产生具有改变的功能的基因产物、不产生基因产物、产生非活性基因产物，或以异常速率或在不合适的组织中或在不合适的刺激下应答产生有活性的基因产物。在一些非限制性实例中，核苷酸变异是单核苷酸变异(SNV)或单核苷酸多态性(SNP)。

例如，核苷酸变异可以指存在变异的核苷酸位置(例如，“核苷酸变异位置”)、通过由核苷酸变异导致的核酸或氨基酸序列的变化或通过与此变异相关的核酸分子或蛋白的一些其他特征的变化。

探针：能够与靶核酸分子(例如，靶DNA或RNA(如mRNA)核酸分子)杂交并且能够被直接或间接检测的核酸分子。因此，探针允许对靶核酸分子(如mRNA)的检测，在一些实施例中，还允许对靶核酸分子的定量。在一些实施例中，探针包含可检测标记。

样品：获得自受试者的、包含DNA(例如，基因组DNA或cDNA)、RNA(包括mRNA或miRNA)、蛋白质或它们的组合的生物样品。实例包括但不限于细胞、细胞裂解物、染色体制备物、外周血液、尿液、唾液、组织活检物(例如肿瘤活检物或淋巴结活检物)、细针穿刺物、外科手术样品、骨髓、羊膜穿刺样品和尸体解剖材料。在一个实例中，样品包括RNA，如mRNA。在具体实例中，样品被直接使用(例如，新鲜或冷冻)，或在使用之前通过如固定(例如，使用福尔马林)和/或在蜡中包埋(如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品)来处理。

受试者：任何多细胞脊椎生物，如人类和非人类哺乳动物(例如，兽类受试者)。

表面(或底物)：任何不溶的或能够通过后续反应成为不溶的固体载体或材料。大量多种固体载体对本领域技术人员而言是已知的，其包括但不限于硝化纤维素、反应盘的孔壁、多孔板、试管、聚苯乙烯珠、磁珠、膜和微粒(如胶乳颗粒)。该术语涵盖任何适合的多孔材料，其具有足够的孔隙率以允许检测试剂接触，以及适合的表面亲和性以固定捕获试剂(如寡核苷酸)。例如，硝化纤维素的多孔结构对多种反应试剂(例如，捕获试剂)具有很好的吸收和吸附性质。尼龙具有类似的特征并且也是适合的。微孔结构，以及在水合状态下具有胶体结构的材料，是可用的。

可用的固体载体的其他实例包括：天然聚合碳水化合物及其合成的经修饰的、交联的或取代的衍生物，如琼脂、琼脂糖、交联海藻酸、取代和交联瓜尔胶、纤维素酯(特别是与硝酸和羧酸形成的纤维素酯)、混合纤维素酯和纤维素醚；含氮的天然聚合物，如蛋白质及衍生物，包括交联或修饰明胶；天然烃聚合物，如胶乳和橡胶；可用适合的多孔结构制备的合成聚合物，如乙烯基聚合物，包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯乙酸酯及其部分水解衍生物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸，上述缩聚物的共聚物和三元共聚物，如聚酯、聚酰胺和其他聚合物，如聚胺酯或聚环氧化物；多孔无机材料，如碱土金属和镁的硫酸盐或碳酸盐，包括硫酸钡、硫酸钙、碳酸钙，碱金属和碱土金属、铝和镁的硅酸盐；铝或硅的氧化物或水合物，如粘土、矾土、滑石、高岭土、沸石、硅胶或玻璃(这些材料可同上述聚合材料一起被用作过滤器)；以及上述各类物质的混合物或共聚物，如通过在事先存在的天然聚合物上启动合成聚合物的聚合反应而获得的接枝共聚物。

靶核酸：核酸分子的确定区域或特定部分，如目的DNA或RNA。在某个实例中，所述靶核酸序列是靶mRNA，这样的靶能通过其特定的序列或功能、通过其基因或蛋白名称；或通过将其从其他核酸中独特鉴定出来的任何其他方法定义。

在一些实例中，靶核酸序列(如mRNA)的改变与疾病或病症“相关”。即，所述靶核酸序列的检测能够被用来推断关于该疾病或病症的样品状态。例如，所述靶核酸序列可以两种(或多种)可区分的形式存在，其中第一种形式与无疾病或状况的有关，第二种(或不同)形式与该疾病或状况的存在有关。这两个不同形式可以被定性区分，如通过核苷酸多态性(例如，SNV)或突变，和/或此两个不同形式可以被定量区分，如通过存在于样品中的该靶核酸序列的拷贝数。

III.用于检测核苷酸变异的核酸酶保护方法

本文公开了用于检测一个或多个靶核酸中核苷酸变异的方法。本文公开的方法能够在一些实施方案中多路复用(multiplexed)。例如，在一些实施方案中，可以在同一反应中检测两种或多种(如2、3、4、5、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多)不同变异。在一些实例中，所述两种或多种变异在相同靶核酸或基因中。在其他实例中，所述两种或多种变异在不同的靶核酸中。这在下述IV中详细讨论。

所公开的方法可包括与靶核酸(如靶RNA)杂交之后变异和/或非变异(野生型)探针的核酸酶保护。在一些实施方案中，所述方法包括至少两种探针，其中一种探针与野生型(非变异)序列形成完全杂交物，第二种探针与变异序列形成完全杂交物。所述探针被设计为使得它们竞争结合所述靶核酸上的相同位置，尤其是包括该变异核苷酸位置的区域，所述变异核苷酸位置在一些实施方案中距探针末端约2-8个碱基(例如3-6个碱基)。所述探针结合于靶核酸的相同链，例如，相同的RNA链或双链分子的同一条链，并竞争结合于该靶核酸的相同位置。不局限于理论，可认为与所述靶核酸形成完全匹配的探针将在竞争中取胜，并至少排斥包括一个或多个与靶核酸的错配的探针部分。因此，形成完全匹配的探针将耐受核酸酶的消化，并且随后可被检测到(直接或间接)。包括一个或多个错配的探针将至少是部分地单链的，并将被核酸酶消化，减少了被检测到的此探针的数量。或者，可以利用例如以下第IV部分(例如，第IV(B)部分)中所述的一种或多种检测方法检测与探针杂交的靶核酸链(如RNA或DNA链)，而非检测用核酸酶处理后仍存在的探针。因此，尽管通篇都提及的是探针的检测，但应理解，也可用受保护的靶核酸(如DNA或RNA)来替代。在靶核酸是RNA的实例中，该靶核酸在检测之前能够被转化为DNA。

在一些实施方案中，所述非变异探针和变异探针在一个探针的3’端和另一个探针的5’端相互重叠。使用此“偏移”(或“竞争物”)探针的示例性示意图如图1A所示。变异核苷酸位置与该探针的重叠末端邻近(例如，距一个探针的3’端约2-8个碱基，并且距另一个探针的5’端约2-8个碱基)。在一些实施方案中，所述非变异探针包括在变异位置——其位于该探针的3’端附近——与非变异(野生型)核苷酸互补的核苷酸，所述变异探针包括在变异位置——其位于该探针的5’端附近——与变异核苷酸互补的核苷酸。在其他实施方案中，所述非变异探针包括在变异位置——其位于探针的5’端附近——与非变异(野生型)核苷酸互补的核苷酸，所述变异探针包括在变异位置——其位于探针的3’端附近——与变异核苷酸互补的核苷酸。如果样品中存在靶核酸的变异形式，变异探针与靶核酸形成完全匹配并被保护免受核酸酶的消化，而通过与变异探针的竞争，非变异探针的末端被排斥(部分或全部)而无法杂交，所述被排斥的末端易被特异性针对单链核酸的核酸酶消化。如果样品中存在所述靶核酸的非变异形式，所述非变异探针与靶核酸形成完全匹配并被保护免受特异性针对单链核酸的核酸酶的消化，而通过与所述非变异探针的竞争，该变异探针的末端被排斥(部分或全部)而无法杂交，所述被排斥的末端易被核酸酶消化。在一些实施方案中，探针被末端标记，因此错配区域的核酸酶的消化移除该标记并降低来自错配探针的信号。如果样品中存在非变异和变异靶核酸的混合物，所述非变异和变异探针将以与样品中对应的非变异和变异核酸数量成比例的数量被保护免受核酸酶消化。因此，在一些实例中，所公开的方法是半定量或定量的。在核酸酶处理之后，样品中存在的探针的检测方法在以下第IV部分中讨论。

在其他实施方案中，所述探针沿着其大部分(甚至全部)长度与在所述非变异探针和变异探针的相同末端(同为5’端或同为3’端)附近(例如，距末端约2-8个碱基)的变异核苷酸位置重叠。使用此“重叠”探针的方法的示例性示意图如图1B所示。在一些实施方案中，每一种探针都被标记不同的可检测标记。如果样品中存在所述靶核酸的变异形式，所述变异探针与该靶核酸形成完全匹配并被保护免受特异性针对单链核酸的核酸酶消化，而通过与所述变异探针的竞争，非变异探针被排斥(部分或全部)而无法杂交，并且易被特异性针对单链核酸的核酸酶消化。如果样品中存在所述靶核酸的非变异形式，所述非变异探针与该靶核酸形成完全匹配并被保护免受核酸酶的消化，而通过与所述非变异探针的竞争，变异探针被排斥(部分或全部)而无法杂交，并且易被核酸酶消化。在一些实施方案中，所述探针被末端标记，因此错配区域的核酸酶消化移除该标记并降低来自错配探针的信号。如果样品中存在非变异和变异靶核酸的混合物，所述非变异和变异探针将以与样品中对应的非变异和变异核酸数量成比例的数量被保护免受核酸酶消化。因此，在一些实例中，所公开的方法是半定量或定量的。在核酸酶处理之后，样品中存在的探针的检测方法在以下第IV部分中讨论。

在一些实施方案中，所述方法包括将样品(如包括核酸(如RNA和/或DNA)的样品)与至少两种与靶核酸分子(其包含核苷酸变异)互补的探针在足以是每个探针与所述靶核酸分子杂交的条件下接触，产生杂交和未杂交核酸的混合物。在一些实施方案中，所述探针之一(如第一探针)与所述核苷酸变异的非变异序列互补，并且所述核苷酸变异位置距该探针末端至少两个碱基，另一探针(如第二探针)与所述核苷酸变异的变异序列互补，并且所述核苷酸变异位置距该探针末端至少两个碱基。杂交后，用核酸酶(如特异性针对单链核酸的核酸酶，例如S1核酸酶)处理所得混合物，以除去未杂交的核酸分子(或核酸分子的未杂交部分)。

在一些实例中，所述靶核酸可在变异核酸位置包括多于一种可能的序列。作为非限制性实例，靶核酸可在非变异核酸中在核苷酸位置包含“C”，在变异核酸中的相同核苷酸位置包含“G”。然而，在一些情况下，所述靶核酸可包含第二种变异序列，例如，在第二种变异核酸中的相同核苷酸位置包含“A”。因此，在其他实例中，所公开的方法还包括用与第二种变异在变异核苷酸位置互补的第三种探针(其与非变异探针和变异探针不同)接触样品。在其他实例中，所述方法可包括用与第三种变异在变异核苷酸位置互补的第四种探针(其与非变异、变异和第二种变异探针不同)接触样品。这样，所公开的方法能够被用来特异性检测样品中存在的变异序列，即使是在可能存在多种变异的情况下(例如，在每种探针上使用不同的可检测标记)。在其他实例中，所述变异探针可包括所有可能的变异核酸的混合物(例如，所述变异探针在一个或多个位置具有简并性)。在一个非限制性实例中，非变异探针在变异核苷酸位置包含“C”，而该变异探针在该变异核苷酸位置包含“A”、“G”和“T”。这样，可以检测非变异或变异靶核酸的存在，尽管特异性变异序列未被鉴定。

在至少一些情况中，样品可包括变异和非变异(野生型)靶核酸的混合物。例如，样品可包括细胞混合物，其中一些细胞包含变异靶核酸，而另一些细胞包含非变异靶核酸(例如包括肿瘤和非肿瘤细胞的样品)。在其他实例中，所述样品可包括细胞，其中一个等位基因包括变异而另一个等位基因包括非变异靶核酸。通过在核酸酶处理后确定检测到的变异探针和非变异探针的数量比值，所公开的方法能够被用来确定样品中存在的变异和非变异(野生型)靶核酸的相对数量。例如，如果所述样品包括50％变异的靶核酸和50％非变异靶核酸，则杂交(且受保护的)探针的一半将是所述非变异探针，杂交(且受保护的)探针的一半将是所述变异探针，结果是检测到比例约为50/50的变异和非变异探针。

在其他实例中，可以利用变异与非变异靶核酸(例如，变异和非变异IVT)的变化的比例产生校正曲线。在一个实例中，利用以下非变异与变异IVT的比例产生校正曲线：100/0、90/10、80/20、60/40、50/50、40/60、20/80、10/90和0/100。确定用每个IVT混合物获得的来自非变异与变异探针的信号比例。然后，可计算在样品中获得的来自非变异与变异探针的信号比例并且将其与校正曲线比较以确定样品中变异靶核酸的存在和相对数量。

在一些实例中，杂交效率、对核酸酶敏感度的差异或检测效率的差异可导致来自一对变异和非变异探针的信号的不同水平，即使样品中存在相同数量的变异和非变异核酸分子。为了解决这个问题，在测定中包括了与所述靶核酸互补的参考探针，但与所述变异核酸位置的上游或下游互补，所述探针不与所述变异和非变异探针重叠。所述参考探针能够测量所述样品中存在的靶核酸的总量，无论其包括变异或非变异核酸。确定非变异探针信号与参考探针信号的比例以及变异探针信号与参考探针信号的比例。这些比例反映了样品中存在的非变异和变异靶核酸的比值。在一些实例中，所述参考探针序列与变异和非变异探针序列被合并到IVT。因此所述IVT反映了真实的靶核酸模型，并可被用于，例如，为特定测定法构建更精确的校正曲线。

在其他实例中，所述IVT可被用于调整测定条件以从每种探针获得相等的信号。例如，与靶核酸不相关的普通核酸序列能够被合并到所有的IVT。此“普通”序列被另外的探针检测，并且每种IVT的浓度能够被调节，以根据来自该普通探针的信号提供相等的信号。替代地，除了物理地调节每种IVT的浓度，可以计算校正因子。一旦IVT浓度相等或在使用校正因子后使IVT浓度的任何不均等标准化，通过变异和非变异探针测量到的任何信号差异都是由杂交和/或检测效率的差异引起的，并且所述信号能够被校正，以产生变异和非变异靶核酸的绝对数量的测量值，而非仅仅为相对信号。

A.反应条件

在所公开的方法中，在足以使每个探针与样品中存在的靶核酸杂交的条件下，将所述样品与至少两种探针接触。根据本公开内容，能够确定在所选严格性条件下能够使一种核酸(例如，非变异或变异探针)与另一种核酸(例如，靶RNA)杂交，同时使与其他物质或分子的非特异性杂交最小的特征(如长度、碱基组成和互补度)。以下详细讨论了所述探针的特征。通常，探针的核酸序列具有与其对应的靶核酸的充分的互补度，使得其能够在所选的严格性杂交条件下杂交(例如，在约37℃或更高(如约37℃、42℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或更高)温度下的杂交)。其中，能够被改变的杂交反应参数是：盐浓度、缓冲液、pH、温度、孵育时间、变性剂如甲酰胺的数量和类型。

在一些实例中，在适合的缓冲液中，例如6X SSPE-T(0.9M NaCl、60mM NaH₂PO₄、6mM EDTA和0.05％Triton X-100)或裂解缓冲液(如下所述)中，将核酸(例如，至少两种探针)以约10pM-约10nM(如约30pM-约5nM，或约100pM-约1nM)的浓度加到样品中。在一些实例中，将每种探针以至少10pM的终浓度加到所述样品中，例如至少30pM、至少50pM、至少80pM、至少100pM、至少150pM、至少200pM、至少300pM、至少400pM、至少500pM、至少1nM或至少10nM。在一个实例中，将每种探针以约167pM的终浓度加到所述样品中。在另一个实例中，将每种探针以约30pM的终浓度加到所述样品中。在另一个实例中，将每种探针以约1nM的终浓度加到所述样品中。

使所述样品中的核酸变性(例如，在约95℃-约105℃下，持续约5-15分钟)，并与所述至少两种探针在约37℃-约65℃的温度下(如约37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃)，例如约50℃下，杂交约1-24小时(例如，至少约2-约20小时、约4-约20小时、约12-约18小时、约16小时或过夜)。在一些实例中，所述至少两种探针与该样品在至少约37℃、至少约40℃、至少约45℃、至少约50℃、至少约55℃、至少约60℃或至少约65℃的温度下孵育。在一个非限制性实例中，所述至少两种探针与该样品在约50℃下孵育。

在一些实施方案中，所述方法不包括核酸纯化(例如，在用所述探针接触该样品之前不进行核酸纯化和/或在用所述探针接触该样品之后不进行核酸纯化)。在一些实例中，所述方法不包括核酸扩增(例如，在用所述探针接触该样品之前不进行核酸扩增和/或在用所述探针接触该样品之后不进行核酸扩增)。在一些实例中，除了细胞裂解，不需要对所述样品进行预处理。在一些实例中，细胞裂解和用所述探针接触该样品按顺序进行。在其他实例中，细胞裂解和用所述探针接触该样品同时发生，在一些非限制性实例中无任何中间步骤。

在所公开的方法中，在所述至少两种探针与样品杂交之后，将所得杂交的和未杂交的核酸分子的混合物在足以移除未杂交(单链)核酸分子条件下，与特异性针对单链核酸的核酸酶(例如，S1核酸酶)接触。在一些实例中，一种或多种所述探针仅有一部分(例如，在探针5’端或3’端约1-10个核苷酸)是单链，并且容易被核酸酶消化。

用一种或多种核酸酶处理除了破坏已经与样品中存在的靶核酸杂交的探针以外，还破坏核酸分子(或其部分)。例如，如果所述样品包括细胞提取物或裂解物，则除了未与互补探针序列杂交的目的靶核酸或目的靶核酸部分，不想要的核酸，如基因组DNA、cDNA、tRNA、rRNA、mRNA和miRNA也会在此步骤中被严重破坏。根据所述杂交复合体和样品中存在的不想要的核酸的属性，可以使用任何一种核酸酶，包括胰腺RNAse、绿豆核酸酶、S1核酸酶、RNAse A、核糖核酸酶T1、外切核酸酶III、外切核酸酶VII、RNAse CLB、RNAse PhyM、RNAse U2或类似物。本领域普通技术人员能够选择适合的核酸酶。在个别实例中，所述核酸酶特异性针对单链核酸，例如S1核酸酶。在本文公开的一些方法实施方案中，特异性针对单链核酸的核酸酶允许从后续反应步骤移除这样的单链分子，其可在后续反应步骤导致不想要的背景或交叉反应(例如，假阳性信号)。S1核酸酶可以从例如Promega,Madison,WI(目录号M5761)；Life Technologies/Invitrogen,Carlsbad,CA(目录号18001-016)；Fermentas,Glen Burnie,MD(目录号EN0321)和其他商购获得。上述酶的反应条件为本领域中公知的，可凭经验优化。

在一些实施例中，将在适合的缓冲液中稀释的S1核酸酶加入到杂交和未杂交核酸的混合物中，并在约37℃-约65℃下孵育(如约37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃)，例如约50℃-约60℃下。加入的S1核酸酶的量应足以消化所述混合物中存在的未杂交(单链)的核酸分子(或其部分)，例如，约5-100U/μl反应(例如，约8U/μl-约80U/μl、约10U/μl-约50U/μl或约20U/μl-40U/μl)。在一些实例中，将约400-4000单位的S1核酸酶加到50μl反应中。在一个非限制性实例中，将约2000单位的S1核酸酶加到50μl反应中。将所述核酸酶与所述杂交和未杂交核酸的混合物在50℃-60℃下(如约50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃)孵育约10-180分钟(例如，约10-60分钟、约60-90分钟、约90-120分钟或约90-180分钟)。孵育时间可根据核酸酶处理的温度调节。在一些实例中，将所述杂交和未杂交核酸的混合物与S1核酸酶在60℃下孵育约2小时。在其他实例中，将所述杂交和未杂交核酸的混合物与S1核酸酶在50℃下孵育约1小时。在又一实例中，将所述杂交和未杂交核酸的混合物与S1核酸酶在37℃下孵育约90分钟。本领域普通技术人员能够选择核酸酶消化的适合的时间和温度。在用核酸酶处理后，将反应终止，例如通过加入终止溶液(例如，包括EDTA和NaOH的溶液)并将所述样品在约80-95℃下(80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃)加热约10-20分钟(例如，约15分钟)。用于终止核酸酶反应的其他常规方法可由本领域普通技术人员确定。

任选地，可对样品另作处理，以移除未杂交物质和/或失活或移除残留的酶(例如，通过酚萃取、沉淀、柱过滤等)。在一些实例中，可任选地处理所述样品，以使所述靶核酸(如靶RNA)与其互补探针分离(例如，利用碱基水解和加热)。杂交后，可将已杂交的靶降解，如通过核酸酶或通过化学处理，使所述探针与已与靶杂交的探针数量呈正比。或者，可以处理所述样品，以留下所述靶的(单链)杂交部分或所述杂交的靶与所述探针形成的双链用于进行进一步分析。

B.探针

所公开的方法包括检测靶核酸分子中核苷酸变异的存在。根据靶核酸分子与靶核酸中的核苷酸变异，利用本说明书给出的标准和本领域普通技术人员的知识，能够设计用于所公开的方法中的探针。

在所公开的方法中，所述探针包含与野生型(非变异)或变异核苷酸互补的核苷酸。在一些实施方案中，所述变异核苷酸位置在探针的末端(如5’端或3’端)。在其他实施方案中，所述变异核苷酸位置距离探针的5’端或3’端至少2个碱基(如距离探针末端至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或更多个碱基)。提及“距离探针末端2个碱基”的核苷酸位置指的是从该探针末端开始的第2个核苷酸，提及“距离探针末端3个碱基”的核苷酸位置指的是从该探针末端开始的第3个核苷酸，以此类推(即，末端核苷酸是距离该探针“末端1个碱基”)。图2举例说明了一组示例性的“偏移”探针，其中所述变异核苷酸位置距离该探针末端3个碱基。在一些实例中，所述变异核苷酸位置距离该探针末端2-8个碱基，例如，距离探针5’端2、3、4、5、6、7或8个碱基或距离探针3’端2、3、4、5、6、7或8个碱基。在一个非限制性实例中，变异核苷酸位置距离探针末端(5’端或3’端)3个碱基。在另一个非限制性实例中，变异核苷酸位置距离探针末端(5’端或3’端)4个碱基。在一些实例中，变异核苷酸位置的最佳位置可能受到特定变异的周围序列背景的影响。利用本公开内容的教导，本领域普通技术人员能够制备并测试具有不同变异核苷酸位置的探针以确定最佳位置。

影响探针-靶杂交特异性的因素包括探针长度、解链温度、自身互补性以及重复或非独特序列的存在。参见，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3d ed.,Cold Spring HarborPress,2001；Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,1992(and Supplements to 2000)；Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium ofMethods from Current Protocols in Molecular Biology,4th ed.,Wiley &Sons,1999。

本文公开的探针可被选择包含与靶核酸分子互补的至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或更多个连续核苷酸且包括核苷酸变异位置(如约6-75、10-60、15-50、18-45、20-42或23-41个与靶核酸分子互补的连续核苷酸)。能够被用来实施本公开内容的方法的探针的特定长度包括具有至少6、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个与靶核酸分子互补的连续核苷酸且包括核苷酸变异位置的探针。在特定的非限制性实例中，在所公开方法中使用的探针长度为15-75(如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75)个核苷酸。

导致特定程度的杂交(严格性)的条件根据杂交方法的属性和杂交核酸序列的组成与长度变化。通常，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(如Na⁺浓度)将决定杂交的严格性。在一些实例中，在所公开方法中使用的探针的解链温度(T_m，在此温度下，混合物中的一半核酸分子是双链，另一半核酸分子是单链)为至少约23℃，如至少约37℃、至少约42℃、至少约45℃、至少约50℃、至少约55℃、至少约60℃、至少约65℃、至少约70℃、至少约75℃或至少约80℃，如约23℃-70℃(例如，约23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70℃)。在一个实例中，在所公开的方法中使用的探针的T_m为约60℃-约70℃。在特定的非限制性实例中，在所公开的方法中使用的探针的T_m为约60℃。在一些实例中，所述探针的T_m为约59℃-约62℃(如约59.1、59.2、59.3、59.4、59.5、59.6、59.7、59.8、59.9、60.0、60.1、60.2、60.3、60.4、60.5、60.6、60.7、60.8、60.9、61.0、61.1、61.2、61.3、61.4、61.5、61.6、61.7、61.8或61.9℃)。计算探针的T_m的方法是对本领域普通技术人员已知的(见，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3ded.,Cold Spring Harbor Press,2001,第10章)。用于计算探针T_m的工具还可在万维网获得(如在promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm)。在一些实施方案中，使用“碱基堆叠”法计算探针T_m。在一些实例中，每种探针被选择具有相同或相似的T_m以促进在样品中同时检测非变异和/或变异核苷酸。例如，所述探针可被选择彼此间T_m相差最多2.5℃(如彼此间相差2.4℃、2.3℃、2.2℃、2.1℃、2.0℃、1.9℃、1.8℃、1.7℃、1.6℃、1.5℃、1.4℃、1.3℃、1.2℃、1.1℃、1.0℃、0.9℃、0.8℃、0.7℃、0.6℃、0.5℃、0.4℃、0.3℃、0.2℃、0.1℃或更少)。

在一些实例中，本文公开的探针包括一个或多个合成碱基或替代碱基(如肌苷)。在其他实例中，本文公开的探针包含一个或多个修饰核苷酸或核酸类似物，如一个或多个锁核酸(见，例如，美国专利6794499)或一个或多个肽核酸。可以在探针的一个或多个位置(如1、2、3、4、5或更多位置)使用修饰核苷酸、非天然核苷酸、合成或替代核苷酸。在一些实例中，相对于具有相同长度和组成、不包含修饰核酸的探针的T_m而言，在该探针中使用一个或多个修饰或非天然核苷酸能够提高该探针的T_m。本领域普通技术人员能够设计包含此类修饰核苷酸的探针以获得具有所需T_m的探针。还提供了在一个或多个位置(如1、2、3、4、5个或更多个位置)简并的探针，例如，在所述探针的特定位置包括核苷酸混合物(如2、3或4种核苷酸)的探针。

C.核苷酸变异

所公开的方法可被用来检测任何类型的核苷酸变异(例如，一个或多个核苷酸的取代、插入、重复和/或缺失)，只要能够设计并合成与变异和非变异序列互补的探针(例如，具有上述B部分所述特性的探针)。所述变异序列可以是蛋白编码序列的一部分，并可导致由核酸序列编码的一个或多个氨基酸的改变(例如，产生一个或多个氨基酸取代、插入或缺失)，或者可以是“沉默”改变，例如不引起氨基酸序列改变的核苷酸变异。所述核苷酸还可在核苷酸的非编码区，包括但不限于非翻译区或内含子。

在一些实施方案中，所述核苷酸变异是与野生型或非变异序列相比一个或多个核苷酸的取代。所述核苷酸变异可以是单核苷酸多态性(SNP，例如，如果靶核酸是DNA)或单核苷酸变异(SNV，例如，如果靶核酸是RNA)，其中所述变异与所述非变异序列仅有一个核苷酸不同。这类核苷酸变异的非限制性实例如下：

非变异：ACTGACTG

变异：ACTGCCTG

在其他实例中，所述变异与所述非变异序列的区别是两个或多个核苷酸。所述变异序列与非变异序列相比，存在2、3、4、5个或更多个连续核苷酸的取代(例如，至少2个连续核苷酸、至少3个、至少10个或至少15个连续核苷酸，如2-5个、2-10个或2-15个连续核苷酸的取代)。这类核苷酸变异的非限制性实例如下：

非变异：ACTGACTGA

变异：ACTGCTTGA

在其他实例中，所述变异序列与非变异序列相比，存在至少2个、至少3个、至少4个或至少5个非连续核苷酸的取代，如2、3、4、5个或更多非连续核苷酸的取代(例如，每个取代与其他取代之间至少间隔一个核苷酸)。这类核苷酸变异的非限制性实例如下：

非变异：ACTGACTGA

变异：AATGCCTGA

在其他实施方案中，所述核苷酸变异与野生型或非变异序列相比具有一个或多个核苷酸的缺失。例如，所述核苷酸变异可以是靶核酸的1个、2个、3个、4个、5个或更多连续核苷酸的缺失(例如，至少1个连续核苷酸、至少2个、至少3个、至少10个或至少15个连续核苷酸的缺失，如1-5个、1-10个或1-15个连续核苷酸的缺失)。这类核苷酸变异的非限制性实例如下：

非变异：ACTGACTGA

变异：ACTGA－TGA

在一些实例中，所述核苷酸变异是3个连续核苷酸的缺失，如密码子缺失。这类核苷酸变异的非限制性实例如下：

非变异：ACTGACTGA

变异：ACT---TGA

在其他实例中，所述变异序列可包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个或至少15个非连续核苷酸的缺失，如2个、3个、4个、5个或更多个非连续核苷酸的缺失。这类核苷酸变异的非限制性实例如下：

非变异：ACTGACTGA

变异：AC–GAC–GA

在其他实施方案中，所述核苷酸变异与野生型或非变异序列相比具有一个或多个核苷酸的插入。例如，所述核苷酸变异可以是靶核酸的1个、2个、3个、4个、5个或更多连续核苷酸的插入(例如，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个或至少15个连续核苷酸的插入，如1-5个、1-10个或1-15个连续核苷酸的插入)。这类核苷酸变异的非限制性实例如下：

非变异：ACTGA–CTG

变异：ACTGAGCTG

在其他实例中，所述变异序列可包括2个、3个、4个或更多非连续核苷酸的插入(如至少2个、至少3个、至少4个或至少5个非连续核苷酸的插入，如2-5个、2-10个或2-15个非连续核苷酸的插入)。这类核苷酸变异的非限制性实例如下：

非变异：ACT–GA–CT

变异：ACTTGAGCT

在其他实例中，所述核苷酸变异与野生型或非变异序列相比具有一个或多个核苷酸的重复。例如，所述核苷酸变异可以是靶核酸的1个、2个、3个、4个、5个或更多连续核苷酸的重复(例如，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个或至少15个连续核苷酸的重复，如1-5个、1-10个、3-5个或1-15个连续核苷酸的重复)。这类核苷酸变异的非限制性实例如下：

非变异：ACT––GACT

变异：ACTCTGACT

本领域普通技术人员能够鉴定可以利用本文公开的方法来检测的其他核苷酸变异，包括上述一种或多种核苷酸变异类型的组合。

在所述方法的特定的非限制性实例中(如以下实施例中所述)，检测到引起氨基酸取代的单核苷酸变异。在一些实例中，所述核苷酸变异位于KRAS编码序列。在一个实例中，所述变异包括在KRAS编码序列的183位核苷酸的A>C取代，这导致在61位氨基酸的Gln>His取代(Q61H)。在另一个实例中，所述变异包括在KRAS编码序列的35位核苷酸的G>A取代，这导致在12位氨基酸的Gly>Asp取代(G12D)。在其他实例中，所述核苷酸变异位于EGFR编码序列。在一个实例中，所述变异包括在EGFR编码序列的2527位核苷酸的G>T取代，这导致在761位氨基酸的Asp>Tyr取代(D761Y)。在另一个实例中，所述变异包括在EGFR编码序列的2615位核苷酸的C>T取代，这导致在790位氨基酸的Thr>Met取代(T790M)。在又一实例中，所述变异包括在EGFR编码序列的2819位核苷酸的T>G取代，这导致在858位氨基酸的Leu>Arg取代(L858R)。在另一个实例中，所述变异包括在BRAF编码序列的1799位核苷酸的T>A取代，这导致在600位氨基酸的Val>Glu取代(V600E)。以下表2和9中提供了能够被用来检测上述变异的示例性探针组(SEQ ID NOs:1-10和15-16)。能够利用本文公开的方法来检测的示例性变异在表1中示出。本领域普通技术人员能够鉴定其他目的变异，包括与多种疾病和紊乱相关的变异。例如，与癌症相关的变异可从万维网获得(cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/census)

表1：示例性变异

IV.检测方法

杂交和核酸酶处理后，所述混合物中剩余的探针能够通过本领域中已知或以下开发的任何适合的方法检测。在一些实例中，利用捕获法(例如，将探针捕获到阵列或多个小珠上)或原本检测探针序列的方法来检测探针。在此类方法中，所述至少两种探针的至少一部分具有不同的序列，以对探针的特异性捕获和区分，例如，利用“偏移”或“竞争物”探针，如示例性的图1A中所示的那些。在其他实例中，所述探针是通过不需要探针的序列特异性捕获的方法检测，例如，通过在每种探针上使用不同的可检测标记。在这样的实例中，所述探针可具有相同序列(除了所述核苷酸变异位置)，如示例性的图1B中所示的那些，或者所述探针可包括不同序列，如示例性的图1A中所示的那些。这些方法通常允许多路复用或在单次测定中检测多于一个变异，例如，在阵列的不同位置、多孔板的不同孔、不同小珠、不同的流道等检测不同的探针。多于一个核苷酸变异可存在于单一核酸靶(如RNA)中(如-nnnV¹nnnnnnn_xnnnnnnnV²nnnn-，其中V¹和V²充分间隔以允许在每个变异位置有一对竞争物探针)；或者特定基因可表达多于一种mRNA变异体，其中每一种在相应位置(例如，EGFR G719(wt)、EGFR G719C、EGFR G719S和/或EGFR G719A；或KRAS G12(wt)、KRAS G12D、KRAS G12V、KRAS G12A、KRAS G12R、KRAS G12C和/或KRAS G12S)或不同位置(例如，上述EGFR719位置形式的一种或多种与EGFR L858R和/或EGFR T790M)具有不同的核苷酸；或者来自多种不同基因的变异(例如，上述EGFR形式的一种或多种，以及上述KRAS形式的一种或多种和/或BRAF形式的一种或多种(如V600E))；或者上述所有的组合皆可在单次测定中共同检测。可以选择来自相同或不同靶核酸的其他变异或变异组合。本领域普通技术人员能够调整本说明书文公开的方法，以在单次测定中检测预期数量的变异。

A.利用序列-特异性接头检测探针

在一些实施方案中，在杂交和核酸酶处理之后，将所述样品与包括多个空间上分离的区域的表面接触，每个区域包括至少一个与双功能接头(也被称为“编程接头”)相连的锚。或者，在杂交和核酸酶处理之后，将所述样品与多个表面接触，其中每个表面包括至少一个与双功能接头相连的锚。例如，所述表面可以是一组小珠，其中每个小珠亚组包括至少一个与双功能接头相连的锚。例如，第一个亚组可包括至少一个与第一双功能接头相连的锚，而第二个亚组可包括至少一个与第二双功能接头相连的不同的锚，以此类推。在另一个实例中，所述表面可以是流动池，如具有多个通道的流动池，其中每个通道的亚组包括至少一个与双功能接头相连的锚。例如，第一个亚组可包括至少一个与第一双功能接头相连的锚，而第二个亚组可包括至少一个与第二双功能接头相连的锚，以此类推。

示例性方法公开于以下国际专利公开中：WO 99/032663、WO00/037683、WO 00/037684、WO 00/079008、WO 03/002750和WO08/121927，以及美国专利6238869、6458533和7659063，其全文以引用的方式纳入本说明书。还可参见Martel et al.,Assay and DrugDevelopment Technologies.2002,1(1-1):61-71；Martel et al.,Progressin Biomedical Optics and Imaging,2002,3:35-43；Martel et al.,GeneCloning and Expression Technologies,Q.Lu and M.Weiner,Eds.,Eaton Publishing,Natick(2002)；Seligmann,B.PharmacoGenomics,2003,3:36-43；Martel et al.,“Array Formats”in“MicroarrayTechnologies and Applications,”U.R.Muller and D.Nicolau,Eds,Springer-Verlag,Heidelberg；Sawada et al.,Toxicology in Vitro,20:1506-1513；Bakir,et al.,Biorg.& Med.Chem Lett,17:3473-3479；Kris,et al.,Plant Physiol.144:1256-1266；Roberts,et al.,LaboratoryInvestigation,87:979-997；Rimsza,et al.,Blood,2008Oct 15,112(8):3425-3433；Pechhold,et al.,Nature Biotechnology,27,1038-1042。上述所有文献通过以引用的方式全文纳入本说明书。

所述锚和双功能接头通过杂交、退火、共价连接或其他结合联系在一起。所述双功能接头包括第一部分和第二部分，其中第一部分与锚的至少一部分特异性结合(例如，互补)，第二部分与所述测定中包括的探针之一的至少一部分(或与该探针结合的靶的区域)特异性结合(例如，互补)。在一些实例中，在与包括锚和双功能接头的表面接触前，将样品处理使所述核酸酶失活(例如，在95℃孵育15-30分钟)并中和。将所述样品和表面(例如，阵列、小珠或流动池)孵育足够长的时间，使所述探针与和锚相连的双功能接头特异性地结合(例如，杂交)。在一些实例中，所述样品与表面的孵育在约37℃-约65℃(例如，约45℃-约60℃或约50℃-约60℃，如50℃)进行约1-72小时(例如，约3-18小时、约12-24小时、约16-24小时、约24-72小时、约24-48小时、约36-72小时或过夜)，使探针与所述双功能接头杂交(“探针捕获”)。

在一些实施方案中，所公开的方法包括在表面(例如，在阵列、小珠或流动池上)上的锚，其与双功能接头相连，所述双功能接头用来在核酸酶步骤之后捕获探针。在一些实例中，锚是长度约8-150个核苷酸的寡核苷酸(例如，约15-100、20-80、25-75或25-50个核苷酸，如约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140或150个核苷酸)。在一个非限制性实例中，所述锚的长度约为25个核苷酸。在一些实例中，所述锚包括与所述双功能接头的第一部分特异性结合的第一部分，以及在所述表面和锚的第一部分之间发挥间隔段的作用的第二部分。在一些实例中，所述锚的第二部分的长度约为6-60个碳原子或核苷酸(如约6、7、8、9、10、11、12、24、30、36、42、48、54或60个碳原子或核苷酸)。在其他实例中，所述锚的第二部分的长度约为5-100个碳原子或核苷酸(如约10-50、15-40、20-30或约25个碳原子或核苷酸)。

所公开的方法中的锚的碱基组成应使所述锚和双功能接头配对的热力学稳定性较高。在一些实例中，所述锚的碱基组成百分比是约30-40％G、30-40％C、10-20％A和10-20％T。在一些实例中，所述锚中的最近邻频率(nearest neighbor frequency)使G-G或C-C最近邻最小化，以减少由G四分体的形成介导的副反应。

设计并合成所公开的方法中使用的锚的方法记载于如PCT公开WO 98/24098中被，其通过以引用的方式纳入本说明书。在一些实例中，需要一个锚的集合，其中每一个锚彼此都明显不同。获得不同锚的集合的示例性算法如下：

(1)确定该集合的大小。在一些实施方案中，16、24、36、48、49、64、81、96和100构成可用的大小。

(2)确定该锚集合的总体序列结构。以上描述的长度和碱基组成被用来确定这样的参数。总体上，G碱基和C碱基的数量相等，A碱基和T碱基的数量相等。此相等使最终集合的构型多样性达到最优。因此，此类集合将通过方程G_nC_nA_mT_m来描述。

(3)对于通过m和n确定的集合结构，使用随机数字发生器以产生随机序列异构体的集合。

(4)所述随机序列集合的一个元素被选择作为此集合的元素#1来使用。

(5)确定集合元素之间允许的最大相似性。相似性根据局部成对碱基比对确定。例如，当具有相等长度n的两条寡核苷酸链相比对，其5’端和3’端相互重合时，缺少错配指这样的情况：在1-n的所有位置，这两条链的碱基都是相同的。完全不匹配指这样的情况：在1-n的所有位置，这两条链的碱基都是不同的。例如，在16个16聚体捕获探针的集合中，有用的最大相似性可以是10个或更多错配。

(6)选择该随机序列集合的第二个元素，并确定其与元素#1的相似性。如果元素#2与元素#1的相似性小于允许的最大相似性，则元素#2将被保留在该集合中。如果元素#2与元素#1的相似性大于允许的最大相似性，元素#2将被抛弃并选择新序列进行对比。重复此过程，直到确定第二个元素。

(7)按照次序，选择随机序列集合中的其他元素，其与之前所选的所有元素之间满足差异性限制。

能够被用于所公开的方法中的一些表面(或底物)可容易地从供应商获得。在一些实施方案中，所述表面是96、384或1536孔微量滴定板，如Corning Costar或BD Biosciences所售改良板(例如，γ照射平板)。在其他实施方案中，底物包括一个或多个小珠(例如能够通过大小或颜色(例如通过流式细胞术)区分的一组小珠)。在一些实施方案中，底物包括流动池(如具有多个通道的流动池)。或者，可通过以下方式形成包括孔(所述孔又包括凹槽(indentation)或浅凹槽(dimple))的表面：对物质(如铝或钢)进行微机械加工以制备模具，然后向该模具内微注射塑料或类似物质以形成一种结构。或者，能够组装包括玻璃、塑料、陶瓷等的结构。所述分隔器(separator)可以是，例如一片有洞从中穿过的材料(如硅酮)，使得当将三片连接时，每个洞将构成测试孔的壁。所述细分器(subdivider)可以是，例如，一薄片材料(如硅酮)，其形状为滤网(screen)或细网筛(meshwork)的形式。在一些实例中，所述基底是材料(例如玻璃或塑料)的扁平片，例如用于生化测定的典型微孔板的底部的形状。所述基底的上表面可以是平的，或是形成于每个样品孔中并具有凹槽，所述凹槽与细分器形状配合以提供完全细分或孔。所述三片可通过标准步骤连接，例如用于硅晶片组装的步骤。

用于所述表面的合适的材料包括但不限于：玻璃、二氧化硅、金、银、凝胶或聚合物、硝酸纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚异丁烯、聚丁二烯、聚异戊二烯、聚乙烯吡咯烷、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚氟乙烯-丙烯、聚乙烯乙烯醇、聚甲基戊烯、聚氯三氟乙烯、聚砜、羟基化双向拉伸聚丙烯(hydroxylated biaxially orientedpolypropylene)、胺化双向拉伸聚丙烯(aminated biaxially orientedpolypropylene)、巯基化双向拉伸聚丙烯(thiolated biaxially orientedpolypropylene)、乙烯丙烯酸、乙烯甲基丙烯酸及其共聚物的混合物(参见美国专利5,985,567)。

通常，能够被用来形成所述表面的材料的适合特征包括：容易发生表面激活以使得在激活时，所述载体的表面能够与生物分子(如寡核苷酸)共价(不可逆地)连接；容易发生生物分子的“原位”合成；具有化学惰性以使得未被寡核苷酸或蛋白质占据的所述载体的表面不容易发生非特异性结合，或当非特异性结合发生时，此材料可轻易从该表面除去而不会除去寡核苷酸或蛋白质。

根据本公开内容，可使用多种阵列形式用于排列所述锚。一种适合的形式包括离散细胞的二维模式(如64×64阵列中的4096个正方形)。如本领域普通技术人员会了解的，其他阵列形式(包括但不限于狭长(矩形)和圆形阵列)同样适用(见美国专利5981185)。在一些实例中，所述阵列是多孔板。

寡核苷酸锚、双功能接头或探针能够通过传统技术合成，例如，使用商用的寡核苷酸合成器和/或将如此合成的小片段连接在一起。长度太长而无法通过此方法可靠合成的核酸可使用传统方法通过扩增步骤产生。

在一个实施方案中，可通过多种传统技术之一将预制的核酸锚(如寡核苷酸锚)分布于检测区域表面上或内部，所述传统技术包括光刻或丝网印刷化学吸附、通过喷墨技术排列、毛细管、屏幕或流体通道芯片(screen or fluid channel chip)、利用电极阵列的电化学模式、用针或刺接触、或通过在过滤器上热处理或UV辐射而变性(见，例如，Rava et al.(1996)，美国专利5545531；Fodor et al.(1996)，美国专利5510270；Zanzucchi et al.(1997)，美国专利5643738；Brennan(1995)，美国专利5474796；PCT WO 92/10092；PCT WO 90/15070)。锚可被放置于检测区域表面上方，或者，例如对聚丙烯酰胺凝胶板而言，以某种方式包埋在该表面内部，该方式使一些锚从该表面伸出并可与接头相互作用。在一个实施方案中，预制的寡核苷酸锚在5’端衍生出游离氨基基团；将其以通常依照经验确定的浓度(例如，约1μM)溶解于缓冲液如50mM磷酸缓冲液(pH 8.5，1mM EDTA)中；使用Pixus纳米喷射分散器(Cartesian Technologies)，以约10.4纳升的液滴形式将其分布于检测孔内部的特定位置，检测孔的上表面是新的、干燥的DNA结合板(Corning Costar)的表面。在另一个实施方案中，预制的寡核苷酸锚在3’端衍生出游离氨基基团并包括7个碳原子的间隔基团。将寡核苷酸锚以20μM浓度溶解于pH 8.5的0.5M磷酸缓冲液中，并在Falcon 1172平板上接触印刷，在潮湿的房间使用毛细针接受γ照射(BD Biosciences)。根据寡核苷酸吸附和蒸发的相对速率，需要在制备过程中控制孔中的湿度。在另一个实施方案中，可使用传统方法直接在检测区域的表面合成寡核苷酸，所述传统方法例如，生长中的寡核苷酸链的光激活去保护(例如，与定点“遮蔽(mask)”联合使用)，或使用纳米喷射分散器分散失活化合物的纳升液滴的模式。例如，可以使所有生长中的寡核苷酸——其将获得单个核苷酸——去保护，之后将核苷酸加到该表面。在另一个实施方案中，利用传统方法将所述核苷酸通过其3’端吸附于该表面。

本领域技术人员应了解，在一些实例中，利用本文提供的方法之一进行的检测，或甚至本文所述的全部核酸酶保护，是通过合适编程的计算机或其他仪器来实施的，例如，是自动化的。

B.利用其他序列-特异性方法检测探针

在一些实施方案中，在杂交和核酸酶处理之后，利用其他方法如高通量平台检测所述样品中的探针。在一些实例中，利用传统的微阵列分析或杂交体捕获来检测探针。在一些实施方案中，所述探针不包括可检测标记，并且使用间接检测方法。此类方法是本领域普通技术人员已知的，其包括但不限于下述方法。需要了解的是，本公开内容所使用的检测方法还包括未来将开发出的新型检测方法。

在一个实例中，利用基于小珠的测定(如小珠阵列)检测探针。基于小珠的测定的一个实例利用小珠(Luminex,Austin,TX)，如QBEAD测定。在一些实例中，通过与连接到小珠上的寡核苷酸杂交(例如，在约50℃下杂交约1-24小时)，在小珠或其他小珠上捕获探针。通过如流式细胞术(如利用Luminex 200、Flexmap3D或其他适合的仪器)或其他适合的检测系统(如生物素/链霉亲和素)，能够检测被包括在所述探针中的可检测标记。

在另一个实例中，利用标准微阵列检测探针。此类阵列的一个实例是Nimblegen微阵列(Nimblegen,Madison,WI)。在一些实例中，将所述探针与寡核苷酸的阵列杂交，所述寡核苷酸与该探针特异性结合。如果存在，则可以检测所述探针包括的可检测标记。

在其他实施例中，用“条形码”测定来检测探针。此测定的一个实例是分析系统(Nanostring Technologies,Seattle,WA)。在一些实例中，在杂交和核酸酶处理之后，将所述探针与包含一个或多个颜色编码标签(“条形码”)的寡核苷酸杂交。所述颜色编码标签的检测提供了对被包括在所述样品中的探针的鉴定。见，例如，WO07/0761282、WO 07/076129、WO 07/139766。

在一个实例中，利用流动池技术来检测探针。示例性的流动池可从Advanced Biosensor Technology(Richmond,VA)获得。在一些实例中，在杂交和核酸酶处理之后，探针与流动池通道中对应探针或双功能接头杂交。然后利用常规方法如电化学检测、HPLC或质谱法检测所述探针的存在。

在其他实例中，通过质谱法检测探针。在其他实施例中，根据其大小可以将全长探针和标记的存在与已至少部分被核酸酶消化的探针区分开。在其他实例中，质谱能够根据探针的大小和序列组成检测并区分探针。在其他实例中，能够通过测序(例如，Sanger测序、焦磷酸测序、可逆染料终止物测序(Illumina测序)、通过连接的测序(SOLiD测序)、基于半导体的测序、Helioscope^TM测序、单分子测序或纳米孔测序)来检测探针(或靶与探针杂交的区域)。在一些实例中，探针在其5’端和/或3’端包括一个或多个侧翼序列。所述侧翼序列包括若干连续的核苷酸，其具有在该样品中存在的核酸分子中未发现的序列(如至少12个核苷酸的序列)，并且此侧翼序列提供了通用杂交和/或扩增序列，其还可被用作该探针测序的通用引物。此通用杂交和/或扩增序列，当其具有与至少一部分扩增引物互补的序列时，允许多路复用，因为相同扩增引物能够被用来扩增针对不同靶核酸分子的特异性探针。在又一实例中，通过技术(GenMark Diagnostics,Carlsbad,CA)检测探针。

C.利用差异化标记的探针检测

在所公开的方法的一些实施方案中，将所述样品与至少两种探针接触，每种探针包括不同的可检测标记(如在以下第V部分中所述的标记)。在每种探针中不同的可检测标记的存在允许检测标记(以及因此探针)的存在，不管被检测探针的序列如何。因此，此类检测方法能够被用在测定中，其中除了变异核苷酸位置以外，所述探针包括相同的序列。此类检测方法还能够被用在测定中，其中除了包括所述变异核苷酸位置的重叠区域以外，所述探针包括不同的序列。

在一些实施方案中，所述方法中所使用的至少两种探针的每一种被不同的半抗原(如生物素、地高辛、荧光素或二硝基苯)标记。在核酸酶处理之后，可以通过检测每种标记确定每种探针的存在和/或数量。在一些实例中，通过适合的比色测定检测每种标记，其中每种标记的存在导致不同有色产物的产生。在一个非限制性实例中，将一种探针用生物素标记并通过将所述生物素标记的探针与缀合到辣根过氧化物酶的亲和素或链霉亲和素接触来检测，将另一种探针用地高辛标记并通过将所述地高辛标记的探针与缀合到碱性磷酸酶的地高辛抗体接触来检测。所述生物素标记的探针的存在和/或数量通过在辣根过氧化物酶的作用下显色底物(如TMB、DAB或ABTS)向有色产物(例如，蓝色产物)的转化确定。所述地高辛标记的探针的存在和/或数量通过在碱性磷酸酶的作用下显色底物向不同的有色产物(如红色产物)的转化确定。本领域普通技术人员能够选择适合的标记物、酶和底物的组合，以检测并区分混合物中存在的多种被标记的探针。

在其他实施方案中，所述方法中所使用的至少两种探针的每一种都被不同的荧光标记标记。在核酸酶处理后剩余的每种探针的存在和/或数量能够通过检测该混合物中剩余的荧光标记确定。可以使用目前已知或未来将被开发出的任何检测并区分荧光标记的方法。在一些实例中，在核酸酶消化后，通过电泳(如毛细管电泳)分离所述混合物，并检测荧光标记，例如使用激光诱导的荧光检测。适合的电泳和检测系统是可商购的，例如，Applied Biosystems 3130Genetic Analyzer或3730DNA Analyzer(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)。在其他实例中，将所述探针用基于序列的方法(如上述方法)捕获并通过其不同荧光标记的特异性发射波长区分。

在其他实施方案中，将每种探针都用供体荧光基团和受体荧光基团标记，其中每种探针的供体和受体荧光基团的组合是不同的。在一些实例中，所述受体荧光基团在最接近核苷酸变异位置的探针末端。如果探针未杂交，该受体荧光基团将被核酸酶除去并且不会检测到信号(或检测到减弱的信号)。如果该探针发生杂交，该受体荧光基团将被保护免受核酸酶的消化并且会检测到信号。在其他实例中，所述受体荧光基团是猝灭剂，并且此猝灭剂最靠近核苷酸变异位置的探针末端。如果该探针未杂交，则所述猝灭剂将被核酸酶除去并检测到来自供体荧光基团的信号。如果该探针发生杂交，则所述猝灭剂将被保护免受核酸酶的消化并且不会检测到来自供体荧光基团的信号

差异标记探针的其他检测方法包括流式细胞术。例如，可在小珠上捕获被标记了不同荧光标记的探针，并且在流式细胞仪上通过其发射光谱区分。

D.通过测序进行的探针检测

在一些实例中，在核酸酶保护步骤之后存在的探针或与探针杂交的靶的区域能够通过测序来检测。核酸测序方法在本领域中是常规的。

V.可检测的标记

在一些实例中，所公开的探针包括一种或多种可检测的标记。可检测的标记是本领域中公知的。“可检测标记”是能够被用来产生可检测的信号的分子或材料，所述信号指示样品中该探针(例如，结合或杂交的探针)的存在或浓度。因此，经标记的核酸分子提供了样品中该靶核酸序列(例如，具有一个或多个非变异或变异核苷酸的靶核酸)的存在和浓度的指示物。尽管提供了实例，本公开内容并不限于特定标记物的使用。

在一些实例中，在所公开的方法中使用的每种探针被标记以相同的可检测的标记。在其他实例中，至少一种探针被标记以与所述方法中使用的至少另一种探针不同的可检测标记。例如，至少一种探针(例如，“野生型”或“非变异”探针)被荧光基团(如Cy-3^TM)标记，至少一种探针(例如，“变异”探针)被不同的荧光基团(如Cy-5^TM)标记。如果所述方法中包括其他探针，它们可被标记以与第一种和第二种探针之一相同的可检测的标记，或标记以与第一种和第二种探针都不同的可检测的标记。

与一种或多种核酸分子(如公开的探针)相关的标记可被直接或间接检测。能够通过任何已知或有待被发现的机制，包括光子(包括无线电频率、微波频率、红外频率、可见光频率和紫外线频率的光子)的吸收、发射和/或散射检测标记。可检测的标记包括有色、荧光、磷光和冷光分子和物质；催化剂(如酶)，其将一种底物转化为另一种物质以提供可检测的差异(如通过将无色物质转化为有色物质，反之亦然，或通过产生沉淀或提高样品浊度)；半抗原；放射性核素；以及顺磁性和磁性分子或物质。其他可检测标记包括拉曼(光散射)标记(例如，生物标签,Oxonica,Bucks,UK)。

在非限制性实例中，使用与半抗原分子(如硝基芳香族化合物(例如，二硝基苯(DNP))、生物素、荧光素或地高辛)共价连接的dNTP来标记探针。将半抗原和其他标记物与dNTP缀合的方法(例如，促使其并入被标记的探针)是本领域中公知的。其步骤的实例参见，例如，美国专利5258507、4772691、5328824和4711955。标记能够直接或间接地在dNTP上的任何位置与该dNTP连接，如磷酸(例如，α、β或γ磷酸)或糖。在一些实例中，被标记的核酸分子的检测可通过用原发性第一抗半抗原抗体接触半抗原标记的探针而完成。在一个实例中，将所述第一抗半抗原抗体(如小鼠抗半抗原抗体)直接用酶标记。在另一个实施例中，与酶缀合连接的次级第二抗抗体(如山羊抗小鼠IgG抗体)被用于信号放大。在其他实施例中，所述半抗原是生物素，并且通过将所述半抗原标记的探针与缀合至酶(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的亲和素或链霉亲和素接触来检测。

可检测标记的其他实例包括荧光分子(或荧光染料)。大量荧光染料对本领域普通技术人员而言是已知的，并且能够被选择，例如从Life Technologies(Carlsbad,CA)，例如，参见The Molecular ProbesHandbook–A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies。美国专利5866366(Nazarenko et al.)中提供了能够与核酸分子(如探针)结合(例如，化学缀合)的特定荧光团的实例，例如：4-乙酰氨基-4’-异硫氰酰芪-2,2’-二磺酸、吖啶及其衍生物(如吖啶和吖啶异硫氰酸酯)、5-(2’-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5-二磺酸盐(荧光黄VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺、亮黄、香豆素及其衍生物如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)；焰红染料(cyanosine)；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5’,5”-二溴邻苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙基氨基-3-(4’-异硫氰酰苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸盐；4,4’-二异硫氰酰二氢-芪-2,2’-二磺酸；4,4’-二异硫氰酰芪-2,2’-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-(4’-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4’-异硫氰酸盐(DABITC)；伊红及其衍生物(如伊红和伊红异硫氰酸酯)；赤鲜红(erythrosin)及其衍生物(如赤鲜红B和赤鲜红异硫氰酸酯)；乙锭；荧光素及其衍生物(如5-羧基荧光素(FAM))、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)和QFITC(XRITC)、6-羧基-荧光素(HEX)、TET(四甲基荧光素)；2′,7′-二氟荧光素(OREGON染料)；荧光胺；IR144；IR1446；孔雀石绿异硫氰酸盐；4-甲基伞形酮；邻甲酚肽；硝基酪氨酸；副品红；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘及其衍生物(如芘、芘丁酸盐和琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯)；活性红4(Cibacron亮红3B-A)；罗丹明及其衍生物(如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸盐、罗丹明绿、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明和四甲基罗丹明异硫氰酸盐(TRITC)；磺酰罗丹明B、磺酰罗丹明101和磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(Texas染料)；N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸盐(TRITC)；核黄素；玫红酸和铽螯合物衍生物；LightCycler Red 640；Cy5.5；Cy56-羧基荧光素；二氟化硼二吡咯(BODIPY)；吖啶；芪；Cy3；Cy5、染料(Applied Biosystems)；LC Red 640；LC Red705；以及Yakima yellow。荧光团的其他实例包括670、570、CALRed 590、CALRed 610、CAL615、CALRed 635、CALGreen 520、CALGold 540和CALOrange 560(Biosearch Technologies,Novato,CA)。其他适合的荧光团包括本领域普通技术人员已知的荧光基团，例如，可从Molecular Probes/Life Technologies(Carlsbad,CA)获得的荧光基团。

其他适合的荧光团包括在约617nm处发光的硫醇反应性铕螯合物(Heyduk和Heyduk,Analyt.Biochem.248:216-27,1997；J.Biol.Chem.274:3315-22,1999)，以及GFP、Lissamine^TM、二乙基氨基香豆素、荧光素氯三嗪、萘荧光素、4,7-二氯罗丹明和氧杂蒽(如美国专利5800996记载，Lee et al.)及其衍生物。还可使用本领域普通技术人员已知的其他荧光团，例如，Life Technologies销售的荧光团，包括ALEXA染料系列(例如，如美国专利5696157、6130101和6716979中所述)、染料系列(二氟化二吡咯硼染料，例如，如美国专利4774339、5187288、5248782、5274113、5338854、5451663和5433896中所述)、Cascade染料(芘磺酸盐的胺反应性衍生物，记载于美国专利5132432)和Marina染料(美国专利5830912)。

在特定的实例中，荧光团被用作供体荧光团或受体荧光团。“受体荧光团”是从供体荧光团吸收能量的荧光团，例如在约400-900nm范围内(如在约500-800nm范围内)。受体荧光团通常吸收一定波长的光，此波长通常比该供体荧光团的最大吸收波长长至少10nm(如至少长20nm)，并且受体荧光团的荧光发射在约400-900nm的波长范围最大。受体荧光团具有与该供体荧光团的发射相重叠的激发光谱，因此由该供体发射的能量能够激发该受体。理想地，受体荧光团能够与核酸分子相连。

在特定实例中，受体荧光基团是暗猝灭剂(dark quencher)，如Dabcyl、QSY7(分子探针)、QSY33(分子探针)、BLACK HOLE染料(Biosearch Technologies；如BHQ0、BHQ1、BHQ2和BHQ3)、ECLIPSE^TM暗猝灭剂(Epoch Biosciences)或IOWA染料(Integrated DNA Technologies)。猝灭剂能够减少或终止供体荧光团的发射。在这样的实例中，不是在受体荧光团与供体荧光团足够近时检测来自该受体荧光团的发射信号的增强(或在二者距离明显时检测来自受体荧光团的发射信号的减弱)，而是当该猝灭剂与供体荧光团距离明显时能够检测来自供体荧光团的发射信号的增强(或在二者距离足够近时检测来自供体荧光团的发射信号的减弱)。

“供体荧光基团”是能够将能量转移至受体荧光团，从而产生来自该受体的可检测荧光信号的荧光团或发光分子。供体荧光团通常是在约300-900nm的范围内(例如350-800nm)有吸收的化合物。供体荧光团在理想激发波长有强摩尔吸收系数，例如大于约10³M^-1cm^-1。

除了上述荧光染料，荧光标记可以是荧光纳米颗粒，如半导体纳米晶体(例如QUANTUM DOT^TM，可从如Life Technologies获得；还可参见美国专利6815064、6682596和6649138)。半导体纳米晶体是具有依赖大小的光学和/或电学特性的微观粒子。当用初级能源使半导体纳米晶体发光时，能量的次级发射发生的频率对应于该半导体纳米晶体中使用的半导体材料的带隙。此发射能够作为特定波长的有色光或荧光被检测。具有不同光谱特征的半导体纳米晶体在如美国专利6602671记载。可以通过技术偶联到多种生物分子(包括dNTP和/或核酸)或底物的半导体纳米晶体在例如Bruchez et al.,Science281:2013-2016,1998；Chan et al.,Science 281:2016-2018,1998和美国专利6274323中记载。

不同组成的半导体纳米晶体的形成在如美国专利6927069、6914256、6855202、6709929、6689338、6500622、6306736、6225198、6207392、6114038、6048616、5990479、5690807、5571018、5505928、5262357以及美国专利公开2003/0165951和PCT公开99/26299(公开于1999年5月27日)中被公开。可以产生根据半导体纳米晶体的不同光谱特征鉴定的半导体纳米晶体的不同群体。例如，可以产生根据半导体纳米晶体的组成、大小或大小和组成发射不同颜色的光的半导体纳米晶体。例如，基于大小发射不同波长光(565nm、655nm、705nm或800nm发射波长)的量子点，其适合用作本文公开的探针中的荧光标记，可从Life Technologies(Carlsbad,CA)获得。

其他标记包括，例如，放射性同位素(如³H)、金属螯合物(如放射性或顺磁性金属离子如Gd³⁺的DOTA和DPTA螯合物)和脂质体。

能够与核酸分子(如探针)一起使用的可检测标记还包括酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β萄半乳糖苷酶、β乳葡萄糖苷酸酶或β酶内酰胺酶。在所述可检测标记包括酶的情况下，色原体(chromogen)、荧光化合物或发光化合物可与酶结合使用，以产生可检测信号(多种此类化合物是可商购的，例如，从Life Technologies,Carlsbad,CA)。显色化合物的具体实例包括二氨基联苯胺(DAB)、4-硝基苯基磷酸盐(pNPP)、固红、固蓝、溴氯吲哚基磷酸盐(BCIP)、硝基蓝四唑(NBT)、BCIP/NBT、AP橙、AP蓝、四甲基联苯胺(TMB)、2,2’-联氮-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐](ABTS)、邻联茴香胺、4-氯萘(4-CN)、硝基苯基-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)、邻苯二胺(OPD)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β–半乳吡喃糖苷(X-Gal)、甲基伞形酮酰-β-D-半乳吡喃糖苷(MU-Gal)、对硝基苯基-α-D-半乳吡喃糖苷(PNP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β–D-葡糖苷酸(X-Gluc)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、品红、碘硝基四唑(INT)、四唑蓝和四唑紫。

代替地，酶能够被用于金相检测方案。金相检测方法包括使用酶(如碱性磷酸酶)，结合水溶性金属离子和该酶的氧化还原失活的底物。所述底物被该酶转化为氧化还原活性剂，且所述氧化还原活性剂还原该金属离子，使其形成可检测沉淀物(参见，例如，美国专利申请公开2005/0100976、PCT公开2005/003777和美国专利申请公开2004/0265922)。金相检测方法还包括使用氧化还原酶(如辣根过氧化物酶)以及水溶性金属离子、氧化剂和还原剂，以形成可检测沉淀物(参见，例如，美国专利6670113)。

在一些实施方案中，所述可检测标记在该探针的5’端或3’端被连接到或并入该探针(例如，该探针是末端标记探针)。在其他实施方案中，所述可检测标记被连接或并入该探针的任何核苷酸位置，该位置可被“竞争物”探针的杂交取代，或者由于该探针末端附近的杂交碱基的“呼吸”的存在使末端碱基不稳定的错配，导致该位置是或可以是单链。在一些实例中，所述可检测标记被连接到或并入到核苷酸变异位置的两个碱基之间。在一个非限制性实例中，如果核苷酸变异位置位于从探针末端开始的第3个碱基，则所述可检测标记可位于该探针相同末端的前5个碱基中的一个或多个碱基。

VI.样品

在所公开的方法中使用的样品包括任何包括核酸(如基因组DNA、cDNA、病毒DNA或RNA、rRNA、tRNA、mRNA、miRNA、寡核苷酸、核酸片段、修饰的核酸、合成核酸等)的样本。在一些实例中，所公开的方法包括在分析样品前获得样品。在一些实例中，所公开的方法包括选择患有肿瘤的受试者，随后在一些实例中进一步选择一种或多种包括核苷酸变异的靶核酸，以基于受试者肿瘤进行检测，例如，以确定受试者的诊断或预后或选择一种或多种治疗方法。在其他实例中，所公开的方法包括选择患有、疑似患有或可能发展出疾病或病症(如可遗传的遗传疾病，例如囊性纤维化(cystic fibrosis)、色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa)、肌肉萎缩症，或疾病易感性基因变异，例如BRCA1或BRCA2突变)的受试者，并随后在一些实例中进一步选择一种或多种包含核苷酸变异的靶核酸，以基于受试者的已知或疑似病症进行检测，例如，以确定受试者的诊断或预后或选择一种或多种治疗方法。

示例性样品包括但不限于细胞(如哺乳动物细胞、植物细胞、真菌细胞、细菌细胞)、病毒、细胞裂解物、血液涂片、细胞离心制备物、细胞涂片、体液(例如，血液、血清、血浆、唾液、痰、尿液等)、组织样本(例如，组织或肿瘤活检物、组织移植物、异种移植物)、细针穿刺物、组织切片(例如，低温恒温组织切片和/或石蜡包埋组织切片)、口腔拭子(buccal swab)、宫颈拭子和/或环境样品(如食物、水、土壤、空气过滤或水过滤样品)。在其他实例中，所述样品包括从受试者分离的核酸(如基因组DNA、cDNA、RNA、mRNA)，例如，从受试者的细胞、细胞裂解物、血液涂片、细胞涂片、体液、组织活检物、细针穿刺物和/或组织切片中分离出的核酸。从受试者获得样品的方法是本领域已知的。例如，获得体液、组织或细胞样品的方法是常规的。从样品中分离核酸的方法也是常规的。示例性样品可从正常的细胞或组织或从肿瘤细胞或组织获得。肿瘤形成是一种生物病症，其中一种或多种细胞发生了特征性退行发育——失去分化能力、生长速度加快、入侵周围组织，并且细胞能够转移。在特定实例中，生物样品包括肿瘤样品，如包含肿瘤细胞的样品。

示例性的肿瘤细胞或组织可被包含于或分离自实体肿瘤，其包括：肺癌(例如，非小细胞肺癌，如肺鳞状细胞癌)、乳腺癌(例如，小叶和导管癌)、肾上腺皮质癌、成釉细胞瘤(ameloblastoma)、壶腹癌(ampullary cancer)、膀胱癌、骨癌、宫颈癌、胆管瘤、结直肠癌、子宫内膜癌(endometrial cancer)、食道癌、胃癌(gastric cancer)、神经胶质瘤、颗粒细胞瘤(granular cell tumor)、头颈癌、肝细胞癌、葡萄胎(hydatiform mole)、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤(mesothelioma)、骨髓瘤(myeloma)、成神经细胞瘤(neuroblastoma)、口腔癌、骨软骨瘤(osteochondroma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、卵巢癌、胰腺癌、毛母质瘤(pilomatricoma)、前列腺癌、肾细胞癌、唾液腺瘤、软组织瘤、Spitz痣、鳞状细胞癌、畸胎样癌(teratoid cancer)和甲状腺癌。示例性的肿瘤细胞还可被包含于或分离自血癌包括白血病，包括急性白血病(如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病，以及成髓细胞、早幼粒细胞、粒单核细胞、单核细胞和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s disease)、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级形式)、多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征和骨髓发育不良。

例如，可通过手术切除全部或部分肿瘤、通过收集从该肿瘤的细针穿刺物以及其他本领域已知方法从含有细胞材料的肿瘤得到样品。在一些实例中，组织或细胞样品被应用于底物并分析以确定是否存在一个或多个核苷酸变异。在公开方法中使用的固体载体需要仅包含该生物样品并且，任选地但有利地允许对该样品中组分(例如，蛋白质和/或核酸序列)的便利的检测。示例性的载体包括显微镜载玻片(例如，玻璃的显微镜载玻片或塑料的显微镜载玻片)、盖玻片(例如，玻璃盖玻片或塑料盖玻片)、组织培养皿、多孔板、膜(例如，硝酸纤维素或聚偏氟乙烯(PVDF))或BIACORE^TM芯片。

所公开的方法是灵敏的且特异性的，并允许在包含甚至有限数量细胞的样品中检测靶核酸中的核苷酸变异。例如，可在低至100个细胞(如包括100或更多细胞的样品，如500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、50000或更多细胞)中检测靶核酸中的一个或多个核苷酸变异的存在。在一些实例中，可在约1000-100000个细胞(例如，1000-50000、1000-15000、1000-10000、1000-5000、3000-50000、6000-30000或10000-50000个细胞)中检测靶核酸(如变异靶核酸)的表达。在其他实例中，可在约1-1000个细胞(如约1-500个细胞、约1-250个细胞、约1-100个细胞、约1-50个细胞、约1-25个细胞或约1个细胞)中检测靶核酸中的一个或多个核苷酸变异的存在。在其他实例中，所公开的方法允许在样品或反应(如典型的30μl反应)中检测靶核酸中一个或多个核苷酸变异的低至10000个拷贝(如10000或更多拷贝，例如，约15000、25000、50000、100000、150000、200000、500000或更多拷贝)。在其他实例中，能够在样品中检测靶核酸中一个或多个核苷酸变异的约10000-250000拷贝(如约10000-100000拷贝、约15000-150000拷贝、约20000-200000拷贝或约100000-250000拷贝)的存在。

本文所述的样品能够通过本领域中目前已知或未来将被开发出的任何方法制备。在一些实例中，所述样品中的细胞在水性溶液(例如使用细胞裂解缓冲液)中被裂解或渗透化处理。所述水性溶液或细胞裂解缓冲液包括洗涤剂(如十二烷基硫酸钠)和一种或多种促溶剂(chaotropic agent)(例如甲酰胺、盐酸胍、异硫氰酸胍或尿素)。所述溶液可还包含缓冲液(例如SSC)。在一些实例中，所述裂解缓冲液包括约15％-25％甲酰胺(v/v)、约0.01％-0.1％SDS和约0.5-6XSSC(例如，约3X SSC)。所述缓冲液可任选地包括tRNA(例如，约0.001-约2.0mg/ml)或核糖核酸酶抑制剂。所述裂解缓冲液可还包括pH指示剂如酚红、EDTA(例如，约1mM或更低)和/或蛋白酶K(例如，约0.1-2mg/ml)。在一个特定的实例中，所述裂解缓冲液包括20％甲酰胺、3X SSC(79.5％)、0.05％SDS、1μg/ml tRNA和1mg/ml酚红。将细胞在水性溶液中孵育充分长的时间(如约1-60分钟、约5-20分钟或约10分钟)并且在足够的温度(如约22℃-115℃、约37℃-105℃或约90℃-100℃)下孵育，以溶解裂解细胞或使细胞可渗透。在一些实例中，在约95℃进行裂解。在一些实例中，所述裂解步骤包括将该样品在约95℃孵育约5-15分钟以使该样品中的RNA变性(但基因组DNA不受影响)。在其他实例中，所述裂解步骤包括将该样品在约105℃孵育约5-15分钟以使样品中的RNA和基因组DNA同时变性。

在一些实例中，直接使用粗细胞裂解而没有进一步纯化(“仅进行细胞裂解”的样品制备)。可在存在或不存在一种或多种公开的探针的情况下溶解细胞。如果在不存在探针的情况下裂解细胞，可随后将一种或多种探针添加到粗裂解物中。在其他实例中，先从细胞裂解物中分离核酸，然后用一种或多种所公开的探针接触。在一些实例中，将分离的核酸(如RNA或DNA)添加到裂解缓冲液，然后加入一种或多种探针。

在其他实例中，通过在介质中固定和包埋该组织制备组织样品，或包括作为固体载体(如玻璃载玻片)上的单层，例如通过涂抹或离心细胞使其附着于该固体载体。在其他实例中，通过沉淀细胞群(如从组织样品或培养细胞获得的细胞)制备细胞沉淀(cell pellet)。所述细胞沉淀还可被固定和包埋于包埋介质中，用于分析。在其他实例中，新鲜冷冻(例如，未固定)组织或组织切片可被用于本文公开的方法。在特定实例中，将FFPE组织切片用于所公开的方法中。

在一些实例中，使用包埋介质。包埋介质是一种惰性材料，将组织和/或细胞包埋在其中，以帮助保存并用于后续分析。包埋还使组织样品可被切成薄切片。包埋介质包括石蜡、火棉胶、OCT^TM化合物、琼脂、塑料或丙烯酸。许多包埋介质是疏水的；因此，需要在分析前除去惰性材料，这主要利用亲水试剂进行。本文大量使用的术语“去石蜡化”或“脱蜡”，指从生物样品中部分或完全移除任何类型的包埋介质。例如，通过从有机溶剂(如甲苯、二甲苯、柠檬烯或其他适合的溶剂)中经过，对石蜡包埋的组织切片进行脱蜡。在其他实例中，在石蜡包埋的组织样品上覆盖热矿物油或(ExxonMobilChemical)，石蜡在加热和轻轻倒置条件下溶入有机相。在其他实例中，直接使用石蜡包埋的组织切片(例如，无脱蜡步骤)。

组织能够通过任何适合的方法固定，包括灌注法或在固定剂中浸没。固定剂可被分类为：交联剂(如醛类，例如甲醛、多聚甲醛和戊二醛，以及非醛类交联剂)、氧化剂(例如，金属离子和复合物，如四氧化锇和铬酸)、蛋白质变性剂(例如，乙酸、甲醇、乙醇)、机理未知的固定剂(例如，氯化汞、丙酮和苦味酸)、组合试剂(例如，卡诺氏固定液、methacarn固定液、Bouin固定液、B5固定液、Rossman固定液和Gendre固定液)、微波和其他固定剂(例如，排除容积固定和蒸发固定)。所述固定剂中还可包括添加剂，如缓冲液、洗涤剂、鞣酸、酚、金属盐(如氯化锌、硫酸锌和锂盐)和镧。

在制备组织或细胞样品中最常用的固定剂是甲醛，通常以福尔马林溶液的形式(在缓冲液中含4％甲醛，相当于含10％缓冲的福尔马林)。在一个实例中，所述固定剂是10％中性缓冲福尔马林。

VII.测定输出

在一些实施方案中，所公开的方法包括确定样品中一种或多种核酸(如一种或多种非变异或变异核酸)的存在或数量。将所述测试的结果以可理解的输出提供给用户(如科学家、临床医生或其他医疗工作者、实验室人员或患者)，所述输出提供关于所述测试结果的信息。在一些实例中，所述输出可以是纸质输出(例如，书写或打印输出)、屏幕展示、图形输出(例如，图形、图表或其他简图)或声音输出。在一个实例中，所述输出是表格或图形，其包括对该样品中检测(或未检测)的非变异和/或变异核酸的存在或数量(如标准数量或比例)的定性或定量指示。在其他实例中，所述输出是底物存在的信号的图或图像(例如，来自阵列的荧光或冷光的数字图像)。在另一个实例中，所述输出是核酸序列。在一些实例中，所述输出是由以合适方式编程的计算机或其他仪器提供。

在一些实例中，所述输出是数值，如样品中非变异或变异核酸的数量(包括但不限于，样品中非变异与变异核酸的比例，或样品中非变异和/或变异核酸的百分比)。在其他实例中，所述输出是图形展示，例如，在标准曲线上指示样品中非变异或变异核酸的值(如数量或相对数量)的图形。在一些实例中，该输出是与用户通讯，例如，通过经由物理的、声音的或电子的方式(例如，通过邮件、电话、传真、电子邮件或与电子医学记录的通信)的输出。

所述输出能够提供定量信息(例如，特定非变异或变异核酸的数量、样品中非变异与变异核酸的比例、或者相对于对照样品或值的非变异或变异核酸的数量)或可提供定性信息(例如，确定特定非变异或变异核酸是否存在)。在一些实例中，所述输出被表达为：相对于细胞数量、组织面积、组织或细胞数量、核酸的μg、样品体积(例如，血液的体积)或者病毒、真菌、细菌滴度的变异或非变异核酸的数量。在其他实例中，所述输出能够提供关于样品中非变异或变异核酸的相对数量的定性信息，如鉴定相对于对照的增加或减少，或相对于对照没有变化。在其他实例中，所述输出能够提供样品中的变异或非变异核酸相对于对照或管家基因，或者相对于所述靶核酸中所述变异核苷酸位置的上游或下游区域而言的相对数量。

通过以下非限制性实施例进一步说明本公开内容。

实施例

实施例1

检测体外转录物中的核苷酸变异

本实施例描述了利用定量核酸酶保护测定方法检测IVT中的单核苷酸变异。

设计探针组，以检测KRAS或表皮生长因子受体(EGFR)中的核苷酸变异。表2中提供了探针序列。将每个野生型探针的3’端用生物素标记，将每个变异探针的5’端用生物素标记。

表2：探针组

^a 3’bSh表示该探针的3’端被生物素标记，5’bSh表示该探针的5’端被生物素标记。每个探针中的变异核苷酸位置通过加粗和下划线标明。

合成每种野生型或变异序列的合成的IVT mRNA。将每种IVT在裂解缓冲液中稀释到所需浓度，并将25μl加入到96孔板的每个孔中，然后是5μl在裂解缓冲液中的1nM的生物素标记的探针混合物和70μl变性油。每种生物素标记的探针的最终浓度为167pM。将所述板在95℃下加热10-15分钟，然后在50℃下孵育约16小时(过夜)以使IVT-探针杂交。杂交后，加入50单位的S1核酸酶(在20μl S1核酸酶缓冲液中)并将该板在50℃下孵育60-90分钟并振荡，以消化未结合的IVT和探针。通过将每个孔中的全部溶液转移至新的96孔板(其每个孔中包含10μl终止液)，终止S1核酸酶反应。将新板在90℃℃下孵育15分钟，并使其在室温下冷却约15分钟。通过加入10μl中和溶液来中和反应，然后将其转移至经编程的ArrayPlate^TM。

ArrayPlate^TM包括点样在每个孔中的16个独特的“锚”寡核苷酸的4×4网格，所述“锚”寡核苷酸被修饰以结合“编程接头”，所述编程接头包括与锚互补的序列和与所述探针之一互补的序列。将ArrayPlate^TM中的反应在50℃下孵育约16小时(过夜)以使探针与所述编程接头杂交。冲洗ArrayPlate^TM，然后与生物素-过氧化物酶在37℃下孵育1小时。在最终冲洗之后，在每个孔中加入发光底物，并在HTG’s Omix Imager上捕捉图像。

对于所有探针而言，可以检测低至每孔15000拷贝(1fM)的IVT的信号(表3)。该测定在3个数量级上表现出线性，从每孔1500万拷贝(1pM)IVT到15000拷贝(1fM)IVT(图3)，R平方值大于0.900。该测定还表现出良好的重复性(表4)，变异系数(CV)通常小于15％。

实施例2

检测样品中的野生型和变异核酸

此实施例描述了利用竞争性定量核酸酶保护测定方法检测相同样品中野生型和变异核酸。

如实施例1中所述实施所述方法，除了将野生型探针和每个SNP的变异探针的混合物加入到单一孔中并且所述测定还包括野生型和变异IVT的混合物。

代替地，起始样品是肺FFPE样品，其中加入了野生型和变异IVT的混合物。在此情况下，将该FFPE样品从载玻片上刮入离心管中，加入裂解缓冲液和变性油，并将该样品以14000rpm离心1分钟。将该样品在95℃下孵育15分钟，并在室温下冷却5-10分钟。加入IVT和20mg/ml蛋白酶K/100μl裂解缓冲液，并将该样品在50℃下孵育并振荡30-60分钟。此时，将25μl样品转移至96孔板中并按照实施例1的方案操作。

变异探针表现出高水平的检测特异性(表5-8)。对于野生型和变异IVT，当存在16％变异IVT时，在所有探针组都观测到信号强度的明显差异(p＜0.05)。当仅存在6％变异IVT时，一些探针组(D761Y和L858R)表现出强度的明显差异(表6)。对于加入了野生型和变异IVT混合物的肺FFPE样品，当肺FFPE样品中存在16％变异IVT时，在所有探针组都观测到信号强度的明显差异(p＜0.05)。当仅存在6％变异IVT时，一些探针组(Q61H、D761Y、T790M、L858R)表现出强度的明显差异(表8)。

表5：混合的野生型和变异IVT滴定(平均信号强度，全部标准化，加权(n＝4))

表6：来自表5的野生型/变异SNP检测的T检验

表7：被加到肺FFPE中的混合的野生型和变异IVT的滴定(平均信号强度，全部标准化，加权(n＝4))

表8：来自表7的野生型/变异SNP检测的T检验

实施例3

检测细胞系中的变异体

此实施例描述了利用定量核酸酶保护测定方法，检测来自已知包括KRAS和/或EGFR突变的细胞系的样品中的变异。

起始样品是来自已知包括一个或多个EGFR突变的细胞系(H1975和11-18细胞)以及来自无已知EGFR突变的细胞系(A549细胞)的细胞。将在25μl裂解缓冲液中的20000个细胞转移至96孔板并按照实施例1中的方案操作。由不同的野生型和变异EGFR IVT比例构成的标准曲线也在相同的板上运行以作为定量对照。

A549细胞系(人肺癌，ATCC编号CCL-185)没有已知的EGFR突变(Tracy et al.,Cancer Res.64:7241-7244,2004)，因此可作为野生型细胞对照。H1975细胞系(人肺腺癌，ATCC编号CRL-5908)被报道在等位基因的约50-50混合物具有T790M和L858R EGFR突变(Sordella et al.,Science 305:1163-1167,2004)。11-18细胞系已被报道具有L858R EGFR突变但不具有T790M EGFR突变(Nagai et al.,Cancer Res.65:7276-7282,2005)。所述测定表明，A549细胞系对EGFRT790和L858而言是野生型的(图4A和B)。H1975细胞系表达约50％T790M和50％L858R(图4A和B)，11-18细胞系对T790而言是野生型的但表达约50％L858R(图4A和B)。在所述细胞系样品中表达的变异RNA的数量是根据在与细胞系样品相同的条件下评估的野生型和变异IVT的比例的滴定来估算。

实施例4

检测多种样品类型中BRAF V600E变异

此实施例描述了检测IVT、细胞裂解物、细胞沉淀和FFPE黑色素瘤样品中的BRAF V600E变异。

设计探针组以检测BRAF中的V600E变异。表9提供探针序列。野生型探针的3’端被生物素标记，变异探针的5’端被生物素标记。

表9：BRAF V600E探针组

^a3’bR表示该探针的3’端被生物素标记，5’bR表示该探针的5’端被生物素标记。每个探针中的变异核苷酸位置通过加粗和下划线标明。

对不同量的混合的BRAF野生型和V600E IVT的检测是按照实施例2的描述进行。将野生型探针和BRAF V600E SNP变异探针的混合物加到单一孔中，所述测定还包括单独的V600野生型或V600E IVT或者野生型和变异IVT的混合物。总IVT浓度保持在200fM不变。V600E突变甚至可在其仅为总转录物数量的5％时被检测到(表5)。

利用定量核酸酶保护测定方法，测定来自已知包括所述突变的细胞系的细胞裂解物中的BRAF V600E的存在。按照实施例3描述的方案操作，除了从50000个细胞制备细胞裂解物以及在60℃下进行S1核酸酶反应。所述起始样品是来自已知为BRAF V600E变异的杂合体的结肠癌细胞系(HT-29和COLO-205；www.atcc.org/～/media/PDFs/Culture％20Guides/Cell_Lines_by_Gene_Mutation.ashx)和在BRAF第600位氨基酸为野生型的鳞状细胞癌细胞系(RPMI-2650)的细胞。利用该V600wt和V600E探针，在该已知的杂合细胞系中同时检测到BRAF V600E变异和野生型，而在RPMI-2650细胞系中仅检测到野生型(图6)。

还制备了固定的细胞沉淀并将其用作测定样品。通过以下方式制备细胞沉淀：将8-15×10⁶细胞离心、除去上清并将细胞重新沉淀在1-4ml PBS中。将所述细胞沉淀在冷的10％中性缓冲的福尔马林中固定至少4小时。然后将所述细胞以1500rpm离心5分钟并除去上清。用Shandon细胞块制备系统(Thermo Scientific,Waltham,MA)制备细胞块。简言之，向15ml圆锥管中的沉淀的细胞中加入1-2滴试剂#2并涡旋。然后，将1-2滴试剂#1与所述细胞混合。将胶凝的细胞块转移至盒(cassette)中，并置于70％乙醇中。将所述FFPE细胞沉淀块在切片机上切成5μm的切片。该细胞沉淀的面积约为1cm²。每5μm切片添加裂解缓冲液(25μL)。然后将所述样品加热至95℃并如以上实施例2所述用蛋白酶K处理。在此实验中，以每孔1个5μm切片的浓度测试所述样品。根据实施例1的方案进行核酸酶保护测定。在RPMI-2650细胞中仅检测到野生型BRAF V600，而在COLO-205细胞中同时检测到野生型和V600E变异(图7)。二者在HT-29细胞沉淀中都未检测到。这可能是由于在此细胞沉淀的样品制备中的问题。

利用实施例1中所述的方案，在一系列的原发性或转移性黑色素瘤的52个FFPE样品中检测BRAF V600E突变的存在，除了在60℃下进行S1核酸酶反应。使用实施例2的方案制备FFPE样品。所述样品中的4个没有足以产生识别的信号。在48个具有足够信号的样品中的26个(54％)中鉴别出BRAF V600E突变(图8A-B)。这与已发表的黑色素瘤中BRAF突变的频率一致(Davies et al.,Nature417:949-954,2002)。

考虑到本公开内容的原理所适用的许多可能实施方案，应当意识到，所举例说明的实施方案仅为实例，而不应当视为对本发明范围的限制。本发明的范围由以下权利要求确定。因此，本发明人要求保护落入这些权利要求范围和本质之内的所有发明。

Claims (36)

1.一种检测样品中靶核酸中的核苷酸变异的存在的方法，包括：

使所述样品与至少两种与包含核苷酸变异的靶核酸分子互补的探针在足以使第一探针和第二探针与所述靶核酸杂交的条件下接触，产生杂交的核酸分子和未杂交的核酸分子的混合物，

其中所述第一探针在所述靶核酸分子核苷酸变异处与野生型互补，其中所述靶核酸分子核苷酸变异位置距所述第一探针末端至少两个碱基，

其中所述第二探针在所述靶核酸分子核苷酸变异处与第一变异互补，其中所述靶核酸核苷酸变异位置距所述第二探针末端至少两个碱基；

在足以移除未杂交的核酸分子的条件下，使杂交的核酸分子和未杂交的核酸分子的混合物与特异性针对单链核酸分子的核酸酶接触；并且

检测所述混合物中一种或多种探针的存在，从而检测所述样品中核苷酸变异的存在。

2.权利要求1的方法，其中所述核苷酸变异位置距离每种探针末端2-6个碱基。

3.权利要求2的方法，其中所述核苷酸变异位置距离每种探针末端3个碱基。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述第一探针和所述第二探针各包含一个可检测标记。

5.权利要求4的方法，其中所述第一探针和所述第二探针是末端标记的。

6.权利要求5的方法，其中：

所述靶核酸分子核苷酸变异位置距离所述第一探针的5’端至少2个碱基，并且所述可检测标记位于所述第一探针的5’端，以及

所述靶核酸分子核苷酸变异位置距离所述第二探针的3’端至少2个碱基，并且所述可检测标记位于所述第二探针的3’端。

7.权利要求5的方法，其中：

所述靶核酸分子核苷酸变异位置距离所述第一探针的3’端至少2个碱基，并且所述可检测标记位于所述第一探针的3’端，以及

所述靶核酸分子核苷酸变异位置距离所述第二探针的5’端至少2个碱基，并且所述可检测标记位于所述第二探针的5’端。

8.权利要求5的方法，其中所述第一探针和所述第二探针均在5’各包含可检测标记。

9.权利要求5的方法，其中所述第一探针和所述第二探针均在3’端包含可检测标记。

10.权利要求4-9中任一项的方法，其中所述可检测标记包括半抗原、荧光分子、酶或放射性同位素。

11.权利要求10的方法，其中所述可检测标记包括生物素。

12.权利要求11的方法，其中检测混合物中一种或多种所述探针的存在包括使所述探针与缀合到辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的亲和素或链霉亲和素接触。

13.权利要求4-10中任一项的方法，其中所述第一探针和所述第二探针包含不同的可检测标记。

14.权利要求4-10中任一项的方法，其中所述第一探针和所述第二探针包含相同的可检测标记。

15.权利要求4-14中任一项的方法，还包括使所述样品与第三探针在足以使所述第三探针与所述靶核酸杂交的条件下接触，所述第三探针与靶核酸分子核苷酸变异处的第二变异互补且所述第三探针末端包含可检测标记，其中所述靶核酸核苷酸变异位置距离所述第三探针的经标记末端至少2个碱基。

16.权利要求15的方法，还包括使所述样品与第四探针在足以使所述第四探针与所述靶核酸杂交的条件下接触，所述第四探针与靶核酸分子核苷酸变异处的第三变异互补且所述第四探针末端包含可检测标记，其中所述靶核酸核苷酸变异位置距离所述第四探针的经标记末端至少2个碱基。

17.权利要求1-16任一项的方法，其中所述足以使至少两种探针与靶核酸杂交的条件包括将所述至少两种探针与所述样品在约50℃下孵育约16小时。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述至少两种探针均包含18-75个核苷酸。

19.权利要求18的方法，其中所述至少两种探针均具有约50℃-约70℃的解链温度(T_m)。

20.权利要求19的方法，其中所述至少两种探针均具有约60℃的解链温度(T_m)。

21.权利要求18-20中任一项的方法，其中所述至少两种探针均包含20-41个核苷酸。

22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述探针中的至少一种包含一个或多个经修饰的核苷酸。

23.权利要求22的方法，其中所述一种或多种经修饰的核苷酸包括锁核酸、肽核酸、非天然核苷酸，或其中两种或多种的组合。

24.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述特异性针对单链核酸分子的核酸酶包括S1核酸酶。

25.权利要求24的方法，其中所述足以移除未杂交的核酸分子的条件包括将杂交的核酸分子和未杂交的核酸分子的混合物与S1核酸酶在约60℃下接触约2小时，或在约50℃下接触约1小时。

26.权利要求1-3或17-25中任一项的方法，其中检测所述混合物中检测一种或多种所述探针的存在包括测序、核酸扩增或质谱。

27.权利要求4-25中任一项的方法，其中检测所述混合物中一种或多种所述探针的存在包括毛细管电泳。

28.权利要求4-25中任一项的方法，其中检测所述混合物中一种或多种所述探针的存在包括：

使所述混合物与包括多个空间上分离的区域的表面接触，每个区域包括至少一个与双功能接头相连的锚，所述双功能接头包括特异性结合所述锚的第一部分以及特异性结合所述探针之一的第二部分，接触条件为足以使所述探针特异性结合至所述双功能接头的第二部分的条件；以及

检测所述可检测标记的存在。

29.权利要求4-25中任一项的方法，其中检测所述混合物中一种或多种探针的存在包括：

使所述混合物与包括表面亚组的表面组接触，其中每个表面亚组包括至少一个双功能接头连接的锚，所述双功能接头包括特异性结合所述锚的第一部分以及特异性结合所述探针之一的第二部分，接触条件为足以使所述探针特异性结合至所述双功能接头的第二部分的条件；以及

检测所述可检测标记的存在。

30.权利要求29的方法，其中所述表面组包括一组小珠或微流体通道。

31.权利要求30的方法，其中所述表面组包括：

第一表面，其包括与所述第一表面稳定连接的基本上相似的第一锚，以及第二表面，其包括与所述第二表面相连的基本上相似的第二锚；其中所述第一锚和所述第二锚彼此基本上不同；

第一双功能接头，其具有与所述第一锚互补的第一部分和与所述第一探针互补的第二部分；以及

第二双功能接头，其具有与所述第二锚互补的第一部分和与所述第二探针互补的第二部分。

32.权利要求28-31中任一项的方法，其中所述锚包括特异性结合所述双功能接头的第一区域以及包括间隔分子的第二区域。

33.权利要求32的方法，其中所述包括间隔分子的第二区域位于所述第一区域和所述表面之间。

34.权利要求1-33中任一项的方法，还包括裂解所述样品。

35.权利要求1-34中任一项的方法，其中所述样品包括组织、固定的组织、肿瘤活检物、细胞、血液、体液或分离的核酸。

36.权利要求35的方法，其中所述分离的核酸包括RNA或mRNA。