CN109996890A - 电化学dna检测 - Google Patents

Abstract

公开了电化学DNA检测方法，其包括以下步骤i)用至少一个扩增引物扩增靶DNA，其中所述至少一个扩增引物通过其5′末端与标记化学地连接；ii)使扩增产物变性以产生两个单链DNA(ssDNA)分子，其中至少一个是5′标记的；iii)将所述扩增产物的5′标记的ssDNA分子与互补寡核苷酸捕获探针杂交，所述互补寡核苷酸捕获探针通过其3′末端附接至电极；以及iv)确定与杂交产物相关联的标记的存在；其中与所述互补寡核苷酸捕获探针杂交的ssDNA分子内5′末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离由0‑280个核苷酸组成。还公开了盒装置、操作装置、控制操作装置的方法以及实施所述方法的计算机程序，其适合于执行这些步骤。

Description

电化学DNA检测

技术领域

本公开涉及电化学DNA检测方法。进一步地，本公开涉及盒装置、操作装置、控制操作装置的方法以及实施这些方法的计算机程序，所述装置、方法和程序适合于执行上述电化学DNA检测方法。

背景技术

最近，微阵列技术已开发以促进大规模核酸分析，使得能够同时分析数千个DNA序列(参见例如美国专利号5,445,93或WO2007017699A2)。术语微阵列旨在表示对许多小斑点的分析。它通常在固体支持物上进行，且也可以小规模进行。微阵列技术已成功应用于多个领域，例如人乳头瘤病毒(HPV)诊断中(参见专利公开WO0168915和专利公开号CA2484681)。

然而，使用微阵列技术仍然存在缺点，因为需要昂贵的设备和费力的操作。例如，CombiMatrix微阵列和ElectraSense微阵列是具有12,544个电极的互补金属氧化物半导体(CMOS)芯片，所述12,544个电极可以单独寻址或在用户定义的组中寻址(参见US 20110281766A1)。这些阵列可作为定制DNA芯片可商购，其具有在每个电极处使用顺序电化学反应以添加亚磷酰胺而产生的不同核酸探针序列。可以在CombiMatrix的微阵列读数器上使用花青素(Cy)染料和荧光扫描仪检测仪，或者备选地，使用辣根过氧化物酶(HRP)和酶增强电化学检测(ECD)检测探针的杂交。CombiMatrix微阵列支持用户定义的DNA探针的原位电化学合成。CombiMatrix微阵列最初被开发为高度多路复用的电化学平台。原始互补金属氧化物(CMOS)微阵列具有1,000个铂(Pt)电极(1K微阵列)，并且其用于开发在各个电极上的不同DNA探针的原位电化学合成。使用酶增强电化学检测(ECD)(Dill,K.；Montgomery,D.D.；Ghindilis,A.L；Schwarzkopf,K.R.Immunoassays and sequence-specific DNA detection on a microchip using enzyme amplified electrochemicaldetection.J Biochem.Biophys.Methods 2004,59,181-187)来检测与这些探针的杂交。12K微阵列作为定制基因芯片可商购，所述定制基因芯片已用于多种基因组测定(例如基因分型、基因表达、SNP分析等)。

MICHAEL J.LODES等，“Identification of Upper Respiratory TractPathogens using electrochemical detection on an oligonucleotide microarray”，PLOS ONE，第2卷，第9期，2007年9月26日，第e924页，公开了电化学DNA检测方法，所述方法包括以下步骤：(i)用一对扩增引物扩增靶DNA，其中所述引物中的至少一个通过其5'末端与标记化学地连接；(ii)将扩增产物的5'标记的ssDNA分子与至少一个互补寡核苷酸捕获探针杂交。捕获探针使用Combimatrix在阵列上合成；(iii)确定与杂交产物相关联的标记的存在。

在即时诊断(point-of-care diagnosis)领域，需要便携式设备，并且它还必须具有稳健、灵敏、易于操作的系统，但不损害诊断的可靠性。

发明内容

本发明提供了用于DNA的电化学检测的改进方法。本发明人开发了用于电化学DNA检测的稳健、灵敏且可靠的方法，所述方法包括扩增、与探针杂交和电化学检测。发明人已经出人意料地发现，其中探针通过其3'末端附接至电极上，并且有待与探针杂交的分子内5'末端和杂交区的第一个核苷酸之间的距离由0至300个核苷酸组成，优选0至280，更优选0至270，更优选0至265、0至240、0至200、10至200、0至150、25至150、0至120、30至120、0至110(36、61、83、109)、0至90、50至90(50、51、52、53、54、55、56、57、59、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90)，提供了高灵敏度的用于电化学检测DNA的方法，其允许检测以低浓度存在的DNA。

第一方面，本发明涉及电化学DNA检测方法，所述方法包括以下步骤：

i)用至少一个扩增引物扩增靶DNA，其中所述至少一个扩增引物通过其5'末端与标记化学地连接；

ii)使扩增产物变性以产生两个单链DNA(ssDNA)分子，其中至少一个是5'标记的；

iii)将扩增产物的5'标记的ssDNA分子与互补寡核苷酸捕获探针杂交，所述互补寡核苷酸捕获探针通过其3'末端附接至电极；以及

iv)确定与杂交产物相关的标记的存在，其中与互补寡核苷酸捕获探针杂交的ssDNA分子内5'末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离由0-280个核苷酸组成。

发明人出人意料地发现，当与现有技术方法相比时，本方法提供了信号检测的显著增加，导致DNA检测的灵敏度和特异性改善。

本发明另外提供改进的盒装置、操作装置、控制操作装置的方法以及实施这些方法的计算机程序，所述装置、方法和程序适合于执行上述电化学DNA检测方法。

为了执行本发明的方法，需要适当的装置。因此，本发明的第二方面涉及用于如上定义的电化学DNA检测的装置的用途，其中所述装置包含：

i)至少一个用于扩增靶DNA的引物，其中所述至少一个用于扩增靶DNA的引物通过其5'末端与标记化学地连接；

ii)与靶DNA序列互补的寡核苷酸捕获探针，其中所述寡核苷酸捕获探针通过其3'末端附接至电极；和

iii)检测所述标记的装置；

其中当使用时，与寡核苷酸捕获探针杂交的ssDNA分子内5'末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离由0-280个核苷酸组成。

执行本发明的方法的装置可以包括在盒装置中。因此，本发明的第三方面涉及用于电化学检测的盒装置，所述盒装置包括微流体回路，所述微流体回路包含：

微流体扩增室，其是可操作的以引起用至少一个扩增引物扩增靶DNA的扩增并引起扩增产物的变性以产生两个其中至少一个是5'标记的单链DNA(ssDNA)分子，其中所述至少一个扩增引物通过其5'末端与标记化学地连接；和

微流体传感器室，其包含一个或更多个电极和一个或更多个通过它们的3'末端附接至所述一个或更多个电极的互补寡核苷酸捕获探针，并且是可操作的以引起所述扩增产物的至少一个5'标记的ssDNA分子与所述一个或更多个互补寡核苷酸捕获探针的杂交，一旦杂交，与所述互补寡核苷酸捕获探针杂交的ssDNA分子内5'末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离为0-280个核苷酸；其中，

所述微流体传感器室进一步是可操作的以引起与杂交产物相关联的标记的存在的确定。

检测一个或更多个特定靶DNA所需的全部或部分装置(试剂、电极、捕获探针、引物等)可预先加载到盒上。也就是说，在一些实施方案中，盒包括以下中的一个、一些或全部：试剂、电极、捕获探针和至少一个引物。例如，全部或部分流体/液体装置可以预装在相应的容器、泡罩等中。

微流体传感器室可以包含电极阵列(即多于一个电极)，其上附接有不同的互补寡核苷酸捕获探针。在这方面可以有不同的配置。例如，取决于要执行的检测，不同的电极可以具有与其附接的不同的探针和/或相同的探针，和/或相同的电极可以具有与其附接的多于一个的探针等。在本发明的一些优选实施方案中，相同的电极可以包含与其附接的1至10个，优选1至5个不同的寡核苷酸捕获探针，更优选地，相同的电极包含与其附接的一个捕获探针。在这些实施方案的一些中，微流体传感器室的电极阵列中的每个电极可以包含与其附接的1至10个，优选1至5个不同寡核苷酸捕获探针，更优选一个与其附接的捕获探针。

在一些实例中，盒装置可进一步包含用于接收靶DNA的样品入口。

根据一些实施方式(implementations)，盒装置可进一步包含容器，所述容器含有杂交缓冲液并与微流体回路流体连通，使得所述杂交缓冲液可转移至微流体传感器腔室。

盒可以出售以备与操作装置组合使用，使得用户仅需要将含有靶DNA的样品加载到盒上并将其关联(例如插入)到操作装置中以直接获得指示样品中靶DNA存在或不存在，甚至靶DNA的量的结果。也就是说，一旦将含有靶DNA的样品加载到盒上并将盒引入操作装置中，操作装置就可以获得指示靶DNA存在或不存在的结果。整个系统可以包含具有集成电极(阵列)的消耗盒装置和用于操作和读取盒装置的各自的操作装置(或仪器)，操作装置优选地以自动方式操作以便直接将结果提供给用户。这种设备通常一般称为芯片实验室。

本发明的另一方面涉及控制用于操作如上定义的盒装置的操作装置的方法，所述盒装置可与操作装置相关联(例如，可附接、可连接等)。也就是说，当盒装置附接或连接到操作装置(通过用本发明该方面的方法控制操作装置)时，盒装置被操作。如上所述，盒装置可以通过将盒装置插入操作装置、或将盒装置与操作装置连接、或将盒装置与操作装附接，或将盒装置与操作装置接合、或将盒装置加载操作装中来与操作装置相关联。

控制方法，即控制操作装置的方法，包括由操作装置的控制器将控制信号提供给操作装置的第一加热器单元，用于通过提供第一加热循环给微流体扩增室来操作盒装置的微流体扩增室，使得扩增和变性在微流体扩增室中发生。控制方法还包括由控制器将控制信号提供给操作装置的第二加热器单元，用于通过向微流体传感器室提供第二加热循环来操作盒装置的微流体传感器室，使得杂交在微流体传感器室中发生。控制方法还包括由控制器将控制信号提供给操作装置的检测单元，用于操作微流体传感器室，使得确定与杂交产物相关联的标记的存在。

在另一方面，本发明提供了用于操作盒装置的操作装置，该盒装置与操作装置相关联(例如可加载进入，可引入)，其中操作装置包含第一加热器单元、第二加热器单元、检测单元和控制器。控制器可以通过如在本公开的其他部分中更详细地描述的计算装置、电子装置或其组合来实现。

在又一方面，本发明还涉及计算机程序产品，其包含程序指令，用于使操作装置的控制器执行如上所述的控制操作装置以操作盒设备的方法。

本发明的DNA检测方法，执行这种检测的装置、盒装置、操作装置和计算机程序不限于任何特定的DNA。只要存在本发明第一方面中公开的条件，就可以检测任何靶DNA。特别相关的是引物设计(其确定待检测的ssDNA分子内5'末端和杂交区的第一个核苷酸之间的距离为0至300个核苷酸，优选0-280，更多优选0至270，更优选0至265、0至240、0至200、10至200、0至150、25至150、0至120、30至120、0至110(36、61、83、109)、0至90、50至90(50、51、52、53、54、55、56、57、59、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90))以及捕获探针的取向，所述捕获探针通过其3'末端附接至电极上。

其他相关特征与方法配置有关(即5'标记的引物和通过其3'末端附接至电极的捕获探针)。例如，本发明人已经通过在根据本发明的盒装置(结合相应的操作装置)上执行该方法，检测人样品中的人乳头瘤病毒(HPV)，甲型流感H1N1病毒和甲型流感H3N2病毒。所采用的盒装置和检测人HPV、甲型流感H1N1病毒和甲型流感H3N2病毒DNA的条件描述于下面的实施例中。获得的结果表明，当使用本发明的配置时，检测信号的强度出人意料地增加。

虽然可用于检测任何类型的靶DNA，但本发明的方法和装置可用于诊断多种疾病，并且还可用于检测多种微生物，优选病原微生物。因此，本发明的方法和装置在医学领域得到应用，特别是肿瘤学和产前检测、兽医学、微生物学、食品科学和环境科学。此外，就待分析的样品包含核酸而言，可以在所提议的检测方法和装置的背景下进行这种样品的表征。

此外，在本发明的一些实施方案中，检测方法和装置仅包含一个扩增产物(即扩增子)(每个靶DNA或病原微生物)。特别地，在本发明的一些实施方案中，检测方法和装置仅包含一个扩增产物或扩增产物的一个5'标记的ssDNA分子(每个靶DNA或病原微生物)。

另外，本发明的一些实施方案中，相同的电极可包含与其附接的1至10个，优选1至5个不同的寡核苷酸捕获探针(每个靶DNA或病原微生物)。更优选地，相同的电极包含与其附接的一个寡核苷酸捕获探针(每个靶DNA或病原微生物)，以克服病原体基因组中的潜在可变性，并且还提供全异基因座的序列信息。

在一些实施方案中，本发明的检测方法和装置仅包含一个互补寡核苷酸捕获探针(每个扩增产物或扩增产物的5'标记的ssDNA分子)，和一个扩增产物或扩增产物的5'标记的ssDNA分子(每个靶DNA或病原生物)。

为了克服信号强度的变化，具体基因型基于所有病原体特异性探针的平均信号强度确定，所述探针包含每个寡核苷酸捕获探针的2至6个，优选2至3个重复。

在一些实施方案中，检测方法和装置包含一对用于扩增靶DNA的扩增引物。在这些实施方案中，扩增引物中的至少一个通过其5'末端与标记化学地连接。

本发明的另一方面是电化学DNA检测方法，所述方法包括以下步骤：

i)用至少一个扩增引物扩增靶DNA，其中所述至少一个扩增引物通过其5'末端与标记化学地连接；

ii)使扩增产物变性以产生两个单链DNA(ssDNA)分子，其中至少一个是5'标记的；

iii)将扩增产物的5'标记的ssDNA分子与至少一个互补寡核苷酸捕获探针杂交，所述互补寡核苷酸捕获探针通过其3'末端附接至电极；其中所述至少一个互补寡核苷酸捕获探针中的每个包含相同的寡核苷酸序列；以及

iv)确定与杂交产物相关联的标记的存在；

其中与互补寡核苷酸捕获探针杂交的ssDNA分子内5'末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离由0至300个核苷酸组成。

本发明的又一方面涉及用于如上定义的电化学DNA检测的装置的用途，其中所述装置包含：

i)至少一个用于扩增靶DNA的引物，其中所述至少一个扩增引物通过其5'末端与标记化学地连接；

ii)至少一个与所述靶DNA序列互补的寡核苷酸捕获探针，其中所述寡核苷酸捕获探针通过其3′末端附接至电极，并且其中所述至少一个互补寡核苷酸捕获探针中的每个包含相同的寡核苷酸序列；和

iii)检测所述标记的装置；

其中当使用时，与互补寡核苷酸捕获探针杂交的ssDNA分子内5′末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离由0至300个核苷酸组成。

在一些实施方案中，所述装置包含一对扩增引物，所述一对扩增引物包含至少一个引物以扩增靶DNA。

在一些实施方案中，电极仅包含一个互补寡核苷酸捕获探针。

最后，本发明的另一方面涉及用于电化学DNA检测的盒装置，所述盒装置包括微流体回路，所述微流体回路包含：

微流体扩增室，其是可操作的以引起用至少一个扩增引物的靶DNA的扩增并引起扩增产物的变性以产生两个其中至少一个是5′标记的单链DNA(ssDNA)分子，其中所述至少一个扩增引物通过其5'末端与标记化学地连接；和

微流体传感器室，其包含一个或更多个电极和一个或更多个互补的寡核苷酸捕获探针(所述互补的寡核苷酸捕获探针通过它们的3'末端附接至所述一个或更多个电极)，并且是可操作的以引起扩增产物的至少一个5'标记的ssDNA分子与一个或更多个互补寡核苷酸捕获探针中的一个的杂交，其中所述一个或更多个互补寡核苷酸捕获探针中的每个包含相同的寡核苷酸序列，并且一旦杂交，与寡核苷酸捕获探针杂交的ssDNA分子内5′末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离为0至300个核苷酸；其中，

所述微流体传感器室进一步是可操作的以确定与杂交产物相关联的标记的存在。

在一些实施方案中，所述一个或更多个电极仅包含通过其3'末端与其附接的一个互补寡核苷酸捕获探针。

在一些实施方案中，盒装置包含至少一个扩增引物。

在一些实施方案中，盒装置包含一对扩增引物，该对扩增引物包含至少一个扩增引物。鉴于详细描述和附图，本发明的这些和其他优点和特征将变得显而易见。

附图简述

下面将参考附图描述本公开的非限制性实施例，其中：

图1是最接近的现有技术CombiMatrix的电化学检测系统的示意图。TMB是3,3',5,5'-四甲基联苯胺；Red是还原的；Ox是氧化的；SA是链霉抗生物素蛋白；HRP是辣根过氧化物酶。

图2是本发明的示意图。所提供的细节对应于本发明的实施例1的特定条件(距离和DNA修饰)。S 8.5是在其5'末端具有硫醇的探针；S 8.3是在其3'末端具有硫醇的探针；S7.5是在其5'末端具有硫醇的探针；S 7.3是在其3'末端具有硫醇的探针；点●是生物素；方形■是硫醇。

图3是用本发明的不同探针获得的检测信号(以nA表示)的显示的示意图。S 8.5是在其5'末端具有硫醇的探针；S 8.3是在其3'末端具有硫醇的探针；S 7.5是在其5'末端具有硫醇的探针；S 7.3是在其3'末端具有硫醇的探针。

图4是使用本发明的探针在阵列内发生的微观事件的示意图。S 8.5是在其5'末端具有硫醇的探针；S 8.3是在其3'末端具有硫醇的探针；S 7.5是在其5'末端具有硫醇的探针；S 7.3是在其3'末端具有硫醇的探针；点是生物素。

图5a是根据实施例的适于执行类似于其他附图所示的DNA检测方法的盒装置的示意图。

图5b是根据实施例的适用于类似于图5a所示的盒装置的电极微阵列的示意图；

图6示意性地示出了根据实施例的适用于操作类似于图5a所示的盒装置的操作装置；

图7是示意性地示出根据实施例的控制类似于图6所示的操作装置的方法的流程图。

图8表示用于HPV检测的电极阵列的检测信号(以nA表示)，“br”是生物素标记；“ic”是扩增的内部对照；“ec”是内源对照；A是HPV 39；B是HPV 45；C是HPV 16；D是HPV 18；E是HPV 31；F是HPV33；G是HPV 35；H是HPV 51；I是HPV 52；J是HPV 56；K是HPV 58；L是HPV59；M是HPV 66；N是HPV 68。

图9表示用于HPV检测的电极阵列，“br”是生物素标志物；“ic”是内部阳性对照；“ec”是外部阳性对照；A是HPV 39；B是HPV 45；C是HPV 16；D是HPV 18；E是HPV 31；F是HPV33；G是HPV 35；H是HPV 51；I是HPV 52；J是HPV 56；K是HPV 58；L是HPV 59；M是HPV 66；N是HPV 68。A...N是固定化的捕获探针(cpA...N)；c是反电极。上标表示阵列的相应四分之一。

图10表示从对应于甲型流感H1N1病毒的261个核苷酸的扩增片段获得的经标记的ssDNA的电极阵列(其用于通过与特异性探针杂交检测呼吸道病毒)的检测信号(以nA表示)。在与不同探针杂交的ssDNA分子内5’末端和杂交区的第一个核苷酸之间的距离，显示在获得的相应信号的顶部。PV1、PV3和PV4是特异性捕获探针。

图11表示从对应于甲型流感H3N2病毒的261个核苷酸的扩增片段获得的经标记的ssDNA的电极阵列(其用于通过与特异性探针杂交检测呼吸道病毒)的检测信号(以nA表示)。在与不同探针杂交的ssDNA分子内5’末端和杂交区的第一个核苷酸之间的距离，显示在获得的相应信号的顶部。PV2、PV3和PV5是特异性捕获探针。

图12是与下文实施例3和4的不同探针杂交的ssDNA分子内5’末端和杂交区的第一个核苷酸之间的距离的示意图。

发明详述

除非另有说明，否则本申请中使用的所有术语应以其本领域已知的普通含义理解。本申请中使用的某些术语的其他更具体的定义如下所述，并且旨在统一地应用于整个说明书和权利要求中，除非另有明确规定的定义提供了更宽泛的定义。包括本文给出的定义是为了理解的目的，并且预期在整个说明书，权利要求和附图中应用。

本发明的方法用于靶DNA的电化学检测。在本发明中，“靶DNA”是指任何易于被检测的核酸分子、DNA或RNA。靶DNA优选为DNA。当靶DNA是RNA时，扩增步骤之前是逆转录酶事件；例如RNA通过rtPCR扩增。可以进行本领域技术人员从现有技术中已知的任何RNA扩增方法。靶DNA可以是任何长度。它可以是基因、基因片段、非编码序列、多态性、cDNA、微小RNA、突变、点突变、缺失、插入。靶DNA可以是纯化的或存在于组织中，例如宫颈涂片，因此，靶DNA可以包含在样品中。样品可以从任何受试者获得。在优选的实施方案中，靶DNA是来自病毒、细菌或哺乳动物例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猫、牛、马、山羊、绵羊、灵长类动物或人的核酸，优选人的核酸。受试者可以是任何年龄、性别或种族。

在本发明第一方面的优选实施方案中，来自微生物的靶DNA选自由以下组成的组：人乳头瘤病毒，包括高风险(16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 68)、低风险(6 11 40 42 43 44 54 61 62 70 71 72 81 83 84 85 89)和未确定的风险基因型：34、64、67、69 74、86、87、97、101、102、103、106、150、151；呼吸道感染的病毒肇因，例如：腺病毒；博卡病毒；冠状病毒229E；肠道病毒；甲型流感病毒(H7N9、H3N2、H1N1和H1N1/2009)、乙型流感病毒、丙型流感病毒；偏肺病毒(Metapneumovirus)(亚型A和B)；副流感病毒1、2、3和4(亚型A和B)；鼻病毒；呼吸道合胞病毒A型(RSV-A)和呼吸道合胞病毒B型(RSA-B)、冠状病毒OC43、冠状病毒NL63和甲型流感H7N9；人类疱疹病毒，包括单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、水痘带状疱疹病毒3、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr Virus)、巨细胞病毒(Citomegalovirus)、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、人疱疹病毒8；肠道病毒，包括柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒和埃可病毒(Echovirus)；引起败血症的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌和真菌，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、溶血性葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)/停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、缓症链球菌(Streptococcusmitis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、血链球菌(Streptococcussanguinis)/副血链球菌(Streptococcus parasanguinis)、米勒链球菌(Streptococcusmilleri)(包括星座链球菌(S.constellatus)和咽峡炎链球菌(S.anginosus)、链球菌属物种(Streptococcus spp)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、革兰氏阳性球菌(Gram positive cocci、CGP)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、克雷伯菌属物种(Klebsiella spp.)、肠沙门氏菌(Salmonellaenterica)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、肠杆菌属物种(Enterobacter spp.)(阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产气肠杆菌(E.aerogenes))、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、柠檬酸杆菌属物种(Citrobacter spp.)(弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、C.koserii)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)/Serratia plimutica、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)/彭氏变形杆菌(Proteus penneri)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、变形杆菌属物种(Proteus spp.)(普通变形杆菌(P.vulgaris)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、彭氏变形杆菌(P.penneri))、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、嗜血杆菌属物种(Haemophilusspp.)(流感嗜血杆菌(H.influenzae)、副流感嗜血杆菌(H.parainfluenzae))、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、拟杆菌属物种(Bacteroides spp.)(脆弱拟杆菌(B.fragilis)、B.faecis)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)(铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、恶臭假单胞菌(P.putida)、P.stuartii)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、白色假丝酵母(Candida albicans)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、克鲁斯假丝酵母(Candidakrusei)、假丝酵母属物种(Candida spp.)、真菌类群；检测产生内毒素并引起腹泻的细菌、如沙门氏菌属物种(Salmonella spp.)、志贺氏菌属物种(Shigella spp.)、痢疾杆菌(S.dysenteriae)、宋内志贺菌(S.Sonnei)、鲍氏志贺菌(S.boydii)和弗氏志贺菌(S.flexneri)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、耶尔森氏菌属物种(Yersinia spp.)(鼠疫杆菌(Y.pestis)、假结核耶尔森菌(Y.pseudotuberculosis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica))、弯曲杆菌属物种(Campylobacter spp.)(红嘴鸥弯曲杆菌(C.lari)、海欧弯曲杆菌(C.laridis)、乌普萨拉弯曲杆菌(C.upsaliensis)、空肠弯曲杆菌(C.jejuni)、结肠弯曲杆菌(C.coli))、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、大肠杆菌肠致病性EPEC：(肠出血性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、产肠毒素性大肠杆菌和肠致病性大肠杆菌)、艰难梭菌B(Clostridiumdifficile B)、气单胞菌属物种(Aeromonas spp)、aerolisin的生产者；引起泌尿生殖道性传播感染(STIs)的细菌、真菌和寄生虫的检测和分型，如沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、生殖道支原体(Mycoplasmagenitalium)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、解脲支原体(Ureaplasmaurealyticum)/Ureaplasma parvum、人型支原体(Mycoplasma hominis)、假丝酵母属(Candida)(白色假丝酵母(C.albicans)、光滑假丝酵母(C.glabrata)、C.parapsilosis、克鲁斯假丝酵母(C.krusei)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、高里假丝酵母(C.guilliermondii)、杜氏假丝酵母(C.dubliniensis))、梅毒螺旋体(Treponemapallidum)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、I型和II型疱疹病毒；检测引起呼吸道感染的多种细菌，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、嗜血杆菌属物种(Haemophilus spp)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)、百日咳博代氏杆菌(Bordetella pertussis)、Bordetella parapertusis、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、霍氏博德特菌(Bordetellaholmesii)、博德特菌属物种(Bordetella spp.)。在具体实施方案中，本发明的方法用于对人乳头瘤病毒进行检测和/或分型。

在本发明第一方面的另一个优选实施方案中，靶DNA是基因或基因片段，其可具有与癌症患者的治疗应答相关的突变。一些例子包括(i)与结肠直肠癌相关的表皮生长因子受体(EGFR)途径的基因中的点突变，诸如KRAS基因(例如：G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13D、Q61H、Q61L、Q61H(183A>C)、K117N(351A>C)、K117N(351A>T)、A146V、A146T)、BRAF基因(例如:V600E、V600K)、PI3K基因(E542K、E545D、E545K、H1047R)、NRAS基因(G12D、Q61H(183A>T)、Q61R、Q61K、Q61L)中的点突变；(ii)EGFR基因中的点突变、缺失和插入(点突变G719A(c.2156G>C)、G719C(c.2155G>T)、G719S(c.2155G>A)、S768I(c.2303G>T)、T790M(c.2369C>T)、L858R(c.2573T>G)、L861Q(c.2582T>A)；缺失6223*E746_A750del(c.2235_2249del 15)、12370*L747_P753>S(c.2240_2257del18)、12369*L747_T751del(c.2240_2254del15)、6255*L747_S752del(c.2239_2256del18)、12384*E746_S752>V(c.2237_2255>T)、12382*E747_A750>P(c.2239_2248TTAAGAGAAG>C)、6225*、12678*、6218*、12728*、6220*、12419*、6210*、13556*、12386*、12385*、18427*、12403*、12383*、6254*、13551*、12367*、12422*、12387*、26038*、13552*、12416*、23571*；插入H773_V774insH(c.2319_2320insCAC)、D770_N771insG(c.2310_2311insGGT)、V769_D770insASV(c.2307_2308ins9GCCAGCGTG)、V769_D770insASV(c.2309_2310AC>CCAGCGTGGAT)、D770_N771insSVD(c.2311_2312ins9GCGTGGACA))，其已被发现与非小细胞肺癌患者的治疗应答相关；(iii)BRAF基因中的点突变V600E和V600K；MEK1基因中的l111S、P124S和E203K；和AKT1基因中的Q79K，其已被发现与黑色素瘤患者的治疗应答相关。

本发明的方法可用于检测任何上述靶和诊断与任何上述定义的靶DNA相关的疾病或病况。因此，本发明提供了用于检测任何上述定义的靶的方法，以及用于诊断与任何上述定义的靶相关的疾病或病况的方法，所述方法包括实施本发明的方法。在一些实施方案中，疾病是癌症。在优选的实施方案中，癌症是宫颈癌。在其他实施方案中，靶是与癌症患者治疗的应答相关的基因中的突变。因此，本文描述的装置也可用于癌症患者的预后和对治疗的应答。

本发明方法的步骤(i)包括扩增靶DNA。因此，提供含有靶DNA的样品。应注意，样品可包含DNA或由DNA组成。在某些情况下可以推荐预先纯化DNA。在本发明第一方面的优选实施方案中，在步骤(i)中，至少一个扩增引物通过其5'末端与可检测标记化学地连接。如本文所用，术语“标记”是指直接或间接可检测的化合物或组合物，其与引物化学地连接以产生“标记的”引物。标记自身可以被检测到，或者，标记可以包括可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变的活性位点，或者备选地，标记可以被标记结合分子识别和结合，所述标记结合分子包含可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变的活性位点。在一些实施方案中，催化活性位点是酶部分。在本发明的意义上，化学改变是底物的氧化或还原，酶部分是氧化还原酶。在这种情况下，氧化还原酶也称为“转移介质”。因此，转移介质催化底物的氧化或还原，其随后在电极处产生可检测的电压或电流信号。与本发明方法相容的非限制性转移介质或(酶部分)是过氧化物酶，特别是辣根过氧化物酶(HRP)、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶以及其他酶或类似物或其组合。

标记可适用于小规模检测，但优选适用于高通量筛选。标记与引物的连接可以直接进行或通过接头分子进行。术语“接头”或“接头分子”是指将标记与引物连接的任何化学实体。“接头”包括添加到核苷酸主链(在这种情况下，引物序列)上的任何修饰基团，以提供用于连接标记或化合物的反应性基团，所述标记物或化合物包含允许核苷酸序列和标记两者连接的反应性基团。在后一种情况下，“接头”也可以称为“间隔物”。标记优选与引物共价连接。这个“接头”的定义也适用于互补寡核苷酸捕获探针与电极的连接或附接，因为所述附接可以在捕获探针和电极之间直接或通过接头完成。用于对DNA进行标记的方法以及适于通过电化学装置检测DNA的标记是本领域技术人员已知的。

本发明第一方面的步骤(i)中的扩增反应在靶DNA通过至少一个相应的特异性扩增引物扩增所必需的条件下进行。技术人员能够设计合适的引物以扩增给定的靶序列。然而，为了获得改善的灵敏度，技术人员必须注意扩增的DNA分子的5'末端与同一扩增的DNA分子内的杂交区的第一个核苷酸之间的距离由0至300个核苷酸组成，优选0至280，更优选0至270，更优选0至265、0至240、0至200、10至200、0至150、25至150、0至120、30至120、0至110(36、61、83、109)、0至90、50至90(50、51、52、53、54、55、56、57、59、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90)。给定特定靶DNA序列的扩增条件的设计是本领域技术人员可以理解的，或者可以在现有技术中找到。用于扩增核酸的方法在现有技术中是公知的。聚合酶链式反应(PCR)及其变体，例如逆转录PCR(RT-PCR)，是最常见的扩增技术。在本发明的优选实施方案中，扩增通过PCR进行。

本发明第一方面的步骤(iii)中的杂交在针对每个ssDNA及其互补寡核苷酸捕获探针的特定条件下进行。

本文中的术语“杂交”是指两个单链多核苷酸(变性的ssDNA和互补寡核苷酸捕获探针)非共价结合形成稳定的双链多核苷酸的过程(三链杂交在理论上也是可能的)。所得(通常)双链多核苷酸是“杂合体”。用于进行多核苷酸杂交测定的方法在本领域中已得到很好的发展。杂交测定方法和条件将根据应用而变化，并根据本领域已知的一般结合方法选择。应理解，两个单链多核苷酸杂交的能力将取决于诸如它们的互补程度以及杂交反应条件的严格性等因素。

如本文所用，“严格性”是指影响多核苷酸杂交程度的杂交反应的条件。严格条件可以选择允许多核苷酸双链体基于其错配程度区分的条件。高严格性与形成含有错配碱基的双链体的可能性较低相关。因此，严格性越高，能够形成错配双链体的两个单链多核苷酸将保持单链的可能性越大。相反，在较低的严格性下，形成错配双链体的可能性增加。调节杂交反应严格性的手段是本领域技术人员所熟知的。

本发明中的“杂交区”是指扩增的变性的ssDNA内的寡核苷酸，其形成所述变性的ssDNA和互补寡核苷酸捕获探针之间的杂交体。

本发明中的探针是与变性ssDNA的区域互补的寡核苷酸。在本发明意义上的互补寡核苷酸捕获探针是与靶DNA基本上互补的寡核苷酸，特别是与变性的ssDNA的区域互补的寡核苷酸。通过“基本上”互补，应理解捕获探针与靶序列内的杂交区域至少90％互补，优选至少95％互补，例如与杂交区域96％、97％、98％、99％或100％互补。技术人员能够设计与给定靶序列杂交的合适的捕获探针。

互补寡核苷酸捕获探针可以设计以允许检测任何靶DNA序列。例如，捕获探针可以允许检测点突变和单核苷酸多态性，或检测可变大小的DNA序列，例如40至1500个核苷酸，优选或特别是50至500个核苷酸。优选地，互补捕获探针具有包含在35℃至80℃范围内的解链温度。

在具体实施方案中，寡核苷酸捕获探针用于人HPV的检测和/或分型。因此，捕获探针与人HPV中包含的序列互补。用于检测不同人HPV类型的捕获探针是本领域已知的，并且已经公开在例如WO2007017699中。用于扩增包含在HPV类型中的靶序列的引物可能在WO2007017699中公开。

术语“电极”定义为在电化学分析期间保持稳定的导电物质或组分。电极材料的实例包括固体金属、金属浆料、导电碳、导电碳浆料和导电聚合物。可以使电极的表面官能化以促进寡核苷酸捕获探针附接于其上。备选地，电极可以被聚合物覆盖，该聚合物还有助于寡核苷酸捕获探针的附接或使非特异性反应或背景信号最小化。对于本发明的方法，电极优选包含Au、Pt、Ag、Ag/Cl或C。附接至少一个探针的电极称为工作电极。本发明的方法可能需要存在另外的电极，即至少一个参比电极和至少一个反电极。在特定实施方案中，工作电极包含金或碳，优选Au，反电极包含金或碳，优选碳，且参比电极包含Ag/AgCl。在特别优选的实施方案中，工作电极包含金，反电极包含金，且参比电极包含Ag/AgCl。电极可包括具有不同组成的层。例如，电极可包括面向基底的钛底层和面向测量单元的金顶层，探针附接至所述电极。Ti是基底和Au之间的良好粘合剂，而Au被发现适合于探针附接。电极可以包含在阵列或微阵列中。在本发明中，术语“阵列”、“微阵列”、“DNA阵列”、“阵列芯片”、“DNA阵列芯片”、“生物芯片”或“芯片”和“微阵列平台”可互换使用。它们指的是布置在共用基底上的大量探针的集合，所述共用基底可以是塑料表面、硅晶片、尼龙带或载玻片的一部分。微阵列优选包含附接至若干个电极上的若干个捕获探针。每个电极可包含至少一个捕获探针，用于检测一个靶DNA(即与一个靶DNA杂交)。备选地，一个电极可包含检测相同的靶DNA的多于一个，例如，两个、三个或四个不同的捕获探针。在优选实施方案中，相同的电极可以包含与其附接的1至10个，优选1至5个不同的捕获探针，更优选地，相同的电极可包含与其附接的一个捕获探针。进一步地，在一些实施方案中，相同的电极可以包含与其附接的1至10个，优选1至5个捕获探针，其包含相同的寡核苷酸序列，更优选地，相同的电极可以包含与其附接的一个捕获探针。在本发明的情况下，共用基底优选是盒。

捕获探针通过其3'末端附接至包含电极的阵列的基底上。探针通过其3'末端对阵列平台(优选对电极)的附接，可以通过接头进行(术语“接头”已在上面定义)。将寡核苷酸捕获探针附接或结合至固体支持物，特别是用于电化学检测的电极方法是本领域已知的(Sensors 2014,vol.14,p.22208-22229)。例如，硫醇-金属相互作用经常用于生物分子在金表面上的共价结合。硫醇基团表现出对贵金属表面的强亲和力，这允许在硫和金原子之间形成共价键。基于该原理(化学吸附)，已经使用硫醇修饰的DNA探针开发了DNA阵列。在特定的实施方案中，捕获探针在其3'末端被硫醇官能化，并通过化学吸附附接于电极(特别是金电极)。

具体的互补寡核苷酸探针可以通过孵育的手段，通过在电极表面上直接合成或通过喷墨沉积来固定或附接。

本发明第一方面的方法的步骤(iv)包括确定与杂交产物相关联的标记的存在。在特定实施方案中，该确定包括：

a)向杂交产物中加入标记结合分子以形成复合物，其中所述标记结合分子与酶部分化学地连接，b)向步骤(a)产生的复合物中加入在酶部分存在下经历氧化或还原的底物；以及

c)确定底物的氧化或还原。

术语“标记”已在上面定义。术语“标记结合分子”是指具有高亲和力并通过化学键与标记结合从而形成复合物的分子。在本发明方法的特定实施方案中，标记是半抗原或抗原。半抗原是小分子，如果它们首先与大载体(例如蛋白质)偶联形成免疫原，则在某些情况下可被诱导引发免疫应答。半抗原，作为抗原，因为它们具有强结合特性而在生物测定中采用。已经开发用于分析程序的半抗原包括生物素、地高辛、荧光素、达马烷(damatane)和咔唑。与半抗原-结合剂组合的半抗原可用于检测特定的分子靶，例如核酸探针。标记结合分子是分子，诸如蛋白质(包括抗体)，其具有强亲和力并结合标记以形成复合物。在本发明的特定实施方案中，标记优选为生物素或地高辛，并且标记结合分子是半抗原-结合剂，优选选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或其任何类似物，和抗体(例如抗地高辛抗体或抗生物素抗体)。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在优选的实施方案中，标记是生物素，且标记结合分子是链霉抗生物素蛋白。

酶部分(或转移介质)优选是进行氧化还原反应的氧化还原酶。术语“氧化”意味着失去电子以氧化。术语“还原”意味着获得电子以还原。术语“氧化还原反应”是指涉及氧化和还原的任何化学反应。在特定的实施方案中，酶促部分是辣根过氧化物酶(HRP)或酸性磷酸酶，优选是HRP，更优选是polyHRP。在优选的实施方案中，标记是生物素，且标记结合分子是与HRP连接更优选与polyHRP连接的链霉抗生物素蛋白。

在本发明的意义上，术语底物是指在酶部分存在下被氧化或还原的化合物或化合物组。在特定的实施方案中，底物是电子供体底物。合适的电子供体底物选自3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、过氧化物、儿茶酚(cathechol)、OPD(邻苯二胺)、氨基酚或芳族多胺。在特定的实施方案中，底物是TMB。在另一个特定的实施方案中，底物是TMB，且酶部分是HPR，优选polyHRP。

在本发明的优选实施方案中，5'标记是生物素，标记结合分子选自链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白(优选链霉抗生物素蛋白，酶部分是HRP(优选polyHRP)，且底物是TMB。

在一些实施方案中，确定底物的氧化或还原的步骤包括感测由底物的氧化或还原产生的电压或电流信号的存在或不存在。感测步骤通常包括使用参考电压或电流信号来确定由底物的氧化/还原产生的电压或电流信号，其中电压或电流信号的存在指示靶DNA的存在。在反电极和工作电极之间施加恒定电位(电压)，它们之间的电流是测量的值。由于其在电势序中的限定电位，参比电极对于控制施加的电位是必要的。通常通过恒电位仪或多恒电位仪的装置检测信号。

在本发明第一方面的特定的实施方案中，待测定的ssDNA分子内5'末端和杂交区的第一个核苷酸之间的距离由0-280，更优选0至270，更优选0至265、0至240、0至200、10至200、0至150、25至150、0至120、30至120、0至110(36、61、83、109)、0至90、50至90(50、51、52、53、54、55、56、57、59、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90)组成。

本发明的第二方面涉及用于如上定义的电化学DNA检测的装置的用途，其中所述装置包含：i)至少一个用于扩增靶DNA的引物，其中至少一个用于扩增靶DNA的引物通过其5'末端与标记化学地连接；ii)与靶DNA序列互补的寡核苷酸捕获探针，其中所述寡核苷酸捕获探针通过其3'末端附接至电极；和iii)检测所述标记的装置；其中当使用时，与寡核苷酸捕获探针杂交的ssDNA分子内5'末端和杂交区的第一个核苷酸之间的距离由0-280个核苷酸组成。

上述装置，特别是引物，允许产生扩增产物，其中待测定的ssDNA分子内5'末端和杂交区的第一个核苷酸之间的距离由0至300个核苷酸组成，优选0至280、更优选0至270、更优选0至265、0至240、0至200、10至200、0至150、25至150、0至120、30至120、0至110(36、61、83、109)、0至90、50至90(50、51、52、53、54、55、56、57、59、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90)。

所述装置可包含与靶DNA序列互补的多于一个的寡核苷酸捕获探针和多于一个电极。在特定的实施方案中，该装置包括两个或更多个不同的捕获探针，每个捕获探针附接至不同的(工作)电极。在另一个实施方案中，将与相同靶序列互补的多于一个不同的捕获探针附接至相同电极。在优选的实施方案中，所述装置包含与附接至相同电极的相同靶序列互补1至10个，优选1至5个不同的捕获探针，更优选与附接至相同电极的靶序列互补的一个捕获探针。电极的数量是可变的，并且可取决于待测定的靶DNA的数量。在一些实施方案中，该装置包含1至150个，特别是10至100个电极，优选30至80个电极，例如64个电极。

在特定实施方案中，检测标记的装置(iii)包含：

a)标记结合分子，其中所述标记结合分子与酶部分化学地连接；和

b)在酶部分存在下经历氧化或还原的底物。

引物、捕获探针、电极和其他装置(标记、酶部分、底物)如上文更详细地描述。其他装置诸如缓冲液和洗涤溶液也可用于实施本发明的方法。该装置优选地包含在盒中。下面描述与本发明的盒的设计有关的进一步的实施方案。

图5a是根据实施例的盒装置500的示意图，其适用于执行与本公开的其他部分中描述类似的电化学DNA检测方法。

盒装置500可包含用于输入待处理样品的样品入口501和微流体回路。样品可包含DNA或由DNA组成。样品入口501可包含例如短的Luer界面，其底部具有锥形，用于移液管尖端或毛细管密封结构。这样，输入的样品可以适当地提供给微流体回路。

微流体回路可包含通过微管与样品入口501流体连通的样品计量(微流体)环502，以及通过微管与样品计量环502流体连通的样品计量(微流体)室503。

样品计量环502可以配置成含有例如约40μl的最大流体体积，其中加载标志物520为约20μl。样品计量室503可以配置成含有例如约12.5μl的最大流体体积。

样品计量环502和样品计量室503之间的通过微管的流体连通可以通过回转阀509来调节，回转阀509可以以这样的方式操作：当需要时(例如，如下面参考图7的方法所解释的)样品计量室503可以从样品计量环502接收样品。

盒500还可包含含有扩增缓冲液(优选PCR缓冲液)的容器(例如泡罩)513，含有第一洗涤缓冲液的容器(例如泡罩)514，含有触发剂的容器(例如泡罩)515，含有缀合物的容器(例如泡罩)516，含有第二洗涤缓冲液的容器(例如泡罩)517，和含有杂交缓冲液的容器(例如泡罩)518。任何泡罩可以配置成在适当地按压时将其内容物提供给微流体回路。

微流体回路可以进一步包含通过微管与含有扩增(或PCR)缓冲液的泡罩513流体连通的PCR缓冲计量(微流体)室504。所述流体连通可以通过回转阀509来调节，所述回转阀509可以以这样的方式操作：在需要时PCR缓冲计量室504可以接收泡罩513的内容物。PCR缓冲液计量室504可以配置成含有例如约37.5μl的流体体积。

(盒500的)微流体回路还可以进一步包含样品和PCR缓冲液混合(微流体)通道505，其通过微管与样品计量室503和PCR缓冲液计量室504流体连通。该流体连通可以通过回转阀509来调节，回转阀509可以以这样的方式操作：样品和PCR(或扩增)缓冲混合通道505可以在需要时(例如，如下面参照图7的方法所解释的)接收并因此混合样品计量室503的内容物和PCR(或扩增)缓冲液计量室504的内容物。

微流体回路还包含扩增(微流体)腔室506，优选地是PCR(微流体)腔室，其通过微管与样品和PCR缓冲液混合通道505流体连通。所述流体连通可以通过回转阀508来调节，所述回转阀508可以以这样的方式操作：PCR室506可以在需要时(例如，如下面参考图7的方法所解释的)从样品和PCR缓冲液混合通道505接收样品和PCR(或扩增)缓冲液的混合物。PCR(或扩增)室506可以配置为含有例如约30μl的流体体积。

来自泡罩513的PCR(或扩增)缓冲液可包括扩增引物，其中所述引物中的至少一个可通过其5′末端与标记(例如生物素)化学地连接。因此样品中的DNA可以用这种引物扩增，并在PCR(或扩增)室506中变性，以获得相应的5′标记的ssDNA分子。在备选实例中，微流体回路可以进一步包括变性室(未示出)，使得扩增和变性可以在不同的室中发生。使用单个室进行扩增和变性可以允许节省能量和更紧凑的盒装置设计。

微流体回路可另外包含PCR和杂交缓冲液混合(微流体)通道510，其通过微管与PCR(或扩增)室506和含有杂交缓冲液的泡罩518流体连通。该流体连通可以通过回转阀508来调节，该回转阀508可以以这样的方式操作：PCR(或扩增)和杂交缓冲液混合通道510可以在需要时(例如，如下面参照图7的方法所解释的)接收并因此混合PCR(或扩增)室506和泡罩518的内容物。

PCR和杂交缓冲液混合通道510可以配置为含有例如约70μl的流体体积。

盒500还可以进一步包含具有内芯(或流体流动诱导器)的注射器519，其通过微管与盒的微流体回路流体连通。注射器519可以以这样的方式操作：可以发生抽吸效应，以根据需要在微流体回路内引起合适的流体流动。注射器(或流体流动诱导器)519中的可用体积可以是例如约6.5ml。

盒500可另外包含一个或更多个通气出口512，其中废物(微流体)室521通过微管与盒的微流体回路流体连通。这种流体连通可以通过回转阀509来调节，回转阀509可以以这样的方式操作：可以由废物室521接收(和累积)来自例如样品计量室503、PCR缓冲液计量室504、样品和PCR缓冲液混合通道505等的过量流体。这种过量流体向废物室521的转移还可以包含微流体回路中的过量空气，这些过量空气因此可以通过一个或更多个通气出口512排出。当过量流体和/或过量空气由于正压力(例如，当按压泡罩时)或负压(例如当注射器被操作时)移动通过微流体回路时，同样的过量流体和/或过量空气可以通过所述一个或更多个通气出口512排出。

盒500还可包含截止阀507，其可包含例如当膜被流体浸渍到一定程度时可以作为屏障的PTFE膜。截止阀507可以通过微量移液管与PCR室506通过回转阀508流体连通，回转阀508可以以这样的方式操作：PCR(或扩增)室506的加载可以通过在截止阀507中产生的屏障(当例如PTFE膜被充分浸渍时)来停止。

盒500还可以进一步包含传感器(微流体)室511，其通过微管与PCR和杂交缓冲液混合通道510流体连通，使得当需要时(例如，如下面参考图7的方法所解释的)传感器腔室511可以接收PCR(扩增)的混合物和杂交缓冲液的混合物。传感器室511可以被配置为含有例如大约70μl的流体体积，并且可以包括电极(微)阵列。

电极(微)阵列可包含工作电极、反电极和参比电极，其3′末端固定有特异性的互补寡核苷酸探针。因此，至少一个生物素标记的ssDNA分子(来自PCR或扩增室506中的扩增)与这种寡核苷酸探针的杂交可以在传感器室511中发生。在所述杂交过程中，杂交ssDNA分子内5′生物素和与互补探针的杂交区之间的距离约为300个核苷酸或更少。特别地，该距离由0至300个核苷酸组成，优选0至280，更优选0至270，更优选0至265，0至240、0至200、10至200、0至150、25至150、0至120、30至120、0至110(36、61、83、109)、0至90、50至90(50、51、52、53、54、55、56、57、59、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90)。优选地，该距离为约85个核苷酸或更少。在本公开的其他部分中提供了关于这些考虑因素的进一步细节。

含有触发剂的泡罩515和含有缀合物的泡罩516也可以通过微管与传感器室511流体连通。这样，传感器室511可以在需要时(例如，如下面参照图7的方法所解释的)接收由于施加在泡罩上的合适压力产生的来自相应的泡罩515，516的触发剂和缀合物。

缀合物可包含例如链霉抗生物素蛋白或与酶部分偶联的类似物质(例如HRP溶液)。触发剂可以包含例如电子供体底物，诸如TMB。通过与缀合物一起孵育，可以在传感器室511中进行杂交检测，然后与触发剂一起孵育以引起酶促氧化。在本公开的其他部分中提供了关于这些考虑因素的进一步细节。

上述杂交条件(300个核苷酸或更少，或优选85个核苷酸或更少的距离)可以引起酶促氧化以在电极中和/或电极之间感应电流强度，与现有技术的方法和装置相比，所述电流强度显著更高。因此，根据本公开的方法和装置可以在DNA检测中提供更可靠的结果。在本公开的其他部分中提供了关于这些考虑因素的进一步细节。

含有洗涤缓冲液的泡罩514、517可以通过微管与传感器室511流体连通，使得可以在需要时(例如，如下面参考图7的方法所解释的)由于施加在泡罩上的合适压力而从泡罩514、517接收洗涤缓冲液后洗涤传感器室511。

传感器室511的洗涤可以在杂交和与缀合物一起孵育之间引起，并且传感器室511的进一步的洗涤可以在与缀合物一起孵育和与触发剂一起孵育(以引起最终的酶促氧化)之间引起。所述洗涤(即，传感器室511被洗涤的一次或更多次)可以减少干扰背景信号/电流(在电极中)并因此进一步改进DNA检测。在本公开的其他部分中提供了关于这些考虑因素的进一步细节。

尽管已经用一些特定部件描述了图5A的实施方案的盒500，但是显而易见的是，本领域中已知的其他部件也可以用在本公开范围内的盒中。例如，可以如WO2013135640A1中描述的那些回转阀508、509可以用其他阀代替，这些阀也提供上述流体连通而不脱离本公开的范围。

例如，盒500可以以热塑性聚合物中的注模微结构化装置的形式制造。

图5b是根据实施例的适合于与图5a所示类似的盒装置的电极(微)阵列550的示意图。如在说明书的其他部分中所解释的，微阵列550可以用作多恒电位仪。

电极微阵列550可以被配置为布置在传感器室511中(参见图5a)，并且可以包含具有不同功能的多个电极。一些或所有所述电极可以重复以确保结果的再现性。

在这个意义上，电极微阵列550可以构造为第一四分之一电极551，第二四分之一电极552，第三四分之一电极553和第四四分之一电极554。具有与四个四分之一不同的多个部分的其他配置也是可能的，例如，三个三分之一或两个二分之一。

特异性互补寡核苷酸探针可以固定到微阵列550的电极上。该固定优选通过在探针3′末端的硫醇修饰进行。本领域已知的3'末端的备选修饰和/或探针在相应表面上的直接合成也是可能的。

电极微阵列550可包含由例如碳和/或钛/银制成的反电极。特别地，电极的活性部分，即与固定的探针接触的部分，可以由银制成。如图5b的特定示例中所示，第一版本的反电极559可以存在于第一四分之一551中，第二版本的反电极560可以存在于第四四分之一554中。

电极微阵列550可以进一步包含由例如银和/或氯化银制成的参比电极。如所示的特定示例中所示，参比电极可具有第一四分之一551中的第一版本555、第二四分之一552中的第二版本556、第三四分之一553中的第三版本557以及第四四分之一554中的第四版本558。

电极微阵列550还可以进一步包含外部对照电极。在所示的特定实施例中，外部对照电极可以具有第一四分之一中的复制品562以及第三四分之一中的另一复制品563。

电极微阵列550还可以进一步包含内部对照电极。在图中所示的示例中，内部对照电极可以具有两个版本，第二四分之一中的一个版本561和第四四分之一中的另一个版本564。

电极微阵列550可另外包含多个由例如金和/或钛/银制成的工作(或测量)电极。特别地，电极的活性部分，即与固定的探针接触的部分，可以由金制成。工作电极是那些与上面参照图5b所讨论的电极不同的电极，并且可以是一式两份的，一式三份的或甚至一式四份的(如图所示)以确保结果的再现性。一些工作电极可包含一个以上附接的探针，例如两个靶向相同的DNA的不同的探针。电极的数量是可变的，并且可取决于待测定的靶DNA的数量。在一些实施方案中，电极微阵列包含1至150，更优选或特别是10至100个电极，更优选30至80个电极，例如64个电极。

计数器，参比电极和工作电极可以协作以作为三电极测量单元或恒电位器一起工作。恒定电位(电压)可以在反电极和工作电极之间施加，使得可以在它们之间感应出电流，即可以感应出电流，如在本公开的其他部分中更详细地解释的。

可以读取(即测量)这些感应电流，并且可以处理所述读数(即测量值)，以产生可由例如合格的工作人员(例如医生、护士等)解释的DNA检测结果。参比电极可用于控制和调节反电极和工作电极之间施加的恒定电位。包括公共反电极、公共参比电极和多个(例如64个)工作电极的配置称为多恒电位仪。

(不同的)探针可以在多种关系(例如，一对一、多对一、一对多，取决于要执行的检测)下固定到所有工作电极。一对一关系意味着一个探针固定在一个工作电极上。多对一关系意味着各种不同的探针固定在一个工作电极上。一对多关系意味着一个探针固定在各种不同的工作电极上。

外部和内部对照电极是工作电极，其用于检查用于电化学DNA检测的装置(参考包含在盒中的装置)是否按预期工作，并且所获得的测量或读数可被认为是有效的。在这个意义上，外部和内部对照电极包括用于PCR对照的探针。

电极微阵列可以布置(例如点样、印刷)在合适的基底(导电材料，例如金、银、石墨烯等)上。反电极和工作电极可以在其接触基底的底层处由钛制成，并且在其顶层(即与底层相对的层)处由金制成，即接触基底的第一层可以包含钛并且与第一层相对的第二层可以包含金。钛是基底和金之间的良好粘合剂。金提供了将探针固定到其上的良好特征，并提供了良好的导电性。使用良好的粘合剂和良好的电导体使得试剂和电导体在检测过程中保持附接至盒装置(即附接至形成盒装置的材料，诸如塑料的材料)并且在洗涤发生时不会从其上脱离。参比电极可以由银和/或氯化银制成，因为这些材料由于其在电势序中的确定电位而允许良好地控制所施加的电位。

工作电极可以点样或印刷，其直径为例如大约1mm。参比电极可以是例如约32mm长，约1.8mm宽。

不同类型的探针可以固定到工作电极上。此类探针的实例可以是HPV-DNA探针、对照-DNA探针、生物素等。HPV-DNA探针可用于检测HPV(14种不同的基因型，每种基因型一式四份)。其他引用的探针可用于进行进一步的控制以确保阵列/恒电位仪的功能性/连通性，并独立于扩增的DNA检查测定试剂。

图6示意性地示出了根据实施例的操作装置600，其适于操作与参考图5a和5b描述的那些类似的盒装置。因此，来自所述图5a和5b的数字参考可以在以下关于操作装置600的描述中重复使用。

操作装置600可以包含控制器(未示出)，所述控制器其被配置为控制(通过向操作装置600的不同组件发送/从操作装置600的不同组件接收控制信号)操作装置600的不同组件，用于在盒装置500中执行DNA检测方法(如本公开的其他部分中所描述的)。也就是说，控制器可以操作操作装置600的组件，使得DNA检测的方法在盒装置500中执行。

操作装置600还可以包含托盘601，所述托盘601配置成适当地接收和接合盒装置500，以及(任选地)夹紧机构602，所述夹紧机构602被配置为适当地紧固盒装置500以使其由操作装置600正确操作。

操作装置600还可以进一步包括泡罩马达603，其可(被控制器)操作用于对盒装置500的任何泡罩513-518施加合适的压力，并且回转阀马达604，其可(被控制器)操作用于适当地调节盒装置500的任何回转阀508、509。

可以操作泡罩马达603以使压力施加到相应的泡罩513-518，以在需要时(例如，如下面参考图7的方法所解释的)将泡罩的内容物提供给微流体回路。可以操作回转阀马达604以便调节盒装置500的微流体回路内的流体连通(例如微通道、微流体室等之间)。

操作装置600还可以进一步包括检测单元605，所述检测单元605可(被控制器)操作，以使读数接触器(包含在检测单元605中)与盒装置500的(微)阵列550的电极(在其传感器室511中)之间产生适当的接触。读数接触器和电极之间的这种接触可能导致读取电极中感应的电流强度作为在盒装置500中执行的DNA检测方法的结果。这些读数可以由控制器接收和处理，以便向例如医疗和/或护理人员提供可解释的结果。

操作装置600还可包含流体流动诱导器519的驱动器606，所述流体流动诱导器519的驱动器606可(被控制器)操作以驱动盒装置500的注射器(或流体诱导器)519，以便在需要时(例如下面参考图7的方法所解释的)在盒装置500的微流体回路内引起抽吸和随后的流体运动(或流动)。例如，驱动器606可包含注射泵马达和驱动机构。

操作装置600可另外包括可被控制器操作的第一加热器单元607，以便向PCR(或扩增)室506提供第一加热(或孵育)循环，使得扩增和变性在(盒装置500的)PCR室506中发生。

操作装置600还可以包含可被控制器操作的第二加热器单元608，用于向(盒装置500的)传感器室511提供第二加热(或孵育)循环，使得杂交在传感器室511中发生。

第二加热器单元608也可以被控制器操作，以向传感器室511提供进一步的加热(或孵育)循环，使得导致在传感器室511中含有的HRP或polyHRP溶液(与酶促部分化学连接的标记结合分子)的孵育。

操作装置600可另外包括照明单元609，用于在盒装置500的操作期间提供所需的照明。照明单元609可以包含例如LED，其旨在照亮盒的某些部分以供医疗/护理人员进行目测。至少一些所述LED可以具有提供在盒装置500的操作期间发生的确定事件或情况的光指示器的功能，即，LED可以提供示出正在执行的过程的状态的光指示器。

图7是示意性地示出根据实施例控制与图6所示类似的操作装置600的方法的流程图。关于图5a、5b和6的数字参考可以在以下关于所述操作方法的描述中重复使用。

该方法可以由操作装置600的控制器执行。(操作装置600的)控制器可以通过计算装置、电子装置或其组合来实现。计算装置可以是呈现在存储器中并且可由处理器执行的一组指令(即，计算机程序)。控制器包含具有所述一组指令的存储器，和处理器。指令可以包含至少执行控制如本公开的其他部分中描述的操作装置的方法的功能。在这个意义上，处理器与存储器一起配置以执行控制操作装置的这种方法。控制器可以是例如计算机、芯片上系统(即SoC)或微控制器，一旦运行处理器上的指令，其可以操作操作装置600的组件(机械和电子组件)。

在(操作装置600的)控制器仅由电子装置实现的情况下，控制器包含或可以是例如CPLD(复杂可编程逻辑器件)、FPGA(现场可编程门阵列)或ASIC(应用-特定集成电路)。

在(操作装置600的)控制器是电子装置和计算装置的组合的情况下。计算装置可以是处理器和具有一组指令的存储器，并且电子装置可以是能够实现相应步骤或所引用的控制操作装置600(用于操作盒装置500)的方法的步骤的任何电子回路。控制器(例如计算机、芯片上系统、微控制器)控制操作装置600的组件，以便实现所述步骤。

计算机程序可以呈现在存储介质(例如，CD-ROM、DVD、USB驱动器、计算机存储器或只读存储器上)上或者承载在载波信号上(例如，电或光学载波信号)。

计算机程序可以是源代码、目标代码、和诸如部分编译形式的目标代码和代码中间源的形式，或者适合用于控制操作装置600的方法的实现的任何其他形式。(Thecomputer program may be in the form of source code,object code,a codeintermediate source and object code such as in partially compiled form,or inany other form suitable for use in the implementation of the method ofcontrolling the operator device 600.)载体可以是能够携带计算机程序的任何实体或设备。

例如，载体可以包含存储介质，诸如ROM，例如CD ROM或半导体ROM，或磁记录介质，例如硬盘。此外，载体可以是可传输的载体，诸如电信号或光信号，其可以通过电缆或光缆或通过无线电或其他手段传达。

备选地，载体可以是嵌入计算机程序的集成电路，该集成电路适于执行或用于执行相关方法。

在初始框700处，DNA样品通过样品入口501的加载可以检测。

在框701处，控制信号可以(被控制器)发送到流体流动诱导器519的驱动器606，以引起抽吸效应以及最后的DNA样品从样品计量环502到样品计量室503的流体转移。

在同一框701处，控制信号可以被进一步发送到回转阀马达604，以使阀509实现样品计量环502和样品计量室503之间所需的流体连通。

一旦用DNA样品填充样品计量室503，就可以进行确定是否已经加载了足够量的DNA样品。例如，操作装置的传感器可以与控制器一起在样品计量室503中进行该确定或体积的确定，或者人可以通过观察样品计量室503来手动进行确定。

在框702处，控制信号可以(被控制器)发送到泡罩马达603，以对含有PCR(或扩增)缓冲液的泡罩513施加压力，从而PCR缓冲液从泡罩513到PCR(或扩增)缓冲液计量室504的流体转移可发生。

在相同的框702处，控制信号可以被进一步发送到回转阀马达604，以使阀509能够在泡罩513和PCR缓冲液计量室504之间实现所需的流体连通。

一旦用PCR缓冲液填充PCR缓冲液计量室504，就可以确定是否有足够量的PCR(或扩增)缓冲液可用。例如，操作装置的传感器可以与控制器一起在PCR缓冲液计量室504中进行该确定或体积的确定，或者人可以通过观察PCR缓冲液计量室504来手动进行确定。过量的PCR缓冲液可以通过废物室521收集，并且过量的空气可以通过通气出口512排出。

控制信号也可以被发送到流体流动诱导器519的驱动器606，以引起抽吸作用以及随后的含有废物或过量流体的微通道排空。

在框703处，控制信号可以(被控制器)发送到流体流动诱导器519的驱动器606，以引起抽吸作用和随后的DNA样品(来自样品计量室503)和PCR缓冲液(来自PCR缓冲液计量室504)到样品和PCR缓冲液混合通道505的流体转移。控制信号可以进一步发送到回转阀马达604，以使阀509能够实现从样品计量室503和PCR缓冲液计量室504朝向样品和PCR缓冲液混合通道505的所需流体连通。

在同一框703，随后的控制信号可以(被控制器)发送到流体流动诱导器519的驱动器606，以引起抽吸作用以及混合的样品和PCR缓冲液从样品和PCR缓冲液混合通道505向PCR室506的相应流体转移。控制信号也可以被发送到回转阀马达604，以使阀508能够实现从样品和PCR缓冲液混合通道505朝向PCR室506的所需流体连通。因此，框703的执行可导致PCR(或扩增)室506加载DNA样品和PCR(或扩增)缓冲液的混合物。

另外的控制信号可以(被控制器)发送到流体流动诱导器519的驱动器606，以引起抽吸作用以及随后的含有废物或过量流体的微通道的排空。

在框704处，控制信号可以(被控制器)发送到泡罩马达603，用于向含有洗涤缓冲液的泡罩517施加压力，如此以致洗涤缓冲液从泡罩517到传感器室511的流体转移可发生。因此，框704的执行可导致传感器室511被来自泡罩517的洗涤缓冲液洗涤。

另外的控制信号可以(被控制器)发送到流体流动诱导器519的驱动器606，以引起抽吸作用以及随后的传感器室511的排空。

在框705处，控制信号可以(被控制器)发送到泡罩马达603，以对含有杂交缓冲液的泡罩518施加压力，从而可以发生来自泡罩518的杂交缓冲液的预填充。控制信号也可以被发送到回转阀马达604，以使阀508将杂交缓冲液保持在泡罩518内，直到需要为止。

在框706，控制信号可以(被控制器)发送到第一加热器单元607，用于在PCR室506中引起连续加热(和冷却)循环，使得进行PCR(或扩增)过程。这些加热(和冷却)循环可包含例如：第一个循环，98℃5分钟；45个循环，98℃15秒，55℃15秒和72℃30秒；72℃1分钟结束。总体PCR(或扩增)时间可小于或等于45分钟。第一加热器单元607可以以这样的方式向PCR室506提供所需的温度：基本上避免或至少衰减由于变化的温度而引起的流体膨胀。

在框707处，控制信号可以(被控制器)发送到回转阀马达604，使阀508能够实现从含有(在先前的框705保留的)杂交缓冲液的泡罩518和PCR室506朝向PCR和杂交缓冲液混合通道510的流体连通。控制信号也可以被发送到泡罩马达603，用于对泡罩518施加压力，以促进杂交缓冲液从泡罩518到PCR和杂交缓冲液混合通道510的流体转移。

一旦PCR流体(来自PCR室506)和杂交缓冲液(来自泡罩518)已经在PCR和杂交缓冲液混合通道510中混合，所得混合物可继续朝向传感器室511流动。因此，框707可以导致用PCR流体和杂交缓冲液的混合物填充传感器室511。

在框708处，控制信号可以(被控制器)发送到第二加热器单元608，以提供第二加热循环，并因此引起传感器室511中含有的PCR流体和杂交缓冲液的混合物的孵育。因此(来自PCR或扩增室506)PCR流体的杂交可以在传感器室511中产生。

在框709处，控制信号可以(被控制器)发送到流体流动诱导器519的驱动器606，以引起抽吸作用和随后的传感器室511的排空。

另外的控制信号可以(被控制器)发送到泡罩马达603，用于向含有洗涤缓冲液的泡罩514施加压力，使得洗涤缓冲液从泡罩514到传感器室511的流体转移可发生。传感器室511因此可以被来自泡罩514的洗涤缓冲液洗涤。

再另外的控制信号可以(被控制器)发送到流体流动诱导器519的驱动器606，以引起抽吸作用以及随后的传感器室511的排空。

又再另外的控制信号可以(被控制器)发送到泡罩马达603，用于向包含洗涤缓冲液的泡罩517施加压力，如此以至于洗涤缓冲液从泡罩517到传感器室511的流体转移可发生。传感器室511因此可以被来自泡罩517的洗涤缓冲液洗涤。

额外的控制信号可以(被控制器)发送到流体流动诱导器519的驱动器606，以引起抽吸作用以及随后的传感器室511的排空。

在框710处，控制信号可以(被控制器)发送到泡罩马达603，用于对含有缀合物(例如HRP溶液)的泡罩516施加压力，使得缀合物溶液从泡罩516到传感器室511的流体转移可发生。即，将电化学溶液(HRP溶液)注入传感器室511中。

在框711处，控制信号可以(被控制器)发送到第二加热器单元608，用于引起传感器室511中含有的HRP溶液孵育。所述控制信号可以是这样的：与HRP溶液的孵育可以例如在37℃下进行持续约60分钟，也就是说，一旦用第二加热器单元608加热传感器室511，HRP溶液的孵育就可以进行。

在框712处，控制信号可以(被控制器)发送到流体流动诱导器519的驱动器606，以引起抽吸作用以及随后的传感器室511的排空。

另外的控制信号可以(被控制器)发送到泡罩马达603，用于向含有洗涤缓冲液的泡罩514施加压力，如此以至于洗涤缓冲液从泡罩514到传感器室511的流体转移可发生。因此，传感器室511可以被来自泡罩514的洗涤缓冲液洗涤。

再另外的控制信号可以(被控制器)发送到流体流动诱导器519的驱动器606，以引起抽吸作用以及随后的传感器室511的排空。

又再另外的控制信号可以(被控制器)发送到泡罩马达603，用于向含有洗涤缓冲液的泡罩517施加压力，如此以至于洗涤缓冲液从泡罩517到传感器室511的流体转移可发生。因此，传感器室511可以被来自泡罩517的洗涤缓冲液洗涤。

另外的控制信号可以(被控制器)发送到流体流动诱导器519的驱动器606，以引起抽吸作用以及随后的传感器室511的排空。

在框713处，控制信号可以(被控制器)发送到泡罩马达603，用于向含有触发剂(例如TMB)的泡罩515施加压力，使得触发剂从泡罩516到传感器室511的流体转移可发生。也就是说，将检测溶液(TMB)注入传感器室511中。

在最后的框714处，控制信号可以(被控制器)发送到检测单元605，以使得(检测单元605的)读数接触器与传感器室511中的(微)阵列550的电极之间的适当接触。读数接触器和电极之间的这种接触可导致读取电极中感应的电流强度。这些读数可以由控制器接收和处理，以便向例如医疗和/或护理人员提供可解释的结果。

尽管已经参考图5a的盒装置500描述了图7中所示的方法，但是显而易见的是，该方法或根据本发明的另一个实施方案的方法可以用根据本发明的其他盒装置执行。

如上所述，对于本发明的方法，本发明的装置可用于检测任何靶DNA，特别是用于检测上文已公开的任何靶DNA。本发明中的靶DNA是指靶核酸，因此，RNA靶也易于根据其检测。那么，在扩增步骤之前的逆转录酶事件会是需要的。本发明的装置还可用于诊断与任何上述定义的靶DNA相关的疾病或病况。因此，本发明提供了用于检测任何上述定义的靶的方法，以及用于诊断与任何上述定义的靶相关的疾病或病况的方法，所述方法包括使用本发明的装置。在一些实施方案中，靶是HPV。在一些实施方案中，所述疾病是癌症。在优选的实施方案中，所述癌症是宫颈癌。在其他实施方案中，所述靶是与癌症患者的治疗应答相关的基因中的突变。因此，本文描述的装置也可用于癌症患者的预后和对治疗的应答。

就待分析的样品包含核酸而言，可以在所提议的检测方法和装置的背景下进行这种样品的表征，包括核酸扩增和扩增产物的变性，然后进行特异性探针杂交。

如在本说明书和权利要求书中所用的，单数形式的“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文清楚地另外指明。例如，术语“一个阵列”可以包括多个阵列，除非上下文另有明确规定。

贯穿本说明书和权利要求书，词语“包含”以及该词语的变形并不旨在排除其他的技术特征、添加剂、组分或步骤。此外，“包含”一词涵盖“由...组成”的情况。当审查本说明书时，本发明的另外的目的、优点以及特征对本领域的普通技术人员而言将变得显而易见，或通过本发明的实践是可以获悉的。通过说明的方式提供了以下实施例和附图，并且它们并不意图限制本发明。与附图相关并放在权利要求中的括号中的参考标记仅用于试图提高权利要求的可理解性，并且不应被解释为限制权利要求的范围。此外，本发明覆盖在此描述的特定的以及优选实施方案的所有可能的组合。

实施例

尽管本文仅公开了一些实施例，但其他备选、修改、用途和/或等同物也是可能的。此外，还涵盖了所描述的实施例的所有可能组合。因此，本公开的范围不应受特定实施例的限制，而应仅通过公平阅读所附权利要求来确定。

实施例1：PCR和杂交测定

测定的过程步骤：

1.样品摄取(样品包含DNA或纯化的DNA)

2.在芯片上的样品转移

3.关闭盖

4.计量样品

5.计量PCR缓冲液

6.通过混合通道将样品和缓冲液转移到具有冻干的PCR试剂的PCR室中

7.PCR

8.将来自PCR的样品与经计量体积的杂交缓冲液混合

9.预洗传感器

10.用样品冲洗传感器区域

11.杂交

12.传感器洗涤步骤(3x)

13.用电化学溶液冲洗传感器区域

14.孵育

15.传感器洗涤步骤(3x)

16.添加检测溶液(底物)

17.检测

盒

整个盒由消耗品(具有PCR腔和杂交腔)、生物试剂和电极阵列组成。

微流体盒将具有用于样品摄取的界面并且将具有嵌入的电化学传感器。

在具有PCR和杂交分析功能的盒上的功能元件：

1.流体界面

2.封闭芯片的盖

3.用于试剂储存的泡罩(blisters)

4.用于计量的阀

5.混合器

6.PCR单元

7.杂交单元

8.带电极的传感器包(package)

9.仪器的流体界面

10.仪器的气动界面

11.仪器的热界面(确保定义的温度)

12.电极

13.仪器的电气界面

14.废水库

热界面-PCR

为了实现快速热循环-特别是冷却-该区域应尽可能小。

总结了PCR热界面的要求：

·温度范围：室温至100℃

·温度超调：最大±2℃，持续5秒

·精度温度：<＝±0.5℃

·加热速度：2-4℃/秒(取决于加热区的最终设计和尺寸)

·冷却速度：2-3℃/秒(取决于加热区的最终设计和尺寸)

热界面-杂交区域

对于杂交，需要恒定的温度。没有必要循环温度。温度可以是37℃。

热界面-杂交区：

·温度范围：室温至70℃

·精度温度：<＝±1℃

·加热速度：不重要，因为只需要达到并保持1个温度

·冷却速度：不重要，因为只需要达到和保持1个温度。

实施例2.使阵列功能化的过程：

使阵列功能化的过程包括以下步骤：

购买或提供硫醇修饰的探针，其中硫醇修饰位于探针的3′末端。这些探针构成捕获探针(CP)。

通过与还原剂一起孵育来使CP去保护，所述还原剂破坏硫醇修饰的二硫化物基团，并产生CP的活化形式。接下来，将活化的CP形式与马来酰亚胺一起孵育，然后与电极的阵列一起孵育，后者通过与高分子量聚醚孵育而预先进行功能化，所述聚醚与金属离子形成复合物。

在用探针孵育之前，用水虎鱼酸(piranha acid)(H₂SO₄和H₂O₂的混合物)清洁阵列表面。

对于64电极盒，需要在60-65％rH和室温下180nl/点进行点样。

实施例3:检测人乳头瘤病毒：

进行了人乳头瘤病毒(HPV)16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68的检测和基因分型。那些HPV类型与发生子宫颈癌的高风险相关。

直接从子宫颈样品进行检测。用棉签取样并用盐水缓冲液重悬。

在专门为此诊断设计的盒中，加入0.15ml量的用盐水缓冲液重悬的样品。

将该盒引入先前使用方案编程的设备中以进行此类型的诊断。该方案花一个小时十五分钟完成。最终结果是电化学读数。

该阵列如上面的实施例2中所述最初被功能化。

将10μl样品与30μl PCR缓冲液混合并注射到PCR室(其中冻干的PCR混合物是储存的)中。

PCR：

PCR条件和使用的试剂总结如下。

表1：循环方案

该方案可以优化以达到<45分钟的总PCR时间。

PCR试剂：

表2：PCR试剂

编号	组分	体积	浓度
				1	样品	10μl
2	聚合酶		0.1U/μl
				3	缓冲液		1×
4	引物		0.4μM
				5	内部对照DNA

这些试剂/体积可以优化。缓冲液从主混合物中除去并储存在芯片上(液体)。将其他组分在芯片上冻干(固体)。

使用来自WO2007/017699A2的引物和探针。

在PCR期间，需要控制样品在PCR室内的正确位置，因为温度的变化可能使液体膨胀。一旦PCR完成，将30μl扩增产物与30μl杂交溶液混合。

将该混合物在99℃变性至少2分钟，然后将其注入电化学阵列并在37℃下孵育5分钟(杂交)。

一旦杂交完成，进行洗涤步骤。

为了放大信号，将电化学溶液(polyHRP)注入电化学阵列并在37℃下孵育2分钟30秒。

在阵列室的一些洗涤步骤之后，将检测溶液(TMB)注入阵列中，并通过电化学检测杂交。

下面提供了杂交测定和检测的更多细节：

杂交测定在37℃下进行。杂交缓冲液需要预热。

描述杂交测定：

1.一旦PCR完成，将30μl扩增产物与30μl需要在37℃预热的杂交溶液(SSC-Triton1％)混合。

2.将该混合物注入电化学阵列，并在37℃下孵育30分钟(杂交)。

3.一旦杂交完成，将洗涤溶液注入阵列室中三次。

4.为了放大信号，将电化学溶液(polyHRP)注入电化学阵列并在37℃下孵育2分钟30秒。

5.将洗涤溶液(吐温20(10％))注入阵列室中三次。

6.然后将检测溶液(TMB)注入阵列中，并通过电化学检测杂交。

结果：

从多恒电位仪获得电化学读数，其实现了恒定电位(例如-0.2V)的计时电流法。

实验用探针和不同的距离进行，其中所述探针通过与其5′末端相对的3′末端附接至电极上，其中所述距离为在与探针杂交的ssDNA分子内5′末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离(参见图2、3和4)。

在图2、3和4中，S 8.5是在其5′末端具有硫醇的探针，并且其中与探针杂交的ssDNA分子内5′末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离为83个核苷酸；S 8.3是在其3′末端具有硫醇的探针，其中与探针杂交的ssDNA分子内5′末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离为83个核苷酸；S 7.5是在其5′末端具有硫醇的探针，其中与探针杂交的ssDNA分子内5′末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离为343个核苷酸；且S 7.3是在其3′末端具有硫醇的探针，并且其中与探针杂交的ssDNA分子内5′末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离为343个核苷酸。

如图3中所说明的，当探针通过硫醇经由其3′末端附接至电极时，与经由其5′末端附接的探针相比，观察到电化学电流的出人意料增加。当与探针杂交的ssDNA分子内5′末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离小于300个核苷酸时，这种效应增加(参见图3，与S7.3相比，S 8.3的结果)。

在所有情况下，引物用生物素标记并通过与polyHRP结合的链霉抗生物素蛋白检测，使用的底物是TMB。

在表3中在用于HPV诊断的每个相应的电极中描述了电化学电流。进行了四次重复。这些结果也表示在图8中。

在表3中，“br”是生物素标志物(用固定在电极阵列上的生物素标记的探针，其用于知道polyHRP和TMB正确地起作用)；“ic”是扩增的内部对照(检测合成DNA片段的扩增的特异性探针，因此知道PCR缓冲液正确地起作用)；“ec”是内源对照(检测所有样品中存在的人管家基因的特异性探针)；A是HPV 39；B是HPV 45；C是HPV 16；D是HPV 18；E是HPV 31；F是HPV33；G是HPV 35；H是HPV 51；I是HPV 52；J是HPV 56；K是HPV 58；L是HPV 59；M是HPV 66；和N是HPV 68。

图9包含所公开的电极阵列的图形表示。

实施例4:检测甲型流感H1N1和甲型流感H3N2病毒

用于以下实验的遗传物质是来自甲型流感H1N1或H3N2的合成DNA。

类似的结果可从以下任何类型的呼吸道样品中获得：通过手动或自动提取的鼻咽灌洗液和分泌液，咽部分泌液和支气管肺泡灌洗液(BAL)。

使用对于H1N1和H3N2共同的通用扩增引物，产生261bp的相应扩增产物。在本情况中，该对的两个引物都在其5′末端被生物素标记。

正向引物：长度29nt；熔点温度：62,03℃；31,03％GC。

反向引物：长度20nt。熔点温度：54,37℃；40％GC。

所有探针在其3′末端进行硫醇标记。

PV1：长度：20nt；熔点温度：66,95℃；70％GC；对H1N1特异；

PV2：长度：21nt；熔点温度：68,27℃；66％GC；对H3N2特异；

PV3：长度：25nt；熔点温度：60,41℃；40％GC；对甲型流感通用；

PV4：长度：22nt；熔点温度：66,83℃；59％GC；对H1N1特异；

PV5：长度：23nt；熔点温度：62,87℃；56％GC；对H3N2特异。

在热循环仪上编程以下温度循环：

实验条件是：

结果：

图10和11表示从分别对应于甲型流感H1N1病毒和甲型流感H3N2病毒的261个核苷酸的扩增片段获得的经标记的ssDNA的电极阵列(其用于通过与特异性探针杂交检测呼吸道病毒)的检测信号(以nA表示)。

在图10中，PV1、PV3和PV4是特异性探针，其3′末端附接有硫醇，与探针杂交的ssDNA分子内5'末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离分别为36、109和61个核苷酸。

在图11中，PV2、PV3和PV5是特异性探针，其3'末端附接有硫醇，与探针杂交的ssDNA分子内5'末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离分别为36、109和60个核苷酸。

如图10和11所示，当与探针杂交的ssDNA分子内5'末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离少于300个核苷酸，优选少于280个核苷酸时，观察到电化学电流的出人意料增加。

表3：

Claims (27)

1.电化学DNA检测方法，其包括以下步骤：

i)用至少一个扩增引物扩增靶DNA，其中所述至少一个扩增引物通过其5'末端与标记化学地连接；

ii)使扩增产物变性以产生两个单链DNA(ssDNA)分子，其中至少一个是5'标记的；

iii)将所述扩增产物的5'标记的ssDNA分子与互补寡核苷酸捕获探针杂交，所述互补寡核苷酸捕获探针通过其3'末端附接至电极；以及

iv)确定与杂交产物相关联的标记的存在；

其中与所述互补寡核苷酸捕获探针杂交的ssDNA分子内5'末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离由0-280个核苷酸组成。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)包括用一对扩增引物扩增靶DNA，其中所述扩增引物中至少一个通过其5'末端与标记化学地连接。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，在步骤(iii)中，将1至10个，优选1至5个与所述靶DNA序列互补的不同寡核苷酸捕获探针附接至所述电极，更优选将与所述靶序列互补的一个捕获探针附接至所述电极。

4.根据权利要求1-3所述的方法，其中步骤(iv)包括：

a)向所述杂交产物中加入标记结合分子以形成复合物，其中所述标记结合分子与酶部分化学地连接，

b)向步骤(iv)产生的所述复合物中加入在所述酶部分存在下经历氧化或还原的底物；以及

c)确定所述底物的氧化或还原。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述ssDNA分子内5′末端和杂交区的第一个核苷酸之间的距离由0-265，优选0-200，最优选0-110组成。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述5'标记是半抗原，优选生物素和/或结合所述5'标记的分子是半抗原结合分子，优选链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白，和/或所述酶部分是氧化还原酶，优选HRP或polyHRP，和/或所述底物是电子供体，优选3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其用于对人乳头瘤病毒的检测和/或分型。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其用于对甲型流感H1N1和H3N2病毒的检测和/或分型。

9.用于根据权利要求1-8中任一项所定义的电化学DNA检测的装置的用途，其中所述装置包含：

i)至少一个用于扩增所述靶DNA的引物，其中所述至少一个用于扩增所述靶DNA的所述引物通过其5'末端与标记化学地连接；

ii)与所述靶DNA序列互补的寡核苷酸捕获探针，其中所述寡核苷酸捕获探针通过其3'末端附接至电极；和

iii)检测所述标记的装置；

其中当使用时，与所述寡核苷酸捕获探针杂交的ssDNA分子内5'末端和杂交区域的和第一个核苷酸之间的距离由0-280个核苷酸组成。

10.根据权利要求9所述的装置的用途，其中所述装置包含与所述电极附接的与所述靶DNA序列互补的1至10个，优选1至5个不同寡核苷酸捕获探针，更优选与所述电极附接的与所述靶序列互补的一个寡核苷酸捕获探针。

11.根据权利要求9-10中任一项所述的装置的用途，其中当使用时，与所述探针杂交的ssDNA分子内5'末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离由0-265，优选0-200，最优选0-110组成。

12.用于电化学DNA检测的盒装置，其包括微流体回路，所述微流体回路包含：

微流体扩增室，其是可操作的以引起用至少一个扩增引物的靶DNA的扩增并引起扩增产物的变性以产生两个其中至少一个是5'标记的单链DNA(ssDNA)分子，其中所述至少一个扩增引物通过其5'末端与标记化学地连接；和

微流体传感器室，其包含一个或更多个电极和一个或更多个通过它们的3'末端附接至所述一个或更多个电极的互补寡核苷酸捕获探针，并且是可操作的以引起所述扩增产物的至少一个5'标记的ssDNA分子与所述一个或更多个互补寡核苷酸捕获探针的杂交，一旦杂交，与所述互补寡核苷酸捕获探针杂交的ssDNA分子内5'末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离为0-280个核苷酸；其中，

所述微流体传感器室进一步是可操作的以确定与杂交产物相关联的标记的存在。

13.根据权利要求12所述的盒装置，其还包含：容器，其含有具有至少一个扩增引物的扩增缓冲液并与所述微流体回路流体连通，使得所述扩增缓冲液可转移至所述微流体扩增室。

14.根据权利要求12或13中任一项所述的盒装置，其中所述微流体传感器室是可操作的以这样的方式确定与所述杂交产物相关联的标记的存在：

向所述杂交产物添加标记结合分子形成复合物，其中所述标记结合分子与酶部分化学地连接；

向所形成的复合物添加底物，所述底物在所述酶部分存在下经历氧化或还原；和

确定所述底物的氧化或还原。

15.根据权利要求12-14中任一项所述的盒装置，其中，包含在所述微流体传感器室内的一个或更多个电极包含附接至每个电极的1到10个，优选1到5个不同的寡核苷酸捕获探针，更优选地，每个电极包含与其附接的一个寡核苷酸捕获探针。

16.根据权利要求12-15中任一项所述的盒装置，其中，所述盒还包含容器，所述容器含有杂交缓冲液并与所述微流体回路流体连通，使得所述杂交缓冲液能转移至所述微流体传感器室。

17.根据权利要求12-16中任一项所述的盒装置，其还包含含有缓冲液的容器，所述缓冲液具有与所述酶部分化学地连接的所述标记结合分子；和

含有缓冲液的容器，所述缓冲液具有在所述酶部分存在下经历氧化或还原的所述底物；其中，

所述容器与所述微流体回路流体连通，使得所述缓冲液能转移到所述微流体传感器室。

18.控制操作装置以操作权利要求12-17中任一项定义的盒装置的方法，所述盒装置能与所述操作装置相关联，所述方法包括：

由所述操作装置的控制器将控制信号提供给所述操作装置的第一加热器单元，用于通过提供第一加热循环给所述微流体扩增室来操作所述盒装置的微流体扩增室，使得扩增和变性在微流体扩增室中发生；由所述控制器将控制信号提供给所述操作装置的第二加热器单元，用于通过向所述微流体传感器室提供第二加热循环来操作所述盒装置的微流体传感器室，使得杂交在所述微流体传感器室中发生；以及

由所述控制器将控制信号提供给所述操作装置的检测单元，用于操作所述微流体传感器室，使得确定与所述杂交产物相关联的标记的存在。

19.操作装置，其用于操作能与所述操作装置相关联的盒装置，其中

所述操作装置包含第一加热器单元、第二加热器单元、检测单元，其中所述检测单元包含用于接触所述电极并从其获得一个或更多个读数的读数接触器；和

控制器，其包含用于执行权利要求18定义的方法的电子装置，用于控制所述操作装置。

20.操作装置，其用于操作能与所述操作装置相关联的盒装置，其中

所述操作装置包含第一加热器单元、第二加热器单元、检测单元，其中所述检测单元包含用于接触所述电极并从其获得一个或更多个读数的读数接触器；和

控制器，其包含存储器和处理器，使存储在所述存储器中的并能由所述处理器执行的指令具体化，所述指令包含执行权利要求18所定义的用于控制所述操作装置的方法的功能。

21.芯片实验室，其包含根据权利要求12-17中任一项所述的盒装置和权利要求19-20中任一项定义的用于操作和读取所述盒装置的操作装置。

22.计算机程序产品，其包含程序指令，所述程序指令用于使操作装置的控制器执行权利要求18定义的控制操作装置以操作盒装置的方法。

23.电化学DNA检测方法，其包括以下步骤：

i)用至少一个扩增引物扩增靶DNA，其中所述至少一个扩增引物通过其5'末端与标记化学地连接；

ii)使扩增产物变性以产生两个单链DNA(ssDNA)分子，其中至少一个是5'标记的；

iii)将所述扩增产物的5'标记的ssDNA分子与至少一个互补寡核苷酸捕获探针杂交，所述互补寡核苷酸捕获探针通过其3'末端附接至电极；其中所述至少一个互补寡核苷酸捕获探针中的每个包含相同的寡核苷酸序列；以及

iv)确定与杂交产物相关联的标记的存在；

其中与所述互补寡核苷酸捕获探针杂交的ssDNA分子内5'末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离由0至300个核苷酸组成。

24.根据权利要求23所述的电化学DNA检测方法，其中用一对扩增引物扩增所述靶DNA，其中所述引物中的至少一个通过其5'末端与标记化学地连接。

25.用于根据权利要求23-24中任一项所述的电化学DNA检测的装置的用途，其中，所述装置包括：

i)至少一个用于扩增所述靶DNA的引物，其中所述至少一个扩增引物通过其5′末端与标记化学地连接；

ii)至少一个与所述靶DNA序列互补的寡核苷酸捕获探针，其中所述寡核苷酸捕获探针通过其3'末端附接至电极，并且其中所述至少一个互补寡核苷酸捕获探针中的每个包含相同的寡核苷酸序列；和

iii)检测所述标记的装置；

其中当使用时，与所述寡核苷酸捕获探针杂交的ssDNA分子内5'末端和杂交区域的和第一个核苷酸之间的距离由0至300个核苷酸组成。

26.根据权利要求25所述的装置的用途，其中所述装置包含：

i)用于扩增所述靶DNA的一对引物，其中所述引物中的至少一个通过其5'末端与标记化学地连接。

27.用于电化学DNA检测的盒装置，其包括微流体回路，所述微流体回路包含：

微流体扩增室，其是可操作的以引起用至少一个扩增引物的靶DNA的扩增并引起扩增产物的变性以产生两个其中至少一个是5'标记的单链DNA(ssDNA)分子，其中所述至少一个扩增引物通过其5'末端与标记化学地连接；和

微流体传感器室，其包含一个或更多个电极和一个或更多个通过它们的3'末端附接至所述一个或更多个电极的互补寡核苷酸捕获探针，并且是可操作的以引起所述扩增产物的至少一个5'标记的ssDNA分子与所述一个或更多个互补寡核苷酸捕获探针中之一的杂交，其中所述一个或更多个互补寡核苷酸捕获探针中的每个包含相同的寡核苷酸序列，并且一旦杂交，与所述寡核苷酸捕获探针杂交的ssDNA分子内5'末端和杂交区域的第一个核苷酸之间的距离为0至300个核苷酸；其中，

所述微流体传感器室进一步是可操作的以确定与杂交产物相关联的标记的存在。