ES2305483T3 - Deteccion del virus del papiloma humano mediante microarrays (chips) de adn. - Google Patents
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Abstract
Método para detectar la presencia de HPV que comprende los siguientes pasos: a. amplificación y marcaje de parte del gen E1 del HPV, en particular su extremo 3'' b. hibridación del fragmento marcado en un soporte sólido que contiene microarrays con varias sondas de captura específicas del HPV; c. eliminación de los fragmentos marcados no capturados; d. detección de la parte capturada detectable que indica la presencia de ADN con la secuencia de HPV en una muestra.
Description
Detección del virus del papiloma humano mediante
microarrays (chips) de ADN.
La presente invención se enmarca en el campo de
la biología molecular y del diagnóstico y, en particular, se
refiere a un procedimiento de diagnóstico mejorado para la detección
de virus del tipo Virus de Papiloma Humano (HPV) empleando técnicas
de microarray de ADN (chip de ADN). EL método de diagnóstico es útil
para la detección de cualquier tipo de HPV conocido, por ejemplo,
para la detección temprana de lesiones epiteliales
(pre)neoplásticas en el cuello del útero y tumores de la
piel, cabeza y cuello, así como de otras zonas.
Después de la cardiopatía isquémica, el cáncer
es la segunda causa principal global de muerte en Estados Unidos y
Europa Occidental y, a pesar de los recientes avances en su
tratamiento, no existe, para la mayoría de los tipos de cáncer,
ninguna curación milagrosa a la vista. El cáncer causa
aproximadamente el 25% de todas las muertes. Su incidencia sigue
creciendo, reflejando probablemente el aumento de la edad media de
la población. La clave de la supervivencia es el diagnóstico y el
tratamiento tempranos.
Hace aproximadamente dos décadas, el HPV estaba
asociado a los tumores humanos. Desde entonces, se ha detectado en
tumores y lesiones (pre)neoplásticas de distintas zonas,
tales como el cuello del útero, pene, piel, oído medio, ano,
tumores celulares escamosos de la cabeza y región del cuello (mucosa
oral, amígdala, laringe, faringe), pulmón, vejiga urinaria.
Se conocen más de 70 tipos diferentes de HPV con
distintas relaciones con la evolución de una lesión. Algunos de
estos tipos tienen una vinculación más fuerte con la evolución hacia
tumores malignos que otros, por ejemplo el tipo 16 y 18 están
asociados a la displasia intraepitelial cervical de alto grado. Se
denominan tipos de HPV de "alto riesgo" (HR). El número de
HR-HPV se ha ampliado en los últimos años por
ejemplo al tipo 16, 18, 45, 31, 33. Otros tipos están asociados
principalmente a tumores benignos, tal como los tipos 1, 2, 4, 5 y
6 con verrugas benignas de la piel. El tipo 11 de HPV a menudo está
presente en papilomas respiratorios recurrentes juveniles. Con
frecuencia en una serie de casos de un tipo histológico de lesión se
han detectado distintos tipos de HPV. Ocasionalmente se encontraron
múltiples tipos de HPV en una lesión (coinfección). En la
eritroplasia de Querat se encontró el tipo 8 de HPV en combinación
con otros tipos de HPV [Wieland 2000]. En los receptores de
transplantes renales, el número de lesiones queratóticas aumenta
después de varios años. También en estas lesiones se reconoce un
amplio rango de tipos de HPV [De Jong-Tieben 2000].
En la Epidermodisplasia Verruciforme se ha observado el tipo 47 de
HPV [Adachi 1996]. En la distrofia ungueal global, se encontró una
infección del tipo 57 [McCown 1999].
Aunque ya se han descrito diversos tipos
distintos, recientemente se han encontrado variaciones menores en
la composición de ADN en un tipo. Debido a la diversidad genética
del HPV, la utilización de la amplificación de
tipo-específico es poco práctica para los estudios
epidemiológicos, para los cuales es esencial una tipificación
precisa.
Dentro de la región del HPV se han descrito
numerosas secuencias genéticas tanto a nivel de ADN como a nivel de
proteína, tales como E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, L1 y L2. Varios
procedimientos utilizan uno o más de los genes anteriores, por
ejemplo la combinación PGMY LBA, SPF_{10} LiPA GP5+/6+. Sólo uno
está usando una región distinta de la E1, el de nuestra
invención.
Existen diversos procedimientos para la
detección del HPV en general, así como para su tipificación. Muchos
de ellos utilizan la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para
amplificar parte del genoma del HPV. Para la PCR se pueden utilizar
cebadores específicos de tipo. Como alternativa, se utilizan
cebadores que permitan la amplificación de más de un tipo. En
algunas pruebas del HPV, se pretende que los cebadores amplifiquen
todos los tipos (cebadores generales). Estos cebadores pueden
degenerarse hasta cierto punto. Con esta aproximación, una o más
combinaciones de cebadores pretenden abarcar todos los tipos de HPV
(Jacobs y col., J Clin Microbiol 1997
35:791-795; Bauer y col., JAMA 1991
265:472-477). Después de la PCR, se puede
realizar la secuenciación para tipificar el HPV. Una aproximación
alternativa consiste en hibridar los fragmentos de ADN en un filtro
que contiene distintas áreas con distintos fragmentos de ADN. Cada
zona contiene entonces el ADN que corresponde a un tipo. Sin
embargo, pueden tener lugar hibridaciones cruzadas. En teoría, todos
los distintos tipos de HPV pueden ser amplificados y secuenciados
individualmente, pero dependiendo de la cantidad de tipos y
variaciones que deban ser conocidos, esto aumentaría mucho el
volumen de trabajo.
Otras aproximaciones para la detección de los
tipos de HPV consisten en la utilización del análisis del
polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción
combinado con una técnica de amplificación y otra alternativa para
la detección del HPV es la utilización de una técnica de
amplificación en combinación con polimorfismos conformacionales de
una sola hebra (Mayrand, J Clin Microbiol 2000
38:3388-3393). Otras aproximaciones son la
captura híbrida II y la reacción en cadena de la ligasa (Yamazaki y
col., Int J Cancer 2001 94:222-227).
Todavía otra aproximación consiste en detectar
el HPV mediante la hibridación in situ (AmorTegui y col.,
1990 23:301-306; Unger y col., J Histo Chem
Cytochem 1998 46:535-540; Lizard y col., J
Virol. Methods 1998 72:15-25) o por PCR
in situ (Jean-Shiunn Shyu J Surg Oncol 2001
78:101-109). En una diapositiva histológica
o espécimen citológico son necesarios fragmentos de ADN específicos
del tipo de HPV para obtener una señal. Por tanto, en el
reconocimiento teórico de cualquier tipo de HPV, se necesita al
menos un número similar de diapositivas / especímenes para examinar
un tipo de muestra biológica. Sería un procedimiento muy
laborioso.
Desarrollos recientes se refieren a la
utilización, después de PCR, de un ensayo de sonda en línea o blot
en línea para detectar los distintos tipos. La comparación de
distintos ensayos de sondas en línea (PGMY LBA y SPF_{10} LiPA)
revela una diferencia en la sensibilidad para un ensayo: con PGMY
LBA se detectaron más tipos 42, 56 y 59 de HPV y con SPF_{10}
LiPA más tipos 31 y 52 de HPV [Van Doorn 2002]. También para los
cebadores GP5+/6+ se ha descrito recientemente un ensayo blot
inverso en línea que detecta 37 tipos mucosales [Van den Brule
2002, J Clin Microbiol 2002 40:779-787]. La
concordancia entre los distintos métodos es moderada (Meyer y col.,
Dermatology 2000 201:204-211; Vernon J Clin
Microbiol 2000 38:651-655).
Recientemente, se ha desarrollado la tecnología
del "chip" (véase por ejemplo la US 5.445.934). El término
tecnología por "microarray" o "chip" tal como se emplea
aquí alude al análisis de numerosos puntos pequeños para facilitar
el análisis del ácido nucleico a gran escala, lo que permite el
análisis simultáneo de miles de secuencias de ADN. Esta técnica se
considera como una mejora de los métodos existentes, ampliamente
basados en la electrofóresis en gel. Para revisión, véase Nature
Gen. (1999) 21 Suppl. 1. Los métodos de ensayo de blot
en línea y microarray utilizan ambos zonas restringidas que
contienen fragmentos específicos de ADN. Como se conoce en la
técnica, la el blot en línea se realiza normalmente en membranas
(Gravitt y col., J Clin Microbiol 1998
36:3020-3027), mientras que el microarray se
realiza normalmente en un soporte sólido y se puede llevar a cabo
también a escala más pequeña.
La utilidad de los arrays de ADN para los
análisis genéticos ha sido demostrada en numerosas aplicaciones,
incluyendo la detección de mutaciones, genotipificación, el mapeo
físico y la monitorización de la expresión genética. El mecanismo
básico es la hibridación entre arrays de nucleótidos y un ácido
nucleico diana.
Recientemente, el método de
Point-EXACCT fue transferido al formato de
microarray de ADN, donde un soporte de vidrio está recubierto de
forma homogénea con estreptavidina. Este recubrimiento se utiliza
para colocar la sonda biotinilada en la diapositiva de vidrio e
hibridar un ADN diana de una sola hebra con esta sonda de ácido
nucleico. Para la detección, se añade una segunda sonda o el ADN de
una sola hebra ya marcado. La utilización de diapositivas
recubiertas de estreptavidina para el análisis por microarray se
revela en la WO 02/44713, cuyo contenido se incorpora aquí como
referencia.
En conclusión, los tipos de HPV se pueden
distinguir por medio de varias técnicas laboriosas. La presente
invención proporciona otra mejora de la técnica por microarray con
cobertura de todos los tipos conocidos de HPV en el array.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto de la invención, se utiliza una
combinación de oligonucleótidos, permitiendo la amplificación de
una parte del gen E1 de HPV. Esta parte de la secuencia no ha sido
utilizada para la tipificación del HPV anteriormente. Es
especialmente preferente el extremo 3' del gen E1 de HPV, en
particular una región entre los nucleótidos 29 aproximadamente a
188 aproximadamente desde el terminus 3' del gen E1. El tamaño del
gen entero varía desde 1.820 a 1.964 nucleótidos.
Además, la presente invención proporciona un
método para detectar la presencia de HPV que comprende las
siguientes etapas:
- a.
- amplificar y marcar parte del gen E1 de HPV, en particular su extremo 3';
- b.
- hidridar el fragmento marcado en un soporte sólido que contiene microarrays con diversas sondas de captura de HPV específicas;
- c.
- retirar los fragmentos marcados no capturados;
- d.
- detectar las partes capturadas detectables que indican la presencia de una secuencia de ADN de HPV en una muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto de la invención, es posible
llevar a cabo el examen de la integración del HPV en el ADN humano,
una combinación de la región E1 con otra región de HPV tal como E6 o
L1.
En otro aspecto de la invención, se emplean
microarrays para la detección del(de los) tipo(s)
específico(s) de HPV después de la amplificación.
En otro aspecto de la invención, el sistema
permite la lectura rápida con absorción en un microscopio de luz
regular adecuado, para detectar y tipificar el HPV en un
procedimiento.
La presente invención también porporciona un kit
que comprende:
- a.
- un dispositivo adecuado para llevar a cabo el método de detección según la presente invención tal como se reivindica;
- b.
- un número de cebadores para la amplificación de la región E1 del HPV;
- c.
- un número de soportes sólidos que contienen sondas de captura de HPV.
Este y otros aspectos de la invención se exponen
con más detalle en la descripción siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 muestra una representación
esquemática de las secuencias de HPV que contienen regiones con
grupos de cebadores generales. La representación esquemática está
modificada a partir de una imagen presentada por Kleter, Utrecht,
24 de enero de 2002. La posición desde los cebadores CWZ en la
región E1 es claramente diferente de otros lugares.
La Figura 2 muestra una representación
esquemática del procedimiento por microarray. A partir de una
muestra clínica o de otra muestra, se extrae ADN (A), se amplifica
y marca (B); paralelamente se ha preparado un microarray que
contiene todos los subtipos de HPV (C). El ADN marcado es hibridado
en el array (D). El ADN y los demás componentes que no están
asociados se eliminan por lavado. Los fragmentos restantes se
hibridan en base a las secuencias de HPV correspondientes y se
visualizan basándose en la presencia de la marca. Luego, los puntos
con marca se pueden distinguir de los sin marca y se utilizan para
la detección de los tipos de HPV (E, F).
La Figura 3 muestra un ejemplo de detección de
HPV 16 en el modo de fluorescencia y absorción.
\vskip1.000000\baselineskip
Ctl de detección >= control positivo por
triplicado.
HPV 16 >= puntos con sondas de captura para
HPV 16 por triplicado visualizados tal como se describe en el
procedimiento.
Sensibilidad >= señal de tres concentraciones
distintas de sondas de captura de HPV en triplicado.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona una mejora
significativa del método de detección de HPV. Se utiliza una nueva
combinación de oligonucleótidos para la detección de HPV para la
amplificación y la detección.
El término "producto de amplificación" se
refiere a un fragmento específico de ADN de doble hebra que se
produce en un proceso destinado a la multiplicación de aquel
fragmento. Se incorporan todos los métodos de amplificación
conocidos.
El término "HPV específico" se emplea aquí
para la combinación de los grupos de cebadores y la sonda de
detección. La longitud de la sonda de detección puede ser demasiado
corta para ser específica para el HPV en sí misma cuando se examina
frente a toda la información de los bancos de genes. Sin embargo,
después de la amplificación con sondas específicas de HPV, la
posibilidad de detectar ADN marcado distinto del de HPV es
despreciable. Los oligonucleótidos para la captura, sin embargo,
pueden no ser únicos.
Los términos "cebador y sonda" tal como se
utilizan aquí se refieren a los oligonucleótidos. El cebador se
utiliza para el fragmento de ADN de una sola hebra que se emplea
para la amplificación. La sonda se utiliza para el fragmento de ADN
de una sola hebra que tiene una función de captura en el soporte
sólido. El término "sonda de detección" tal como se emplea
aquí acentúa la función de captura.
El término "cebador o sonda degenerada"
indica un oligonucleótido que en ciertas posiciones contiene una
mezcla de distintos nucleótidos o un análogo de base.
Los términos "incubación de proteínas e
hibridación de ácidos nucleicos" tienen componentes similares, es
decir la difusión y el enlace de moléculas a sus dianas
específicas. Con "difusión", tal como se emplea aquí, se
indica que es el mismo proceso para los ácidos nucleicos, proteínas
y demás moléculas que interactúan con una diana en el soporte
sólido.
El término "visualización" indica cualquier
manera mediante la cual puede visualizarse un producto de
hibridación con hapteno de forma no radioactiva con cualquier
sistema de microscopía.
La diana del soporte sólido se compone de una
parte sólida con uno o más tipos diferentes de moléculas unidas es
decir inmovilizadas, tales como ácidos nucleicos, proteínas, células
completas, partes de células o tejidos.
Los términos "cámara de incubación y cámara de
hibridación", tal como se emplean aquí, son sinónimos y se
refieren al espacio tridimensional por encima de la diana presente
en el soporte sólido, donde el soporte sólido es parte integrante
de la cámara de incubación / hibridación.
Los términos técnica o tecnología por
"microarrays" o "chip", tal como se emplean aquí, son
sinónimos y pretenden indicar el análisis de una pluralidad de
pequeños puntos de ácidos nucleicos distribuidos en una pequeña zona
superficial para facilitar el análisis del ácido nucleico a gran
escala, permitiendo así el análisis simultáneo de miles de
secuencias de ADN y/o ARN. Los términos son aplicables del mismo
modo al análisis de péptidos o proteínas de forma similar.
El término "fluido de incubación" pretende
indicar el fluido que contiene por ejemplo el sustrato que ha de
unirse al soporte sólido.
El término "fluido de prueba" pretende
indicar el volumen de cualquier componente fluido necesario para el
experimento/prueba que deba llevarse a cabo con el fluido por todo
el sistema.
Los términos "inmunohistoquímica" e
"inmunocitoquímica" pretenden indicar, como sinónimos, la unión
de anticuerpos a haptenos, normalmente partes de tejido o células
presentes en el soporte sólido, pero también, tal como se utiliza
aquí, es el procedimiento de visualización después de la unión al
hapteno.
Los términos "HPV de bajo y alto riesgo"
indican una diferencia en relación con la posibilidad de desarrollo
de malignidad. Especialmente aplicados para el cuello del útero. En
cuanto al alto riesgo, se trata de una mayor posibilidad de
desarrollo de malignidad que para los tipos de HPV de bajo
riesgo.
Todas las secuencias genéticas del HPV indicadas
en Octubre de 2000 (E1, E2, E4, E5, E6, E7, L1 y L2) (tanto a nivel
de ADN como de proteína) se analizaron separada y sistemáticamente
para seleccionar una región del genoma de HPV que permitiera la
subdivisión de todos los tipos de HPV en clusters de tipos de HPV.
En base a la homología de secuencias al nivel de proteína y/o de
ADN, se pueden asignar varios tipos de HPV no asignados
anteriormente como HPV de bajo riesgo o de alto riesgo. La
subdivisión de todos los tipos de HPV tiene como fin distinguir de
la forma más amplia posible entre los tipos mucosales de HPV de bajo
y alto riesgo.
Se utilizaron los siguientes criterios. Cada
cluster tenía que contener al menos dos regiones con un grado
relativamente alto de homología de secuencia de ADN entre los
distintos tipos de HPV en el cluster para permitir la formulación
de cebadores de PCR "comunes". Además, estos sitios de
localización de cebadores de PCR potenciales debían ser diferentes
en lo posible entre los distintos clusters para permitir la
amplificación de tipos de HPV específicos del cluster y/o
específicos de riesgo. Otro criterio era que entre los
emplazamientos de los cebadores de PCR potenciales hubiese
suficiente heterogeneidad entre las secuencias de ADN como para
seleccionar las secuencias de ADN que permitieran discriminar entre
los distintos tipos de HPV. En base a estos criterios, se eligió el
gen E1 del HPV para el diseño del ensayo. Posteriormente, se
distinguieron tres grupos principales de tipos de HPV: i) tipos
mucosales de HPV de alto riesgo, ii) tipos mucosales de HPV de bajo
riesgo y iii) los tipos restantes de HPV. Se formularon seis
clusters. El cluster A contenía todos los tipos conocidos de HPV de
bajo riesgo. Los clusters E y F contenían casi todos los tipos de
HPV de alto riesgo, los clusters B y C contenían los tipos
restantes de HPV y el cluster D contenía tanto los tipos de HPV de
alto riesgo como algunos de los tipos restantes de HPV. Los
ejemplos de cebadores de cada cluster se muestran en la Tabla 1
(SEQ ID NO: 1, etc.) con y sin etiqueta.
La amplificación de los productos E1 de HPV se
lleva cabo adecuadamente mediante PCR o por otro método conocido
por los especialistas en la técnica. Los cebadores se pueden marcar,
diseñar con una etiqueta o no marcarse. En los últimos dos casos,
se necesita un segundo paso para añadir una marca al producto de
amplificación. Estas técnicas son bien conocidas también por los
especialistas.
Se ha descubierto ahora sorprendentemente que la
tecnología por microarrays se puede aplicar con éxito a la
detección de uno o más tipos de HPV dentro de una muestra,
permitiendo así el análisis de muestras clínicas a una escala de
operación mucho más amplia. Normalmente, la presencia de uno o más
tipos de HPV en una muestra se pone de manifiesto en un día. La
técnica de array de oligonucleótidos de ADN de acuerdo con la
presente invención funciona con altas concentraciones de todos los
productos. Los distintos puntos son caracterizados por sondas
específicas de HPV. Una vez establecido el principio, las
concentraciones se optimizan paso a paso para permitir una eficacia
más alta del análisis por array del HPV.
Las composiciones de los cebadores y de los
reactivos utilizados se determinan y optimizan mediante
experimentación rutinaria. El modo de detección puede variar, pero
la invención se pone en práctica adecuadamente con microscopía de
absorción y demás, por ejemplo con microscopía de exploración por
fluorescencia y láser. Se utiliza preferentemente un modo de
fluorescencia por razones de cuantificación, mayor sensibilidad,
mayor rango dinámico, en lugar del modo de extinción. Este último
tiene la ventaja de que el resultado se hace visible con microscopía
de luz regular.
- -
- Detección de infección por HPV.
- -
- Detección de infección única o múltiple en el mismo análisis.
- -
- Para detectar la recurrencia después del tratamiento del cáncer cervical o displasia.
- -
- Para detectar la infección por HPV en la exploración cervical.
- -
- Para detectar el HPV en caso de citología cervical con células atípicas de importancia indeterminada (células ASCUS).
- -
- Para detectar el HPV de tipo de alto riesgo en anomalías epiteliales cervicales.
- -
- Para detectar la presencia o ausencia del HPV en el diagnóstico diferencial del carcinoma de origen desconocido.
Algunas realizaciones de la presente invención
además se detallan e ilustran a continuación.
En una realización preferente, se marcan las
secuencias diana del HPV en una reacción de PCR asimétrica después
de una amplificación PCR específica habitual para HPV. Como
etiquetas existen varias opciones, que son bien conocidas por los
expertos en la técnica. En la PCR asimétrica se emplean cebadores de
oligonucleótidos inversos modificados por
5'-digoxigenina que reconocen una etiqueta. Las
concentraciones de cebadores pueden variar. Las concentraciones
adecuadas son, respectivamente, de 0,05 y 1 \muM para los
cebadores directos e inversos. Las variaciones en estas condiciones
son bien conocidas por los especialistas en la técnica.
En otra realización se pueden emplear también
otras formas de amplificación. Los ejemplos consisten en PCR de
círculo rodante, amplificación basada en la secuencia de ácidos
nucleicos, amplificación mediada por transcripción. Estas son bien
conocidas por los especialistas en la técnica.
En una realización alternativa, como marca
existen otras opciones, como la biotina. La elección puede depender
de la forma en la que los oligonucleótidos de captura están unidos
al soporte sólido (véase a continuación).
En una realización alternativa, los productos de
amplificación se pueden marcar internamente utilizando
digoxigenina-11-dUTP que sustituye
dTTP (o una mezcla de los dos últimos nucleótidos) en la mezcla de
amplificación de la PCR u otras marcas bien conocidas por los
especialistas en la técnica.
Todavía en otra realización alternativa, los
productos de amplificación se pueden marcar directamente con un
grupo fluorescente (por ejemplo Cy-tintes,
fluoresceína, rhodamina, rojo texas) utilizando cebadores inversos
modificados (marcados en el extremo) o nucleótidos modificados
(marca interna) en la PCR.
En otras realizaciones, para marcar los puntos
cuánticos se pueden utilizar análogos que permiten un tipo de
reacción de coloración plata u oro, análogos nucleares que permiten
la detección basada en infrarrojos o interferencias. Estos son bien
conocidos por los especialistas en la técnica.
En otra realización, para preparar ADN de una
sola hebra, los productos de amplificación se pueden marcar de una
de las maneras anteriormente mencionadas utilizando concentraciones
iguales de cebadores en la reacción por PCR. En este caso, los
productos de amplificación de ADN de doble hebra deben ser
desnaturalizados (por ejemplo mediante calor), rápidamente
enfriados sobre hielo y utilizados en la mezcla de hibridación. Se
pueden emplear también otras formas de preparación de ADN de una
sola hebra después de la amplificación. Estas son bien conocidas
por los especialistas en la materia.
En una realización preferente, los productos de
amplificación antes de una segunda amplificación pueden ser
purificados después de un primer procedimiento de amplificación. Se
puede utilizar esta aproximación después de una amplificación
inicial sin marca, para marcar posteriormente el producto de
amplificación.
En general, los oligonucleótidos de captura se
pueden unir de distintas formas a un soporte sólido o se pueden
sintetizar directamente sobre el soporte sólido mediante síntesis
fotodirigida.
En una realización preferente, se utilizan
diapositivas revestidas de estreptavidina como soporte sólido para
el análisis de microarrays, tal como se describe en la WO 02/44713,
que se incorpora aquí como referencia. Se utilizan diapositivas de
vidrio para microscopio recubiertas de estreptavidina como soporte
sólido en este procedimiento de microarray.
En otra realización, se pueden utilizar otras
formas de unión de las sondas de captura al soporte sólido. Los
ejemplos son: entrecruzamiento del ADN a las diapositivas aminadas
(silanizadas) mediante cocción del array a 80ºC durante
2-4 horas. Se puede utilizar el entrecruzamiento UV
como paso adicional (también para: diapositivas revestidas de
poli-L-lisina); otros soportes
sólidos tales como las diapositivas revestidas de
amino-silano, diapositivas revestidas de acrilamida,
diapositivas epoxi activadas, diapositivas aldehído activadas,
diapositivas activadas por éster de NHS, diapositivas activadas por
hidrogel epoxi, diapositivas activadas por isotiocianato,
diapositivas activadas por mercaptosilano, diapositivas de vidrio
revestidas de nitrocelulosa son bien conocidas por los
especialistas en la técnica.
La concentración de oligonucleótidos modificados
por 5'-biotina puede variar, pero, en una
realización preferente, la concentración puede ser 12 \muM, en 3
x SSC / 1,5M de betaína [SSC; 1 x (8,76 g/l de NaCl, 4,41 g/l de
citrato de sodio), pH 7,0].
Existen diversos robots para el posicionamiento
de oligonucleótidos ya sintetizados en el soporte sólido. Estos son
conocidos de los especialistas en la técnica. Utilizamos un robot de
punteado de arrays SDDC-2 de Engineering Services
Inc. (ESI, Toronto, ON, Canadá) y agujas de micropunteado Stealth
(SMP3, Arraylt). Se supone que estas agujas suministran un volumen
de \sim 0,6 nl en cada lugar de punteado, lo que resulta en puntos
de \sim 100 \mum de diámetro según el fabricante.
En una realización preferente, los puntos de las
diapositivas se imprimieron por triplicado por razones de control
de calidad, pero esto puede variar desde uno a 10 o más. El espacio
entre los puntos puede variar dependiendo del software, pero puede
ser tan pequeño como de 10 micras y ser tan grande como desde 400
\mum a más de 1 mm.
En una realización preferente, utilizamos una
humedad relativa de entre el 45% y el 60% durante el punteado y se
mantiene la temperatura a 22ºC, pero estas condiciones pueden
variar.
Los puntos que contienen una suspensión de
oligonucleótidos de ADN modificados por 5'-biotina
se imprimen en diapositivas de vidrio con estreptavidina utilizando
un robot de micropunteado comercial (SDDC-2,
ESI/Virtek). Utilizamos soluciones 12 \muM de oligonucleótidos
biotinilados para el punteado, pero se ha demostrado que
6-20 \muM de oligonucleótidos en las soluciones de
punteado producían resultados similares.
En una realización preferente, se puede añadir
en el tampón de punteado betaína. La concentración de betaína puede
variar, pero una concentración de 1,5M a 3 x SSC es apropiada. Con
las soluciones de punteado de ADN obtenemos puntos claramente
visibles (visualmente y por microscopía de luz), haciendo de este
punto el procedimiento un punto que da validez a la calidad del
array. Después de someter a prueba la calidad del array mediante
esta comprobación visual, se puede eliminar por lavado la betaína
para almacenar durante tiempo las diapositivas sin que haya una
influencia negativa sobre el oligonucleótido enlazado, la
hibridación posterior o el fondo después de la visualización.
En otra realización, se pueden utilizar tampones
de punteado sin betaína. Estos son bien conocidos por los
especialistas en la técnica.
En una realización preferente, se utilizaron
oligonucleótidos modificados por 5'-biotina para la
impresión en el array. Se utilizó un brazo separador de 16-átomos
para unir el grupo biotina a los oligonucleótidos, mientras que se
empleó un brazo espaciador de 12 átomos en la unión entre la
digoxigenina (DIG) y el penúltimo nucleótido del extremo
5'-terminal. La longitud del espaciador puede variar
de 1 a 16 c-átomos.
Basándose en una experiencia previa con
K-ras, se diseñaron las sondas para el HPV de forma
similar al K-ras, es decir que se acopló
directamente la marca de biotina con un espaciador a un fragmento
específico de HPV de 20 mer. Los experimentos iniciales no tuvieron
éxito. Posteriormente, el fragmento específico del HPV se aumentó
hasta una longitud de 40 nucleótidos. Esto resultó en señales más
fuertes, pero incrementó también la reactividad cruzada. Por tanto,
hacía falta un espaciador adicional entre el oligonucleótido con el
espaciador de biotina y el fragmento específico del HPV. Además, el
HPV de 40-mer se puede reducir de tamaño, con lo
que mejora la calidad, ya que se puede reducir la reactividad
cruzada. en la Tabla 1 siguiente se muestran los cebadores y las
sondas.
En una realización preferente, los
oligonucleótidos de captura modificados por
5'-biotina tienen una longitud de 35 nucleótidos.
El extremo 5' de la secuencia de oligonucleótidos empieza por un
15-mer que contiene una repetición triple [TTTTC],
seguido por un tramo de nucleótidos específicos del tipo de HPV. La
longitud de la primera parte con repeticiones puede variar desde
ninguna repetición (es decir 0 nucleótidos) a más de 10
repeticiones. Esta parte tiene una segunda función espaciadora y
optimiza la hibridación. En este caso, las repeticiones son
suficientes para una señal adecuada. Además, la composición del
nucleótido puede ser distinta a TTTTC, pero debe seleccionarse de
modo tal que no tenga lugar ninguna hibridación cruzada con otros
fragmentos relevantes de ADN en el ensayo. Para una sonda de captura
específica del HPV la longitud espaciadora no necesita ser
constante, sino que también puede variar.
En una realización preferente, las secuencias
específicas del HPV tienen una longitud de 20 nucleótidos. Éstas se
eligieron a partir de alineaciones de secuencias múltiples después
de ordenar y agrupar en clusters todas las secuencias del gen E1
del HPV y se compararon contra todas las bases de datos de
nucleótidos del colaborador NCBI para comprobar su unicidad entre
las cepas del HPV (NCBI: Centro Nacional de Información
Biotecnológica). Dentro de la secuencia específica del HPV de los
oligonucleótidos de captura de dos tipos estrechamente asociados,
al menos 1 pero preferentemente 2 posiciones son únicas al tipo de
HPV.
En otra realización, la longitud de los 20
nucleótidos específicos del HPV puede variar. Esta puede ser más
corta, más larga o se pueden utilizar combinaciones de distintas
longitudes.
En otra realización, las sondas de captura se
componen de ácidos nucleicos de péptidos modificados en 5' (PNA).
Estos pueden ser utilizados debido a su unión de gran afinidad.
También puede estar presente en el array una combinación de
oligonucleótidos modificados en 5' y PNA.
Con el propósito de reconocer dónde se localizan
los puntos en la diapositiva, utilizamos oligonucleótidos
marcadores con oligonucleótidos modificados por
5'-biotina de 40 nucleótidos de longitud, con una
modificación por digoxigenina en el penúltimo nucleótido
3'-terminal. Pero la longitud de este
oligonucleótido marcador puede variar y ser más larga o más
corta.
En otra realización, la secuencia de
oligonucleótidos puede ser complementaria a aquellas definidas en la
tabla. Esto es válido para el cebador y las sondas.
Los arrays punteados se mantuvieron en un lugar
seco y frío (refrigerado) hasta su utilización. Los arrays se
almacenaron durante más de 3 meses y produjeron resultados similares
a arrays nuevos.
En una realización preferente, los arrays
impresos se lavan antes de la hibridación con una solución salina
tamponada con fosfato [PBS; 1 x (0,21 g/l de KH_{2}PO_{4}, 9 g/l
de NaCl, 0,73 g/l de Na_{2}HPO_{4}\cdot7H_{2}O, pH 7,4)]
que contiene 0,5 ml/l de Tween 20 durante 10 minutos para eliminar
los materiales no unidos. También son adecuados otros tampones de
lavado como es bien conocido por los especialistas en la
técnica.
En una realización preferente se utilizaron
placas de cubierta desechables (Shandon) para todos los pasos de
hibridaciones, incubaciones, lavado y detección inmunoquímica. Las
placas de vidrio para microscopio se ajustan en estas placas de
cubierta y se mantienen en posición vertical durante todo el
procedimiento. Existe un espacio de 80 micras en la parte superior
de la placa cuando se fija en la placa de cubierta (volumen
aproximado de 80 \mul) y la mezcla de incubación queda retenida
por las fuerzas capilares. El lavado de las placas se realiza
sencillamente mediante la adición de PBS-T hasta el
reservorio superior del tampón (aproximadamente 3 ml) y se hace
pasar por el array.
En otra realización se pueden utilizar otros
portaplacas o la placa se puede incubar horizontalmente. En estas
situaciones, la cantidad de fluido de hibridación puede variar.
En una realización preferente, los microarrays
se prehibridaron en un tampón que contenía 3,3 x SSC / 1,7 mM de
EDTA / 17 mM de Hepes / un 0,12% de Tween 20, pH 7,3 durante 5
minutos, a temperatura ambiente, y se hibridaron en la misma
solución con la sonda durante 1 hora a 22ºC. La solución de
hibridación con la sonda contenía un 40% en volumen de los
productos totales de PCR no purificados de la PCR asimétrica por
hibridación en el mismo tampón, pero esta proporción del 40% puede
variar. La incubación para la hibridación se mantuvo durante 1 hora
a temperatura ambiente (alrededor de 22ºC), pero el tiempo y la
temperatura pueden variar. La mezcla de hibridación puede ser una
composición de distintas reacciones PCR y el tampón de hibridación.
O, para distintas reacciones PCR, se puede realizar una hibridación
en serie.
En otra realización, se pueden utilizar otros
tampones y temperaturas de hibridación. Estos son bien conocidos
por los especialistas en la materia.
En una realización preferente se lleva a cabo un
lavado después de la hibridación para reducir la hibridación
cruzada de la diana a los oligonucleótidos de captura desacoplados.
Se efectúan cinco lavados posteriores de 5 minutos cada uno, a
temperatura ambiente, con PBS-Tween 20 (0,05%); 2 x
SSC / 0,1% de SDS; 1 x SSC / 0,1% de SDS; 0,1 x SSC; 0,05 x
SSC.
En otra realización, el procedimiento de lavado
después de la hibridación puede realizarse a otras temperaturas,
normalmente más altas.
En una realización preferente, el array de HPV
se diseña con una sonda de control visual (VCP) que contiene la
marca de biotina en el extremo 5' y un hapteno visualizador en el
penúltimo extremo 3'. De hecho, se trata de un control positivo
interno para el procedimiento de visualización y puede proporcionar
también información sobre la posición de las sondas específicas del
HPV y demás sondas de control negativo. La VCP se puede puntear en
varias concentraciones, proporcionando información sobre el rango
dinámico del procedimiento de visualización en cada
experimento.
En otra realización, se pueden utilizar también
otras sondas de control. Estas son bien conocidas por los
especialistas en la materia.
En una realización preferente, como control para
la hibridación se puede añadir a la mezcla de hibridación un
oligonucleótido antisentido marcado Cy3, que reconoce el tramo de 15
nucleótidos que precede a la secuencia específica del HPV de los
oligonucleótidos de captura. La longitud de este array puede ser más
larga, dependiendo de la longitud del segundo espaciador, o más
corta.
En otra realización, este oligonucleótido
antisentido se puede añadir al array después de la
Dig-detección y la visualización, seguido de un
corto paso de lavado con PBS-T.
En una realización preferente, después de la
hibridación y el lavado, en los grupos de digoxigenina que quedaban
en el array de la PCR marcada se incubaron los productos mediante
dilución al 1:100 de un anticuerpo monoclonal de ratón para la
digoxigenina (clon anti-digoxigenina 1.71.256, Roche
Molecular Biochemicals, Almere, Holanda) de acuerdo con el
protocolo de los fabricantes, seguido de una incubación de 45
minutos con una dilución 1:20 de inmunoglobulinas conejo
anti-ratón conjugadas con fosfatasa alcalina (DAKO,
Amsterdam, Holanda). Se utilizó el kit de sustrato de fosfatasa
alcalina Vector Blue (SK-5300, Vector Laboratories,
Burlingame, CA, USA) para detectar la actividad de la fosfatasa
alcalina según las instrucciones del fabricante. El Vector Blue
produce un producto de reacción azul que se puede ver mediante
microscopía fluorescente o de campo claro. Las diapositivas
analizadas con microscopía de luz (modo de absorción) se montaron
con un medio de montaje de base acuosa Imsol Mount (Klinipath,
Duiven, Holanda). Las diapositivas analizadas con un escáner láser
(modo de fluorescencia) se lavaron dos veces durante 5 minutos en
PBS que contenía 0,5 ml/l de Tween 20, se enjuagaron en agua, se
lavaron durante 3 minutos en etanol al 100% y se secaron al aire en
oscuridad. El producto de reacción Vector Blue se detecta como
fluorescencia roja mediante un láser que se excita a 635 m de
longitud de onda. Las sustancias químicas mencionadas anteriormente
no son restrictivas en ningún sentido, pero son ejemplos de
componentes que se pueden utilizar para un resultado adecuado.
En otra realización, se pueden utilizar otros
productos químicos de visualización que son bien conocidos por los
especialistas en la técnica. Un ejemplo es el kit de sustrato de
fosfatasa alcalina Vector Blue (SK-5100), que se
puede emplear para producir puntos rojos en microscopía de campo
claro y puntos verdes en el modo de detección por fluorescencia (a
una excitación de 532 nm).
En una realización preferente, las diapositivas
de modo fluorescente se escanearon con el escáner láser de
microarrays Genepix 4000A y el análisis de datos se realizó con el
software GenePix Pro 3.0 de Axon Instruments Inc. (Foster City,
CA). La exploración muestra una imagen del array completo sin perder
la imagen global. Este escáner utiliza un láser de 532 nm para
excitar Cy3 y de 635 nm para excitar Cy5. La luz verde del láser de
532 nm se utilizó también para excitar el producto de reacción de
fosfatasa alcalina, así como el Vector Red, y la luz del láser de
635 nm se utilizó para excitar el producto de reacción de Vector
Blue y fosfatasa alcalina. Las imágenes de dieciséis bits TIFF de
resolución de 10 \mum fueron sustraídas para observar la
intensidad de fondo local. El software no normaliza los datos. Se
utilizó el valor medio de las intensidades características de tres
puntos para calcular las intensidades medias de señal de cada
concentración de ADN punteada. Las diapositivas en el modo de
absorción fueron analizadas también semicuantitativamente mediante
microscopía de luz regular (utilizando una ampliación total de
25x).
En otra realización, las diapositivas se pueden
fotografiar con una cámara CCD fijada a un microscopio óptico.
Cuando se utilizan adaptadores específicos o lentes de baja
ampliación, todo el array puede ser visualizado y documentado de
una sola vez. Se pueden emplear también otros sistemas
comercialmente disponibles y pueden ser determinados fácilmente por
los especialistas en la técnica.
En una realización preferente, el array se
visualiza mediante microscopía convencional de campo claro. Así,
los escáneres mencionados anteriormente no son obligatorios para el
análisis. Esta instalación permite la utilización del array de HPV
en cualquier laboratorio moderno de patología donde se facilita la
PCR y la inmunohistoquímica.
En otra realización, para la formación de
imágenes se pueden utilizar los métodos basados en infrarrojo,
contraste de fases o interferencia. Estos son bien conocidos por
los especialistas en la técnica.
Aunque la presente invención se describe aquí
según algunas realizaciones típicas, se entenderá que se pueden
realizar variaciones sin apartarse del espíritu de la invención. Por
ejemplo, el array de ADN de HPV según la invención se describe aquí
utilizando fosfatasa alcalina para la detección con microscopía por
absorción. Evidentemente, con propósito de visualización, esta
enzima puede ser sustituida por una sustancia fluorescente o por
otro grupo detectable conocido. Esto será según el sistema de
detección microscópico normalmente utilizado. Las características
de prueba del sistema pueden depender de la combinación empleada.
Estas variaciones son evidentes para el especialista en la técnica
y están todas incluidas en el alcance de la presente invención.
El presente descubrimiento debe considerarse en
todos los aspectos como ilustrativo y no restrictivo, indicándose
el alcance de la invención a través de las reivindicaciones
adjuntas, y todos los cambios que entran en el significado y rango
de equivalencia pretenden estar incluidos aquí.
<110> B.V. de diagnóstico de puntos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Detección del Virus del Papiloma
Humano con microarray de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 03/103 PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/EP 03/
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-04-16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: basada en la secuencia de ADN genómico del Virus del
Papiloma Humano
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<220>
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<221> enlace del cebador
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<222> (1)..(20)
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<400> 1
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\hfill20
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<210> 2
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: basada en la secuencia de ADN genómico del Virus del
Papiloma Humano
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<221> enlace del cebador
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<210> 3
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: basada en la secuencia de ADN genómico del Virus del
Papiloma Humano
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: basada en la secuencia de ADN genómico del Virus del
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Artificial: basada en la secuencia de ADN genómico del Virus del
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<213> Secuencia Artificial
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Artificial: basada en la secuencia de ADN genómico del Virus del
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: basada en la secuencia de ADN genómico del Virus del
Papiloma Humano
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<220>
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<221> enlace del cebador
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<222> (1)..(20)
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<220>
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<221> base modificada
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<222> (2)
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<223> i
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<220>
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<221> base modificada
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<222> (7)
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<223> i
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<220>
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<220>
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\hskip-.1em\dddseqskipcntggtncan attaganttg
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: basada en la secuencia de ADN genómico del Virus del
Papiloma Humano
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<220>
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<221> enlace del cebador
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<222> (1)..(18)
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<210> 14
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: basada en la secuencia de ADN genómico del Virus del
Papiloma Humano
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<220>
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<221> enlace del cebador
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: basada en la secuencia de ADN genómico del Virus del
Papiloma Humano
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<220>
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<221> enlace del cebador
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: basada en la secuencia de ADN genómico del Virus del
Papiloma Humano
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace del cebador
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<222> (1)..(22)
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<221> base modificada
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<222> (2)
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<223> i
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<223> i
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<221> base modificada
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<222> (8)..(9)
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<223> i
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<220>
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<221> base modificada
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<222> (11)
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<223> i
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<220>
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<221> base modificada
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<222> (20)
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<223> i
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: basada en la secuencia de ADN genómico del Virus del
Papiloma Humano
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace del cebador
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<211> 27
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: basada en la secuencia de ADN genómico del Virus del
Papiloma Humano
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace del cebador
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<222> (1)..(27)
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<221> base modificada
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: basada en la secuencia de ADN genómico del Virus del
Papiloma Humano
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<220>
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<221> enlace del cebador
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<222> (1)..(26)
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<220>
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<221> base modificada
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<223> i
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<221> base modificada
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<222> (21)
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<223> i
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: basada en la secuencia de ADN genómico del Virus del
Papiloma Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace del cebador
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: basada en la secuencia de ADN genómico del Virus del
Papiloma Humano
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace del cebador
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: basada en la secuencia de ADN genómico del Virus del
Papiloma Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace del cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
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<400> 22
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<211> 26
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: basada en la secuencia de ADN genómico del Virus del
Papiloma Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace del cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(26)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill26
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<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttcttttc ttttcagagg agcaggacga caatg
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<210> 25
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<211> 35
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<210> 26
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<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 26
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\hfill35
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<211> 35
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<212> DNA
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\newpage
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<400> 51
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<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttcttttc ttttcctttg tattataaag ctaaa
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
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<211> 35
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Superficial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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<213> Secuencia Artificial
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Artificial: sonda de detección, basada en la secuencia de ADN
genómico del Virus del Papiloma Humano
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genómico del Virus del Papiloma Humano
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genómico del Virus del Papiloma Humano
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genómico del Virus del Papiloma Humano
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Claims (5)
1. Método para detectar la presencia de HPV que
comprende los siguientes pasos:
- a.
- amplificación y marcaje de parte del gen E1 del HPV, en particular su extremo 3';
- b.
- hibridación del fragmento marcado en un soporte sólido que contiene microarrays con varias sondas de captura específicas del HPV;
- c.
- eliminación de los fragmentos marcados no capturados;
- d.
- detección de la parte capturada detectable que indica la presencia de ADN con la secuencia de HPV en una muestra.
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque las primeras sondas de ácido nucleico
están impresas en el soporte de vidrio o están construidas en el
soporte mediante síntesis de oligonucleótidos
foto-dirigidos.
3. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque se utiliza una combinación de la región
de E1 con otra secuencia de HPV.
4. Kit que comprende:
- a.
- un dispositivo adecuado para llevar a cabo el método de detección de acuerdo con la presente invención según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3;
- b.
- un número de conjunto de cebadorespara la amplificación de la región E1 del HPV;
- c.
- uno o más soportes sólidos que contienen sondas de captura.
5. Kit según la reivindicación 4, que además
comprende:
- d.
- reactivos para la intensificación de la señal.
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