JP6248633B2 - 標的核酸の検出方法 - Google Patents
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Description
(1)標的核酸とハイブリダイズする検出プローブ及び支持体に固定された捕捉プローブとを用いるサンドイッチハイブリダイゼーション法による標的核酸の検出方法であって、検出プローブの核酸分子中の少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されており、標的核酸と検出プローブとをハイブリダイズさせて形成された複合体に光照射して、検出プローブ中の光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させ、該共有結合を形成させた複合体を、支持体に固定された捕捉プローブとハイブリダイズさせる工程を有する、検出方法。
(2) 捕捉プローブの核酸分子中の少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されており、前記共有結合を形成させた複合体を捕捉プローブとハイブリダイズさせて形成された複合体に光照射して、捕捉プローブ中の光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させる工程を更に有する、(1)に記載の検出方法。
(3)光反応性基が3−シアノビニルカルバゾール基、p−カルバモイルビニルフェノール基、4,5’,8−トリメチルソラレン基及びN3−メチル−5−シアノビニルウラシル基から選択される少なくとも1種である、(1)又は(2)に記載の検出方法。
以下の実施例、比較例に用いた核酸を表1に示す。
実施例1では、標的核酸T−01と、光反応性基が導入された検出プローブD−01及びD−02とをハイブリダイズさせ、形成された複合体に光照射して検出プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させ、この複合体を捕捉プローブC−01とハイブリダイズさせて、標的核酸を検出した。
東レ社製の「3D−Gene」(登録商標)の基板(256柱基板)に、捕捉プローブとしてC−01を固定したものを用いた。
T−01(10μM)と、D−01(100μM)及びD−02(100μM)を、T−01に対するD−01、D−02の各使用量が1モル当量となるように混合し、10mMリン酸バッファー(100mM塩化ナトリウム含有)で希釈した。得られた溶液を0.1、1、100amolの3通りのモル濃度になるよう調整(各々のトータル液量5μL)し、それぞれ以下の操作を行った。
実施例1において、検出プローブとしてD−01の代わりにD−03を使用し、D−02の代わりにD−04を使用し、またハイブリダイズさせて形成された複合体に光照射して検出プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させる工程を行わなかったこと以外は、実施例1と同様の操作を行い、標的核酸T−01に対して1モル当量のD−03及びD−04を混合したものを調製し、標的核酸T−01を検出した。
参考例1では、標的核酸T−01と、検出プローブD−03及びD−04とをハイブリダイズさせて形成された複合体を、光反応性基が導入された捕捉プローブC−02とハイブリダイズさせ、形成された複合体に光照射して捕捉プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させて、標的核酸を検出した。
アビジンコートビーズ(サーモサイエンティフィック社製)に、捕捉プローブとしてC−02を固定し、ビオチン水溶液でブロッキング処理したものを用いた。
T−01(10μM)と、検出プローブとしてD−03(100μM)及びD−04(100μM)を、T−01に対するD−03、D−04の各使用量が1モル当量となるように混合し、10mMリン酸バッファー(100mM塩化ナトリウム含有)で希釈し、トータル液量200μL、T−01の終濃度を0.25μMとした。この混合溶液をヒートブロックで95℃、5分間保持し、その後ゆっくりと室温まで冷却した。「オムニフィット」(株式会社アイシスの登録商標)ガラスカラム(内径3mm、両末端に2μmのステンレスフリッツのカラム栓)に、C−02を固定したビーズを入れ、上記混合溶液(200μL)を加えた後、5分間攪拌しながら、ブラックライトで365nmの光を照射した。溶液をろ過後、上記ビーズを50%DMSO水溶液で洗浄後、Cy3−ストレプトアビジンの水溶液(0.01μM)を添加し染色した。溶液をろ過後、上記ビーズを50%DMSO水溶液で洗浄した。染色済みのビーズは、CCDカメラを搭載した蛍光顕微鏡(オリンパス社製)を用いて検出した。その結果を表3に示した。
実施例3では、標的核酸T−01と、光反応性基が導入された検出プローブD−01及びD−02とをハイブリダイズさせ、形成された複合体に光照射して検出プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させ、この複合体を捕捉プローブC−03とハイブリダイズさせ、標的核酸を検出した。
アビジンコートビーズ(サーモサイエンティフィック社製)に、C−03を固定し、ビオチン水溶液でブロッキング処理したものを用いた。
T−01(10μM)と、D−01(100μM)及びD−02(100μM)を、T−01に対するD−01、D−02の各使用量が1モル当量となるように混合し、10mMリン酸バッファー(100mM塩化ナトリウム含有)で希釈し、トータル液量400μL、T−01の終濃度を0.25μMとした。この混合溶液をヒートブロックで95℃、5分間保持し、その後ゆっくりと室温まで冷却したものを、ガラスチューブに移し、トランスイルミネーターで20分間、365nm(10μW/cm2)の光を照射した。「オムニフィット」ガラスカラム(内径3mm、両末端に2μmのステンレスフリッツのカラム栓)に、C−03を固定したビーズを入れ、上記混合溶液(200μL)を加えた後、5分間攪拌した。溶液をろ過後、上記ビーズを50%DMSO水溶液で洗浄後、Cy3−ストレプトアビジンの水溶液(0.01μM)を添加し染色した。溶液をろ過後、上記ビーズを50%DMSO水溶液で洗浄した。染色済みのビーズは、蛍光顕微鏡(オリンパス社製)を用いて検出した。その結果を表3に示した。
実施例3において、捕捉プローブとしてC−03の代わりにC−04を用いたこと以外は、実施例3と同様の操作を行い、標的核酸T−01を検出した。その結果を表3に示した。
実施例5では、標的核酸T−01と、光反応性基が導入された検出プローブD−01及びD−02とをハイブリダイズさせ、形成された複合体に光照射して検出プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させ、さらにこの複合体を光反応性基が導入された捕捉プローブC−02とハイブリダイズさせ、形成された複合体に光照射して捕捉プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させて、標的核酸を検出した。
アビジンコートビーズ(サーモサイエンティフィック社製)に、捕捉プローブとしてC−02を固定し、ビオチン水溶液でブロッキング処理したものを用いた。
T−01(10μM)と、D−01(100μM)及びD−02(100μM)を、T−01に対するD−01、D−02の各使用量が1モル当量となるように混合し、10mMリン酸バッファー(100mM塩化ナトリウム含有)で希釈し、トータル液量200μL、T−01の終濃度を0.25μMとした。この混合溶液をヒートブロックで95℃、5分間保持し、その後ゆっくりと室温まで冷却したものを、ガラスチューブに移し、トランスイルミネーターで20分間、365nm(10μW/cm2)の光を照射した。「オムニフィット」ガラスカラム(内径3mm、両末端に2μmのステンレスフリッツのカラム栓)に、C−02を固定したビーズを入れ、上記混合溶液(200μL)を加えた後、5分間攪拌しながら、ブラックライトで365nmの光を照射した。溶液をろ過後、上記ビーズを50%DMSO水溶液で洗浄後、Cy3−ストレプトアビジンの水溶液(0.01μM)を添加し染色した。溶液をろ過後、上記ビーズを50%DMSO水溶液で洗浄した。染色済みのビーズは、蛍光顕微鏡(オリンパス社製)を用いて検出した。その結果を表3に示した。
参考例1において、捕捉プローブとしてC−02の代わりにC−03を使用し、またハイブリダイズさせて形成された複合体に光照射して捕捉プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させる工程を行わなかったこと以外は、参考例1と同様の操作を行い、標的核酸T−01に対して1モル当量のD−03及びD−04を混合したものを調製し、標的核酸T−01を検出した。
実施例1において、標的核酸としてT−01の代わりにT−02、検出プローブとしてD−01及びD−02の代わりにD−05及びD−06、捕捉プローブとしてC−01の代わりにC−05を用いたこと、及び、T−02(10μM)とD−05(100μM)及びD−06(100μM)をT−02に対するD−05、D−06の各使用量が1モル当量となるように混合し、10mMリン酸バッファー(100mM塩化ナトリウム含有)で希釈した溶液を0.1、0.01amolの2通りのモル濃度になるよう調整し、DNAチップ上でのハイブリダイゼーション後、DNAチップをブラックライトで365nmの光を5分間照射したこと以外は、実施例1と同様の操作を行い、標的核酸T−02を検出した。その結果を表4に示した。
実施例6において、検出プローブとしてD−05及びD−06の代わりにD−07及びD−08を使用し、捕捉プローブとしてC−05の代わりにC−06を使用し、ハイブリダイズさせて形成された複合体に光照射して検出プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させる工程を行わず、またDNAチップ上でのハイブリダイゼーション後、DNAチップを光照射して捕捉プローブと標的核酸の間で共有結合を形成させる工程を行わなかったこと以外は、実施例6と同様の操作を行い、標的核酸T−02を検出した。
本発明の、SNPs(single nucleotide polymorphisms)検出への適用を検討した。本実施例ではヒトゲノムDNAを用いるため、標的核酸は二本鎖核酸である。
東レ社製の「3D−Gene」(登録商標)の基板(256柱基板)に、表1の捕捉プローブC−07(野生型)、C−08(Gly12Ser変異型)、C−09(Gly12Arg変異型)、C−10(Gly12Cys変異型)を固定したものを用いた。
検体DNAとしてA549細胞から抽出したDNAを用いた。A549細胞は、肺がん組織由来の培養細胞であり、Gly12Ser変異が生じていることが知られている。A549細胞から抽出した5μgのゲノムDNAを超音波処理(コバリス、s220)によって断片化し、断片化したゲノムDNAのうち600ngを検出に用いた。断片化の処理条件は、メーカー推奨の方法に従った。断片の長さは、バイオアナライザー(アジレント社製)を用いて評価した。なお、ひとつの細胞には2pgのDNAが含まれていることが知られている。またSNPs遺伝子は、1細胞あたり2コピー存在するため、ゲノムDNA 600ngには、SNPs遺伝子の配列が1amol含まれていることになる。
ゲノムDNA 600ng(1amol)に対して、検出プローブD−09、D−10、D−11、D−12の各使用量が100モル当量(すなわち各検出プローブが100amol)となるよう検体DNAを調製(各々のトータル液量5μL)し、それぞれ以下の操作を行った。
実施例7において、検出プローブとしてD−09、D−10、D−11、D−12の代わりにD−13、D−14、D−15、D−16を使用し、ハイブリダイズさせて形成された複合体に光照射して検出プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させる工程を行わなかったこと以外は、実施例7と同様の操作を行い、標的核酸を検出した。
配列番号2:合成DNA
配列番号3:合成DNA(5’末端及び3’末端ビオチン化)
配列番号4:合成DNA(5’末端及び3’末端ビオチン化)
配列番号5:合成DNA(5’末端及び3’末端ビオチン化)
配列番号6:合成DNA(5’末端及び3’末端ビオチン化)
配列番号7:合成DNA(5’末端及び3’末端ビオチン化)
配列番号8:合成DNA(5’末端及び3’末端ビオチン化)
配列番号9:合成DNA(5’末端及び3’末端ビオチン化)
配列番号10:合成DNA(5’末端及び3’末端ビオチン化)
配列番号11:合成DNA(5’末端アミノ化)
配列番号12:合成DNA(5’末端ビオチン化)
配列番号13:合成DNA(5’末端アミノ化)
配列番号14:合成DNA(5’末端アミノ化)
配列番号15:合成DNA(5’末端アミノ化)
配列番号16:合成DNA(5’末端アミノ化)
配列番号17:合成DNA(5’末端アミノ化)
Claims (3)
- 標的核酸とハイブリダイズする検出プローブ及び支持体に固定された捕捉プローブとを用いるサンドイッチハイブリダイゼーション法による標的核酸の検出方法であって、
検出プローブの核酸分子中の少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されており、
標的核酸と検出プローブとをハイブリダイズさせて形成された複合体に光照射して、検出プローブ中の光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させ、該共有結合を形成させた複合体を、支持体に固定された捕捉プローブとハイブリダイズさせる工程を有する、検出方法。 - 捕捉プローブの核酸分子中の少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されており、
前記共有結合を形成させた複合体を捕捉プローブとハイブリダイズさせて形成された複合体に光照射して、捕捉プローブ中の光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させる工程を更に有する、請求項1に記載の検出方法。 - 光反応性基が3−シアノビニルカルバゾール基、p−カルバモイルビニルフェノール基、4,5’,8−トリメチルソラレン基及びN3−メチル−5−シアノビニルウラシル基から選ばれる少なくとも1種である、請求項1又は2に記載の検出方法。
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