WO2013140890A1 - 標的核酸分子の検出方法 - Google Patents

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WO2013140890A1
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acid molecule
target nucleic
marker
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邦夫 堀
健造 藤本
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オリンパス株式会社
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
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    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid molecule using an optical cross-linking reaction.
  • the nucleic acid molecule in the sample solution can be detected by, for example, a hybridization method using a labeled probe that specifically hybridizes with the nucleic acid molecule.
  • a labeled probe previously immobilized on a bead and a target nucleic acid molecule are hybridized, and then the hybridized target nucleic acid molecule immobilized on the bead is precipitated on the bottom of the container. Thereafter, the temperature of the reaction solution is gradually raised to above the denaturation temperature of the target nucleic acid, the labeled probe is released from the beads to the supernatant, and the amount of fluorescence or luminescence in the supernatant is measured over time (for example, patents). Reference 1).
  • a method has been developed to introduce a reactive functional group into the base that constitutes the oligonucleotide, and to form a covalent bond with other oligonucleotides and other molecules via this reactive functional group (cross-linking).
  • cross-linking has been.
  • a method using 2-Amino-6-vinylpurine see, for example, Non-Patent Document 1
  • a method using 3-Cyanovinylcarbazole Nucleoside which is a reactive base derivative (see, for example, Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3, or Patent Document 2) is disclosed.
  • a method for quantifying a target nucleic acid molecule using an optical cross-linking reaction and fluorescence resonance energy transfer For example, after associating a FRET probe and a target nucleic acid molecule under conditions suitable for specific association, the temperature between the two nucleic acid strands in the formed aggregate is not changed without changing the temperature and salt concentration of the reaction solution.
  • a method is disclosed in which a covalent bond is formed using an optical cross-linking reaction, and then this aggregate is detected and analyzed for each molecule (see, for example, Patent Document 3).
  • the formed aggregate is detected under normal measurement temperature conditions (for example, room temperature, etc.), so that a nonspecific aggregate (nonspecific aggregate) is detected during the aggregate detection operation.
  • the formation of non-specific aggregates is achieved by stabilizing the aggregate of the FRET probe and the target nucleic acid molecule by the optical cross-linking reaction. It can be effectively suppressed.
  • a FRET probe that specifically binds to a specific nucleic acid molecule is also used to detect an antigen-antibody reaction.
  • an antigen-antibody reaction is performed using an antibody labeled with single-stranded DNA, and the formed antigen-antibody complex is bound to a FRET probe complementary to a single-stranded DNA labeled with an antibody,
  • a method for detecting an antigen by releasing a fluorescent substance in a FRET probe from an antigen-antibody complex to a reaction supernatant by treating with a nucleolytic enzyme and measuring the fluorescence intensity of the reaction supernatant is disclosed. (For example, see Patent Document 4).
  • the formed aggregate is bound to a solid phase carrier such as a bead, and the aggregate to which the solid phase carrier is bound is separated and recovered from a free labeled probe by solid-liquid separation, and then the recovered aggregate is
  • the detection accuracy of the aggregate bound to the solid phase carrier may be inferior.
  • Some embodiments of the present invention provide a method for detecting a target nucleic acid molecule using a labeled probe, in which an association of the target nucleic acid molecule and the labeled probe is separated from a free labeled probe using a solid phase carrier. It is an object of the present invention to provide a method capable of detecting a target nucleic acid molecule with high accuracy without being influenced by the solid phase carrier even when recovered.
  • the target nucleic acid molecule is hybridized with both the labeled probe labeled with a luminescent substance and the probe that mediates the binding of the solid phase carrier, and the formed three-membered aggregate is immobilized. After separating and recovering from the free labeled probe in a state bound to the phase carrier, the luminescent material in the aggregate is separated from the solid phase carrier, and the free luminescent material is detected, thereby detecting the solid phase carrier. It was found that the target nucleic acid molecule can be detected with high accuracy without being affected by the above. Furthermore, it was found that the target nucleic acid molecule in the sample can be detected with higher accuracy by stabilizing the formed ternary aggregate by covalent bonding before separation and recovery from the free labeled probe. It was done.
  • a method for detecting a target nucleic acid molecule in one embodiment of the present invention comprises: (A) a nucleic acid-containing sample and a first marker that is a luminescent substance are bound, and a first nucleic acid probe that specifically hybridizes with a target nucleic acid molecule, and a second marker are bound; And preparing a sample solution to which a target nucleic acid molecule and a second nucleic acid probe that specifically hybridizes in a region different from the region to which the first nucleic acid probe hybridizes are added; (B) denaturing the nucleic acid molecules in the sample solution prepared in the step (a); (C) after the step (b), associating nucleic acid molecules in the sample solution; (D) Among the aggregates formed in the step (c), in a three-party aggregate consisting of the target nucleic acid molecule, the first nucleic acid probe, and the second nucleic acid probe, the target nucleic acid
  • the covalent bond formation reaction may be a photochemical reaction via a photoreactive base derivative.
  • the photoreactive base derivative is 3-Cyanovinylcarbazole Nucleoside
  • the covalent bond may be formed by irradiating the sample solution with light of 340 to 380 nm.
  • the ternary aggregate bound to the solid phase carrier recovered in the step (e) may be washed with a washing solution having a salt concentration at which the Tm value of the first nucleic acid probe is 25 ° C. or lower. Good.
  • the first marker may be detected using a fluorescence single molecule measurement method. Good.
  • the detection of the first marker is performed.
  • (P) a step of calculating the number of molecules of the first marker present in the measurement solution containing the released first marker by fluorescence correlation spectroscopy or fluorescence intensity distribution analysis, or (r) Using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, light from the light detection region is moved while moving the position of the light detection region of the optical system in the measurement solution containing the released first marker. Detecting the number of molecules of the first marker present in the measurement solution by detecting May be performed.
  • the step (a) includes: (A ′) preparing a sample solution to which the nucleic acid-containing sample, the first nucleic acid probe, the second nucleic acid probe, and a solid phase carrier having a site that binds to the second marker are added. And The step (e) (E ′) After the step (d), the sample solution may be subjected to a solid-liquid separation process to recover the three-party aggregate.
  • the step (a ′) comprises: (A ′′) A step of preparing a sample solution to which the nucleic acid-containing sample, the first nucleic acid probe, and the second nucleic acid probe bound to a solid phase carrier are added may be used.
  • Another aspect of the present invention is a target nucleic acid molecule detection kit used in the method for detecting a target nucleic acid molecule of any one of (1) to (11) above, A first nucleic acid probe, to which a first marker that is a luminescent substance is bound, and specifically hybridizes with a target nucleic acid molecule; And a second nucleic acid probe that specifically hybridizes in a region different from the region to which the first nucleic acid probe hybridizes. (13) In the target nucleic acid molecule detection kit according to (12), at least one base in a region that hybridizes with the target nucleic acid molecule in the first nucleic acid probe is substituted with a photoreactive base derivative.
  • At least one base in the region that hybridizes with the target nucleic acid molecule in the second nucleic acid probe may be substituted with a photoreactive base derivative.
  • the kit for detecting a target nucleic acid molecule according to (12) or (13) may further include a solid phase carrier having a site that binds to the second marker.
  • the target nucleic acid molecule bound to the labeled nucleic acid probe is separated and recovered from the free labeled nucleic acid probe, and then measured in a state separated from the solid phase carrier. For this reason, by using the method for detecting a target nucleic acid molecule in the embodiment of the present invention, the target nucleic acid molecule can be detected with high accuracy without being affected by a free labeled probe or a solid phase carrier.
  • Example 1 it is the figure which showed typically the one aspect
  • Example 2 it is the figure which showed the measurement result by the FCS method of the number of molecules of the fluorescent substance Tamra released from the magnetic beads recovered from each sample solution by nucleolytic enzyme reaction or ultraviolet irradiation under low salt concentration conditions. is there.
  • Example 3 it is the figure which showed the measurement result by the FCS method of the molecule
  • Example 4 it is the figure which showed the measurement result by the FIDA method of the molecule
  • the method for detecting a target nucleic acid molecule in one embodiment of the present invention includes the following steps (a) to (g).
  • the target nucleic acid molecule means a nucleic acid molecule having a specific base sequence that is a detection target.
  • the target nucleic acid molecule is not particularly limited as long as the base sequence is clarified to such an extent that a nucleic acid probe that specifically hybridizes with the nucleic acid molecule can be designed.
  • it may be a nucleic acid molecule having a base sequence present in animal or plant chromosomes, bacterial or viral genes, or a nucleic acid molecule having an artificially designed base sequence.
  • the target nucleic acid molecule may be a double-stranded nucleic acid or a single-stranded nucleic acid.
  • any of DNA and RNA may be sufficient. Examples of the target nucleic acid molecule include microRNA, siRNA, mRNA, hnRNA, genomic DNA, synthetic DNA obtained by PCR amplification, cDNA synthesized from RNA using reverse transcriptase, and the like.
  • the nucleic acid-containing sample is not particularly limited as long as it is a sample containing nucleic acid molecules.
  • the nucleic acid-containing sample include biological samples collected from animals and the like, samples prepared from cultured cells, and reaction solutions after nucleic acid synthesis reaction. It may be a biological sample itself, or a nucleic acid solution extracted and / or purified from a biological sample.
  • a nucleic acid probe that specifically hybridizes with a target nucleic acid molecule preferentially hybridizes with a target nucleic acid molecule over other nucleic acid molecules that are similar in base sequence to the target nucleic acid molecule.
  • Any nucleic acid probe may be used, and it does not have to hybridize with any nucleic acid molecule other than the target nucleic acid molecule.
  • the nucleic acid probe that specifically hybridizes with the target nucleic acid molecule may be an oligonucleotide having a base sequence that is completely complementary to the partial base sequence of the target nucleic acid molecule. It may have a base sequence having a mismatch of 1 to several bases.
  • the first nucleic acid probe used in the present embodiment has a first marker bound thereto and specifically hybridizes with a target nucleic acid molecule.
  • the first nucleic acid probe include a base sequence that is completely complementary to a partial base sequence of a target nucleic acid molecule, or a base sequence that has a mismatch of one to several bases with the partial base sequence, The oligonucleotide which this marker couple
  • the first marker is a luminescent substance.
  • the luminescent substance include particles (usually molecules or aggregates thereof) that emit light by fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, light scattering, and the like.
  • a fluorescent substance is not particularly limited as long as it is a substance that emits fluorescence by emitting light of a specific wavelength, such as fluorescent dyes and quantum dots used in fluorescence analysis such as FCS and FIDA. It can be appropriately selected from among them.
  • the second nucleic acid probe used in the present embodiment has a second marker bound thereto and hybridizes specifically with the target nucleic acid molecule.
  • the second nucleic acid probe include a base sequence that is completely complementary to the partial base sequence of the target nucleic acid molecule, or a base sequence that has a mismatch of one to several bases with the partial base sequence, The oligonucleotide which this marker couple
  • the second marker is not particularly limited as long as it is a substance that can be detected separately from the first marker in the step (g).
  • a substance that does not emit light may be used, and a luminescent substance that has different emission characteristics from the first marker may be used.
  • “Different emission characteristics” mean that the intensities of light of a specific wavelength are different (for example, the intensities of fluorescence of a specific wavelength are different).
  • the second marker for example, a fluorescent substance, nucleic acid (oligonucleotide), hydrophilic organic compound, biotin, glutathione, DNP (dinitrophenol), digoxigenin (digoxigenin) having different luminescence characteristics from the first marker Dig), digoxin, a sugar chain composed of 2 or more sugars, a polypeptide composed of 6 or more amino acids, auxin, gibberellin, steroid, protein, and analogs thereof.
  • nucleic acid oligonucleotide
  • hydrophilic organic compound biotin, glutathione
  • DNP dinitrophenol
  • digoxigenin digoxigenin having different luminescence characteristics from the first marker Dig
  • digoxin digoxin
  • a sugar chain composed of 2 or more sugars
  • a polypeptide composed of 6 or more amino acids auxin, gibberellin, steroid, protein, and analogs thereof.
  • the oligonucleotide constituting the first nucleic acid probe or the second nucleic acid probe may be DNA, RNA, or artificially amplified such as cDNA.
  • a nucleic acid analog that can form a nucleotide chain or base pair in the same manner as a natural nucleobase may be included in part or all.
  • Nucleic acid analogues include those in which side chains of natural nucleotides (naturally occurring nucleotides) such as DNA and RNA are modified with functional groups such as amino groups, and labeled with proteins, low molecular compounds, etc. And the like.
  • BNA Bridged Nucleic Acid
  • nucleotides in which the 4′-position oxygen atom of natural nucleotides is substituted with sulfur atoms, and hydroxyl groups in the 2′-position of natural ribonucleotides are substituted with methoxy groups Nucleotides, Hexitol Nucleic Acid (HNA), peptide nucleic acid (PNA) and the like.
  • HNA Hexitol Nucleic Acid
  • PNA peptide nucleic acid
  • the oligonucleotide constituting the first nucleic acid probe or the second nucleic acid probe may have a region other than the region that hybridizes with the target nucleic acid molecule.
  • a region that hybridizes with the target nucleic acid molecule and a region that binds the first marker or the second marker may be bound by a linker having an appropriate base length.
  • the first nucleic acid probe or the second nucleic acid probe is, for example, a nucleic acid probe designed based on the base sequence information of the target nucleic acid molecule or the base sequence information of the region forming the base pair and synthesized based on the design. And can be prepared by binding a marker. A marker may be bound simultaneously with the synthesis of the nucleic acid probe.
  • the design and synthesis of the first nucleic acid probe or the second nucleic acid probe, the binding reaction between the first nucleic acid probe and the first marker, and the binding reaction between the second nucleic acid probe and the second marker are performed according to conventional methods. It can be carried out.
  • Both the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe are hybridized to one target nucleic acid molecule, and a three-party aggregate comprising these is formed. That is, the region that hybridizes with the first nucleic acid probe and the region that hybridizes with the second nucleic acid probe in the target nucleic acid molecule are different from each other.
  • the target nucleic acid molecule is a double-stranded nucleic acid molecule
  • both the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe hybridize to the single-stranded nucleic acid molecule. Note that the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe may simultaneously hybridize to the target nucleic acid molecule.
  • a specific association condition between the first nucleic acid probe and the target nucleic acid molecule, and the second nucleic acid probe and the target nucleic acid molecule is preferable that the specific association conditions are substantially the same. Specific association conditions depend on the type and length of the base sequences of the target nucleic acid molecule and nucleic acid probe. Therefore, it is preferable to design the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe so that the specific association conditions are uniform.
  • the specific association conditions between the target nucleic acid molecule and the nucleic acid probe can be determined from a melting curve. Since the formation of aggregates generally depends on temperature conditions and salt concentration conditions, the temperature of the solution containing only the nucleic acid probe and the target nucleic acid molecule is changed from high temperature to low temperature, and the absorbance of the solution is measured. Thus, a melting curve can be obtained. From the obtained melting curve, the temperature conditions in the range from the temperature at which the nucleic acid probe that had existed in the single-stranded state started to form an aggregate with the target nucleic acid molecule to the temperature at which almost all became an aggregate were determined. Specific association conditions can be used. By changing the salt concentration in the solution from a low concentration to a high concentration instead of the temperature, the melting curve can be similarly determined to determine the specific association conditions.
  • the specific association conditions differ depending on the type of target nucleic acid molecule or nucleic acid probe, and are determined experimentally.
  • the Tm value (melting temperature) can be substituted.
  • the Tm value of a region having a base sequence complementary to the target nucleic acid molecule 50% of double-stranded DNA is 1
  • the temperature at which the DNA is dissociated into the double-stranded DNA can be calculated.
  • a condition in which the temperature is a value in the vicinity of the Tm value, for example, a condition in which the Tm value is about ⁇ 3 ° C. can be set as the specific association condition.
  • the specific association conditions can be determined in more detail by experimentally obtaining a melting curve in the vicinity of the calculated Tm value.
  • a sample solution is prepared by adding a nucleic acid-containing sample, a first nucleic acid probe, and a second nucleic acid probe to an appropriate solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as it is a solvent that does not damage the first marker and the second marker, and can be appropriately selected from buffers generally used in the technical field. it can.
  • the buffer include a phosphate buffer such as PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4), a Tris buffer, and the like.
  • an organic solvent such as formamide may be used depending on the types of the first marker and the second marker.
  • the nucleic acid molecules in the prepared sample solution are denatured.
  • “denaturing a nucleic acid molecule” means dissociating base pairs. For example, it means that a double-stranded nucleic acid is a single-stranded nucleic acid.
  • the denaturation temperature varies depending on the length of the base of the target nucleic acid molecule.
  • the temperature is not limited to the above as long as it can be modified.
  • the denaturation by the low salt concentration treatment can be performed by adjusting the salt concentration of the sample solution to be sufficiently low, for example, by diluting with purified water or the like.
  • the nucleic acid molecules in the sample solution are associated. Formation of an association between the target nucleic acid molecule, the first nucleic acid probe, and the second nucleic acid probe is performed under specific association conditions. Specifically, when heat denaturation is performed, after the high temperature treatment, the temperature of the sample solution is lowered to a temperature suitable for specific association conditions, thereby associating nucleic acid molecules in the sample solution as appropriate. be able to. Preferably, the temperature of the sample solution is lowered to about a temperature of Tm ⁇ 3 ° C. of a region having a base sequence complementary to the target nucleic acid molecule in the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe.
  • the salt concentration of the sample solution is increased to a concentration suitable for specific association conditions by adding a salt solution after the low salt concentration treatment. By doing so, the nucleic acid molecules in the sample solution can be appropriately associated.
  • the temperature of the solution is preferably lowered relatively slowly when forming an aggregate.
  • the solution temperature of the solution can be lowered at a temperature lowering rate of 0.05 ° C./second or higher.
  • a surfactant In order to suppress non-specific hybridization, it is also preferable to add a surfactant, formamide, dimethyl sulfoxide, urea or the like to the solution in advance. These compounds may be added alone or in combination of two or more. By adding these compounds, nonspecific hybridization can be made difficult to occur in a relatively low temperature environment.
  • the target nucleic acid molecule and the first nucleic acid molecule in the three-party aggregate composed of the target nucleic acid molecule, the first nucleic acid probe, and the second nucleic acid probe At least one covalent bond is formed with one nucleic acid probe, and at least one covalent bond is formed between the target nucleic acid molecule and the second nucleic acid probe.
  • the method for forming a covalent bond in step (d) is not particularly limited as long as it can form a covalent bond linking two single-stranded nucleic acids forming a base pair. Can be appropriately selected from known methods used for cross-linking.
  • the “same conditions as in the formation of the three-party aggregate in step (c)” are preferably the same conditions for the temperature and salt concentration of the sample solution, but the target nucleic acid molecule, the first nucleic acid probe, and the first nucleic acid probe 3 in the step (c) is easy to form an association with the nucleic acid probe of 2 and easy to form an association of the nucleic acid molecule other than the target nucleic acid molecule with the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe. It may be substantially the same at the time of formation of a worker aggregate and at the time of formation of a covalent bond in step (d), and may not necessarily be physically completely the same.
  • the temperature of the sample solution at the time of forming the three-party aggregate in step (c) is Tm value ⁇ 3 ° C.
  • the temperature of the sample solution at the time of forming the covalent bond in step (d) is also Tm value ⁇ 3 ° C.
  • the temperature may be in the range of.
  • a Tm value of ⁇ 3 ° C. is a specific association condition, and even if there is some variation within the above temperature range, This is because there is little influence.
  • a covalent bond by a photochemical reaction.
  • the photochemical reaction means a reaction performed by irradiating light of a specific wavelength and using the light energy.
  • a covalent bond can be formed between the nucleic acid strands of the aggregate by irradiating the sample solution with light of a specific wavelength. There is no need to fluctuate. For this reason, it is possible to suppress the influence other than the covalent bond formation on the aggregate in the sample solution, and the operation is simple.
  • a first nucleic acid probe in which at least one base in a region hybridizing with a target nucleic acid molecule in the first nucleic acid probe is substituted with a photoreactive base derivative and a target nucleic acid in the second nucleic acid probe
  • a photochemical reaction causes a reaction between the target nucleic acid molecule and the first nucleic acid probe.
  • a covalent bond via the photoreactive base derivative can be formed between the target nucleic acid molecule and the second nucleic acid probe.
  • the base substituted with the photoreactive base derivative in the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe is not particularly limited as long as it is a base in a region that hybridizes with the target nucleic acid molecule. Moreover, only 1 base may be substituted by the photoreactive base derivative, and 2 or more bases may be substituted by the photoreactive base derivative.
  • the photoreactive base derivative has a site (photoreactive site) where the reactivity in organic synthesis reaction is activated by irradiation with light of a specific wavelength, and is similar to natural nucleotides.
  • Examples of such a photoreactive base derivative include 3-Cyanovinylcarbazole Nucleoside ( CNV K) (see, for example, Non-Patent Document 2 or 3).
  • the nucleic acid probe substituted with the photoreactive base derivative can be produced, for example, by using the photoreactive base derivative as a raw material when the nucleic acid probe is synthesized using a known oligonucleotide synthesizer. it can. Moreover, after manufacturing an unsubstituted nucleic acid probe, it can obtain by introduce
  • CNV K When CNV K is used as the photoreactive base derivative, specifically, a three-party association comprising these in a sample solution containing the target nucleic acid molecule, the first nucleic acid probe, and the second nucleic acid probe.
  • the sample solution is irradiated with 300 nm to 380 nm light, preferably 340 nm to 380 nm light, more preferably 360 nm to 370 nm light, more preferably 366 nm ultraviolet light, CNV K 5 ′ side
  • the atoms constituting the pyrimidine base and the atoms constituting CNV K in the target nucleic acid molecule forming a base pair with the purine base adjacent to are bonded by a covalent bond.
  • thymine (T) or adenine (A) via a linker to psoralen for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, pp. 5602-5606, You may use what added July (1991).
  • T thymine
  • A adenine
  • psoralen was bound to T or A in the TA sequence via a linker.
  • a psoralen-binding nucleic acid probe is prepared.
  • the first nucleic acid probe or the second nucleic acid forming a base pair via this psoralen
  • the probe and the target nucleic acid molecule are cross-linked to stabilize the three-party aggregate.
  • step (e) first, a solid phase carrier having a site that binds to the second marker is added to the sample solution, and the second marker in the third party aggregate is added.
  • the solid support and the three-membered aggregate are bound to each other.
  • the three-party aggregate bound to the solid phase carrier is recovered by solid-liquid separation treatment.
  • the solid phase carrier used in this embodiment has a site that binds to the second marker. Specifically, it is a solid phase carrier in which a substance that specifically or nonspecifically binds or adsorbs to the second marker is bound to the surface.
  • the second marker is an oligonucleotide
  • the substance includes an oligonucleotide that hybridizes with the oligonucleotide, an antigen or antibody for the second marker, a ligand or receptor for the second marker, or biotin and avidin. Examples include substances that specifically bind to the second marker.
  • the solid phase carrier may be non-specifically bound to the second marker, but is specifically bound or the like from the viewpoint of the accuracy of detection and / or quantification of the target nucleic acid molecule. Preferably there is.
  • the method for binding the solid phase carrier and the substance that specifically or non-specifically binds or adsorbs to the second marker is not particularly limited, and may be physically adsorbed. It may be chemically bonded to the functional group. When chemically bonding, it can be bonded by a method suitable for each functional group.
  • EDAC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride) reaction
  • EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • reaction to crosslink amino groups using a bipolar linker, activated aldehyde group or tosyl group, and second marker For example, a reaction that binds a functional group in a substance that binds or adsorbs specifically or non-specifically.
  • the surface of the solid phase carrier may be coated with a functional group in advance.
  • the shape, material, etc. of the solid phase carrier are not particularly limited as long as it is a solid having a site that binds to the second marker.
  • particles that can be suspended in water such as beads and can be separated from the liquid by a general solid-liquid separation process, a membrane, a container, a chip substrate, etc. Good.
  • Specific examples of the solid phase carrier include magnetic beads, silica beads, agarose gel beads, polyacrylamide resin beads, latex beads, plastic beads, ceramic beads, zirconia beads, silica membranes, silica filters, and plastic plates.
  • the solid support is particles such as beads, the solid support is added to the sample solution.
  • the sample solution is permeated through the solid support.
  • the solid phase carrier is a container whose inner wall is coated with a substance that binds to the second marker, the sample solution is injected into the container that is the solid phase carrier.
  • the second marker when the second marker is biotin, beads or filters in which avidin or streptavidin is bound to the surface can be used as the solid phase carrier. Further, when the second marker is digoxigenin (Dig), beads or filters in which an anti-Dig antibody is bound to the surface can be used as a solid phase carrier.
  • the three-party aggregate is bound to the solid-phase carrier via the second marker in the three-party aggregate. Thereafter, a solid-liquid separation treatment is performed to separate and recover the three-party aggregate bound to the solid phase carrier from the free first nucleic acid probe present in the liquid phase.
  • the solid-liquid separation process is not particularly limited as long as it is a method capable of recovering the solid phase carrier in the solution by separating it from the liquid component.
  • the known processes used for the solid-liquid separation process It can be appropriately selected and used.
  • the solid phase carrier is a particle such as a bead
  • the suspension containing the solid phase carrier may be centrifuged to precipitate the solid phase carrier, and the supernatant may be removed.
  • the solid phase carrier remaining on the surface of a filter paper or the like may be recovered by filtration using a filtration filter.
  • the solid phase carrier is a magnetic bead
  • a magnet is brought close to the container in which the solution is placed, the solid phase carrier is converged on the surface of the container closest to the magnet, and then the supernatant May be removed.
  • the solid phase carrier is a container whose inner wall is coated with a substance that binds to the second marker, the liquid in the container that is the solid phase carrier is discharged.
  • the solid phase carrier is a membrane or a filter, the sample solution is allowed to permeate the solid phase carrier, thereby binding the solid phase carrier to the three-party aggregate and the three-party aggregate bound to the solid phase carrier. Separation and recovery from the free first nucleic acid probe can be performed in one operation.
  • step (a) a solid phase carrier having a site that binds to the second marker is added to the sample solution together with the nucleic acid-containing sample, the first nucleic acid probe, and the second nucleic acid probe in advance.
  • step (c) after forming a three-party aggregate bound to the solid phase carrier, solid-liquid separation treatment is performed to convert the three-party aggregate bound to the solid phase carrier into the free first You may isolate
  • a sample solution is prepared by adding a second marker previously bound to a solid phase carrier, a nucleic acid-containing sample, and a first nucleic acid probe.
  • the sample solution is fixed.
  • the solid-liquid separation treatment separates and recovers the three-party aggregate bound to the solid phase carrier from the free first nucleic acid probe. May be.
  • the 2nd marker used in this case may be couple
  • a solution containing a three-party aggregate bound to the solid phase carrier is prepared.
  • the recovered solid phase carrier is supplied to step (f) as a solution containing the carrier.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not hinder the detection of light emitted from the first marker in a later step, and is selected from among buffers generally used in the technical field. Can be appropriately selected and used.
  • the buffer include a phosphate buffer such as PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4), a Tris buffer, and the like.
  • the recovered solid phase carrier may be washed with an appropriate solvent before the step (f). By washing, the free first nucleic acid probe can be separated and removed more strictly from the three-party aggregate bound to the solid phase carrier.
  • the solvent for washing the solid phase carrier is not particularly limited as long as it does not impair the binding between the second marker and the solid phase carrier, and the solvent bonded to the solid phase carrier used in the step (f) 3
  • the solvent may be the same as or different from the solvent used for preparing the solution containing the aggregate.
  • the solid phase carrier is washed in a state where the first nucleic acid probe is inhibited from forming a non-specific association (for example, an association with the second nucleic acid probe). It is preferable.
  • the first nucleic acid probe is washed with a solvent having a salt concentration such that the Tm value of the first nucleic acid probe is very low. Among these, it is preferable to wash with a solvent having a salt concentration at which the Tm value of the first nucleic acid probe is lower than the temperature during washing.
  • the salt concentration varies depending on the base sequence of the probe, considering that washing is performed at room temperature of about 25 ° C., a salt concentration solvent in which the Tm value of the first nucleic acid probe is 25 ° C. or less is used for washing.
  • a salt concentration solvent in which the Tm value of the first nucleic acid probe is 25 ° C. or less is used for washing.
  • the solvent specifically, a low salt concentration used for washing or the like in a hybridization method such as x0.01 SSC (1.5 mM NaCl, 0.15 mM sodium citrate solution) or a salt concentration solution lower than this.
  • the solvent may be a solvent that does not contain a salt such as water.
  • the first marker is released from the collected three-party aggregate.
  • the method for releasing the first marker is not particularly limited as long as it is a method capable of separating the first marker in the tripartite aggregate from the solid phase carrier.
  • a first marker is liberated by adding a nucleolytic enzyme to a solution containing a three-party association bound to a solid phase carrier and decomposing a nucleic acid molecule including the first nucleic acid probe by the enzyme.
  • the nucleolytic enzyme used for releasing the first marker is not particularly limited, and may be either a DNA degrading enzyme or an RNA degrading enzyme, or may be a restriction enzyme.
  • the DNA degrading enzyme include S1 Nuclease, Mung Bean Nuclease, BAL 31 Nuclease, Exonclease I, Exonclease III IV, DNase I and the like.
  • the RNA degrading enzyme include Ribonuclease H, and examples of the DNA / RNA degrading enzyme include Micrococcal Nuclease.
  • the first marker can be separated from the solid phase carrier by digesting the recognition site of the restriction enzyme in the tripartite aggregate by restriction enzyme treatment. Restriction enzymes include, but are not limited to, EcoRI and HindIII.
  • the first marker can be released by chemically decomposing nucleic acid molecules including the first nucleic acid probe by alkali instead of enzymatic reaction (f4).
  • alkali is added to a solution containing a three-party association bound to a solid phase carrier to adjust the pH of the solution to 50 ° C. to 100 ° C., preferably 70 ° C. to 100 ° C., more preferably. Is heated to 80 ° C to 100 ° C.
  • the alkali treatment may be performed at a pH and concentration at which the nucleic acid molecule is decomposed.
  • the kind of alkali used is not specifically limited, An inorganic alkali may be sufficient and an organic alkali may be sufficient.
  • a strong alkali solution such as a 0.1 mM sodium hydroxide solution or a 0.1 mM potassium hydroxide solution is added, and a solution containing a three-party association bound to a solid phase carrier is pH 10 or more, preferably pH 12 or more. Then, it is heated to 50 ° C. or higher, preferably 70 ° C. or higher.
  • the covalent bond formed by the photochemical reaction using CNV K is easy to be eliminated by strong energy.
  • the energy applied at this time may be light energy or thermal energy.
  • the first nucleic acid probe, the second nucleic acid probe, and the target nucleic acid molecule are covalently bound by a photochemical reaction using CNV K as a photoreactive base derivative, they are immobilized under disassociation conditions.
  • the first marker can also be released by irradiating ultraviolet rays of 300 nm to 380 nm, preferably 340 nm to 380 nm, to the three-membered aggregate bound to the phase carrier (f1).
  • the disassociation condition refers to the target nucleic acid molecule when a covalent bond is not formed between the target nucleic acid molecule and the first nucleic acid probe, or between the target nucleic acid molecule and the second nucleic acid probe.
  • the first nucleic acid probe or the target nucleic acid molecule and the second nucleic acid probe are dissociated.
  • the disassociation condition include a low salt concentration condition in which the Tm value of the first nucleic acid probe is very low, as in the washing treatment.
  • a three-membered association bound to a solid phase carrier is a solution having a salt concentration at which the Tm value of the first nucleic acid probe is 25 ° C. or lower (even if it does not contain a salt such as water). The solution is irradiated with ultraviolet rays of 300 to 380 nm.
  • first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe and the target nucleic acid molecule are covalently bonded by a photochemical reaction using CNV K as a photoreactive base derivative, they are bound to a solid phase carrier 3
  • the first marker can also be released by heating the aggregate to a temperature sufficiently higher than the Tm value of the first nucleic acid probe.
  • the three-membered aggregate bound to the solid phase carrier is heated to 80 ° C. or higher (f3). It is preferable to heat the ternary aggregate bound to the solid support in a state where a solvent that does not inhibit the detection of light emitted from the first marker such as water is added.
  • step (g) the target nucleic acid molecule is detected by detecting the released first marker.
  • One molecule of the first marker is released from one molecule of the ternary aggregate.
  • the number of first markers detected in step (g) is equal to the number of target nucleic acid molecules in the nucleic acid-containing sample added in step (a).
  • the released first marker can be detected by irradiating light having a wavelength optimal for its spectral characteristics and detecting the optical characteristics of the light emitted from the marker. “Detecting the optical properties of the marker” means detecting an optical signal of a specific wavelength emitted from the marker. Examples of the light signal include fluorescence intensity and fluorescence polarization. In the present embodiment, the fluorescence intensity is preferable.
  • the method for detecting the first marker is not particularly limited as long as it is a method that can detect and analyze the intensity of a fluorescent signal of a molecule in a solution or its temporal change (fluctuation). For example, the fluorescence intensity emitted from all the fluorescent molecules in the solution may be measured, or the fluorescence intensity may be measured for each molecule.
  • the fluorescence intensity of the solution can be measured by a conventional method using a fluorescence spectrophotometer such as a fluorescence plate reader.
  • the fluorescence intensity of the solution depends on the amount of the first marker contained in the solution. For this reason, for example, by preparing a calibration curve indicating the relationship between the content of the first marker and the fluorescence intensity in advance, the amount of the first marker in the solution, that is, the target nucleic acid in the nucleic acid-containing sample The amount of molecules can be quantified.
  • Examples of a method for measuring the fluorescence intensity for each molecule in the sample solution include fluorescence correlation spectroscopy (Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS), or fluorescence intensity distribution analysis method (Fluorescence Intensity Distribution Analysis, FIDA).
  • fluorescence correlation spectroscopy Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS
  • fluorescence intensity distribution analysis method Fluorescence Intensity Distribution Analysis, FIDA
  • numerator can be performed by a conventional method, for example using well-known single molecule fluorescence analysis systems, such as MF20 (made by Olympus).
  • Nucleic acid molecules can be detected and quantified. Further, by detecting the fluctuation of the fluorescence intensity of the molecules existing in the focal region in the confocal optical system by FCS, by calculating the number of molecules of the released first marker by performing statistical analysis, Target nucleic acid molecules can be detected and quantified.
  • a fluorescent molecule in a solution can also be detected by a scanning molecule counting method (Scanning Molecular Counting). Specifically, by detecting the fluorescence from the light detection region while moving the position of the light detection region of the optical system in the measurement sample solution using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope. The number of molecules of the released first marker present in the measurement sample solution is calculated (see, for example, International Publication No. 11/108369, International Publication No. 11/108370, International Publication No. 11/108371). ).
  • the scanning molecule counting method particles that emit light that moves randomly and moves in a measurement sample solution (hereinafter referred to as “luminescent particles”) traverse the minute region while scanning the sample solution with the minute region.
  • the light emitted from the luminescent particles in the micro area is detected, so that each luminescent particle in the measurement sample solution is individually detected to count the luminescent particles and emit light in the measurement sample solution. It is a technique that makes it possible to obtain information on the concentration or number density of particles.
  • the sample required for measurement may be a very small amount (for example, about several tens of ⁇ L), the measurement time is short, and in the case of the optical analysis technology such as FIDA Compared to the above, it is possible to quantitatively detect the characteristics such as the concentration or number density of the luminescent particles having a lower concentration or number density.
  • the “light detection region” of the optical system of the confocal microscope or the multiphoton microscope is a minute region in which light is detected in those microscopes, and when illumination light is given from the objective lens, This corresponds to a region where the illumination light is collected.
  • a region is determined particularly by the positional relationship between the objective lens and the pinhole.
  • the scanning molecule counting method is configured to detect light from the light detection region of the confocal microscope or the multiphoton microscope, as in the case of the optical analysis technology such as FIDA, the light detection mechanism itself, The amount of sample solution may be trace as well.
  • the scanning molecule counting method statistical processing such as calculation of fluctuations in fluorescence intensity is not performed, so the photoanalysis technique of the scanning molecule counting method is necessary for the optical analysis technique in which the particle number density or concentration is FIDA or the like. Applicable to sample solutions that are significantly lower than
  • each of the particles dispersed or dissolved in the solution is individually detected. Therefore, the information is used to quantitatively count the particles in the measurement sample solution. It is possible to calculate the concentration or number density of the material or to acquire information on the concentration or number density. That is, according to the scanning molecule counting method, particles passing through the light detection region and detected light signals are detected one by one so that the particles are detected one by one. Particle counting is possible. Therefore, it is possible to determine the concentration or number density of particles in the measurement sample solution with higher accuracy than before.
  • the detection of the first marker released in the target nucleic acid molecule detection method of the present embodiment is performed by the scanning molecule counting method, and particles in the measurement sample solution are individually detected by the light emitted by the first marker, and the number thereof.
  • the particle concentration is determined by counting the concentration of the first marker in the measurement sample solution, the concentration is lower than the concentration that can be determined based on the fluorescence intensity measured by a fluorescence spectrophotometer or a plate reader. Even so, the first marker can be detected.
  • the target nucleic acid molecule in the nucleic acid-containing sample is very low and the released first marker is 1 femtomole or less, the target nucleic acid molecule is not amplified in advance by using the scanning molecule counting method. Quantitative detection is possible.
  • the measurement sample solution is not subjected to mechanical vibration or hydrodynamic action.
  • the inside is observed uniformly or in a state where the measurement sample solution is mechanically stable. Therefore, for example, the reliability of the quantitative detection result is improved as compared with the case where a flow is generated in the sample, and the particles to be detected in the measurement sample solution (in the present invention, the released first Measurement can be performed in a state where there is no influence or artifact due to mechanical action on the marker.
  • the amount of sample required increases significantly, and particles, luminescent probes or conjugates or other substances in the solution may be altered or denatured by hydrodynamic action due to flow.
  • the detection accuracy of luminescent particles having a relatively slow diffusional mobility in a solution, such as a solid phase carrier may be low.
  • the influence of the solid phase carrier is eliminated even when the fluorescence single molecule measurement method is used, by using the first marker in a free state separated from the solid phase carrier as a detection target.
  • the first marker can be detected with high accuracy.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing one aspect of the method for detecting a target nucleic acid molecule of the present embodiment.
  • a fluorescent substance is used as the first marker
  • biotin is used as the second marker
  • avidin beads are used as the solid phase carrier.
  • a covalent bond is formed (cross-linked) between the first nucleic acid probe and the target nucleic acid molecule and between the second nucleic acid probe and the target nucleic acid molecule by a photochemical reaction using CNV K, and a nucleolytic enzyme is used.
  • the first marker is released.
  • the target nucleic acid molecule 1, the first nucleic acid probe 2 to which the fluorescent substance 2a is bound, and the second nucleic acid probe 3 to which the biotin 3a is bound are hybridized to a triplet aggregate formed at 365 nm.
  • Irradiation with ultraviolet rays forms covalent bonds between CNV K2b in the first nucleic acid probe 2 and the target nucleic acid molecule 1, and between CNV K3b in the second nucleic acid probe 3 and the target nucleic acid molecule 1, respectively. (Cross-link) is generated (the first figure in FIG. 1).
  • the avidin beads 4 are added to the sample solution, and the tripartite aggregate is bound to the avidin beads 4 through the biotin 3a (second stage diagram in FIG. 1). Thereafter, after washing with a low salt concentration solution, the target nucleic acid molecule 1, the first nucleic acid probe 2, and the second nucleic acid probe 3 are decomposed by an enzyme treatment with a nucleolytic enzyme (the third figure in FIG. 1). ), The fluorescent substance 2a is released from the avidin bead 4 (the fourth figure in FIG. 1).
  • the Tm value of the aggregate of the second nucleic acid probe and the target nucleic acid molecule is made sufficiently higher than the Tm value of the aggregate of the first nucleic acid probe and the target nucleic acid molecule, and the solid-liquid in step (e) If the second nucleic acid probe can hybridize to the target nucleic acid molecule in the separation process and the previous washing process, at least one covalent bond is formed only between the first nucleic acid probe and the target nucleic acid molecule. What is necessary is just to form.
  • the target nucleic acid molecule is separated from the free labeled probe or the like in the same manner as the target nucleic acid molecule detection method of the present embodiment. Detection is possible without being affected by the solid phase carrier.
  • the Tm value of the aggregate of the first nucleic acid probe and the target nucleic acid molecule is made lower than the temperature of the washing solution used for the washing treatment, preferably 10 ° C. or more, and the second nucleic acid probe and the target nucleic acid are made.
  • the Tm value of the association with the molecule higher than the temperature of the washing solution, preferably higher by 10 ° C. or more, the free first nucleic acid probe can be washed away by the washing treatment.
  • the second nucleic acid probe is changed to PNA.
  • a nucleic acid analog that can form a stronger base pair than a natural oligonucleotide is included in at least a part, and the nucleic acid chain portion of the first nucleic acid probe is composed only of a natural oligonucleotide. It is done.
  • the solid-liquid separation in the step (e) and the previous washing treatment are not formed with a covalent bond with the target nucleic acid molecule, but nonspecifically hybridize with other nucleic acid molecules.
  • the target nucleic acid molecule detection method of the present embodiment is the same as that of the present embodiment except that the first nucleic acid probe can be released and the second nucleic acid probe can hybridize with the target nucleic acid molecule.
  • the second nucleic acid probe is used as a target nucleic acid molecule for the release of the first marker from the recovered three-party aggregate in the step (f). It can also be carried out by washing under a solution condition with stringent stringency so that it cannot be hybridized.
  • the second nucleic acid probe bound to the solid phase carrier is dissociated from the target nucleic acid molecule, the first marker forming an aggregate with the target nucleic acid molecule is released from the solid phase carrier.
  • ⁇ Target nucleic acid molecule detection kit> It is also preferable to make a kit of various reagents and devices including the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe, which are used in the target nucleic acid molecule detection method of the present embodiment. With the kit, the target nucleic acid molecule detection method of the present embodiment can be performed more simply.
  • the kit includes, in addition to the nucleic acid probe, a solid phase carrier having a site that binds to the second marker, various buffers used for preparing a sample solution, and three after stabilization by covalent bonding A washing solution for washing the aggregate, an incubator with a thermostatic device, and the like can be included.
  • One aspect of the present invention is a single-stranded RNA having a sequence homologous to human microRNA let-7a (hsa-let-7a, 5′-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUU-3 ′) (SEQ ID NO: 1) as a target nucleic acid molecule.
  • the unlabeled target nucleic acid molecule was detected by the target nucleic acid molecule detection method.
  • a base having a complementary base sequence in the region from the 5 'end to the 9th base of let-7a and a base complementary to the 5th base from the 5' end of let-7a A nucleic acid probe (7a right tamura-1, 5'-ACTAKCTCA-3 ') in which CNV K was substituted as a base derivative for cross-linking and a fluorescent substance Tamra was bound to the 3' end as a first marker was used. .
  • the second nucleic acid probe has a base sequence complementary to the region from the 3 ′ end to the 13th base of let-7a on the 3 ′ end side, and the sixth nucleic acid probe from the 3 ′ end of let-7a.
  • a nucleic acid probe (B-7aL1, 5′-) in which CNV K is substituted as a base derivative that crosslinks a base complementary to the base of this sequence, and 10 bases of thymidine and biotin are added to the 5 ′ end as a second marker. TTTTTTTTTTAACTAKACACACT-3 ′) was used.
  • K means CNV K.
  • nucleotide sequences of each probe before substitution with CNV K are shown in SEQ ID NOs: 2 and 3, respectively.
  • the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe were synthesized by Fasmac Co., Ltd.
  • the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe have a final concentration of 100 nM
  • the target nucleic acid molecule is a synthetic RNA consisting of a base sequence homologous to let-7a at a final concentration of 10 nM, 1 nM, 100 pM, 50 ⁇ L each of solutions added so as to be 10 pM, 1 pM, and 0 pM was prepared (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 0.1% Tween 20).
  • an RNA degradation inhibitor product name: Super Rase In, manufactured by Ambion
  • the target nucleic acid molecule used was synthesized by Hokkaido System Science Co., Ltd. Each sample solution was denatured at 70 ° C. for 2 minutes, and then hybridization (association) was performed by lowering the temperature to 10 ° C. at 1 ° C./15 seconds. Thereafter, the sample solution was irradiated with 365 nm light in ice. 10 ⁇ L of Dynabeads (product name: Dynabeads MyOne Streptavidin, manufactured by Invitron) was added to each sample solution as magnetic beads and incubated at room temperature for 15 minutes. Thereafter, the magnetic beads were washed once each with x1 SSC, x0.1 SSC, and x0.01 SSC.
  • FIG. 2 shows the measurement results by FIDA of the number of molecules of the fluorescent substance Tamra released from the magnetic beads recovered from each sample solution by a nucleolytic enzyme reaction.
  • the horizontal axis represents the target nucleic acid molecule concentration (nM), and the vertical axis represents the number of fluorescent molecules.
  • nM target nucleic acid molecule concentration
  • the vertical axis represents the number of fluorescent molecules.
  • the first marker was released from the solid phase carrier by nucleolytic enzyme reaction or ultraviolet irradiation under a low salt concentration condition.
  • the target nucleic acid molecule, the first nucleic acid probe, and the first nucleic acid molecule were synthesized in the same manner as in Example 1 except that the synthetic RNA having a base sequence homologous to let-7a was changed to a final concentration of 10 nM or 0 nM.
  • a sample solution containing 2 nucleic acid probes was prepared, subjected to hybridization (association) after denaturation, and then irradiated with ultraviolet rays to form covalent bonds.
  • Dynabeads product name: Dynabeads MyOne Streptavidin, manufactured by Invitron
  • the magnetic beads were washed once each with x1 SSC, x0.1 SSC, and x0.01 SSC. After washing, 50 ⁇ L of ⁇ 0.1 SSC, ⁇ 0.01 SSC, or pure water was added, heated at 50 ° C. for 1 minute, and irradiated with 365 nm ultraviolet rays for 10 seconds in that state.
  • the supernatant was collected, irradiated with the excitation wavelength of Tamra, and the supernatant was measured by fluorescence correlation spectroscopy (FCS method).
  • FCS method fluorescence correlation spectroscopy
  • the magnetic beads bound with the three-party aggregate were washed once with x1 SSC, x0.1 SSC, and x0.01 SSC, respectively, and then the S1 nuclease solution (Takara) was obtained in the same manner as in Example 1. Biotechnology) was added and reacted, and 30 ⁇ L of TE buffer was added to the resulting reaction solution.
  • the supernatant was collected and irradiated with the excitation wavelength of Tamra.
  • the supernatant was measured by a fluorescence intensity distribution analysis method (FIDA method).
  • FIDA method fluorescence intensity distribution analysis method
  • an S1 nuclease solution manufactured by Takara Bio Inc. was added to and reacted with the magnetic beads after washing in the same manner as in Example 1.
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • FIG. 3 shows the measurement results by FCS of the number of molecules of the fluorescent substance Tamra released from the magnetic beads recovered from each sample solution.
  • the horizontal axis represents the treatment performed to release Tamra, and the vertical axis represents the number of fluorescent molecules analyzed using the FCS method.
  • “S1 nuclease without let7a” indicates the result of the sample solution to which the target nucleic acid molecule was not added.
  • the number of fluorescent molecules of about 2 can be measured under each solution condition.
  • the first marker is released from the solid phase carrier by heating under an alkaline condition or under a low salt concentration condition.
  • the target nucleic acid molecule, the first nucleic acid probe, and the first nucleic acid molecule were synthesized in the same manner as in Example 1 except that the synthetic RNA having a base sequence homologous to let-7a was changed to a final concentration of 10 nM or 0 nM.
  • a sample solution containing 2 nucleic acid probes was prepared, subjected to hybridization (association) after denaturation, and then irradiated with ultraviolet rays to form covalent bonds.
  • FIG. 4 shows the measurement results by FCS method of the number of molecules of the fluorescent substance Tamra released from the magnetic beads recovered from each sample solution by heating under low salt concentration conditions or alkaline conditions.
  • the horizontal axis shows the temperature when Tamra is liberated, and the vertical axis shows the number of fluorescent molecules analyzed using the FCS method.
  • FCS method the number of fluorescent molecules of the fluorescent substance Tamra released from the magnetic beads recovered from each sample solution by heating under low salt concentration conditions or alkaline conditions.
  • the horizontal axis shows the temperature when Tamra is liberated
  • the vertical axis shows the number of fluorescent molecules analyzed using the FCS method.
  • “Water / 0 nM” and “Water / 10 nM” indicate the results when the magnetic beads prepared from the sample solution having a target nucleic acid molecule of 0 nM or 10 nM are heated in water
  • “1 mM NaOH / “0 nM” and “1 mM NaOH / 10 nM” are the results of heating the magnetic beads prepared from a sample solution with a target nucleic acid molecule of 0 nM or 10 mM in 1 mM NaOHH, respectively
  • “10 mM NaOH / 0 nM” and “10 mM NaOH / “10 nM” indicates the results when the magnetic beads prepared from the sample solution having a target nucleic acid molecule of 0 nM or 10 nM were heated in 10 mM NaOH, respectively.
  • the number of fluorescent molecules was hardly detected over the entire temperature range.
  • higher concentration of NaOH releases more fluorescent dye, and treatment with 90 ° C than 70 ° C has more free fluorescent molecules. all right.
  • the luminescent substance that is the first marker is released from the solid support, and is measured with high sensitivity by a fluorescence single molecule measurement method such as the FCS method. It turns out that is possible.
  • Fluorescent molecules can be measured at a concentration of about 80 ° C. or higher, preferably 90 ° C. or higher to release the luminescent substance as the first marker from the solid phase carrier even in pure water.
  • the first marker is released from the solid phase carrier by heating.
  • the target nucleic acid molecule, the first nucleic acid probe, and the first nucleic acid molecule were synthesized in the same manner as in Example 1 except that the synthetic RNA having a base sequence homologous to let-7a was changed to a final concentration of 10 nM or 0 nM.
  • a sample solution containing 2 nucleic acid probes was prepared, subjected to hybridization (association) after denaturation, and then irradiated with ultraviolet rays to form covalent bonds.
  • the sample solution was diluted 10-fold with x1 B & W buffer (0.5 M NaCl, 5 mM Tris), and the diluted sample solution with a total amount of 50 ⁇ L was added to magnetic beads as Dynabeads (Product name: Dynabeads MyOne Streptavidin, Invitron). 10 ⁇ L) was added and incubated at room temperature for 15 minutes. Thereafter, the magnetic beads were washed once each with x1 SSC, x0.1 SSC, and x0.01 SSC. After washing, 50 ⁇ L of x1 SSC, x1 TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA), or pure water was added and kept at 90 ° C. for 30 minutes. After the magnetic beads were deposited on the side of the container at room temperature, the supernatant was removed. It measured by the fluorescence intensity distribution analysis method (FIDA method).
  • FIDA method fluorescence intensity distribution analysis method
  • FIG. 5 shows the measurement results by the FIDA method of the number of molecules of the fluorescent substance Tamra released from the magnetic beads recovered from each sample solution by heating.
  • the horizontal axis represents the solution conditions during heating, and the vertical axis represents the number of fluorescent molecules analyzed using the FIDA method.
  • “Heat” indicates the result when heated at 90 ° C.
  • “RT” indicates the result when not heated.
  • the number of fluorescent molecules was hardly detected under all solution conditions.
  • fluorescent molecules could be detected under all conditions. From these results, it was found that the release of fluorescent molecules can be detected by heating at 90 ° C. preferably without using alkali treatment or the like.
  • the target nucleic acid molecule present in the sample can be detected with high sensitivity and accuracy by the target nucleic acid detection method according to some embodiments of the present invention. Therefore, the method for detecting a target nucleic acid according to some embodiments of the present invention can be used in fields such as biochemistry, molecular biology, and clinical examination that detect or quantitatively analyze a nucleic acid in a sample.
  • SYMBOLS 1 Target nucleic acid molecule, 2 ... 1st nucleic acid probe, 2a ... Fluorescent substance, 2b ... CNV K, 3 ... 2nd nucleic acid probe, 3a ... Biotin, 3b ... CNV K, 4 ... Avidin bead.

Abstract

　標的核酸分子の検出方法は、少なくとも、核酸分子と、第１マーカーが結合する第１核酸プローブと、第２マーカーが結合する第２核酸プローブとを会合させて３者会合体を形成し、標的核酸分子と第１核酸プローブとの間及び標的核酸分子と第２核酸プローブとの間に、少なくとも１の共有結合を形成させ、前記３者会合体を第２マーカーを介して固相担体に結合させた後、前記固相担体と結合した３者会合体を回収し、回収された３者会合体から第１マーカーを遊離させ、遊離された第１のマーカーを検出することにより標的核酸分子を検出することを含む。

Description

標的核酸分子の検出方法
　本発明は、光クロスリンク反応を利用して標的核酸分子を検出する方法に関する。
　本願は、２０１２年３月２１日に、日本に出願された特願２０１２－０６３６８２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　試料溶液中の核酸分子は、例えば、核酸分子と特異的にハイブリダイズする標識済みプローブを用いるハイブリダイゼーション法により検出できる。例えば、予めビーズに固定した標識プローブと標的核酸分子をハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズされかつビーズに固定化された標的核酸分子を容器底面に沈降させる。その後反応液の温度を標的核酸の変性温度以上にまで徐々に上げて標識プローブをビーズから上清に放出させ、上清中の蛍光又は発光量を経時的に測定する方法がある（例えば、特許文献１参照。）。
　また、オリゴヌクレオチドを構成する塩基に反応性官能基を導入し、この反応性官能基を介して、他のオリゴヌクレオチドやその他の分子との間に共有結合を形成する（クロスリンク）方法が開発されている。例えば、反応性官能基を導入した塩基誘導体を用いて核酸分子同士を共有結合的クロスリンクする技術として、２－Ａｍｉｎｏ－６－Ｖｉｎｙｌｐｕｒｉｎｅを用いる方法（例えば、非特許文献１参照。）や、光反応性の塩基誘導体である３－Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅを用いる方法（例えば、非特許文献２、非特許文献３、又は特許文献２参照。）等が開示されている。
　光クロスリンク反応と蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）を利用して標的核酸分子を定量する方法もある。例えば、特異的な会合に適した条件でＦＲＥＴプローブと標的核酸分子とを会合させた後、反応溶液の温度及び塩濃度を変更することなく、形成された会合体中の２本の核酸鎖間に光クロスリンク反応を利用して共有結合を形成させた後、この会合体を一分子ごとに検出し解析する方法が開示されている（例えば、特許文献３参照）。ハイブリダイゼーションを用いた検出では、一般的には、形成された会合体の検出を通常の測定温度条件（例えば室温等）において行うため、会合体検出操作時に非特異的会合体（非特異的なハイブリダイゼーションにより形成された会合体）が形成されやすいが、先述の方法では、光クロスリンク反応によりＦＲＥＴプローブと標的核酸分子との会合体を安定化することによって、非特異的会合体の形成を効果的に抑制することができる。
　特定の核酸分子と特異的に結合するＦＲＥＴプローブは、抗原抗体反応の検出にも利用されている。例えば、１本鎖ＤＮＡで標識された抗体を用いて抗原抗体反応を行い、形成された抗原抗体複合体と、抗体を標識した１本鎖ＤＮＡと相補的なＦＲＥＴプローブとを結合させた後、核酸分解酵素で処理することによって抗原抗体複合体からＦＲＥＴプローブ中の蛍光物質を反応液上清に遊離させ、この反応液上清の蛍光強度を測定することにより、抗原を検出する方法が開示されている（例えば、特許文献４参照）。
日本国特開２００４－１２１２３１号公報 国際公開第０９／０６６４４７号 日本国特開２０１１－０３６１５０号公報 日本国特開２０１１－０３３６１３号公報
佐々木茂貴、薬学雑誌（YAKUGAKU ZASSHI）、２００２年、第１２２巻第１２号、第１０８１～１０９３ページ。 フジモト（Fujimoto）、他２名、ヌクレイック・アシッズ・シンポジウム・シリーズ（Nucleic Acids Symposium Series）、２００８年、第５２巻、第４２３～４２４ページ。 ヨシムラ（Yoshimura）、他１名、オーガニック・レターズ（ORGANIC LETTERS）、２００８年、第１０巻第１５号、第３２２７～３２３０ページ。
　標識プローブと標的核酸分子との会合体を精度よく検出するためには、標的核酸分子との会合体中の標識プローブを検出する際に、遊離の標識プローブを検出しない、又は標的核酸分子との会合体中の標識プローブと遊離の標識プローブとを区別して検出する必要がある。例えば、形成された会合体をビーズ等の固相担体に結合させ、固相担体が結合した会合体を固液分離処理により遊離の標識プローブから分離して回収した後、回収された会合体を検出操作に供することによって、会合体中の標識プローブのみを検出することができる。しかしながら、会合体の検出方法によっては、固相担体が結合した会合体は検出精度が劣る場合がある。
　本発明のいくつかの態様は、標識済みプローブを用いて標的核酸分子を検出する方法において、標的核酸分子と標識済みプローブとの会合体を、固相担体を用いて遊離の標識プローブから分離して回収した場合でも、前記固相担体の影響を受けずに高精度に標的核酸分子を検出し得る方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、標的核酸分子を、発光物質で標識した標識プローブと固相担体との結合を介在するプローブの両方とハイブリダイズさせ、形成された３者会合体を固相担体と結合した状態で遊離の標識プローブから分離して回収した後、前記会合体中の発光物質を固相担体と切り離し、遊離の状態となった発光物質を検出することにより、固相担体の影響を受けずに高精度に標的核酸分子を検出し得ることが見出された。さらに、遊離の標識プローブから分離回収する前に、形成された３者会合体を共有結合により安定化させておくことによって、試料中の標的核酸分子をより高精度に検出し得ることが見出された。
　すなわち、本発明のいくつかの態様は、以下を提供する。
（１）本発明の一態様における標的核酸分子の検出方法は、
　（ａ）核酸含有試料と、発光物質である第１のマーカーが結合されており、かつ標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の核酸プローブと、第２のマーカーが結合されており、かつ標的核酸分子と、前記第１の核酸プローブがハイブリダイズする領域とは異なる領域で特異的にハイブリダイズする第２の核酸プローブと
　を添加した試料溶液を調製する工程と、
　（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の核酸分子を変性させる工程と、
　（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記試料溶液中の核酸分子を会合させる工程と、
　（ｄ）前記工程（ｃ）において形成された会合体のうち、前記標的核酸分子と前記第１の核酸プローブと前記第２の核酸プローブとからなる３者会合体において、前記標的核酸分子と前記第１の核酸プローブとの間に少なくとも１の共有結合を形成させると共に、前記標的核酸分子と前記第２の核酸プローブとの間に少なくとも１の共有結合を形成させる工程と、
　（ｅ）前記工程（ｄ）の後、前記試料溶液中に、前記第２のマーカーと結合する部位を備える固相担体を添加し、前記３者会合体中の前記第２のマーカーを介して前記固相担体及び前記３者会合体を結合させた後、固液分離処理により、前記固相担体と結合した前記３者会合体を回収する工程と、
　（ｆ）前記工程（ｅ）の後、回収された３者会合体から前記第１のマーカーを遊離させる工程と、
　（ｇ）前記工程（ｆ）の後、遊離された第１のマーカーを検出することにより、前記標的核酸分子を検出する工程と、
を有する。
（２）　前記（１）の標的核酸分子の検出方法の前記工程（ｆ）において、
（ｆ１）前記標的核酸分子と前記第１の核酸プローブとの間、又は前記標的核酸分子と前記第２の核酸プローブとの間に共有結合が形成されていない場合には、前記３者会合体が脱会合する条件下で、前記３者会合体に３００～３８０ｎｍの紫外線を照射する、
（ｆ２）前記３者会合体を核酸分解酵素により分解する、
（ｆ３）前記３者会合体を８０℃以上に加温する、又は
（ｆ４）前記３者会合体をアルカリ条件下で５０～１００℃に加温する
ことにより、前記３者会合体から前記第１のマーカーを遊離させてもよい。
（３）　前記（２）の標的核酸分子の検出方法の前記（ｆ１）において、前記３者会合体への紫外線照射を、前記第１の核酸プローブのＴｍ値が２５℃以下となる濃度の塩を含む溶液中で行ってもよい。
（４）　前記（１）～（３）のいずれか一つの標的核酸分子の検出方法において、共有結合の形成反応が、光反応性塩基誘導体を介した光化学的反応であってもよい。
（５）　前記（４）の標的核酸分子の検出方法において、前記第１の核酸プローブ中の前記標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の少なくとも一塩基が、光反応性塩基誘導体に置換されており、
　前記第２の核酸プローブ中の前記標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の少なくとも一塩基が、光反応性塩基誘導体に置換されていてもよい。
（６）　前記（４）又は（５）の標的核酸分子の検出方法において、前記光反応性塩基誘導体が、３－Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅであり、
　前記共有結合が、前記試料溶液に３４０～３８０ｎｍの光を照射することにより形成されてもよい。
（７）　前記（１）～（６）のいずれか一つの標的核酸分子の検出方法において、前記工程（ｆ）の前に、
　前記工程（ｅ）において回収された前記固相担体と結合した前記３者会合体を、前記第１の核酸プローブのＴｍ値が２５℃以下となる塩濃度である洗浄用溶液で洗浄してもよい。
（８）　前記（１）～（７）のいずれか一つの標的核酸分子の検出方法の前記工程（ｇ）において、前記第１のマーカーの検出を、蛍光１分子測定法を用いて行ってもよい。
（９）　前記（８）の標的核酸分子の検出方法の前記工程（ｇ）において、前記第１のマーカーの検出を、
（ｐ）蛍光相関分光法、又は蛍光強度分布解析法により、前記遊離された第１マーカーを含有する測定用溶液中に存在している第１マーカーの分子数を算出する工程、又は
（ｒ）共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記遊離された第１マーカーを含有する測定用溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域からの光を検出することにより、前記測定用溶液中に存在している第１マーカーの分子数を算出する工程、
により行ってもよい。
（１０）　前記（１）～（９）のいずれか一つの標的核酸分子の検出方法において、前記工程（ａ）が、
（ａ’）前記核酸含有試料と、前記第１の核酸プローブと、前記第２の核酸プローブと、前記第２のマーカーと結合する部位を備える固相担体とを添加した試料溶液を調製する工程であり、
　前記工程（ｅ）が、
（ｅ’）前記工程（ｄ）の後、前記試料溶液を固液分離処理することにより、前記３者会合体を回収する工程であってもよい。
（１１）　前記（１０）の標的核酸分子の検出方法において、前記工程（ａ’）が、
（ａ”）前記核酸含有試料と、前記第１の核酸プローブと、固相担体と結合した状態の前記第２の核酸プローブとを添加した試料溶液を調製する工程
であってもよい。
（１２）　本発明の他の態様は、前記（１）~（１１）のいずれか一つの標的核酸分子の検出方法に用いられる標的核酸分子検出用キットであって、
　発光物質である第１のマーカーが結合されており、かつ標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の核酸プローブと、
　第２のマーカーが結合されており、かつ標的核酸分子と、前記第１の核酸プローブがハイブリダイズする領域とは異なる領域で特異的にハイブリダイズする第２の核酸プローブと
　を含む。
（１３）　前記（１２）の標的核酸分子検出用キットにおいて、前記第１の核酸プローブ中の前記標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の少なくとも一塩基が、光反応性塩基誘導体に置換されており、
　前記第２の核酸プローブ中の前記標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の少なくとも一塩基が、光反応性塩基誘導体に置換されていてもよい。
（１４）　前記（１２）又は（１３）の標的核酸分子検出用キットにおいて、さらに、前記第２のマーカーと結合する部位を備える固相担体を含んでもよい。
　本発明の態様における標的核酸分子の検出方法においては、標識済み核酸プローブと結合させた標的核酸分子を、遊離の標識済み核酸プローブから分離回収した後に、固相担体から分離した状態で測定する。このため、本発明の態様における標的核酸分子の検出方法を用いることにより、標的核酸分子を、遊離の標識済みプローブや固相担体の影響を受けずに、高精度に検出することができる。
本発明の標的核酸分子の検出方法の一態様を模式的に示した図である。 実施例１において、各試料溶液から回収された磁気ビーズから核酸分解酵素反応により遊離させた蛍光物質Ｔａｍｒａの分子数のＦＩＤＡ法による測定結果を示した図である。 実施例２において、各試料溶液から回収された磁気ビーズから核酸分解酵素反応又は低塩濃度条件下での紫外線照射によって遊離させた蛍光物質Ｔａｍｒａの分子数のＦＣＳ法による測定結果を示した図である。 実施例３において、各試料溶液から回収された磁気ビーズから低塩濃度条件下又はアルカリ条件下での加温によって遊離させた蛍光物質Ｔａｍｒａの分子数のＦＣＳ法による測定結果を示した図である。 実施例４において、各試料溶液から回収された磁気ビーズから加温によって遊離させた蛍光物質Ｔａｍｒａの分子数のＦＩＤＡ法による測定結果を示した図である。
　本発明の一態様における標的核酸分子の検出方法は、下記工程（ａ）～（ｇ）を有する。
（ａ）核酸含有試料と、発光物質である第１のマーカーが結合されており、かつ標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の核酸プローブと、第２のマーカーが結合されており、かつ標的核酸分子と、前記第１の核酸プローブがハイブリダイズする領域とは異なる領域で特異的にハイブリダイズする第２の核酸プローブとを添加した試料溶液を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の核酸分子を変性させる工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記試料溶液中の核酸分子を会合させる工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）において形成された会合体のうち、前記標的核酸分子と前記第１の核酸プローブと前記第２の核酸プローブとからなる３者会合体において、前記標的核酸分子と前記第１の核酸プローブとの間に少なくとも１の共有結合を形成させ、前記標的核酸分子と前記第２の核酸プローブとの間に少なくとも１の共有結合を形成させる工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）の後、前記試料溶液中に、前記第２のマーカーと結合する部位を備える固相担体を添加し、前記第３者会合体中の前記第２のマーカーを介して前記固相担体及び前記３者会合体を結合させた後、固液分離処理により、前記固相担体と結合した前記３者会合体を回収する工程と、
（ｆ）前記工程（ｅ）の後、回収された３者会合体から前記第１のマーカーを遊離させる工程と、
（ｇ）前記工程（ｆ）の後、遊離された第１のマーカーを検出することにより、前記標的核酸分子を検出する工程。
　本実施形態において、標的核酸分子とは、検出の標的である特定の塩基配列を有する核酸分子を意味する。前記標的核酸分子としては、前記核酸分子と特異的にハイブリダイズする核酸プローブの設計が可能な程度に塩基配列が明らかになっているものであれば、特に限定されるものではない。例えば、動物や植物の染色体や、細菌やウィルスの遺伝子に存在する塩基配列を有する核酸分子であってもよく、人工的に設計された塩基配列を有する核酸分子であってもよい。なお、本実施形態において、標的核酸分子としては、２本鎖核酸であってもよく、１本鎖核酸であってもよい。また、ＤＮＡとＲＮＡのいずれであってもよい。前記標的核酸分子として、例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ増幅等による合成ＤＮＡ、ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡ等がある。
　また、本実施形態において、核酸含有試料とは、核酸分子を含有する試料であれば、特に限定されるものではない。前記核酸含有試料として、例えば、動物等から採取した生体試料、培養細胞等から調製された試料、核酸合成反応後の反応溶液等が挙げられる。生体試料等そのものであってもよく、生体試料等から抽出および又は精製した核酸溶液でもよい。
　本実施形態において、「標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする核酸プローブ」とは、標的核酸分子と塩基配列において類似しているその他の核酸分子よりも、標的核酸分子と優先的にハイブリダイズする核酸プローブであればよく、標的核酸分子以外の核酸分子と全くハイブリダイズしないものである必要はない。例えば、標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする核酸プローブとしては、標的核酸分子の部分塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであってもよく、標的核酸分子の部分塩基配列と１塩基～数塩基のミスマッチを有する塩基配列を有していてもよい。
　本実施形態において用いられる第１の核酸プローブは、第１のマーカーが結合されており、かつ標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする。第１の核酸プローブとしては、例えば、標的核酸分子の部分塩基配列と完全に相補的な塩基配列、又は当該部分塩基配列と１塩基～数塩基のミスマッチを有する塩基配列を有し、かつ第１のマーカーが結合したオリゴヌクレオチドが挙げられる。
　第１のマーカーは、発光物質である。発光物質としては、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子（通常、分子又はそれらの凝集体）が挙げられる。本実施形態においては、検出感度が高いため、第１のマーカーとして蛍光物質を用いることが好ましい。蛍光物質としては、特定の波長の光を放射することにより蛍光を放出する物質であれば特に限定されるものではなく、ＦＣＳやＦＩＤＡ等の蛍光解析において使用されている蛍光色素や量子ドット等の中から適宜選択して用いることができる。
　本実施形態において用いられる第２の核酸プローブは、第２のマーカーが結合されており、かつ標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする。第２の核酸プローブとしては、例えば、標的核酸分子の部分塩基配列と完全に相補的な塩基配列、又は当該部分塩基配列と１塩基～数塩基のミスマッチを有する塩基配列を有し、かつ第２のマーカーが結合したオリゴヌクレオチドが挙げられる。
　第２のマーカーは、工程（ｇ）において、第１のマーカーと区別して検出可能な物質であれば特に限定されるものではない。例えば、光を発さない物質であってもよく、第１のマーカーと発光特性が異なる発光物質であってもよい。なお、「発光特性が異なる」とは、特定の波長の光の強度が異なる（例えば、特定の波長の蛍光強度が異なる）ことを意味する。
　第２のマーカーとしては、例えば、第１のマーカーと発光特性が異なる蛍光物質、核酸（オリゴヌクレオチド）、親水性有機化合物、ビオチン(ｂｉｏｔｉｎ)、グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、ＤＮＰ（ｄｉｎｉｔｏｒｏｐｈｅｎｏｌ）、ジゴキシゲニン(ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ、Ｄｉｇ)、ジゴキシン(ｄｉｇｏｘｉｎ)、２以上の糖からなる糖鎖、６以上のアミノ酸からなるポリペプチド、オーキシン、ジベレリン、ステロイド、タンパク質、及び、それらの類縁体等が挙げられる。
　第１の核酸プローブ又は第２の核酸プローブを構成するオリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたものであってもよく、天然の核酸塩基と同様にヌクレオチド鎖や塩基対を形成することが可能な核酸類似物質を一部又は全部に含むものであってもよい。核酸類似物質としては、ＤＮＡやＲＮＡのような天然型ヌクレオチド（天然に存在するヌクレオチド）の側鎖等がアミノ基等の官能基により修飾されたものや、タンパク質や低分子化合物等で標識されたもの等が挙げられる。より具体的には、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（ＢＮＡ）や、天然型ヌクレオチドの４’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの２’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチドやＨｅｘｉｔｏｌ　Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。
　第１の核酸プローブ又は第２の核酸プローブを構成するオリゴヌクレオチドは、標的核酸分子とハイブリダイズする領域以外の領域を有していてもよい。例えば、標的核酸分子とハイブリダイズする領域と、第１のマーカー又は第２のマーカーを結合する領域とを、適当な塩基長のリンカーで結合させていてもよい。
　第１の核酸プローブ又は第２の核酸プローブは、例えば、標的核酸分子の塩基配列情報や塩基対を形成する領域の塩基配列情報に基づいて塩基配列を設計し、設計に基づいて合成した核酸プローブに、マーカーを結合させることにより作製できる。核酸プローブの合成と同時にマーカーを結合させてもよい。第１の核酸プローブ又は第２の核酸プローブの設計や合成、第１の核酸プローブと第１のマーカーとの結合反応、第２の核酸プローブと第２のマーカーとの結合反応は、常法により行うことができる。
　一の標的核酸分子に、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブが両方ともハイブリダイズし、これらからなる３者会合体が形成される。すなわち、標的核酸分子中、第１の核酸プローブとハイブリダイズする領域と、第２の核酸プローブとハイブリダイズする領域とは、互いに相違している。標的核酸分子が２本鎖核酸分子の場合、そのうちの１本鎖核酸分子に、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブが両方ともハイブリダイズする。なお、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブは、標的核酸分子に同時にハイブリダイズしてもよい。
　第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブを、一の標的核酸分子にハイブリダイズさせるため、第１の核酸プローブと標的核酸分子との特異的会合条件と、第２の核酸プローブと標的核酸分子との特異的会合条件とがほぼ同じ条件であることが好ましい。特異的会合条件は、標的核酸分子及び核酸プローブの塩基配列の種類や長さ等に依存する。
　よって、特異的会合条件を揃えるように、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブを設計することが好ましい。
　具体的には、標的核酸分子と核酸プローブの特異的会合条件は、融解曲線から求めることができる。会合体の形成は一般的に温度条件や塩濃度条件に依存するため、核酸プローブと標的核酸分子のみを含有する溶液の温度を、高温から低温へと変化させ、前記溶液の吸光度を測定することにより、融解曲線を求めることができる。得られた融解曲線から、一本鎖状態で存在していた核酸プローブが、標的核酸分子と会合体を形成し始めた温度から、ほぼ全てが会合体となった温度までの範囲の温度条件を、特異的会合条件とすることができる。温度に代えて、溶液中の塩濃度を低濃度から高濃度への変化させることによっても、同様にして融解曲線を決定し、特異的会合条件を求めることができる。
　このように、特異的会合条件は、標的核酸分子や核酸プローブの種類ごとに異なり、実験的に決定されるものであるが、一般にはＴｍ値（融解温度）で代用することができる。
　例えば、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、核酸プローブの塩基配列情報から、標的核酸分子と相補的な塩基配列を有する領域のＴｍ値（２本鎖ＤＮＡの５０％が１本鎖ＤＮＡに解離する温度）を算出することができる。温度がＴｍ値近傍の値である条件、例えばＴｍ値±３℃程度である条件を、特異的会合条件とすることができる。算出されたＴｍ値近傍において実験的に融解曲線を求めることにより、より詳細に特異的会合条件を決定することもできる。
　まず、工程（ａ）として、核酸含有試料と、第１の核酸プローブと、第２の核酸プローブとを適当な溶媒に添加して、試料溶液を調製する。前記溶媒は、第１マーカー及び第２マーカーを損なわない溶媒であれば、特に限定されるものではなく、当該技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。前記バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。その他、第１マーカー及び第２マーカーの種類によっては、ホルムアミド等の有機溶媒であってもよい。
　次に、工程（ｂ）として、調製された試料溶液中の核酸分子を変性させる。本実施形態において、「核酸分子を変性させる」とは、塩基対を解離させることを意味する。例えば、２本鎖核酸を１本鎖核酸とすることを意味する。本実施形態においては、蛍光物質等の発光物質への影響が比較的小さいことから、高温処理による変性（熱変性）又は低塩濃度処理による変性を行うことが好ましい。中でも、操作が簡便であるため、熱変性を行うことが好ましい。具体的には、熱変性は、前記試料溶液を、高温処理をすることにより、前記試料溶液中の核酸分子を変性することができる。一般的には、ＤＮＡで９０℃、ＲＮＡでは７０℃で数秒間から２分間程度、保温することによって変性させることができるが、標的核酸分子の塩基の長さ等により変性する温度は千差万別であり、変性することが可能であれば、この温度に限定するものではない。一方、低塩濃度処理による変性は、例えば、精製水等により希釈することによって、前記試料溶液の塩濃度が十分に低くなるように調整することによって行うことができる。
　次いで、工程（ｃ）として、前記試料溶液中の核酸分子を会合させる。標的核酸分子と第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブとの会合体の形成は、特異的会合条件で行う。具体的には、熱変性を行った場合には、高温処理後、前記試料溶液の温度を、特異的会合条件に適う温度にまで低下させることにより、前記試料溶液中の核酸分子を適宜会合させることができる。好ましくは、試料溶液の温度を、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブ中の標的核酸分子と相補的な塩基配列を有する領域のＴｍ値±３℃の温度程度まで低下させる。一方、低塩濃度処理による変性を行った場合にも、同様に、低塩濃度処理後、塩溶液を添加する等により、前記試料溶液の塩濃度を、特異的会合条件に適う濃度にまで上昇させることにより、前記試料溶液中の核酸分子を適宜会合させることができる。
　非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、会合体を形成させる際に、溶液の温度を比較的ゆっくりと低下させることが好ましい。例えば、溶液の温度を７０℃以上にして核酸分子を変性させた後、前記溶液の液温を、０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることができる。
　また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、予め溶液中に、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又は尿素等を添加しておくことも好ましい。
　これらの化合物は、１種のみを添加してもよく、２種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的なハイブリダイゼーションを起こりにくくすることができる。
　その後、工程（ｄ）として、工程（ｃ）において形成された会合体のうち、標的核酸分子と第１の核酸プローブと第２の核酸プローブとからなる３者会合体において、標的核酸分子と第１の核酸プローブとの間に少なくとも１の共有結合を形成させ、標的核酸分子と第２の核酸プローブとの間に少なくとも１の共有結合を形成させる。各核酸プローブと標的核酸分子との間にそれぞれ共有結合を形成させることにより、標的核酸分子と第１の核酸プローブと第２の核酸プローブとからなる３者会合体を、温度コントロールを行わない状態、例えばいわゆる常温においても、安定化することができる。
　工程（ｄ）における共有結合の形成方法は、塩基対を形成している２本の１本鎖核酸同士を連結する共有結合を形成可能であれば、特に限定されるものではなく、核酸分子同士をクロスリンクする際に用いられる公知の手法の中から適宜選択して行うことができる。
　なお、工程（ｄ）における共有結合の形成は、工程（ｃ）において形成された３者会合体を維持した状態で行うことが好ましい。例えば、工程（ｃ）における３者会合体の形成を、試料溶液を３者会合体形成可能な温度にまで低下させることにより行った場合には、工程（ｄ）における共有結合の形成は、試料溶液の温度を変更せずに行うことが好ましい。
　なお、「工程（ｃ）における３者会合体形成時と同じ条件」とは、試料溶液の温度及び塩濃度が互いに同一条件であることが好ましいが、標的核酸分子と第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブとの会合体の形成しやすさと、標的核酸分子以外の核酸分子と第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブとの会合体の形成しやすさとが、工程（ｃ）における３者会合体形成時と、工程（ｄ）における共有結合形成時とで実質的に同じであればよく、必ずしも物理的に完全に同一でなくてもよい場合がある。例えば、工程（ｃ）における３者会合体形成時の試料溶液の温度がＴｍ値±３℃であった場合に、工程（ｄ）における共有結合形成時の試料溶液の温度もＴｍ値±３℃の範囲内の温度であればよい場合がある。標的核酸分子の塩基配列の種類によっては、Ｔｍ値±３℃の温度であれば、特異的会合条件であり、前記温度範囲内で多少の変動があったとしても、会合体形成の特異性に対する影響はほとんどないと考えられるためである。
　本実施形態においては、光化学的反応により、共有結合を形成することが好ましい。光化学的反応とは、特定の波長の光を照射し、その光エネルギーを利用して行われる反応を意味する。光化学的反応により共有結合を形成する方法は、試料溶液に特定の波長の光を照射することによって会合体の核酸鎖間に共有結合を形成させることができるため、試料溶液の組成等の条件を変動させる必要がない。このため、試料溶液中の会合体に対して、共有結合形成以外に与える影響を抑えることができ、かつ操作も簡便である。
　例えば、第１の核酸プローブ中の標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の少なくとも一塩基が、光反応性塩基誘導体に置換されている第１の核酸プローブと、第２の核酸プローブ中の標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の少なくとも一塩基が、光反応性塩基誘導体に置換されている第２の核酸プローブとを用いることにより、光化学反応によって、標的核酸分子と第１の核酸プローブとの間、及び標的核酸分子と第２の核酸プローブとの間に、前記光反応性塩基誘導体を介した共有結合を形成することができる。
　第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブ中の光反応性塩基誘導体に置換される塩基は、標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の塩基であれば特に限定されるものではない。また、１塩基のみが光反応性塩基誘導体に置換されていてもよく、２塩基以上が光反応性塩基誘導体に置換されていてもよい。
　ここで、光反応性塩基誘導体とは、特定の波長の光が照射されることにより、有機合成反応における反応性が活性化される部位（光反応性部位）を有し、天然のヌクレオチドと同様に核酸鎖を形成することが可能な塩基誘導体を意味する。
　このような光反応性塩基誘導体としては、例えば、３－Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ（ＣＮＶＫ）（例えば非特許文献２又は３参照。）等が挙げられる。なお、光反応性塩基誘導体に置換されている核酸プローブは、例えば、核酸プローブを公知のオリゴヌクレオチド合成機を用いて合成する際に、光反応性塩基誘導体を原料として用いることにより製造することができる。また、未置換核酸プローブを製造した後、公知の有機合成反応により、当該核酸プローブを構成する塩基に適当な光反応性官能基を導入することによっても得ることができる。
　光反応性塩基誘導体としてＣＮＶＫを用いた場合には、具体的には、標的核酸分子と第１の核酸プローブと第２の核酸プローブを含む試料溶液中で、これらからなる３者会合体を形成させた後、前記試料溶液に３００ｎｍ～３８０ｎｍの光、好ましくは３４０ｎｍ～３８０ｎｍの光、より好ましくは３６０ｎｍ～３７０ｎｍの光、さらに好ましくは３６６ｎｍを含む紫外光を照射すると、ＣＮＶＫの５’側 に隣接するプリン塩基と塩基対を形成している標的核酸分子中のピリミジン塩基を構成する原子とＣＮＶＫを構成する原子とが共有結合により結合する。
　その他、光反応性塩基誘導体として、チミン（Ｔ）又はアデニン（Ａ）にリンカーを介してソラーレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, pp. 5602-5606, July 1991）を付加したものを用いてもよい。例えば、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブ中の標的核酸分子とハイブリダイズする領域にＴＡ配列があった場合に、前記ＴＡ配列中のＴ又はＡにリンカーを介してソラーレンを結合させたソラーレン結合核酸プローブを調製する。次いで、このソラーレン結合核酸プローブと標的核酸分子とを会合させた後、３００ｎｍ等の近紫外光を照射すると、このソラーレンを介して塩基対を形成している第１の核酸プローブ又は第２の核酸プローブと標的核酸分子との間が架橋され、３者会合体が安定化する。
　工程（ｄ）の後、工程（ｅ）として、まず、前記試料溶液中に、第２のマーカーと結合する部位を備える固相担体を添加し、第３者会合体中の第２のマーカーを介して固相担体及び３者会合体を結合させる。その後、固液分離処理により、固相担体と結合した３者会合体を回収する。
　本実施形態において用いられる固相担体は、第２のマーカーと結合する部位を備える。具体的には、表面に、第２のマーカーと特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質を結合させた固相担体である。前記物質としては、第２のマーカーがオリゴヌクレオチドの場合には、前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、第２のマーカーに対する抗原若しくは抗体、第２のマーカーに対するリガンド若しくはレセプター、又はビオチンとアビジンのように第２のマーカーと特異的に結合する物質等が挙げられる。なお、固相担体は、第２のマーカーと非特異的に結合等するものであってもよいが、標的核酸分子の検出および又は定量の精度の点からは、特異的に結合等するものであることが好ましい。
　固相担体と、第２のマーカーと特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質とを結合させる方法は、特に限定されるものではなく、物理的に吸着させてもよく、固相担体表面の官能基に化学的に結合させてもよい。化学的に結合させる場合には、各官能基に適した方法により結合させることができる。例えば、ＥＤＡＣ（１－エチル－３－(３－ジメチルアミノプロピル) －カルボジイミド塩酸塩）反応、ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド）とＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）とを予め混合してカルボン酸とアミノ基とを結合させる反応、双極性を有するリンカーを用いてアミノ基同士を架橋する反応、活性化したアルデヒド基やトシル基と、第２のマーカーと特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質中の官能基を結合する反応等が挙げられる。固相担体表面に官能基を有さない場合には、固相担体表面を予め官能基で被覆してもよい。
　固相担体としては、第２のマーカーと結合する部位を備えている固体であれば、その形状、材質等は特に限定されるものではない。例えば、ビーズ等の水に懸濁可能であり、かつ一般的な固液分離処理によって液体と分離可能な粒子であってもよく、メンブレンであってもよく、容器やチップ基板等であってもよい。固相担体としては具体的には、例えば、磁気ビーズ、シリカビーズ、アガロースゲルビーズ、ポリアクリルアミド樹脂ビーズ、ラテックスビーズ、プラスチックビーズ、セラミックスビーズ、ジルコニアビーズ、シリカメンブレン、シリカフィルター、プラスチックプレート等が挙げられる。例えば、固相担体がビーズ等の粒子の場合、前記試料溶液に前記固相担体を添加する。また、固相担体がメンブレンやフィルターの場合、前記試料溶液を前記固相担体に透過させる。固相担体が、内壁に第２のマーカーと結合する物質で被覆された容器である場合、前記試料溶液を前記固相担体である容器に注入する。
　例えば、第２のマーカーがビオチンの場合、アビジンやストレプトアビジンが表面に結合しているビーズやフィルターを固相担体として用いることができる。また、第２のマーカーがジゴキシゲニン（Ｄｉｇ)の場合、抗Ｄｉｇ抗体が表面に結合しているビーズやフィルターを固相担体として用いることができる。
　固相担体と、３者会合体を含む試料溶液とを接触させることにより、３者会合体中の第２のマーカーを介して、前記３者会合体を固相担体と結合させる。その後固液分離処理を行うことにより、固相担体と結合した３者会合体を、液相に存在する遊離の第１の核酸プローブと分離して回収することができる。
　固液分離処理としては、溶液中の固相担体を液体成分とは分離して回収可能な方法であれば、特に限定されるものではなく、固液分離処理に用いられる公知の処理の中から適宜選択して用いることができる。例えば、固相担体がビーズ等の粒子の場合、固相担体を含む懸濁液に対して遠心分離処理を行い、固相担体を沈殿させ、上清を除去してもよく、前記溶液を濾紙又は濾過フィルターを用いて濾過し、濾紙等の表面に残留した固相担体を回収してもよい。また、固相担体が磁気ビーズである場合には、前記溶液が入れられている容器に磁石を接近させ、前記容器の前記磁石に最も近接する面に固相担体を収束させた後、上清を除去してもよい。固相担体が内壁に第２のマーカーと結合する物質で被覆された容器である場合、固相担体である容器内の液体を排出する。なお、固相担体がメンブレンやフィルターの場合、前記試料溶液を前記固相担体に透過させることにより、固相担体と３者会合体との結合と、固相担体に結合した３者会合体の遊離の第１の核酸プローブからの分離回収を一の操作で行うことができる。
　本実施形態においては、工程（ａ）において、第２のマーカーと結合する部位を備える固相担体を、核酸含有試料と第１の核酸プローブと第２の核酸プローブと共に予め試料溶液に添加しておき、工程（ｃ）において固相担体と結合した３者会合体を形成しておいた後、固液分離処理することにより、固相担体と結合した３者会合体を、遊離の第１の核酸プローブから分離して回収してもよい。また、工程（ａ）において、予め固相担体と結合した状態の第２のマーカーと、核酸含有試料と、第１の核酸プローブとを添加して試料溶液を調製し、工程（ｃ）において固相担体と結合した３者会合体を形成しておいた後、固液分離処理することにより、固相担体と結合した３者会合体を、遊離の第１の核酸プローブから分離して回収してもよい。なお、この際に用いる第２のマーカーは、固相担体と可逆的に結合していてもよく、不可逆的に結合していてもよい。
　回収された固相担体に適当な溶媒を添加することにより、固相担体と結合した３者会合体を含む溶液が調製される。回収された固相担体は、これを含む溶液として、工程（ｆ）に供される。前記溶媒は、後の工程において第１のマーカーから放出される光の検出を阻害しない溶媒であれば、特に限定されるものではなく、当該技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。前記バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。
　回収された固相担体は、工程（ｆ）の前に、適当な溶媒により洗浄してもよい。洗浄により、遊離の第１の核酸プローブをより厳密に、固相担体と結合した３者会合体から分離して除去することができる。固相担体を洗浄する溶媒は、第２のマーカーと固相担体との結合を損なわないものであれば特に限定されるものではなく、工程（ｆ）に供される固相担体と結合した３者会合体を含む溶液の調製に用いる溶媒と同種であってもよく、異なる溶媒であってもよい。
　固液分離処理を室温等において行う場合には、固液分離処理時に非特異的会合体（非特異的なハイブリダイゼーションにより形成された会合体）が形成されやすい。このため、本実施形態においては、第１の核酸プローブが非特異的な会合体（例えば第２の核酸プローブとの会合体）を形成することが抑制される状態で、固相担体を洗浄することが好ましい。
　例えば、第１の核酸プローブのＴｍ値が非常に低くなるような塩濃度の溶媒で洗浄する。
　中でも、第１の核酸プローブのＴｍ値が、洗浄時の温度よりも低くなる塩濃度の溶媒で洗浄することが好ましい。塩濃度はプローブの塩基配列によって様々であるが、２５℃程度の室温で洗浄することを考えると、第１の核酸プローブのＴｍ値が、２５℃以下となる塩濃度の溶媒を洗浄に用いることが好ましい。前記溶媒としては、具体的には、ｘ０．０１ＳＳＣ（１．５ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１５ｍＭのクエン酸ナトリウム溶液）あるいはこれ以下の塩濃度溶液等の、ハイブリダイゼーション法において洗浄等に用いられる低塩濃度溶液が挙げられる。前記溶媒としては、水等の塩を含まない溶媒であってもよい。ストリンジェンシーの高い溶液で洗浄することにより、非特異的な会合体形成を抑制し、遊離の第１の核酸プローブを効果的に除去することができる。本実施形態においては、標的核酸分子と第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブとを共有結合させているため、３者会合体を高いストリンジェンシーによる洗浄でも安定して維持することができる。
　その後、工程（ｆ）として、回収された３者会合体から第１のマーカーを遊離させる。
　第１のマーカーを遊離させる方法は、３者会合体中の第１のマーカーを固相担体から分離させられる方法であれば特に限定されるものではない。
　例えば、固相担体と結合した３者会合体を含む溶液に核酸分解酵素を添加し、前記酵素により第１の核酸プローブをはじめとする核酸分子を分解することにより、第１のマーカーを遊離させることができる（ｆ２）。第１のマーカーの遊離に用いられる核酸分解酵素は、特に限定されるものではなく、ＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素いずれでもよく、制限酵素であってもよい。ＤＮＡ分解酵素としては、例えば、Ｓ１　Ｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｍｕｎｇ　ＢｅａｎＮｕｃｌｅａｓｅ、ＢＡＬ　３１　Ｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉ、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ＩＩＩ 、ＤＮａｓｅ　Ｉ等が挙げられる。ＲＮＡ分解酵素としては、例えばＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｈ、ＤＮＡ／ＲＮＡ分解酵素としては、例えばＭｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ等が挙げられる。
　第１の核酸プローブ又は第２の核酸プローブ中の標的核酸分子とハイブリダイズする領域内に、制限酵素に対応した制限酵素認識配列を含ませるように、第１の核酸プローブ又は第２の核酸プローブを設計してもよい。この場合には、制限酵素処理により、３者会合体中の当該制限酵素の認識部位を消化することにより、第１のマーカーを固相担体から分離させることができる。制限酵素には、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ等があるが、これらに限定されるものではない。
　また、酵素反応ではなく、アルカリによって化学的に第１の核酸プローブをはじめとする核酸分子を分解することによっても、第１のマーカーを遊離させることができる（ｆ４）。具体的には、固相担体と結合した３者会合体を含む溶液にアルカリを添加して当該溶液のｐＨをアルカリとした後、５０℃～１００℃、好ましくは７０℃～１００℃、より好ましくは８０℃～１００℃に加熱する。アルカリ処理は、核酸分子が分解するｐＨ、濃度にすればよい。また、用いるアルカリの種類は特に限定されるものではなく、無機アルカリであってもよく、有機アルカリであってもよい。例えば、０．１ｍＭの水酸化ナトリウム溶液又は０．１ｍＭの水酸化カリウム溶液等の強アルカリ溶液を添加して、固相担体と結合した３者会合体を含む溶液をｐＨ１０以上、好ましくはｐＨ１２以上にした後、５０℃以上、好ましくは７０℃以上に加熱する。
　また、ＣＮＶＫを用いた光化学的反応により形成された共有結合は、強いエネルギーによって結合が解消されやすいことが新たに判明した。この際に加えられるエネルギーとしては、光エネルギーであってもよく、熱エネルギーであってもよい。
　そこで、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブと標的核酸分子とを、光反応性塩基誘導体としてＣＮＶＫを用いた光化学的反応により共有結合させた場合には、脱会合条件下で、固相担体と結合した３者会合体に３００ｎｍ～３８０ｎｍ、好ましくは３４０ｎｍ～３８０ｎｍの紫外線を照射することによっても、第１のマーカーを遊離させることができる（ｆ１）。
　ここで、脱会合条件とは、標的核酸分子と第１の核酸プローブとの間、又は標的核酸分子と第２の核酸プローブとの間に共有結合が形成されていない場合には、標的核酸分子と第１の核酸プローブ、又は標的核酸分子と第２の核酸プローブとが脱会合する条件である。脱会合条件としては、例えば、洗浄処理と同様、第１の核酸プローブのＴｍ値が非常に低くなるような低塩濃度条件等が挙げられる。具体的には、例えば、固相担体と結合した３者会合体を第１の核酸プローブのＴｍ値が、２５℃以下となる塩濃度の溶液（水等の塩を含有しない溶液であってもよい。）に添加した後、当該溶液に３００ｎｍ～３８０ｎｍの紫外線を照射する。
　また、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブと標的核酸分子とを、光反応性塩基誘導体としてＣＮＶＫを用いた光化学的反応により共有結合させた場合には、固相担体と結合した３者会合体を、第１の核酸プローブのＴｍ値よりも充分に高い温度に加温することによっても、第１のマーカーを遊離させることができる。具体的には、固相担体と結合した３者会合体を８０℃以上に加温する（ｆ３）。固相担体と結合した３者会合体に、水等の第１のマーカーから放出される光の検出を阻害しない溶媒を添加した状態で加温することが好ましい。
　その後、工程（ｇ）として、遊離された第１のマーカーを検出することにより、標的核酸分子を検出する。一分子の３者会合体からは一分子の第１のマーカーが遊離する。このため、理論的には、工程（ｇ）において検出された第１のマーカーの数は、工程（ａ）において添加された核酸含有試料中の標的核酸分子の数に等しい。
　遊離された第１のマーカーは、その分光特性に最適な波長の光を照射し、前記マーカーから発される光の光学的特性を検出することにより検出できる。なお、「マーカーの光学的特性を検出する」とは、前記マーカーから発される特定の波長の光シグナルを検出することを意味する。前記光シグナルとしては、蛍光強度や蛍光偏光等がある。本実施形態においては、蛍光強度であることが好ましい。
　第１のマーカーの検出方法は、溶液中の分子の蛍光シグナルの強度又はその時間変化（揺らぎ）を検出し解析し得る方法であれば、特に限定されるものではない。例えば、溶液中の全蛍光分子から発される蛍光強度を測定してもよく、一分子ごとに蛍光強度を測定してもよい。
　溶液の蛍光強度は、蛍光プレートリーダー等の蛍光分光光度計等を用いて常法により測定することができる。溶液の蛍光強度は、前記溶液中に含まれている第１のマーカーの量に依存する。このため、例えば、予め第１のマーカーの含有量と蛍光強度との関係を示す検量線を作成しておくことにより、溶液中の第１のマーカーの量、すなわち、核酸含有試料中の標的核酸分子の量を定量することができる。
　試料溶液中の一分子ごとに蛍光強度を測定する方法としては、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ＦＣＳ）、又は蛍光強度分布解析法（Ｆｌｕｏｒｅｃｓｃｅｎｃｅ　Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ， ＦＩＤＡ）が挙げられる。なお、このような分子の蛍光シグナルの時間変化の検出及び解析は、例えば、ＭＦ２０（オリンパス社製）等の公知の一分子蛍光分析システム等を用いて、常法により行うことができる。
　例えば、ＦＩＤＡにより、共焦点光学系における焦点領域に存在している分子の蛍光強度の揺らぎを検出した後、統計解析を行うことによって遊離した第１のマーカーの分子数を算出することにより、標的核酸分子を検出し定量することができる。
　また、ＦＣＳにより、共焦点光学系における焦点領域に存在している分子の蛍光強度の揺らぎを検出した後、統計解析を行うことによって、遊離した第１のマーカーの分子数を算出することにより、標的核酸分子を検出し定量することができる。
　本実施形態の標的核酸分子の検出方法においては、その他、走査分子計数法（Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ）により、溶液中の蛍光分子を検出することもできる。具体的には、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、測定試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域からの蛍光を検出することにより、測定試料溶液中に存在している遊離した第１のマーカーの分子数を算出する（例えば、国際公開第１１／１０８３６９号、国際公開第１１／１０８３７０号、国際公開第１１／１０８３７１号参照。）。
　走査分子計数法は、微小領域により試料溶液内を走査しながら、測定試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）が微小領域内を横切るときに、微小領域中の発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、測定試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや測定試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする技術である。ＦＩＤＡ等のような光分析技術と同様に、測定に必要な試料が微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子について、その濃度又は数密度等の特性を定量的に検出することが可能となる。
　本実施形態において、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡において光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する。なお、かかる領域は、共焦点顕微鏡においては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。
　走査分子計数法は、その光検出機構自体については、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているので、試料溶液の量は、同様に微量であってよい。しかしながら、走査分子計数法においては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されないので、走査分子計数法の光分析技術は、粒子の数密度又は濃度がＦＩＤＡ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能である。
　また、走査分子計数法では、溶液中に分散又は溶解した粒子の各々を個別に検出するようになっているので、その情報を用いて、定量的に、粒子のカウンティングや測定試料溶液中の粒子の濃度又は数密度の算定又は濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。すなわち、走査分子計数法によれば、光検出領域を通過する粒子と検出された光信号とを１対１に対応させて粒子を一つずつ検出するので、溶液中に分散してランダムに運動する粒子のカウンティングが可能となる。そのため、従前に比して、精度よく測定試料溶液中の粒子の濃度又は数密度を決定することが可能となる。例えば、本実施形態の標的核酸分子の検出方法における遊離した第１のマーカーの検出を走査分子計数法により行い、第１のマーカーが発する光によって測定試料溶液中の粒子を個別に検出しその数を計数して粒子濃度を決定する場合には、測定試料溶液の第１のマーカーの濃度が、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測された蛍光強度に基づいて決定可能な濃度よりも更に低い濃度であっても第１のマーカーを検出可能である。核酸含有試料中の標的核酸分子の濃度が非常に低く、遊離した第１のマーカーが１フェムトモル以下となるような場合でも、走査分子計数法を用いることにより、予め標的核酸分子を増幅せずに定量検出することができる。
　更に、光学系の光路を変更して測定試料溶液中を光検出領域にて走査する態様によれば、測定試料溶液に対して機械的振動や流体力学的な作用を与えずに、測定試料溶液内を一様に或いは測定試料溶液が機械的に安定した状態で観測することになる。そのため、例えば、試料に流れを発生させる場合に比して、定量的な検出結果の信頼性が向上し、また、測定試料溶液中の検出対象となる粒子（本発明においては、遊離した第１のマーカー）に対して力学的な作用による影響又はアーティファクトの無い状態で計測が行えることとなる。試料に流れを与える場合には、常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となる。また、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の粒子、発光プローブ若しくは結合体又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。
　１分子計測等の高感度測定、特に走査分子計数法では、固相担体等のような、溶液中における拡散運度が比較的遅い発光粒子の検出精度が低くなる場合がある。本実施形態においては、固相担体から分離された遊離の状態の第１マーカーを検出対象とすることにより、蛍光１分子測定法を用いた場合であっても、固相担体の影響を排除して高精度に第１マーカーを検出することができる。
　図１は、本実施形態の標的核酸分子の検出方法のうちの一態様を模式的に示した図である。図１において、第１のマーカーとして蛍光物質を、第２のマーカーとしてビオチンを、固相担体としてアビジンビーズ（表面にアビジンが結合したビーズ）を用いている。第１の核酸プローブと標的核酸分子の間、及び第２の核酸プローブと標的核酸分子の間に、ＣＮＶＫを用いた光化学的反応により共有結合形成（クロスリンク）させ、核酸分解酵素を用いて第１のマーカーを遊離させている。
　まず、標的核酸分子１と、蛍光物質２ａが結合した第１の核酸プローブ２、ビオチン３ａが結合した第２の核酸プローブ３とが、ハイブリダイズして形成された３者会合体に、３６５ｎｍの紫外線を照射して、第１の核酸プローブ２中のＣＮＶＫ２ｂと標的核酸分子１との間、及び第２の核酸プローブ３中のＣＮＶＫ３ｂと標的核酸分子１との間に、それぞれ共有結合形成（クロスリンク）を生じさせる（図１の１段目の図）。クロスリンク後に試料溶液にアビジンビーズ４を添加し、３者会合体を、ビオチン３ａを介してアビジンビーズ４と結合させる（図１の２段目の図）。その後、低塩濃度溶液によって洗浄した後、核酸分解酵素による酵素処理によって、標的核酸分子１、第１の核酸プローブ２、及び第２の核酸プローブ３が分解し（図１の３段目の図）、蛍光物質２ａがアビジンビーズ４から遊離する（図１の４段目の図）。
　その他、第２の核酸プローブと標的核酸分子との会合体のＴｍ値を、第１の核酸プローブと標的核酸分子との会合体のＴｍ値よりも充分に高くし、工程（ｅ）における固液分離処理及びその前の洗浄処理においても第２の核酸プローブが標的核酸分子とハイブリダイズすることができる場合には、第１の核酸プローブと標的核酸分子との間にのみ少なくとも１の共有結合を形成させればよい。第２の核酸プローブと標的核酸分子との間には共有結合を形成させない場合であっても、本実施形態の標的核酸分子の検出方法と同様に、標的核酸分子を、遊離の標識済みプローブや固相担体の影響を受けずに検出することができる。
　例えば、第１の核酸プローブと標的核酸分子との会合体のＴｍ値を、前記洗浄処理に用いる洗浄液の温度よりも低くする、好ましくは１０℃以上低くし、かつ第２の核酸プローブと標的核酸分子との会合体のＴｍ値を当該洗浄液の温度以上にする、好ましくは１０℃以上高くすることにより、前記洗浄処理によって、遊離の第１の核酸プローブを洗浄除去することができる。
　第２の核酸プローブと標的核酸分子との会合体のＴｍ値を、第１の核酸プローブと標的核酸分子との会合体のＴｍ値よりも高める方法としては、例えば、第２の核酸プローブをＰＮＡ等の天然のオリゴヌクレオチドよりも強い塩基対を形成し得る核酸類似物質を少なくとも一部に含むように構成させ、第１の核酸プローブの核酸鎖部分を天然のオリゴヌクレオチドのみで構成させる態様が挙げられる。これらの核酸プローブを用いて、工程（ｅ）における固液分離及びその前の洗浄処理を、標的核酸分子と共有結合を形成しておらず、非特異的に他の核酸分子とハイブリダイズしている第１の核酸プローブを遊離させることができ、かつ第２の核酸プローブが標的核酸分子とハイブリダイズすることができる条件で行う以外は、前記の本実施形態の標的核酸分子の検出方法と同様にして工程（ａ）～（ｇ）を行うことにより、標的核酸分子と会合体を形成していない第１の核酸プローブを除去した状態で、標的核酸分子と会合体を形成していた第１の核酸プローブを検出することができる。この場合、前記工程（ｆ）における回収された３者会合体からの前記第１のマーカーの遊離を、固相担体と結合している３者会合体を、第２の核酸プローブが標的核酸分子とハイブリダイズできなくなるほどストリンジェンシーの厳しい溶液条件で洗浄することにより行うこともできる。固相担体と結合している第２の核酸プローブが標的核酸分子から解離することによって、標的核酸分子と会合体を形成している第１のマーカーが、固相担体から遊離する。
＜標的核酸分子検出用キット＞
　本実施形態の標的核酸分子の検出方法に用いられる、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブをはじめとする各種試薬や機器等をキット化することも好ましい。前記キットにより、本実施形態の標的核酸分子の検出方法をより簡便に行うことができる。前記キットには、前記の核酸プローブの他に、第２のマーカーと結合する部位を備える固相担体、試料溶液を調製するために用いられる各種バッファー、共有結合により安定化させた後の３者会合体を洗浄するための洗浄液、恒温装置付インキュベーター等を含ませることができる。
　次に実施例を示して本発明の態様をさらに詳細に説明するが、本発明の態様は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
　ヒトのマイクロＲＮＡであるｌｅｔ－７ａ（ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ、５’－ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ－３’）（配列番号１）と相同な配列をもつ１本鎖ＲＮＡを標的核酸分子として、本発明の一態様である標的核酸分子の検出方法により、未標識の標的核酸分子を検出した。
　第１の核酸プローブとして、ｌｅｔ－７ａの５’末端から９番目の塩基までの領域に相補的な塩基配列を有し、かつｌｅｔ－７ａの５’末端から５番目の塩基と相補的な塩基をクロスリンクする塩基誘導体としてＣＮＶＫに置換し、さらに３’末端に第１のマーカーとして蛍光物質Ｔａｍｒａを結合させた核酸プローブ（７ａ　ｒｉｇｈｔ　ｔａｍｒａ－１、５’－ＡＣＴＡＫＣＴＣＡ－３’）を用いた。また、第２の核酸プローブとして、ｌｅｔ－７ａの３’末端から１３番目の塩基までの領域に相補的な塩基配列を３’末端側に有し、かつｌｅｔ－７ａの３’末端から６番目の塩基と相補的な塩基をクロスリンクする塩基誘導体としてＣＮＶＫに置換し、さらに第２のマーカーとして５’末端側に１０塩基のチミジン及びビオチンを付加した核酸プローブ（Ｂ－７ａＬ１、５’－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣＴＡＫＡＣＡＡＣＣＴ－３’）を用いた。各塩基配列中、「Ｋ」がＣＮＶＫを意味する。また、各プローブのＣＮＶＫに置換する前の塩基配列を配列番号２及び３に示す。なお、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブは、株式会社ファスマックにより合成された。
　試料溶液として、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブが最終濃度で１００ｎＭであり、標的核酸分子としてｌｅｔ－７ａと相同的な塩基配列からなる合成ＲＮＡを最終濃度で１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭ、０ｐＭとなるようにそれぞれ添加した溶液を５０μＬずつ調製した（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ, ０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０）。各溶液には、さらに０．１ｕ／μＬとなるようにＲＮＡ分解阻害剤（製品名：Ｓｕｐｅｒ　Ｒａｓｅ　Ｉｎ、Ａｍｂｉｏｎ社製）を添加した。なお、前記標的核酸分子は、北海道システムサイエンス株式会社で合成したものを使用した。
　各試料溶液を、７０℃で２分間変性させた後、１０℃まで１℃／１５秒で温度を下げることによりハイブリダイゼーション（会合）を行った。その後、前記試料溶液に対して氷中にて３６５ｎｍの光照射を行った。各試料溶液に磁気ビーズとしてダイナビーズ（製品名：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　ＭｙＯｎｅ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｎ社製）を１０μＬ添加し、１５分間室温でインキュベートした。その後、磁気ビーズを、×１ＳＳＣ、×０．１ＳＳＣ、及び×０．０１ＳＳＣでそれぞれ１回ずつ洗浄した。洗浄後、１０Ｕｎｉｔｓ／２０μＬのＳ１ｎｕｃｌｅａｓｅ溶液(タカラバイオ社製)を２０μＬずつ添加し、２３℃で１０分間反応させた。反応溶液に３０μＬのＴＥバッファーを添加した後、磁気ビーズを容器側面に沈着させた後に上清を回収し、Ｔａｍｒａの励起波長を照射して、当該上清を蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ法）により測定した。
　各試料溶液から回収された磁気ビーズから核酸分解酵素反応により遊離させた蛍光物質Ｔａｍｒａの分子数のＦＩＤＡによる測定結果を、図２に示す。横軸は標的核酸分子濃度（ｎＭ）、縦軸は蛍光分子数を示している。測定の結果、１０ｎＭから１ｐＭまで濃度依存的に検出される蛍光分子数が減少していることがわかった。特に１ｐＭ（５０μＬで５０ａｔｔｏｍｏｌ）の濃度で検出できたことがわかった。
［実施例２］
　本発明の他の態様における標的核酸分子の検出方法において、第１のマーカーの固相担体からの遊離を、核酸分解酵素反応又は低塩濃度条件下での紫外線照射によって行った。
　まず、標的核酸分子としてｌｅｔ－７ａと相同的な塩基配列からなる合成ＲＮＡを最終濃度で１０ｎＭ又は０ｎＭとした以外は実施例１と同様にして、標的核酸分子、第１の核酸プローブ、及び第２の核酸プローブを含む試料溶液を調製し、変性後ハイブリダイゼーション（会合）を行った後、紫外線照射して共有結合を形成させた。各試料溶液に磁気ビーズとしてダイナビーズ（製品名：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　ＭｙＯｎｅ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｎ 社製）を１０μＬ添加し、１５分間室温でインキュベートした。その後、磁気ビーズを、×１ＳＳＣ、×０．１ＳＳＣ、及び×０．０１ＳＳＣでそれぞれ１回ずつ洗浄した。
　洗浄後、×０．１ＳＳＣ、×０．０１ＳＳＣ、又は純水を５０μＬ添加し、５０℃にて１分間加温後、その状態で１０秒間３６５ｎｍの紫外線を照射した。磁気ビーズを容器側面に沈着させた後に上清を回収し、Ｔａｍｒａの励起波長を照射して、前記上清を蛍光相関分光法（ＦＣＳ法）により測定した。
　また、同様にして３者会合体を結合させた磁気ビーズを、×１ＳＳＣ、×０．１ＳＳＣ、及び×０．０１ＳＳＣでそれぞれ１回ずつ洗浄した後、実施例１と同様にしてＳ１ｎｕｃｌｅａｓｅ溶液(タカラバイオ社製)を添加して反応させ、得られた反応溶液に３０μＬのＴＥバッファーを添加した後、磁気ビーズを容器側面に沈着させた後に上清を回収し、Ｔａｍｒａの励起波長を照射して、前記上清を蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ法）により測定した。
　また、対照として、標的核酸分子を試料溶液に添加しなかった以外は同様にして、洗浄後の磁気ビーズに実施例１と同様にしてＳ１ｎｕｃｌｅａｓｅ溶液(タカラバイオ社製)を添加して反応させ、得られた反応溶液に３０μＬのＴＥバッファーを添加した後、磁気ビーズを容器側面に沈着させた後に上清を回収し、Ｔａｍｒａの励起波長を照射して、前記上清を蛍光相関分光法（ＦＣＳ法）により測定した。
　各試料溶液から回収された磁気ビーズから遊離させた蛍光物質Ｔａｍｒａの分子数のＦＣＳによる測定結果を、図３に示す。横軸はＴａｍｒａを遊離させるために行った処理を、縦軸はＦＣＳ法を用いて解析した蛍光分子数を示す。また、図３中、「Ｓ１　ｎｕｃｌｅａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｌｅｔ７ａ」は標的核酸分子を添加しなかった試料溶液の結果を示す。各溶液条件で２個程度の蛍光分子数を計測することができ、本発明の一態様における標的核酸分子の検出方法によって、核酸分解酵素による酵素反応や、低塩濃度条件における紫外線照射処理によって、第１のマーカーを固相担体から遊離させられることが明らかである。
［実施例３］
　本発明のさらに他の態様における標的核酸分子の検出方法において、第１のマーカーの固相担体からの遊離を、アルカリ条件下における加温、又は低塩濃度条件下における加温によって行った。
　まず、標的核酸分子としてｌｅｔ－７ａと相同的な塩基配列からなる合成ＲＮＡを最終濃度で１０ｎＭ又は０ｎＭとした以外は実施例１と同様にして、標的核酸分子、第１の核酸プローブ、及び第２の核酸プローブを含む試料溶液を調製し、変性後ハイブリダイゼーション（会合）を行った後、紫外線照射して共有結合を形成させた。各試料溶液に磁気ビーズとしてダイナビーズ（製品名：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　ＭｙＯｎｅ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｎ 社製）を１０μＬ添加し、１５分間室温でインキュベートした。その後、磁気ビーズを、×１ＳＳＣ、×０．１ＳＳＣ、及び×０．０１ＳＳＣでそれぞれ１回ずつ洗浄した。
　洗浄後、１０ｍＭ　ＮａＯＨ、１ｍＭ　ＮａＯＨ、又は純水を５０μＬずつ添加し、７０℃、８０℃、又は９０℃にて３０分間保温した後、その状態で１０秒間３６５ｎｍの紫外線を照射した。磁気ビーズを容器底面に沈着させた後、Ｔａｍｒａの励起波長を照射して、上清を蛍光相関分光法（ＦＣＳ法）により測定した。
　各試料溶液から回収された磁気ビーズから低塩濃度条件下又はアルカリ条件下での加温によって遊離させた蛍光物質Ｔａｍｒａの分子数のＦＣＳ法による測定結果を、図４に示す。横軸はＴａｍｒａを遊離させた際の温度を、縦軸はＦＣＳ法を用いて解析した蛍光分子数を示す。図４の凡例中、「Ｗａｔｅｒ／０ｎＭ」及び「Ｗａｔｅｒ／１０ｎＭ」は、標的核酸分子が０ｎＭ又は１０ｎＭの試料溶液から調製された磁気ビーズを水中で加温した場合の結果を、「１ｍＭ　ＮａＯＨ／０ｎＭ」及び「１ｍＭ　ＮａＯＨ／１０ｎＭ」は、標的核酸分子が０ｎＭ又は１０ｍＭの試料溶液から調製された磁気ビーズを１ｍＭ　ＮａＯＨＨ中で加温した場合の結果を、「１０ｍＭ　ＮａＯＨ／０ｎＭ」及び「１０ｍＭＮａＯＨ／１０ｎＭ」は、標的核酸分子が０ｎＭ又は１０ｎＭの試料溶液から調製された磁気ビーズを１０ｍＭ　ＮａＯＨ中で加温した場合の結果を、それぞれ示している。この結果、標的核酸分子を含まない試料から調製された磁気ビーズ（「Ｗａｔｅｒ／０ｎＭ」等）からは、全ての温度帯にわたって蛍光分子数はほとんど検出されなかった。また、磁気ビーズをＮａＯＨ中で加温した場合には、より高濃度のＮａＯＨのほうが蛍光色素をより多く遊離すること、また、７０℃より９０℃処理のほうが、遊離蛍光分子数が多いことがわかった。このように、アルカリ条件下で５０℃～１００℃に加温した場合でも、第１のマーカーである発光物質は固相担体から遊離し、ＦＣＳ法のような蛍光１分子測定法で高感度測定が可能なことがわかった。
　一方、磁気ビーズを純水中で加温した場合には、７０℃ではほとんど蛍光分子（Ｔａｍｒａ）は検出されなかったが、８０℃以上でＴａｍｒａの遊離が計測され、９０℃ではアルカリ処理と同程度の濃度で蛍光分子を計測できており、８０℃以上、好ましくは９０℃以上に加温することにより、純水中であっても第１のマーカーである発光物質を固相担体から遊離させられることがわかった。
［実施例４］
　本発明のさらに他の態様における標的核酸分子の検出方法において、第１のマーカーの固相担体からの遊離を、加温によって行った。
　まず、標的核酸分子としてｌｅｔ－７ａと相同的な塩基配列からなる合成ＲＮＡを最終濃度で１０ｎＭ又は０ｎＭとした以外は実施例１と同様にして、標的核酸分子、第１の核酸プローブ、及び第２の核酸プローブを含む試料溶液を調製し、変性後ハイブリダイゼーション（会合）を行った後、紫外線照射して共有結合を形成させた。当該試料溶液を×１Ｂ＆Ｗ緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ　Ｔｒｉｓ）にて１０倍希釈し、総量を５０μＬとした希釈済みの試料溶液に、磁気ビーズとしてダイナビーズ（製品名：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　ＭｙＯｎｅ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｎ 社製）を１０μＬ添加し、１５分間室温でインキュベートした。その後、磁気ビーズを、×１ＳＳＣ、×０．１ＳＳＣ、及び×０．０１ＳＳＣでそれぞれ１回ずつ洗浄した。
　洗浄後、×１ＳＳＣ、×１ＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）、又は純水を５０μＬ添加し、９０℃にて３０分間保温した後、室温で磁気ビーズを容器側面に沈着させた後、上清を蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ法）により測定した。
　各試料溶液から回収された磁気ビーズから加温によって遊離させた蛍光物質Ｔａｍｒａの分子数のＦＩＤＡ法による測定結果を、図５に示す。横軸は加温時の溶液条件を、縦軸はＦＩＤＡ法を用いて解析した蛍光分子数を示す。図５の凡例中、「Ｈｅａｔ」は９０℃で加温した場合の結果を、「ＲＴ」は加温しなかった場合の結果を、それぞれ示している。加温しなかった場合、全ての溶液条件で蛍光分子数はほとんど検出されなかった。一方、９０℃で加温した場合、全ての条件で蛍光分子を検出することができた。
　これらの結果から、アルカリ処理等を用いることなく、好ましくは９０℃で加温することによっても、蛍光分子の遊離検出が可能なことがわかった。
　本発明のいくつかの態様における標的核酸の検出方法により、試料中に存在する標的核酸分子を、高感度かつ精度良く検出することができる。そのため、本発明のいくつかの態様における標的核酸の検出方法は、試料中の核酸を検出又は定量解析するような生化学、分子生物学、臨床検査等の分野で利用が可能である。
　１…標的核酸分子、２…第１の核酸プローブ、２ａ…蛍光物質、２ｂ…ＣＮＶＫ、３…第２の核酸プローブ、３ａ…ビオチン、３ｂ…ＣＮＶＫ、４…アビジンビーズ。

Claims (14)

  1. 　（ａ）核酸含有試料と、発光物質である第１のマーカーが結合されており、かつ標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の核酸プローブと、第２のマーカーが結合されており、かつ標的核酸分子と、前記第１の核酸プローブがハイブリダイズする領域とは異なる領域で特異的にハイブリダイズする第２の核酸プローブと
    　を添加した試料溶液を調製する工程と、
    （ｂ）前記工程（ａ）において調製された前記試料溶液中の核酸分子を変性させる工程と、
    （ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記試料溶液中の核酸分子を会合させる工程と、
    （ｄ）前記工程（ｃ）において形成された会合体のうち、前記標的核酸分子と前記第１の核酸プローブと前記第２の核酸プローブとからなる３者会合体において、前記標的核酸分子と前記第１の核酸プローブとの間に少なくとも１の共有結合を形成させると共に、前記標的核酸分子と前記第２の核酸プローブとの間に少なくとも１の共有結合を形成させる工程と、
    （ｅ）前記工程（ｄ）の後、前記試料溶液中に、前記第２のマーカーと結合する部位を備える固相担体を添加し、前記３者会合体中の前記第２のマーカーを介して前記固相担体及び前記３者会合体を結合させた後、固液分離処理により、前記固相担体と結合した前記３者会合体を回収する工程と、
    （ｆ）前記工程（ｅ）の後、回収された３者会合体から前記第１のマーカーを遊離させる工程と、
    （ｇ）前記工程（ｆ）の後、遊離された第１のマーカーを検出することにより、前記標的核酸分子を検出する工程と、
    を有する標的核酸分子の検出方法。
  2. 　前記工程（ｆ）において、
    （ｆ１）前記標的核酸分子と前記第１の核酸プローブとの間、又は前記標的核酸分子と前記第２の核酸プローブとの間に共有結合が形成されていない場合には、前記３者会合体が脱会合する条件下で、前記３者会合体に３００ｎｍ～３８０ｎｍの紫外線を照射する、
    （ｆ２）前記３者会合体を核酸分解酵素により分解する、
    （ｆ３）前記３者会合体を８０℃以上に加温する、又は
    （ｆ４）前記３者会合体をアルカリ条件下で５０℃～１００℃に加温する
    ことにより、前記３者会合体から前記第１のマーカーを遊離させる請求項１に記載の標的核酸分子の検出方法。
  3. 　前記（ｆ１）において、前記３者会合体への紫外線照射を、前記第１の核酸プローブのＴｍ値が２５℃以下となる濃度の塩を含む溶液中で行う請求項２に記載の標的核酸分子の検出方法。
  4. 　共有結合の形成反応が、光反応性塩基誘導体を介した光化学的反応である請求項１～３のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。
  5. 　前記第１の核酸プローブ中の前記標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の少なくとも一塩基が、光反応性塩基誘導体に置換されており、
    　前記第２の核酸プローブ中の前記標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の少なくとも一塩基が、光反応性塩基誘導体に置換されている請求項４に記載の標的核酸分子の検出方法。
  6. 　前記光反応性塩基誘導体が、３－Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅであり、
    　前記共有結合が、前記試料溶液に３４０ｎｍ～３８０ｎｍの光を照射することにより形成される請求項４又は５に記載の標的核酸分子の検出方法。
  7. 　前記工程（ｆ）の前に、
    　前記工程（ｅ）において回収された前記固相担体と結合した前記３者会合体を、前記第１の核酸プローブのＴｍ値が２５℃以下となる塩濃度である洗浄用溶液で洗浄する請求項１～６のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。
  8. 　前記工程（ｇ）において、前記第１のマーカーの検出を、蛍光１分子測定法を用いて行う請求項１～７のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。
  9. 　前記工程（ｇ）において、前記第１のマーカーの検出を、
    （ｐ）蛍光相関分光法、又は蛍光強度分布解析法により、前記遊離された第１マーカーを含有する測定用溶液中に存在している第１マーカーの分子数を算出する工程、又は
    （ｒ）共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記遊離された第１マーカーを含有する測定用溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域からの光を検出することにより、前記測定用溶液中に存在している第１マーカーの分子数を算出する工程、
    により行う請求項８に記載の標的核酸分子の検出方法。
  10. 　前記工程（ａ）が、
    （ａ’）前記核酸含有試料と、前記第１の核酸プローブと、前記第２の核酸プローブと、前記第２のマーカーと結合する部位を備える固相担体とを添加した試料溶液を調製する工程
    であり、前記工程（ｅ）が、
    （ｅ’）前記工程（ｄ）の後、前記試料溶液を固液分離処理することにより、前記３者会合体を回収する工程
    である請求項１～９のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。
  11. 　前記工程（ａ’）が、
    （ａ”）前記核酸含有試料と、前記第１の核酸プローブと、固相担体と結合した状態の前記第２の核酸プローブとを添加した試料溶液を調製する工程
    である請求項１０に記載の標的核酸分子の検出方法。
  12. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法に用いられるキットであって、
    　発光物質である第１のマーカーが結合されており、かつ標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の核酸プローブと、
    　第２のマーカーが結合されており、かつ標的核酸分子と、前記第１の核酸プローブがハイブリダイズする領域とは異なる領域で特異的にハイブリダイズする第２の核酸プローブと
    　を含む標的核酸分子検出用キット。
  13. 　前記第１の核酸プローブ中の前記標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の少なくとも一塩基が、光反応性塩基誘導体に置換されており、
    　前記第２の核酸プローブ中の前記標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の少なくとも一塩基が、光反応性塩基誘導体に置換されている請求項１２に記載の標的核酸分子検出用キット。
  14. 　さらに、前記第２のマーカーと結合する部位を備える固相担体を含む請求項１２又は１３に記載の標的核酸分子検出用キット。
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