JP6095645B2 - 標的核酸分子の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、光クロスリンク反応を利用して標的核酸分子を検出する方法に関する。
本願は、２０１２年３月２１日に、日本に出願された特願２０１２−０６３６８２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

試料溶液中の核酸分子は、例えば、核酸分子と特異的にハイブリダイズする標識済みプローブを用いるハイブリダイゼーション法により検出できる。例えば、予めビーズに固定した標識プローブと標的核酸分子をハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズされかつビーズに固定化された標的核酸分子を容器底面に沈降させる。その後反応液の温度を標的核酸の変性温度以上にまで徐々に上げて標識プローブをビーズから上清に放出させ、上清中の蛍光又は発光量を経時的に測定する方法がある（例えば、特許文献１参照。）。

また、オリゴヌクレオチドを構成する塩基に反応性官能基を導入し、この反応性官能基を介して、他のオリゴヌクレオチドやその他の分子との間に共有結合を形成する（クロスリンク）方法が開発されている。例えば、反応性官能基を導入した塩基誘導体を用いて核酸分子同士を共有結合的クロスリンクする技術として、２−Ａｍｉｎｏ−６−Ｖｉｎｙｌｐｕｒｉｎｅを用いる方法（例えば、非特許文献１参照。）や、光反応性の塩基誘導体である３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅを用いる方法（例えば、非特許文献２、非特許文献３、又は特許文献２参照。）等が開示されている。

光クロスリンク反応と蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）を利用して標的核酸分子を定量する方法もある。例えば、特異的な会合に適した条件でＦＲＥＴプローブと標的核酸分子とを会合させた後、反応溶液の温度及び塩濃度を変更することなく、形成された会合体中の２本の核酸鎖間に光クロスリンク反応を利用して共有結合を形成させた後、この会合体を一分子ごとに検出し解析する方法が開示されている（例えば、特許文献３参照）。ハイブリダイゼーションを用いた検出では、一般的には、形成された会合体の検出を通常の測定温度条件（例えば室温等）において行うため、会合体検出操作時に非特異的会合体（非特異的なハイブリダイゼーションにより形成された会合体）が形成されやすいが、先述の方法では、光クロスリンク反応によりＦＲＥＴプローブと標的核酸分子との会合体を安定化することによって、非特異的会合体の形成を効果的に抑制することができる。

特定の核酸分子と特異的に結合するＦＲＥＴプローブは、抗原抗体反応の検出にも利用されている。例えば、１本鎖ＤＮＡで標識された抗体を用いて抗原抗体反応を行い、形成された抗原抗体複合体と、抗体を標識した１本鎖ＤＮＡと相補的なＦＲＥＴプローブとを結合させた後、核酸分解酵素で処理することによって抗原抗体複合体からＦＲＥＴプローブ中の蛍光物質を反応液上清に遊離させ、この反応液上清の蛍光強度を測定することにより、抗原を検出する方法が開示されている（例えば、特許文献４参照）。

日本国特開２００４−１２１２３１号公報 国際公開第０９／０６６４４７号 日本国特開２０１１−０３６１５０号公報 日本国特開２０１１−０３３６１３号公報

佐々木茂貴、薬学雑誌（YAKUGAKU ZASSHI）、２００２年、第１２２巻第１２号、第１０８１〜１０９３ページ。 フジモト（Fujimoto）、他２名、ヌクレイック・アシッズ・シンポジウム・シリーズ（Nucleic Acids Symposium Series）、２００８年、第５２巻、第４２３〜４２４ページ。 ヨシムラ（Yoshimura）、他１名、オーガニック・レターズ（ORGANIC LETTERS）、２００８年、第１０巻第１５号、第３２２７〜３２３０ページ。

標識プローブと標的核酸分子との会合体を精度よく検出するためには、標的核酸分子との会合体中の標識プローブを検出する際に、遊離の標識プローブを検出しない、又は標的核酸分子との会合体中の標識プローブと遊離の標識プローブとを区別して検出する必要がある。例えば、形成された会合体をビーズ等の固相担体に結合させ、固相担体が結合した会合体を固液分離処理により遊離の標識プローブから分離して回収した後、回収された会合体を検出操作に供することによって、会合体中の標識プローブのみを検出することができる。しかしながら、会合体の検出方法によっては、固相担体が結合した会合体は検出精度が劣る場合がある。

本発明のいくつかの態様は、標識済みプローブを用いて標的核酸分子を検出する方法において、標的核酸分子と標識済みプローブとの会合体を、固相担体を用いて遊離の標識プローブから分離して回収した場合でも、前記固相担体の影響を受けずに高精度に標的核酸分子を検出し得る方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、標的核酸分子を、発光物質で標識した標識プローブと固相担体との結合を介在するプローブの両方とハイブリダイズさせ、形成された３者会合体を固相担体と結合した状態で遊離の標識プローブから分離して回収した後、前記会合体中の発光物質を固相担体と切り離し、遊離の状態となった発光物質を検出することにより、固相担体の影響を受けずに高精度に標的核酸分子を検出し得ることが見出された。さらに、遊離の標識プローブから分離回収する前に、形成された３者会合体を共有結合により安定化させておくことによって、試料中の標的核酸分子をより高精度に検出し得ることが見出された。

すなわち、本発明のいくつかの態様は、以下を提供する。
（１）本発明の一態様における標的核酸分子の検出方法は、
（ａ）核酸含有試料と、発光物質である第１のマーカーが結合されており、かつ標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の核酸プローブと、第２のマーカーが結合されており、かつ前記標的核酸分子と、前記第１の核酸プローブがハイブリダイズする領域とは異なる領域で特異的にハイブリダイズする第２の核酸プローブと
を添加した試料溶液を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の核酸分子を変性させる工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記試料溶液中の核酸分子を会合させる工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）において形成された会合体のうち、前記標的核酸分子と前記第１の核酸プローブと前記第２の核酸プローブとからなる３者会合体において、前記標的核酸分子と前記第１の核酸プローブとの間に少なくとも１の共有結合を形成させると共に、前記標的核酸分子と前記第２の核酸プローブとの間に少なくとも１の共有結合を形成させる工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）の後、前記試料溶液中に、前記第２のマーカーと結合する部位を備える固相担体を添加し、前記３者会合体中の前記第２のマーカーを介して前記固相担体及び前記３者会合体を結合させた後、固液分離処理により、前記固相担体と結合した前記３者会合体を回収する工程と、
（ｆ）前記工程（ｅ）の後、前記３者会合体を８０℃以上に加温することにより、回収された３者会合体から前記第１のマーカーを遊離させる工程と、
（ｇ）前記工程（ｆ）の後、遊離された第１のマーカーを検出することにより、前記標的核酸分子を検出する工程と、
を有し、
前記共有結合の形成反応が、光反応性塩基誘導体を介した光化学的反応であり、前記光反応性塩基誘導体が、３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅである。
（２） 前記（１）の標的核酸分子の検出方法において、前記第１の核酸プローブ中の前記標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の少なくとも一塩基が、前記光反応性塩基誘導体に置換されており、
前記第２の核酸プローブ中の前記標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の少なくとも一塩基が、前記光反応性塩基誘導体に置換されていてもよい。
（３） 前記（１）又は（２）の標的核酸分子の検出方法において、前記共有結合が、前記試料溶液に３４０〜３８０ｎｍの光を照射することにより形成されてもよい。
（４） 前記（１）〜（３）のいずれか一つの標的核酸分子の検出方法において、前記工程（ｆ）の前に、
前記工程（ｅ）において回収された前記固相担体と結合した前記３者会合体を、前記第１の核酸プローブのＴｍ値が２５℃以下となる塩濃度である洗浄用溶液で洗浄してもよい。
（５） 前記（１）〜（４）のいずれか一つの標的核酸分子の検出方法の前記工程（ｇ）において、前記第１のマーカーの検出を、蛍光１分子測定法を用いて行ってもよい。
（６） 前記（５）の標的核酸分子の検出方法の前記工程（ｇ）において、前記第１のマーカーの検出を、
（ｐ）蛍光相関分光法、又は蛍光強度分布解析法により、前記遊離された第１マーカーを含有する測定用溶液中に存在している第１マーカーの分子数を算出する工程、又は
（ｒ）共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記遊離された第１マーカーを含有する測定用溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域からの光を検出することにより、前記測定用溶液中に存在している第１マーカーの分子数を算出する工程、
により行ってもよい。
（７） 本発明の別の一態様における標的核酸分子の検出方法は、
核酸含有試料と、発光物質である第１のマーカーが結合されており、かつ標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の核酸プローブと、第２のマーカーが結合されており、かつ前記標的核酸分子と、前記第１の核酸プローブがハイブリダイズする領域とは異なる領域で特異的にハイブリダイズする第２の核酸プローブと、前記第２のマーカーと結合する部位を備える固相担体と、を添加した試料溶液を調製する工程と、
（ｂ’）前記工程（ａ’）において調製された前記試料溶液中の核酸分子を変性させる工程と、
（ｃ’）前記工程（ｂ’）の後、前記試料溶液中の核酸分子を会合させる工程と、
（ｄ’）前記工程（ｃ’）において形成された会合体のうち、前記標的核酸分子と前記第１の核酸プローブと前記第２の核酸プローブとからなる３者会合体において、前記標的核酸分子と前記第１の核酸プローブとの間に少なくとも１の共有結合を形成させると共に、前記標的核酸分子と前記第２の核酸プローブとの間に少なくとも１の共有結合を形成させる工程と、
（ｅ’）前記工程（ｄ’）の後、前記試料溶液を固液分離処理することにより、前記３者会合体を回収する工程と、
（ｆ’）前記工程（ｅ’）の後、前記３者会合体を８０℃以上に加温することにより、回収された前記３者会合体から前記第１のマーカーを遊離させる工程と、
（ｇ’）前記工程（ｆ’）の後、遊離された第１のマーカーを検出することにより、前記標的核酸分子を検出する工程と、
を有し、
前記共有結合の形成反応が、光反応性塩基誘導体を介した光化学的反応であり、前記光反応性塩基誘導体が、３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅである。
（８） 前記（７）の標的核酸分子の検出方法において、前記工程（ａ’）が、
（ａ”）前記核酸含有試料と、前記第１の核酸プローブと、固相担体と結合した状態の前記第２の核酸プローブとを添加した試料溶液を調製する工程
であってもよい。
（９） 前記（７）又は（８）の標的核酸分子の検出方法において、前記第１の核酸プローブ中の前記標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の少なくとも一塩基が、前記光反応性塩基誘導体に置換されており、
前記第２の核酸プローブ中の前記標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の少なくとも一塩基が、前記光反応性塩基誘導体に置換されていてもよい。
（１０） 前記（７）〜（９）のいずれか一つの標的核酸分子の検出方法において、前記共有結合が、前記試料溶液に３４０〜３８０ｎｍの光を照射することにより形成されてもよい。
（１１） 前記（７）〜（１０）のいずれか一つの標的核酸分子の検出方法において、前記工程（ｆ’）の前に、
前記工程（ｅ’）において回収された前記固相担体と結合した前記３者会合体を、前記第１の核酸プローブのＴｍ値が２５℃以下となる塩濃度である洗浄用溶液で洗浄してもよい。
（１２） 前記（７）〜（１１）のいずれか一つの標的核酸分子の検出方法において、前記工程（ｇ’）において、前記第１のマーカーの検出を、蛍光１分子測定法を用いて行ってもよい。
（１３） 前記（７）〜（１１）のいずれか一つの標的核酸分子の検出方法において、前記工程（ｇ’）において、前記第１のマーカーの検出を、
（ｐ）蛍光相関分光法、又は蛍光強度分布解析法により、前記遊離された第１マーカーを含有する測定用溶液中に存在している第１マーカーの分子数を算出する工程、又は
（ｒ）共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記遊離された第１マーカーを含有する測定用溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域からの光を検出することにより、前記測定用溶液中に存在している第１マーカーの分子数を算出する工程、
により行ってもよい。

本発明の態様における標的核酸分子の検出方法においては、標識済み核酸プローブと結合させた標的核酸分子を、遊離の標識済み核酸プローブから分離回収した後に、固相担体から分離した状態で測定する。このため、本発明の態様における標的核酸分子の検出方法を用いることにより、標的核酸分子を、遊離の標識済みプローブや固相担体の影響を受けずに、高精度に検出することができる。

本発明の標的核酸分子の検出方法の一態様を模式的に示した図である。 実施例１において、各試料溶液から回収された磁気ビーズから核酸分解酵素反応により遊離させた蛍光物質Ｔａｍｒａの分子数のＦＩＤＡ法による測定結果を示した図である。 実施例２において、各試料溶液から回収された磁気ビーズから核酸分解酵素反応又は低塩濃度条件下での紫外線照射によって遊離させた蛍光物質Ｔａｍｒａの分子数のＦＣＳ法による測定結果を示した図である。 実施例３において、各試料溶液から回収された磁気ビーズから低塩濃度条件下又はアルカリ条件下での加温によって遊離させた蛍光物質Ｔａｍｒａの分子数のＦＣＳ法による測定結果を示した図である。 実施例４において、各試料溶液から回収された磁気ビーズから加温によって遊離させた蛍光物質Ｔａｍｒａの分子数のＦＩＤＡ法による測定結果を示した図である。

本発明の一態様における標的核酸分子の検出方法は、下記工程（ａ）〜（ｇ）を有する。
（ａ）核酸含有試料と、発光物質である第１のマーカーが結合されており、かつ標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の核酸プローブと、第２のマーカーが結合されており、かつ標的核酸分子と、前記第１の核酸プローブがハイブリダイズする領域とは異なる領域で特異的にハイブリダイズする第２の核酸プローブとを添加した試料溶液を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の核酸分子を変性させる工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記試料溶液中の核酸分子を会合させる工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）において形成された会合体のうち、前記標的核酸分子と前記第１の核酸プローブと前記第２の核酸プローブとからなる３者会合体において、前記標的核酸分子と前記第１の核酸プローブとの間に少なくとも１の共有結合を形成させ、前記標的核酸分子と前記第２の核酸プローブとの間に少なくとも１の共有結合を形成させる工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）の後、前記試料溶液中に、前記第２のマーカーと結合する部位を備える固相担体を添加し、前記第３者会合体中の前記第２のマーカーを介して前記固相担体及び前記３者会合体を結合させた後、固液分離処理により、前記固相担体と結合した前記３者会合体を回収する工程と、
（ｆ）前記工程（ｅ）の後、回収された３者会合体から前記第１のマーカーを遊離させる工程と、
（ｇ）前記工程（ｆ）の後、遊離された第１のマーカーを検出することにより、前記標的核酸分子を検出する工程。

本実施形態において、標的核酸分子とは、検出の標的である特定の塩基配列を有する核酸分子を意味する。前記標的核酸分子としては、前記核酸分子と特異的にハイブリダイズする核酸プローブの設計が可能な程度に塩基配列が明らかになっているものであれば、特に限定されるものではない。例えば、動物や植物の染色体や、細菌やウィルスの遺伝子に存在する塩基配列を有する核酸分子であってもよく、人工的に設計された塩基配列を有する核酸分子であってもよい。なお、本実施形態において、標的核酸分子としては、２本鎖核酸であってもよく、１本鎖核酸であってもよい。また、ＤＮＡとＲＮＡのいずれであってもよい。前記標的核酸分子として、例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ増幅等による合成ＤＮＡ、ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡ等がある。

また、本実施形態において、核酸含有試料とは、核酸分子を含有する試料であれば、特に限定されるものではない。前記核酸含有試料として、例えば、動物等から採取した生体試料、培養細胞等から調製された試料、核酸合成反応後の反応溶液等が挙げられる。生体試料等そのものであってもよく、生体試料等から抽出および又は精製した核酸溶液でもよい。

本実施形態において、「標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする核酸プローブ」とは、標的核酸分子と塩基配列において類似しているその他の核酸分子よりも、標的核酸分子と優先的にハイブリダイズする核酸プローブであればよく、標的核酸分子以外の核酸分子と全くハイブリダイズしないものである必要はない。例えば、標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする核酸プローブとしては、標的核酸分子の部分塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであってもよく、標的核酸分子の部分塩基配列と１塩基〜数塩基のミスマッチを有する塩基配列を有していてもよい。

本実施形態において用いられる第１の核酸プローブは、第１のマーカーが結合されており、かつ標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする。第１の核酸プローブとしては、例えば、標的核酸分子の部分塩基配列と完全に相補的な塩基配列、又は当該部分塩基配列と１塩基〜数塩基のミスマッチを有する塩基配列を有し、かつ第１のマーカーが結合したオリゴヌクレオチドが挙げられる。

第１のマーカーは、発光物質である。発光物質としては、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子（通常、分子又はそれらの凝集体）が挙げられる。本実施形態においては、検出感度が高いため、第１のマーカーとして蛍光物質を用いることが好ましい。蛍光物質としては、特定の波長の光を放射することにより蛍光を放出する物質であれば特に限定されるものではなく、ＦＣＳやＦＩＤＡ等の蛍光解析において使用されている蛍光色素や量子ドット等の中から適宜選択して用いることができる。

本実施形態において用いられる第２の核酸プローブは、第２のマーカーが結合されており、かつ標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする。第２の核酸プローブとしては、例えば、標的核酸分子の部分塩基配列と完全に相補的な塩基配列、又は当該部分塩基配列と１塩基〜数塩基のミスマッチを有する塩基配列を有し、かつ第２のマーカーが結合したオリゴヌクレオチドが挙げられる。

第２のマーカーは、工程（ｇ）において、第１のマーカーと区別して検出可能な物質であれば特に限定されるものではない。例えば、光を発さない物質であってもよく、第１のマーカーと発光特性が異なる発光物質であってもよい。なお、「発光特性が異なる」とは、特定の波長の光の強度が異なる（例えば、特定の波長の蛍光強度が異なる）ことを意味する。

第２のマーカーとしては、例えば、第１のマーカーと発光特性が異なる蛍光物質、核酸（オリゴヌクレオチド）、親水性有機化合物、ビオチン(ｂｉｏｔｉｎ)、グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、ＤＮＰ（ｄｉｎｉｔｏｒｏｐｈｅｎｏｌ）、ジゴキシゲニン(ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ、Ｄｉｇ)、ジゴキシン(ｄｉｇｏｘｉｎ)、２以上の糖からなる糖鎖、６以上のアミノ酸からなるポリペプチド、オーキシン、ジベレリン、ステロイド、タンパク質、及び、それらの類縁体等が挙げられる。

第１の核酸プローブ又は第２の核酸プローブを構成するオリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたものであってもよく、天然の核酸塩基と同様にヌクレオチド鎖や塩基対を形成することが可能な核酸類似物質を一部又は全部に含むものであってもよい。核酸類似物質としては、ＤＮＡやＲＮＡのような天然型ヌクレオチド（天然に存在するヌクレオチド）の側鎖等がアミノ基等の官能基により修飾されたものや、タンパク質や低分子化合物等で標識されたもの等が挙げられる。より具体的には、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＢＮＡ）や、天然型ヌクレオチドの４’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの２’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチドやＨｅｘｉｔｏｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。

第１の核酸プローブ又は第２の核酸プローブを構成するオリゴヌクレオチドは、標的核酸分子とハイブリダイズする領域以外の領域を有していてもよい。例えば、標的核酸分子とハイブリダイズする領域と、第１のマーカー又は第２のマーカーを結合する領域とを、適当な塩基長のリンカーで結合させていてもよい。

第１の核酸プローブ又は第２の核酸プローブは、例えば、標的核酸分子の塩基配列情報や塩基対を形成する領域の塩基配列情報に基づいて塩基配列を設計し、設計に基づいて合成した核酸プローブに、マーカーを結合させることにより作製できる。核酸プローブの合成と同時にマーカーを結合させてもよい。第１の核酸プローブ又は第２の核酸プローブの設計や合成、第１の核酸プローブと第１のマーカーとの結合反応、第２の核酸プローブと第２のマーカーとの結合反応は、常法により行うことができる。

一の標的核酸分子に、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブが両方ともハイブリダイズし、これらからなる３者会合体が形成される。すなわち、標的核酸分子中、第１の核酸プローブとハイブリダイズする領域と、第２の核酸プローブとハイブリダイズする領域とは、互いに相違している。標的核酸分子が２本鎖核酸分子の場合、そのうちの１本鎖核酸分子に、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブが両方ともハイブリダイズする。なお、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブは、標的核酸分子に同時にハイブリダイズしてもよい。

第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブを、一の標的核酸分子にハイブリダイズさせるため、第１の核酸プローブと標的核酸分子との特異的会合条件と、第２の核酸プローブと標的核酸分子との特異的会合条件とがほぼ同じ条件であることが好ましい。特異的会合条件は、標的核酸分子及び核酸プローブの塩基配列の種類や長さ等に依存する。
よって、特異的会合条件を揃えるように、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブを設計することが好ましい。

具体的には、標的核酸分子と核酸プローブの特異的会合条件は、融解曲線から求めることができる。会合体の形成は一般的に温度条件や塩濃度条件に依存するため、核酸プローブと標的核酸分子のみを含有する溶液の温度を、高温から低温へと変化させ、前記溶液の吸光度を測定することにより、融解曲線を求めることができる。得られた融解曲線から、一本鎖状態で存在していた核酸プローブが、標的核酸分子と会合体を形成し始めた温度から、ほぼ全てが会合体となった温度までの範囲の温度条件を、特異的会合条件とすることができる。温度に代えて、溶液中の塩濃度を低濃度から高濃度への変化させることによっても、同様にして融解曲線を決定し、特異的会合条件を求めることができる。

このように、特異的会合条件は、標的核酸分子や核酸プローブの種類ごとに異なり、実験的に決定されるものであるが、一般にはＴｍ値（融解温度）で代用することができる。
例えば、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、核酸プローブの塩基配列情報から、標的核酸分子と相補的な塩基配列を有する領域のＴｍ値（２本鎖ＤＮＡの５０％が１本鎖ＤＮＡに解離する温度）を算出することができる。温度がＴｍ値近傍の値である条件、例えばＴｍ値±３℃程度である条件を、特異的会合条件とすることができる。算出されたＴｍ値近傍において実験的に融解曲線を求めることにより、より詳細に特異的会合条件を決定することもできる。

まず、工程（ａ）として、核酸含有試料と、第１の核酸プローブと、第２の核酸プローブとを適当な溶媒に添加して、試料溶液を調製する。前記溶媒は、第１マーカー及び第２マーカーを損なわない溶媒であれば、特に限定されるものではなく、当該技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。前記バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。その他、第１マーカー及び第２マーカーの種類によっては、ホルムアミド等の有機溶媒であってもよい。

次に、工程（ｂ）として、調製された試料溶液中の核酸分子を変性させる。本実施形態において、「核酸分子を変性させる」とは、塩基対を解離させることを意味する。例えば、２本鎖核酸を１本鎖核酸とすることを意味する。本実施形態においては、蛍光物質等の発光物質への影響が比較的小さいことから、高温処理による変性（熱変性）又は低塩濃度処理による変性を行うことが好ましい。中でも、操作が簡便であるため、熱変性を行うことが好ましい。具体的には、熱変性は、前記試料溶液を、高温処理をすることにより、前記試料溶液中の核酸分子を変性することができる。一般的には、ＤＮＡで９０℃、ＲＮＡでは７０℃で数秒間から２分間程度、保温することによって変性させることができるが、標的核酸分子の塩基の長さ等により変性する温度は千差万別であり、変性することが可能であれば、この温度に限定するものではない。一方、低塩濃度処理による変性は、例えば、精製水等により希釈することによって、前記試料溶液の塩濃度が十分に低くなるように調整することによって行うことができる。

次いで、工程（ｃ）として、前記試料溶液中の核酸分子を会合させる。標的核酸分子と第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブとの会合体の形成は、特異的会合条件で行う。具体的には、熱変性を行った場合には、高温処理後、前記試料溶液の温度を、特異的会合条件に適う温度にまで低下させることにより、前記試料溶液中の核酸分子を適宜会合させることができる。好ましくは、試料溶液の温度を、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブ中の標的核酸分子と相補的な塩基配列を有する領域のＴｍ値±３℃の温度程度まで低下させる。一方、低塩濃度処理による変性を行った場合にも、同様に、低塩濃度処理後、塩溶液を添加する等により、前記試料溶液の塩濃度を、特異的会合条件に適う濃度にまで上昇させることにより、前記試料溶液中の核酸分子を適宜会合させることができる。

非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、会合体を形成させる際に、溶液の温度を比較的ゆっくりと低下させることが好ましい。例えば、溶液の温度を７０℃以上にして核酸分子を変性させた後、前記溶液の液温を、０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることができる。

また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、予め溶液中に、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又は尿素等を添加しておくことも好ましい。
これらの化合物は、１種のみを添加してもよく、２種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的なハイブリダイゼーションを起こりにくくすることができる。

その後、工程（ｄ）として、工程（ｃ）において形成された会合体のうち、標的核酸分子と第１の核酸プローブと第２の核酸プローブとからなる３者会合体において、標的核酸分子と第１の核酸プローブとの間に少なくとも１の共有結合を形成させ、標的核酸分子と第２の核酸プローブとの間に少なくとも１の共有結合を形成させる。各核酸プローブと標的核酸分子との間にそれぞれ共有結合を形成させることにより、標的核酸分子と第１の核酸プローブと第２の核酸プローブとからなる３者会合体を、温度コントロールを行わない状態、例えばいわゆる常温においても、安定化することができる。

工程（ｄ）における共有結合の形成方法は、塩基対を形成している２本の１本鎖核酸同士を連結する共有結合を形成可能であれば、特に限定されるものではなく、核酸分子同士をクロスリンクする際に用いられる公知の手法の中から適宜選択して行うことができる。
なお、工程（ｄ）における共有結合の形成は、工程（ｃ）において形成された３者会合体を維持した状態で行うことが好ましい。例えば、工程（ｃ）における３者会合体の形成を、試料溶液を３者会合体形成可能な温度にまで低下させることにより行った場合には、工程（ｄ）における共有結合の形成は、試料溶液の温度を変更せずに行うことが好ましい。

なお、「工程（ｃ）における３者会合体形成時と同じ条件」とは、試料溶液の温度及び塩濃度が互いに同一条件であることが好ましいが、標的核酸分子と第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブとの会合体の形成しやすさと、標的核酸分子以外の核酸分子と第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブとの会合体の形成しやすさとが、工程（ｃ）における３者会合体形成時と、工程（ｄ）における共有結合形成時とで実質的に同じであればよく、必ずしも物理的に完全に同一でなくてもよい場合がある。例えば、工程（ｃ）における３者会合体形成時の試料溶液の温度がＴｍ値±３℃であった場合に、工程（ｄ）における共有結合形成時の試料溶液の温度もＴｍ値±３℃の範囲内の温度であればよい場合がある。標的核酸分子の塩基配列の種類によっては、Ｔｍ値±３℃の温度であれば、特異的会合条件であり、前記温度範囲内で多少の変動があったとしても、会合体形成の特異性に対する影響はほとんどないと考えられるためである。

本実施形態においては、光化学的反応により、共有結合を形成することが好ましい。光化学的反応とは、特定の波長の光を照射し、その光エネルギーを利用して行われる反応を意味する。光化学的反応により共有結合を形成する方法は、試料溶液に特定の波長の光を照射することによって会合体の核酸鎖間に共有結合を形成させることができるため、試料溶液の組成等の条件を変動させる必要がない。このため、試料溶液中の会合体に対して、共有結合形成以外に与える影響を抑えることができ、かつ操作も簡便である。

例えば、第１の核酸プローブ中の標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の少なくとも一塩基が、光反応性塩基誘導体に置換されている第１の核酸プローブと、第２の核酸プローブ中の標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の少なくとも一塩基が、光反応性塩基誘導体に置換されている第２の核酸プローブとを用いることにより、光化学反応によって、標的核酸分子と第１の核酸プローブとの間、及び標的核酸分子と第２の核酸プローブとの間に、前記光反応性塩基誘導体を介した共有結合を形成することができる。

第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブ中の光反応性塩基誘導体に置換される塩基は、標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の塩基であれば特に限定されるものではない。また、１塩基のみが光反応性塩基誘導体に置換されていてもよく、２塩基以上が光反応性塩基誘導体に置換されていてもよい。

ここで、光反応性塩基誘導体とは、特定の波長の光が照射されることにより、有機合成反応における反応性が活性化される部位（光反応性部位）を有し、天然のヌクレオチドと同様に核酸鎖を形成することが可能な塩基誘導体を意味する。

このような光反応性塩基誘導体としては、例えば、３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ（^ＣＮＶＫ）（例えば非特許文献２又は３参照。）等が挙げられる。なお、光反応性塩基誘導体に置換されている核酸プローブは、例えば、核酸プローブを公知のオリゴヌクレオチド合成機を用いて合成する際に、光反応性塩基誘導体を原料として用いることにより製造することができる。また、未置換核酸プローブを製造した後、公知の有機合成反応により、当該核酸プローブを構成する塩基に適当な光反応性官能基を導入することによっても得ることができる。

光反応性塩基誘導体として^ＣＮＶＫを用いた場合には、具体的には、標的核酸分子と第１の核酸プローブと第２の核酸プローブを含む試料溶液中で、これらからなる３者会合体を形成させた後、前記試料溶液に３００ｎｍ〜３８０ｎｍの光、好ましくは３４０ｎｍ〜３８０ｎｍの光、より好ましくは３６０ｎｍ〜３７０ｎｍの光、さらに好ましくは３６６ｎｍを含む紫外光を照射すると、^ＣＮＶＫの５’側 に隣接するプリン塩基と塩基対を形成している標的核酸分子中のピリミジン塩基を構成する原子と^ＣＮＶＫを構成する原子とが共有結合により結合する。

その他、光反応性塩基誘導体として、チミン（Ｔ）又はアデニン（Ａ）にリンカーを介してソラーレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, pp. 5602-5606, July 1991）を付加したものを用いてもよい。例えば、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブ中の標的核酸分子とハイブリダイズする領域にＴＡ配列があった場合に、前記ＴＡ配列中のＴ又はＡにリンカーを介してソラーレンを結合させたソラーレン結合核酸プローブを調製する。次いで、このソラーレン結合核酸プローブと標的核酸分子とを会合させた後、３００ｎｍ等の近紫外光を照射すると、このソラーレンを介して塩基対を形成している第１の核酸プローブ又は第２の核酸プローブと標的核酸分子との間が架橋され、３者会合体が安定化する。

工程（ｄ）の後、工程（ｅ）として、まず、前記試料溶液中に、第２のマーカーと結合する部位を備える固相担体を添加し、第３者会合体中の第２のマーカーを介して固相担体及び３者会合体を結合させる。その後、固液分離処理により、固相担体と結合した３者会合体を回収する。

本実施形態において用いられる固相担体は、第２のマーカーと結合する部位を備える。具体的には、表面に、第２のマーカーと特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質を結合させた固相担体である。前記物質としては、第２のマーカーがオリゴヌクレオチドの場合には、前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、第２のマーカーに対する抗原若しくは抗体、第２のマーカーに対するリガンド若しくはレセプター、又はビオチンとアビジンのように第２のマーカーと特異的に結合する物質等が挙げられる。なお、固相担体は、第２のマーカーと非特異的に結合等するものであってもよいが、標的核酸分子の検出および又は定量の精度の点からは、特異的に結合等するものであることが好ましい。

固相担体と、第２のマーカーと特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質とを結合させる方法は、特に限定されるものではなく、物理的に吸着させてもよく、固相担体表面の官能基に化学的に結合させてもよい。化学的に結合させる場合には、各官能基に適した方法により結合させることができる。例えば、ＥＤＡＣ（１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル) −カルボジイミド塩酸塩）反応、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド）とＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）とを予め混合してカルボン酸とアミノ基とを結合させる反応、双極性を有するリンカーを用いてアミノ基同士を架橋する反応、活性化したアルデヒド基やトシル基と、第２のマーカーと特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質中の官能基を結合する反応等が挙げられる。固相担体表面に官能基を有さない場合には、固相担体表面を予め官能基で被覆してもよい。

固相担体としては、第２のマーカーと結合する部位を備えている固体であれば、その形状、材質等は特に限定されるものではない。例えば、ビーズ等の水に懸濁可能であり、かつ一般的な固液分離処理によって液体と分離可能な粒子であってもよく、メンブレンであってもよく、容器やチップ基板等であってもよい。固相担体としては具体的には、例えば、磁気ビーズ、シリカビーズ、アガロースゲルビーズ、ポリアクリルアミド樹脂ビーズ、ラテックスビーズ、プラスチックビーズ、セラミックスビーズ、ジルコニアビーズ、シリカメンブレン、シリカフィルター、プラスチックプレート等が挙げられる。例えば、固相担体がビーズ等の粒子の場合、前記試料溶液に前記固相担体を添加する。また、固相担体がメンブレンやフィルターの場合、前記試料溶液を前記固相担体に透過させる。固相担体が、内壁に第２のマーカーと結合する物質で被覆された容器である場合、前記試料溶液を前記固相担体である容器に注入する。

例えば、第２のマーカーがビオチンの場合、アビジンやストレプトアビジンが表面に結合しているビーズやフィルターを固相担体として用いることができる。また、第２のマーカーがジゴキシゲニン（Ｄｉｇ)の場合、抗Ｄｉｇ抗体が表面に結合しているビーズやフィルターを固相担体として用いることができる。

固相担体と、３者会合体を含む試料溶液とを接触させることにより、３者会合体中の第２のマーカーを介して、前記３者会合体を固相担体と結合させる。その後固液分離処理を行うことにより、固相担体と結合した３者会合体を、液相に存在する遊離の第１の核酸プローブと分離して回収することができる。

固液分離処理としては、溶液中の固相担体を液体成分とは分離して回収可能な方法であれば、特に限定されるものではなく、固液分離処理に用いられる公知の処理の中から適宜選択して用いることができる。例えば、固相担体がビーズ等の粒子の場合、固相担体を含む懸濁液に対して遠心分離処理を行い、固相担体を沈殿させ、上清を除去してもよく、前記溶液を濾紙又は濾過フィルターを用いて濾過し、濾紙等の表面に残留した固相担体を回収してもよい。また、固相担体が磁気ビーズである場合には、前記溶液が入れられている容器に磁石を接近させ、前記容器の前記磁石に最も近接する面に固相担体を収束させた後、上清を除去してもよい。固相担体が内壁に第２のマーカーと結合する物質で被覆された容器である場合、固相担体である容器内の液体を排出する。なお、固相担体がメンブレンやフィルターの場合、前記試料溶液を前記固相担体に透過させることにより、固相担体と３者会合体との結合と、固相担体に結合した３者会合体の遊離の第１の核酸プローブからの分離回収を一の操作で行うことができる。

本実施形態においては、工程（ａ）において、第２のマーカーと結合する部位を備える固相担体を、核酸含有試料と第１の核酸プローブと第２の核酸プローブと共に予め試料溶液に添加しておき、工程（ｃ）において固相担体と結合した３者会合体を形成しておいた後、固液分離処理することにより、固相担体と結合した３者会合体を、遊離の第１の核酸プローブから分離して回収してもよい。また、工程（ａ）において、予め固相担体と結合した状態の第２のマーカーと、核酸含有試料と、第１の核酸プローブとを添加して試料溶液を調製し、工程（ｃ）において固相担体と結合した３者会合体を形成しておいた後、固液分離処理することにより、固相担体と結合した３者会合体を、遊離の第１の核酸プローブから分離して回収してもよい。なお、この際に用いる第２のマーカーは、固相担体と可逆的に結合していてもよく、不可逆的に結合していてもよい。

回収された固相担体に適当な溶媒を添加することにより、固相担体と結合した３者会合体を含む溶液が調製される。回収された固相担体は、これを含む溶液として、工程（ｆ）に供される。前記溶媒は、後の工程において第１のマーカーから放出される光の検出を阻害しない溶媒であれば、特に限定されるものではなく、当該技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。前記バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。

回収された固相担体は、工程（ｆ）の前に、適当な溶媒により洗浄してもよい。洗浄により、遊離の第１の核酸プローブをより厳密に、固相担体と結合した３者会合体から分離して除去することができる。固相担体を洗浄する溶媒は、第２のマーカーと固相担体との結合を損なわないものであれば特に限定されるものではなく、工程（ｆ）に供される固相担体と結合した３者会合体を含む溶液の調製に用いる溶媒と同種であってもよく、異なる溶媒であってもよい。

固液分離処理を室温等において行う場合には、固液分離処理時に非特異的会合体（非特異的なハイブリダイゼーションにより形成された会合体）が形成されやすい。このため、本実施形態においては、第１の核酸プローブが非特異的な会合体（例えば第２の核酸プローブとの会合体）を形成することが抑制される状態で、固相担体を洗浄することが好ましい。
例えば、第１の核酸プローブのＴｍ値が非常に低くなるような塩濃度の溶媒で洗浄する。
中でも、第１の核酸プローブのＴｍ値が、洗浄時の温度よりも低くなる塩濃度の溶媒で洗浄することが好ましい。塩濃度はプローブの塩基配列によって様々であるが、２５℃程度の室温で洗浄することを考えると、第１の核酸プローブのＴｍ値が、２５℃以下となる塩濃度の溶媒を洗浄に用いることが好ましい。前記溶媒としては、具体的には、ｘ０．０１ＳＳＣ（１．５ｍＭ ＮａＣｌ、０．１５ｍＭのクエン酸ナトリウム溶液）あるいはこれ以下の塩濃度溶液等の、ハイブリダイゼーション法において洗浄等に用いられる低塩濃度溶液が挙げられる。前記溶媒としては、水等の塩を含まない溶媒であってもよい。ストリンジェンシーの高い溶液で洗浄することにより、非特異的な会合体形成を抑制し、遊離の第１の核酸プローブを効果的に除去することができる。本実施形態においては、標的核酸分子と第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブとを共有結合させているため、３者会合体を高いストリンジェンシーによる洗浄でも安定して維持することができる。

その後、工程（ｆ）として、回収された３者会合体から第１のマーカーを遊離させる。
第１のマーカーを遊離させる方法は、３者会合体中の第１のマーカーを固相担体から分離させられる方法であれば特に限定されるものではない。

例えば、固相担体と結合した３者会合体を含む溶液に核酸分解酵素を添加し、前記酵素により第１の核酸プローブをはじめとする核酸分子を分解することにより、第１のマーカーを遊離させることができる（ｆ２）。第１のマーカーの遊離に用いられる核酸分解酵素は、特に限定されるものではなく、ＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素いずれでもよく、制限酵素であってもよい。ＤＮＡ分解酵素としては、例えば、Ｓ１ Ｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｍｕｎｇ ＢｅａｎＮｕｃｌｅａｓｅ、ＢＡＬ ３１ Ｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ 、ＤＮａｓｅ Ｉ等が挙げられる。ＲＮＡ分解酵素としては、例えばＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｈ、ＤＮＡ／ＲＮＡ分解酵素としては、例えばＭｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ Ｎｕｃｌｅａｓｅ等が挙げられる。

第１の核酸プローブ又は第２の核酸プローブ中の標的核酸分子とハイブリダイズする領域内に、制限酵素に対応した制限酵素認識配列を含ませるように、第１の核酸プローブ又は第２の核酸プローブを設計してもよい。この場合には、制限酵素処理により、３者会合体中の当該制限酵素の認識部位を消化することにより、第１のマーカーを固相担体から分離させることができる。制限酵素には、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ等があるが、これらに限定されるものではない。

また、酵素反応ではなく、アルカリによって化学的に第１の核酸プローブをはじめとする核酸分子を分解することによっても、第１のマーカーを遊離させることができる（ｆ４）。具体的には、固相担体と結合した３者会合体を含む溶液にアルカリを添加して当該溶液のｐＨをアルカリとした後、５０℃〜１００℃、好ましくは７０℃〜１００℃、より好ましくは８０℃〜１００℃に加熱する。アルカリ処理は、核酸分子が分解するｐＨ、濃度にすればよい。また、用いるアルカリの種類は特に限定されるものではなく、無機アルカリであってもよく、有機アルカリであってもよい。例えば、０．１ｍＭの水酸化ナトリウム溶液又は０．１ｍＭの水酸化カリウム溶液等の強アルカリ溶液を添加して、固相担体と結合した３者会合体を含む溶液をｐＨ１０以上、好ましくはｐＨ１２以上にした後、５０℃以上、好ましくは７０℃以上に加熱する。

また、^ＣＮＶＫを用いた光化学的反応により形成された共有結合は、強いエネルギーによって結合が解消されやすいことが新たに判明した。この際に加えられるエネルギーとしては、光エネルギーであってもよく、熱エネルギーであってもよい。

そこで、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブと標的核酸分子とを、光反応性塩基誘導体として^ＣＮＶＫを用いた光化学的反応により共有結合させた場合には、脱会合条件下で、固相担体と結合した３者会合体に３００ｎｍ〜３８０ｎｍ、好ましくは３４０ｎｍ〜３８０ｎｍの紫外線を照射することによっても、第１のマーカーを遊離させることができる（ｆ１）。

ここで、脱会合条件とは、標的核酸分子と第１の核酸プローブとの間、又は標的核酸分子と第２の核酸プローブとの間に共有結合が形成されていない場合には、標的核酸分子と第１の核酸プローブ、又は標的核酸分子と第２の核酸プローブとが脱会合する条件である。脱会合条件としては、例えば、洗浄処理と同様、第１の核酸プローブのＴｍ値が非常に低くなるような低塩濃度条件等が挙げられる。具体的には、例えば、固相担体と結合した３者会合体を第１の核酸プローブのＴｍ値が、２５℃以下となる塩濃度の溶液（水等の塩を含有しない溶液であってもよい。）に添加した後、当該溶液に３００ｎｍ〜３８０ｎｍの紫外線を照射する。

また、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブと標的核酸分子とを、光反応性塩基誘導体として^ＣＮＶＫを用いた光化学的反応により共有結合させた場合には、固相担体と結合した３者会合体を、第１の核酸プローブのＴｍ値よりも充分に高い温度に加温することによっても、第１のマーカーを遊離させることができる。具体的には、固相担体と結合した３者会合体を８０℃以上に加温する（ｆ３）。固相担体と結合した３者会合体に、水等の第１のマーカーから放出される光の検出を阻害しない溶媒を添加した状態で加温することが好ましい。

その後、工程（ｇ）として、遊離された第１のマーカーを検出することにより、標的核酸分子を検出する。一分子の３者会合体からは一分子の第１のマーカーが遊離する。このため、理論的には、工程（ｇ）において検出された第１のマーカーの数は、工程（ａ）において添加された核酸含有試料中の標的核酸分子の数に等しい。

遊離された第１のマーカーは、その分光特性に最適な波長の光を照射し、前記マーカーから発される光の光学的特性を検出することにより検出できる。なお、「マーカーの光学的特性を検出する」とは、前記マーカーから発される特定の波長の光シグナルを検出することを意味する。前記光シグナルとしては、蛍光強度や蛍光偏光等がある。本実施形態においては、蛍光強度であることが好ましい。

第１のマーカーの検出方法は、溶液中の分子の蛍光シグナルの強度又はその時間変化（揺らぎ）を検出し解析し得る方法であれば、特に限定されるものではない。例えば、溶液中の全蛍光分子から発される蛍光強度を測定してもよく、一分子ごとに蛍光強度を測定してもよい。

溶液の蛍光強度は、蛍光プレートリーダー等の蛍光分光光度計等を用いて常法により測定することができる。溶液の蛍光強度は、前記溶液中に含まれている第１のマーカーの量に依存する。このため、例えば、予め第１のマーカーの含有量と蛍光強度との関係を示す検量線を作成しておくことにより、溶液中の第１のマーカーの量、すなわち、核酸含有試料中の標的核酸分子の量を定量することができる。

試料溶液中の一分子ごとに蛍光強度を測定する方法としては、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ＦＣＳ）、又は蛍光強度分布解析法（Ｆｌｕｏｒｅｃｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ， ＦＩＤＡ）が挙げられる。なお、このような分子の蛍光シグナルの時間変化の検出及び解析は、例えば、ＭＦ２０（オリンパス社製）等の公知の一分子蛍光分析システム等を用いて、常法により行うことができる。

例えば、ＦＩＤＡにより、共焦点光学系における焦点領域に存在している分子の蛍光強度の揺らぎを検出した後、統計解析を行うことによって遊離した第１のマーカーの分子数を算出することにより、標的核酸分子を検出し定量することができる。
また、ＦＣＳにより、共焦点光学系における焦点領域に存在している分子の蛍光強度の揺らぎを検出した後、統計解析を行うことによって、遊離した第１のマーカーの分子数を算出することにより、標的核酸分子を検出し定量することができる。

本実施形態の標的核酸分子の検出方法においては、その他、走査分子計数法（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ）により、溶液中の蛍光分子を検出することもできる。具体的には、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、測定試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域からの蛍光を検出することにより、測定試料溶液中に存在している遊離した第１のマーカーの分子数を算出する（例えば、国際公開第１１／１０８３６９号、国際公開第１１／１０８３７０号、国際公開第１１／１０８３７１号参照。）。

走査分子計数法は、微小領域により試料溶液内を走査しながら、測定試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）が微小領域内を横切るときに、微小領域中の発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、測定試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや測定試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする技術である。ＦＩＤＡ等のような光分析技術と同様に、測定に必要な試料が微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子について、その濃度又は数密度等の特性を定量的に検出することが可能となる。

本実施形態において、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡において光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する。なお、かかる領域は、共焦点顕微鏡においては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。

走査分子計数法は、その光検出機構自体については、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているので、試料溶液の量は、同様に微量であってよい。しかしながら、走査分子計数法においては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されないので、走査分子計数法の光分析技術は、粒子の数密度又は濃度がＦＩＤＡ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能である。

また、走査分子計数法では、溶液中に分散又は溶解した粒子の各々を個別に検出するようになっているので、その情報を用いて、定量的に、粒子のカウンティングや測定試料溶液中の粒子の濃度又は数密度の算定又は濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。すなわち、走査分子計数法によれば、光検出領域を通過する粒子と検出された光信号とを１対１に対応させて粒子を一つずつ検出するので、溶液中に分散してランダムに運動する粒子のカウンティングが可能となる。そのため、従前に比して、精度よく測定試料溶液中の粒子の濃度又は数密度を決定することが可能となる。例えば、本実施形態の標的核酸分子の検出方法における遊離した第１のマーカーの検出を走査分子計数法により行い、第１のマーカーが発する光によって測定試料溶液中の粒子を個別に検出しその数を計数して粒子濃度を決定する場合には、測定試料溶液の第１のマーカーの濃度が、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測された蛍光強度に基づいて決定可能な濃度よりも更に低い濃度であっても第１のマーカーを検出可能である。核酸含有試料中の標的核酸分子の濃度が非常に低く、遊離した第１のマーカーが１フェムトモル以下となるような場合でも、走査分子計数法を用いることにより、予め標的核酸分子を増幅せずに定量検出することができる。

更に、光学系の光路を変更して測定試料溶液中を光検出領域にて走査する態様によれば、測定試料溶液に対して機械的振動や流体力学的な作用を与えずに、測定試料溶液内を一様に或いは測定試料溶液が機械的に安定した状態で観測することになる。そのため、例えば、試料に流れを発生させる場合に比して、定量的な検出結果の信頼性が向上し、また、測定試料溶液中の検出対象となる粒子（本発明においては、遊離した第１のマーカー）に対して力学的な作用による影響又はアーティファクトの無い状態で計測が行えることとなる。試料に流れを与える場合には、常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となる。また、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の粒子、発光プローブ若しくは結合体又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。

１分子計測等の高感度測定、特に走査分子計数法では、固相担体等のような、溶液中における拡散運度が比較的遅い発光粒子の検出精度が低くなる場合がある。本実施形態においては、固相担体から分離された遊離の状態の第１マーカーを検出対象とすることにより、蛍光１分子測定法を用いた場合であっても、固相担体の影響を排除して高精度に第１マーカーを検出することができる。

図１は、本実施形態の標的核酸分子の検出方法のうちの一態様を模式的に示した図である。図１において、第１のマーカーとして蛍光物質を、第２のマーカーとしてビオチンを、固相担体としてアビジンビーズ（表面にアビジンが結合したビーズ）を用いている。第１の核酸プローブと標的核酸分子の間、及び第２の核酸プローブと標的核酸分子の間に、^ＣＮＶＫを用いた光化学的反応により共有結合形成（クロスリンク）させ、核酸分解酵素を用いて第１のマーカーを遊離させている。

まず、標的核酸分子１と、蛍光物質２ａが結合した第１の核酸プローブ２、ビオチン３ａが結合した第２の核酸プローブ３とが、ハイブリダイズして形成された３者会合体に、３６５ｎｍの紫外線を照射して、第１の核酸プローブ２中の^ＣＮＶＫ２ｂと標的核酸分子１との間、及び第２の核酸プローブ３中の^ＣＮＶＫ３ｂと標的核酸分子１との間に、それぞれ共有結合形成（クロスリンク）を生じさせる（図１の１段目の図）。クロスリンク後に試料溶液にアビジンビーズ４を添加し、３者会合体を、ビオチン３ａを介してアビジンビーズ４と結合させる（図１の２段目の図）。その後、低塩濃度溶液によって洗浄した後、核酸分解酵素による酵素処理によって、標的核酸分子１、第１の核酸プローブ２、及び第２の核酸プローブ３が分解し（図１の３段目の図）、蛍光物質２ａがアビジンビーズ４から遊離する（図１の４段目の図）。

その他、第２の核酸プローブと標的核酸分子との会合体のＴｍ値を、第１の核酸プローブと標的核酸分子との会合体のＴｍ値よりも充分に高くし、工程（ｅ）における固液分離処理及びその前の洗浄処理においても第２の核酸プローブが標的核酸分子とハイブリダイズすることができる場合には、第１の核酸プローブと標的核酸分子との間にのみ少なくとも１の共有結合を形成させればよい。第２の核酸プローブと標的核酸分子との間には共有結合を形成させない場合であっても、本実施形態の標的核酸分子の検出方法と同様に、標的核酸分子を、遊離の標識済みプローブや固相担体の影響を受けずに検出することができる。
例えば、第１の核酸プローブと標的核酸分子との会合体のＴｍ値を、前記洗浄処理に用いる洗浄液の温度よりも低くする、好ましくは１０℃以上低くし、かつ第２の核酸プローブと標的核酸分子との会合体のＴｍ値を当該洗浄液の温度以上にする、好ましくは１０℃以上高くすることにより、前記洗浄処理によって、遊離の第１の核酸プローブを洗浄除去することができる。

第２の核酸プローブと標的核酸分子との会合体のＴｍ値を、第１の核酸プローブと標的核酸分子との会合体のＴｍ値よりも高める方法としては、例えば、第２の核酸プローブをＰＮＡ等の天然のオリゴヌクレオチドよりも強い塩基対を形成し得る核酸類似物質を少なくとも一部に含むように構成させ、第１の核酸プローブの核酸鎖部分を天然のオリゴヌクレオチドのみで構成させる態様が挙げられる。これらの核酸プローブを用いて、工程（ｅ）における固液分離及びその前の洗浄処理を、標的核酸分子と共有結合を形成しておらず、非特異的に他の核酸分子とハイブリダイズしている第１の核酸プローブを遊離させることができ、かつ第２の核酸プローブが標的核酸分子とハイブリダイズすることができる条件で行う以外は、前記の本実施形態の標的核酸分子の検出方法と同様にして工程（ａ）〜（ｇ）を行うことにより、標的核酸分子と会合体を形成していない第１の核酸プローブを除去した状態で、標的核酸分子と会合体を形成していた第１の核酸プローブを検出することができる。この場合、前記工程（ｆ）における回収された３者会合体からの前記第１のマーカーの遊離を、固相担体と結合している３者会合体を、第２の核酸プローブが標的核酸分子とハイブリダイズできなくなるほどストリンジェンシーの厳しい溶液条件で洗浄することにより行うこともできる。固相担体と結合している第２の核酸プローブが標的核酸分子から解離することによって、標的核酸分子と会合体を形成している第１のマーカーが、固相担体から遊離する。

＜標的核酸分子検出用キット＞
本実施形態の標的核酸分子の検出方法に用いられる、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブをはじめとする各種試薬や機器等をキット化することも好ましい。前記キットにより、本実施形態の標的核酸分子の検出方法をより簡便に行うことができる。前記キットには、前記の核酸プローブの他に、第２のマーカーと結合する部位を備える固相担体、試料溶液を調製するために用いられる各種バッファー、共有結合により安定化させた後の３者会合体を洗浄するための洗浄液、恒温装置付インキュベーター等を含ませることができる。

次に実施例を示して本発明の態様をさらに詳細に説明するが、本発明の態様は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
ヒトのマイクロＲＮＡであるｌｅｔ−７ａ（ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ、５’−ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ−３’）（配列番号１）と相同な配列をもつ１本鎖ＲＮＡを標的核酸分子として、本発明の一態様である標的核酸分子の検出方法により、未標識の標的核酸分子を検出した。
第１の核酸プローブとして、ｌｅｔ−７ａの５’末端から９番目の塩基までの領域に相補的な塩基配列を有し、かつｌｅｔ−７ａの５’末端から５番目の塩基と相補的な塩基をクロスリンクする塩基誘導体として^ＣＮＶＫに置換し、さらに３’末端に第１のマーカーとして蛍光物質Ｔａｍｒａを結合させた核酸プローブ（７ａ ｒｉｇｈｔ ｔａｍｒａ−１、５’−ＡＣＴＡＫＣＴＣＡ−３’）を用いた。また、第２の核酸プローブとして、ｌｅｔ−７ａの３’末端から１３番目の塩基までの領域に相補的な塩基配列を３’末端側に有し、かつｌｅｔ−７ａの３’末端から６番目の塩基と相補的な塩基をクロスリンクする塩基誘導体として^ＣＮＶＫに置換し、さらに第２のマーカーとして５’末端側に１０塩基のチミジン及びビオチンを付加した核酸プローブ（Ｂ−７ａＬ１、５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣＴＡＫＡＣＡＡＣＣＴ−３’）を用いた。各塩基配列中、「Ｋ」が^ＣＮＶＫを意味する。また、各プローブの^ＣＮＶＫに置換する前の塩基配列を配列番号２及び３に示す。なお、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブは、株式会社ファスマックにより合成された。

試料溶液として、第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブが最終濃度で１００ｎＭであり、標的核酸分子としてｌｅｔ−７ａと相同的な塩基配列からなる合成ＲＮＡを最終濃度で１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭ、０ｐＭとなるようにそれぞれ添加した溶液を５０μＬずつ調製した（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, ０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）。各溶液には、さらに０．１ｕ／μＬとなるようにＲＮＡ分解阻害剤（製品名：Ｓｕｐｅｒ Ｒａｓｅ Ｉｎ、Ａｍｂｉｏｎ社製）を添加した。なお、前記標的核酸分子は、北海道システムサイエンス株式会社で合成したものを使用した。
各試料溶液を、７０℃で２分間変性させた後、１０℃まで１℃／１５秒で温度を下げることによりハイブリダイゼーション（会合）を行った。その後、前記試料溶液に対して氷中にて３６５ｎｍの光照射を行った。各試料溶液に磁気ビーズとしてダイナビーズ（製品名：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｎ社製）を１０μＬ添加し、１５分間室温でインキュベートした。その後、磁気ビーズを、×１ＳＳＣ、×０．１ＳＳＣ、及び×０．０１ＳＳＣでそれぞれ１回ずつ洗浄した。洗浄後、１０Ｕｎｉｔｓ／２０μＬのＳ１ｎｕｃｌｅａｓｅ溶液(タカラバイオ社製)を２０μＬずつ添加し、２３℃で１０分間反応させた。反応溶液に３０μＬのＴＥバッファーを添加した後、磁気ビーズを容器側面に沈着させた後に上清を回収し、Ｔａｍｒａの励起波長を照射して、当該上清を蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ法）により測定した。

各試料溶液から回収された磁気ビーズから核酸分解酵素反応により遊離させた蛍光物質Ｔａｍｒａの分子数のＦＩＤＡによる測定結果を、図２に示す。横軸は標的核酸分子濃度（ｎＭ）、縦軸は蛍光分子数を示している。測定の結果、１０ｎＭから１ｐＭまで濃度依存的に検出される蛍光分子数が減少していることがわかった。特に１ｐＭ（５０μＬで５０ａｔｔｏｍｏｌ）の濃度で検出できたことがわかった。

［実施例２］
本発明の他の態様における標的核酸分子の検出方法において、第１のマーカーの固相担体からの遊離を、核酸分解酵素反応又は低塩濃度条件下での紫外線照射によって行った。
まず、標的核酸分子としてｌｅｔ−７ａと相同的な塩基配列からなる合成ＲＮＡを最終濃度で１０ｎＭ又は０ｎＭとした以外は実施例１と同様にして、標的核酸分子、第１の核酸プローブ、及び第２の核酸プローブを含む試料溶液を調製し、変性後ハイブリダイゼーション（会合）を行った後、紫外線照射して共有結合を形成させた。各試料溶液に磁気ビーズとしてダイナビーズ（製品名：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｎ 社製）を１０μＬ添加し、１５分間室温でインキュベートした。その後、磁気ビーズを、×１ＳＳＣ、×０．１ＳＳＣ、及び×０．０１ＳＳＣでそれぞれ１回ずつ洗浄した。
洗浄後、×０．１ＳＳＣ、×０．０１ＳＳＣ、又は純水を５０μＬ添加し、５０℃にて１分間加温後、その状態で１０秒間３６５ｎｍの紫外線を照射した。磁気ビーズを容器側面に沈着させた後に上清を回収し、Ｔａｍｒａの励起波長を照射して、前記上清を蛍光相関分光法（ＦＣＳ法）により測定した。
また、同様にして３者会合体を結合させた磁気ビーズを、×１ＳＳＣ、×０．１ＳＳＣ、及び×０．０１ＳＳＣでそれぞれ１回ずつ洗浄した後、実施例１と同様にしてＳ１ｎｕｃｌｅａｓｅ溶液(タカラバイオ社製)を添加して反応させ、得られた反応溶液に３０μＬのＴＥバッファーを添加した後、磁気ビーズを容器側面に沈着させた後に上清を回収し、Ｔａｍｒａの励起波長を照射して、前記上清を蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ法）により測定した。
また、対照として、標的核酸分子を試料溶液に添加しなかった以外は同様にして、洗浄後の磁気ビーズに実施例１と同様にしてＳ１ｎｕｃｌｅａｓｅ溶液(タカラバイオ社製)を添加して反応させ、得られた反応溶液に３０μＬのＴＥバッファーを添加した後、磁気ビーズを容器側面に沈着させた後に上清を回収し、Ｔａｍｒａの励起波長を照射して、前記上清を蛍光相関分光法（ＦＣＳ法）により測定した。

各試料溶液から回収された磁気ビーズから遊離させた蛍光物質Ｔａｍｒａの分子数のＦＣＳによる測定結果を、図３に示す。横軸はＴａｍｒａを遊離させるために行った処理を、縦軸はＦＣＳ法を用いて解析した蛍光分子数を示す。また、図３中、「Ｓ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｌｅｔ７ａ」は標的核酸分子を添加しなかった試料溶液の結果を示す。各溶液条件で２個程度の蛍光分子数を計測することができ、本発明の一態様における標的核酸分子の検出方法によって、核酸分解酵素による酵素反応や、低塩濃度条件における紫外線照射処理によって、第１のマーカーを固相担体から遊離させられることが明らかである。

［実施例３］
本発明のさらに他の態様における標的核酸分子の検出方法において、第１のマーカーの固相担体からの遊離を、アルカリ条件下における加温、又は低塩濃度条件下における加温によって行った。
まず、標的核酸分子としてｌｅｔ−７ａと相同的な塩基配列からなる合成ＲＮＡを最終濃度で１０ｎＭ又は０ｎＭとした以外は実施例１と同様にして、標的核酸分子、第１の核酸プローブ、及び第２の核酸プローブを含む試料溶液を調製し、変性後ハイブリダイゼーション（会合）を行った後、紫外線照射して共有結合を形成させた。各試料溶液に磁気ビーズとしてダイナビーズ（製品名：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｎ 社製）を１０μＬ添加し、１５分間室温でインキュベートした。その後、磁気ビーズを、×１ＳＳＣ、×０．１ＳＳＣ、及び×０．０１ＳＳＣでそれぞれ１回ずつ洗浄した。
洗浄後、１０ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＮａＯＨ、又は純水を５０μＬずつ添加し、７０℃、８０℃、又は９０℃にて３０分間保温した後、その状態で１０秒間３６５ｎｍの紫外線を照射した。磁気ビーズを容器底面に沈着させた後、Ｔａｍｒａの励起波長を照射して、上清を蛍光相関分光法（ＦＣＳ法）により測定した。

各試料溶液から回収された磁気ビーズから低塩濃度条件下又はアルカリ条件下での加温によって遊離させた蛍光物質Ｔａｍｒａの分子数のＦＣＳ法による測定結果を、図４に示す。横軸はＴａｍｒａを遊離させた際の温度を、縦軸はＦＣＳ法を用いて解析した蛍光分子数を示す。図４の凡例中、「Ｗａｔｅｒ／０ｎＭ」及び「Ｗａｔｅｒ／１０ｎＭ」は、標的核酸分子が０ｎＭ又は１０ｎＭの試料溶液から調製された磁気ビーズを水中で加温した場合の結果を、「１ｍＭ ＮａＯＨ／０ｎＭ」及び「１ｍＭ ＮａＯＨ／１０ｎＭ」は、標的核酸分子が０ｎＭ又は１０ｍＭの試料溶液から調製された磁気ビーズを１ｍＭ ＮａＯＨＨ中で加温した場合の結果を、「１０ｍＭ ＮａＯＨ／０ｎＭ」及び「１０ｍＭＮａＯＨ／１０ｎＭ」は、標的核酸分子が０ｎＭ又は１０ｎＭの試料溶液から調製された磁気ビーズを１０ｍＭ ＮａＯＨ中で加温した場合の結果を、それぞれ示している。この結果、標的核酸分子を含まない試料から調製された磁気ビーズ（「Ｗａｔｅｒ／０ｎＭ」等）からは、全ての温度帯にわたって蛍光分子数はほとんど検出されなかった。また、磁気ビーズをＮａＯＨ中で加温した場合には、より高濃度のＮａＯＨのほうが蛍光色素をより多く遊離すること、また、７０℃より９０℃処理のほうが、遊離蛍光分子数が多いことがわかった。このように、アルカリ条件下で５０℃〜１００℃に加温した場合でも、第１のマーカーである発光物質は固相担体から遊離し、ＦＣＳ法のような蛍光１分子測定法で高感度測定が可能なことがわかった。
一方、磁気ビーズを純水中で加温した場合には、７０℃ではほとんど蛍光分子（Ｔａｍｒａ）は検出されなかったが、８０℃以上でＴａｍｒａの遊離が計測され、９０℃ではアルカリ処理と同程度の濃度で蛍光分子を計測できており、８０℃以上、好ましくは９０℃以上に加温することにより、純水中であっても第１のマーカーである発光物質を固相担体から遊離させられることがわかった。

［実施例４］
本発明のさらに他の態様における標的核酸分子の検出方法において、第１のマーカーの固相担体からの遊離を、加温によって行った。
まず、標的核酸分子としてｌｅｔ−７ａと相同的な塩基配列からなる合成ＲＮＡを最終濃度で１０ｎＭ又は０ｎＭとした以外は実施例１と同様にして、標的核酸分子、第１の核酸プローブ、及び第２の核酸プローブを含む試料溶液を調製し、変性後ハイブリダイゼーション（会合）を行った後、紫外線照射して共有結合を形成させた。当該試料溶液を×１Ｂ＆Ｗ緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｔｒｉｓ）にて１０倍希釈し、総量を５０μＬとした希釈済みの試料溶液に、磁気ビーズとしてダイナビーズ（製品名：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｎ 社製）を１０μＬ添加し、１５分間室温でインキュベートした。その後、磁気ビーズを、×１ＳＳＣ、×０．１ＳＳＣ、及び×０．０１ＳＳＣでそれぞれ１回ずつ洗浄した。
洗浄後、×１ＳＳＣ、×１ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）、又は純水を５０μＬ添加し、９０℃にて３０分間保温した後、室温で磁気ビーズを容器側面に沈着させた後、上清を蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ法）により測定した。

各試料溶液から回収された磁気ビーズから加温によって遊離させた蛍光物質Ｔａｍｒａの分子数のＦＩＤＡ法による測定結果を、図５に示す。横軸は加温時の溶液条件を、縦軸はＦＩＤＡ法を用いて解析した蛍光分子数を示す。図５の凡例中、「Ｈｅａｔ」は９０℃で加温した場合の結果を、「ＲＴ」は加温しなかった場合の結果を、それぞれ示している。加温しなかった場合、全ての溶液条件で蛍光分子数はほとんど検出されなかった。一方、９０℃で加温した場合、全ての条件で蛍光分子を検出することができた。
これらの結果から、アルカリ処理等を用いることなく、好ましくは９０℃で加温することによっても、蛍光分子の遊離検出が可能なことがわかった。

本発明のいくつかの態様における標的核酸の検出方法により、試料中に存在する標的核酸分子を、高感度かつ精度良く検出することができる。そのため、本発明のいくつかの態様における標的核酸の検出方法は、試料中の核酸を検出又は定量解析するような生化学、分子生物学、臨床検査等の分野で利用が可能である。

１…標的核酸分子、２…第１の核酸プローブ、２ａ…蛍光物質、２ｂ…^ＣＮＶＫ、３…第２の核酸プローブ、３ａ…ビオチン、３ｂ…^ＣＮＶＫ、４…アビジンビーズ。

Claims (13)

1. （ａ）核酸含有試料と、発光物質である第１のマーカーが結合されており、かつ標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の核酸プローブと、第２のマーカーが結合されており、かつ前記標的核酸分子と、前記第１の核酸プローブがハイブリダイズする領域とは異なる領域で特異的にハイブリダイズする第２の核酸プローブと
   を添加した試料溶液を調製する工程と、
   （ｂ）前記工程（ａ）において調製された前記試料溶液中の核酸分子を変性させる工程と、
   （ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記試料溶液中の核酸分子を会合させる工程と、
   （ｄ）前記工程（ｃ）において形成された会合体のうち、前記標的核酸分子と前記第１の核酸プローブと前記第２の核酸プローブとからなる３者会合体において、前記標的核酸分子と前記第１の核酸プローブとの間に少なくとも１の共有結合を形成させると共に、前記標的核酸分子と前記第２の核酸プローブとの間に少なくとも１の共有結合を形成させる工程と、
   （ｅ）前記工程（ｄ）の後、前記試料溶液中に、前記第２のマーカーと結合する部位を備える固相担体を添加し、前記３者会合体中の前記第２のマーカーを介して前記固相担体及び前記３者会合体を結合させた後、固液分離処理により、前記固相担体と結合した前記３者会合体を回収する工程と、
   （ｆ）前記工程（ｅ）の後、前記３者会合体を８０℃以上に加温することにより、回収された前記３者会合体から前記第１のマーカーを遊離させる工程と、
   （ｇ）前記工程（ｆ）の後、遊離された第１のマーカーを検出することにより、前記標的核酸分子を検出する工程と、
   を有し、
   前記共有結合の形成反応が、光反応性塩基誘導体を介した光化学的反応であり、前記光反応性塩基誘導体が、３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅである、標的核酸分子の検出方法。
2. 前記第１の核酸プローブ中の前記標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の少なくとも一塩基が、前記光反応性塩基誘導体に置換されており、
   前記第２の核酸プローブ中の前記標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の少なくとも一塩基が、前記光反応性塩基誘導体に置換されている、請求項１に記載の標的核酸分子の検出方法。
3. 前記共有結合が、前記試料溶液に３４０ｎｍ〜３８０ｎｍの光を照射することにより形成される、請求項１又は２に記載の標的核酸分子の検出方法。
4. 前記工程（ｆ）の前に、
   前記工程（ｅ）において回収された前記固相担体と結合した前記３者会合体を、前記第１の核酸プローブのＴｍ値が２５℃以下となる塩濃度である洗浄用溶液で洗浄する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。
5. 前記工程（ｇ）において、前記第１のマーカーの検出を、蛍光１分子測定法を用いて行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。
6. 前記工程（ｇ）において、前記第１のマーカーの検出を、
   （ｐ）蛍光相関分光法、又は蛍光強度分布解析法により、前記遊離された第１マーカーを含有する測定用溶液中に存在している第１マーカーの分子数を算出する工程、又は
   （ｒ）共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記遊離された第１マーカーを含有する測定用溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域からの光を検出することにより、前記測定用溶液中に存在している第１マーカーの分子数を算出する工程、
   により行う、請求項５に記載の標的核酸分子の検出方法。
7. （ａ’）核酸含有試料と、発光物質である第１のマーカーが結合されており、かつ標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の核酸プローブと、第２のマーカーが結合されており、かつ前記標的核酸分子と、前記第１の核酸プローブがハイブリダイズする領域とは異なる領域で特異的にハイブリダイズする第２の核酸プローブと、前記第２のマーカーと結合する部位を備える固相担体と、を添加した試料溶液を調製する工程と、
   （ｂ’）前記工程（ａ’）において調製された前記試料溶液中の核酸分子を変性させる工程と、
   （ｃ’）前記工程（ｂ’）の後、前記試料溶液中の核酸分子を会合させる工程と、
   （ｄ’）前記工程（ｃ’）において形成された会合体のうち、前記標的核酸分子と前記第１の核酸プローブと前記第２の核酸プローブとからなる３者会合体において、前記標的核酸分子と前記第１の核酸プローブとの間に少なくとも１の共有結合を形成させると共に、前記標的核酸分子と前記第２の核酸プローブとの間に少なくとも１の共有結合を形成させる工程と、
   （ｅ’）前記工程（ｄ’）の後、前記試料溶液を固液分離処理することにより、前記３者会合体を回収する工程と、
   （ｆ’）前記工程（ｅ’）の後、前記３者会合体を８０℃以上に加温することにより、回収された前記３者会合体から前記第１のマーカーを遊離させる工程と、
   （ｇ’）前記工程（ｆ’）の後、遊離された第１のマーカーを検出することにより、前記標的核酸分子を検出する工程と、
   を有し、
   前記共有結合の形成反応が、光反応性塩基誘導体を介した光化学的反応であり、前記光反応性塩基誘導体が、３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅである、標的核酸分子の検出方法。
8. 前記工程（ａ’）が、
   （ａ”）前記核酸含有試料と、前記第１の核酸プローブと、固相担体と結合した状態の前記第２の核酸プローブとを添加した試料溶液を調製する工程
   である、請求項７に記載の標的核酸分子の検出方法。
9. 前記第１の核酸プローブ中の前記標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の少なくとも一塩基が、前記光反応性塩基誘導体に置換されており、
   前記第２の核酸プローブ中の前記標的核酸分子とハイブリダイズする領域中の少なくとも一塩基が、前記光反応性塩基誘導体に置換されている、請求７又は８に記載の標的核酸分子の検出方法。
10. 前記共有結合が、前記試料溶液に３４０ｎｍ〜３８０ｎｍの光を照射することにより形成される、請求項７〜９のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。
11. 前記工程（ｆ’）の前に、
    前記工程（ｅ’）において回収された前記固相担体と結合した前記３者会合体を、前記第１の核酸プローブのＴｍ値が２５℃以下となる塩濃度である洗浄用溶液で洗浄する、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。
12. 前記工程（ｇ’）において、前記第１のマーカーの検出を、蛍光１分子測定法を用いて行う、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。
13. 前記工程（ｇ’）において、前記第１のマーカーの検出を、
    （ｐ）蛍光相関分光法、又は蛍光強度分布解析法により、前記遊離された第１マーカーを含有する測定用溶液中に存在している第１マーカーの分子数を算出する工程、又は
    （ｒ）共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記遊離された第１マーカーを含有する測定用溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域からの光を検出することにより、前記測定用溶液中に存在している第１マーカーの分子数を算出する工程、
    により行う、請求項１２に記載の標的核酸分子の検出方法。

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