WO2013002261A1 - 標的粒子の検出方法 - Google Patents

標的粒子の検出方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2013002261A1
WO2013002261A1 PCT/JP2012/066393 JP2012066393W WO2013002261A1 WO 2013002261 A1 WO2013002261 A1 WO 2013002261A1 JP 2012066393 W JP2012066393 W JP 2012066393W WO 2013002261 A1 WO2013002261 A1 WO 2013002261A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
light
sample solution
particles
target
particle
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/066393
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
和孝 西川
Original Assignee
オリンパス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by オリンパス株式会社 filed Critical オリンパス株式会社
Priority to CN201280029647.6A priority Critical patent/CN103620388B/zh
Priority to JP2013522897A priority patent/JP6013332B2/ja
Priority to EP12805017.6A priority patent/EP2725347B1/en
Publication of WO2013002261A1 publication Critical patent/WO2013002261A1/ja
Priority to US14/091,943 priority patent/US20140087482A1/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1434—Optical arrangements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0028—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders specially adapted for specific applications, e.g. for endoscopes, ophthalmoscopes, attachments to conventional microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/008—Details of detection or image processing, including general computer control
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N2015/1486—Counting the particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting particles that are dispersed and randomly moving in a sample solution by using an optical system capable of detecting light from a minute region in the solution, such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • an optical system capable of detecting light from a minute region in the solution, such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • Intensity of fluorescent molecules or fluorescently labeled molecules (fluorescent molecules, etc.) entering and exiting the microscopic region Is measured. Then, based on the average residence time (translational diffusion time) and the average number of molecules staying in the minute region determined from the value of the autocorrelation function of the measured fluorescence intensity, Information such as the speed, magnitude, and concentration of the movement of fluorescent molecules, etc. is acquired, or various phenomena such as changes in molecular structure or size, molecular binding / dissociation reaction, dispersion / aggregation are detected.
  • Patent Documents 5 and 6 propose a method for detecting a fluorescent substance based on the passage of time of a fluorescence signal of a sample solution measured using an optical system of a confocal microscope.
  • Patent Document 7 weak light from fluorescent fine particles circulated in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate is measured using a photon counting technique, and the fluorescent fine particles in the flow or on the substrate are measured.
  • a signal arithmetic processing technique for detecting the presence has been proposed.
  • the sample required for measurement has an extremely low concentration compared with the conventional method.
  • a minute amount may be sufficient (the amount used in one measurement is about several tens of ⁇ L).
  • the measurement time is greatly reduced (measurement of time on the order of seconds is repeated several times in one measurement). Therefore, these technologies are particularly useful for analyzing rare or expensive samples often used in the field of medical and biological research and development, for clinical diagnosis of diseases, screening for physiologically active substances, etc. When the number is large, it is expected to be used as a powerful tool capable of performing experiments or inspections at a lower cost or faster than conventional biochemical methods.
  • the analysis target is a nucleic acid molecule
  • a technique for increasing the nucleic acid concentration in the sample solution is known before detecting the target nucleic acid molecule.
  • a method of measuring a target nucleic acid molecule from a sample solution after evaporating the solvent from the sample solution and concentrating the sample solution is known (for example, see Patent Document 8).
  • a nucleic acid concentration in the sample solution using a chemical analyzer having a rotation mechanism for separating and concentrating a target component and a detection mechanism for detecting fluorescence emission to measure the concentration of the specific component Is known for example, see Patent Document 9).
  • the nucleic acid concentration can be increased by isolating and purifying nucleic acid molecules from the sample solution.
  • a method is known in which an anionic detergent and a chaotropic salt are added to a sample to precipitate nucleic acid molecules, thereby collecting a precipitate in which nucleic acid molecules are concentrated (for example, Patent Document 10). reference.).
  • a method of capturing nucleic acid molecules in a sample using a membrane or anion exchange matrix for immobilizing nucleic acid molecules, and then releasing the nucleic acid molecules from the membrane or matrix for example, Patent Document 11). Or see 12.).
  • the magnitude of the temporal fluctuation of the measured fluorescence intensity is calculated by statistical processing, and the sample solution is based on the magnitude of the fluctuation.
  • Various characteristics such as fluorescent molecules entering and exiting the minute region are determined. Therefore, in order to obtain a significant result in the above-described optical analysis technique, the concentration or number density of the fluorescent molecules or the like to be observed in the sample solution is one of the lengths on the order of seconds in the equilibrium state.
  • about one fluorescent molecule is always present in the minute region so that as many fluorescent molecules that can be statistically processed within the measurement time can enter and exit the minute region.
  • the volume of the confocal volume is typically about 1 fL, so that the concentration of the fluorescent molecule or the like is preferably about 1 nM or more.
  • the concentration or number density of the particles to be observed in the sample solution is significantly lower than the level that can be statistically processed (for example, significantly lower than 1 nM)
  • the observation target is in the minute region. The state that only rarely enters during the measurement time occurs.
  • the measurement result of the fluorescence intensity a state where the observation target object is not present in the minute region is included for a long period of time, and the amount of observation of the significant fluorescence intensity is reduced.
  • Patent Documents 5 and 6 In the method for detecting a fluorescent substance using an optical system of a confocal microscope described in Patent Documents 5 and 6, a measurement time of several seconds is performed without performing statistical processing related to fluctuations in fluorescence intensity as described above.
  • the presence or absence of a fluorescent signal with a significant intensity in the sample can identify the presence or absence of a fluorescent molecule that is the object of observation in the sample.
  • the frequency of the fluorescent signal with a significant intensity and the particles of the fluorescent molecule or the like in the sample It is disclosed that a correlation is obtained with the number.
  • Patent Document 6 suggests that detection sensitivity is improved by generating a random flow that stirs the sample solution.
  • Patent Document 7 is a technique for individually detecting the presence of fluorescent fine particles in a flow in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate, and is in a normal state in a sample solution. It is not a technique for detecting particles such as molecules or colloids dissolved or dispersed in the sample, that is, particles moving randomly in the sample solution.
  • the technique of patent document 7 includes processes, such as measurement in a flow cytometer, or the fixation process of the fluorescent particle on a board
  • the present invention does not include statistical processing such as that performed in optical analysis techniques such as FCS, FIDA, and PCH, and the concentration or number density of particles to be observed is handled by the optical analysis technique described above.
  • a new photoanalysis technique that can detect the state or characteristics of particles to be observed in a lower sample solution enables target particles that are dispersed and move randomly in the sample solution to be measured in a shorter time.
  • An object is to provide a method of detection.
  • the scanning molecule counting method is a novel optical analysis technique proposed in Japanese Patent Application No. 2010-044714.
  • the target particle detection method is a method for detecting particles that are dispersed in a sample solution and move randomly, (A) concentrating the test sample so as to increase the concentration of the target particles in the test sample; (B) preparing a sample solution containing the test sample concentrated in the step (a) and a luminescent probe that binds to the target particle, and binding the target particle and the luminescent probe in the sample solution A process of (C) counting the number of target particles bound to the luminescent probe present in the sample solution prepared in step (b); Have The light emission characteristics of the emitted light are different between the state where the luminescent probe is bound to the target particle and the state where the luminescent probe is present alone, Counting the number of target particles bound to the luminescent probe in step (c) is: Using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, moving the position of the light detection region of the optical system in the sample solution; While moving the position of the light detection region of the optical
  • the number density of the target particles in the sample solution in the step (c) is the volume of the light detection region. One molecule or less per (V d ).
  • the target particle is a nucleic acid molecule
  • the step (a) ) Is a step of purifying and concentrating nucleic acid molecules from the test sample.
  • the step (a) comprises: In this step, target particles are specifically collected and concentrated.
  • the step of moving the position of the light detection region in the target particle detection method according to any one of the first to fourth aspects of the present invention, in the step of moving the position of the light detection region.
  • the position of the light detection area is moved at a predetermined speed.
  • the step of moving the position of the light detection region in the target particle detection method according to any one of the first to fifth aspects of the present invention, in the step of moving the position of the light detection region.
  • the position of the light detection region is moved at a speed faster than the diffusion movement speed of the target particles bound to the luminescent probe.
  • the detected light is combined with each luminescent probe.
  • the step of detecting the optical signal from the target particle and individually detecting the target particle combined with the luminescent probe it is combined with one luminescent probe based on the shape of the detected time-series optical signal. It is detected that the target particle has entered the light detection region.
  • fluorescence is emitted when the luminescent probes are close to each other. Between a state in which an energy donor part and an energy acceptor part that generate an energy transfer phenomenon are included, and the luminescent probe is bound to the particle and a state in which the luminescent probe is not bound to the particle In the state in which the distance between the energy donor site and the energy acceptor site is different, the luminescent probe is bound to the target particle, and the luminescent probe is present alone, from the luminescent probe. The emission characteristics of the emitted light are different.
  • the target particle is a nucleic acid molecule
  • the luminescent probe is One that specifically hybridizes with the target particle, and at least one of the fluorescent substance constituting the energy donor and the substance constituting the energy acceptor is bound to the target particle.
  • a strand nucleic acid molecule is
  • a method for detecting a target particle is a method for detecting particles that are dispersed in a sample solution and move randomly.
  • a ′ preparing a sample solution including a test sample and a luminescent probe that binds to the target particles;
  • B ′ binding the target particle and the luminescent probe in the sample solution prepared in the step (a ′);
  • C ′ counting the number of target particles bound to the luminescent probe present in the sample solution prepared in step (b ′);
  • Counting the number of target particles bound to the luminescent probe in step (c ′) is: Using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, moving the position of the light detection region of the optical system in the sample solution; While moving the position of the light detection region of the optical system in the
  • the scanning molecule counting method used in the above target particle detection method statistical processing for calculating fluctuations in fluorescence intensity is not executed. Therefore, even if the target particle to be analyzed is present in the sample only in a trace amount that cannot be detected by conventional optical analysis techniques such as FCS, by the above target particle detection method, The target particles in the sample can be detected. Further, in the target particle detection method described above, the concentration of the target particles in the sample solution is increased by the concentration process before the measurement by the scanning molecule counting method, so that the time is shorter than when the concentration process is not performed. The target particles can be detected with a measurement time of.
  • FIG. 5 is a model diagram when the observation target particle crosses the light detection region by moving the position of the light detection region in the sample solution at a speed faster than the diffusion movement speed of the observation target particle.
  • FIG. It is a figure showing the processing procedure for counting particles from the time change of photon count (light intensity) measured by the scanning molecule counting method in the form of a flowchart.
  • Example 1 it is the figure which showed the number of photons counted in each sample solution.
  • Example 1 it is the figure which showed the peak number counted in each sample solution.
  • Example 2 it is the figure which showed the peak number counted in each sample solution.
  • Example 3 it is the figure which showed the peak number counted in each sample solution for every density
  • Example 4 it is the figure which showed the peak number counted in each sample solution.
  • the scanning molecule counting method will be described.
  • particles that emit light that moves in a sample solution and moves randomly while traversing the sample solution by the minute region (hereinafter referred to as “luminescent particles”) cross the minute region.
  • the light emitted from the luminescent particles in the micro area is detected, and each luminescent particle in the sample solution is individually detected to count the luminescent particles and the concentration or number density of the luminescent particles in the sample solution.
  • a small amount of sample for example, about several tens of ⁇ L
  • the measurement time is short, and the characteristics such as the density or number density of the luminescent particles having a lower concentration or number density are quantitatively compared with those of optical analysis techniques such as FIDA. Can be detected.
  • the luminescent particles mean particles that emit light by fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, light scattering, and the like.
  • the particles in which the target particles and the luminescent probe are bonded are luminescent particles.
  • the “light detection region” of an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope is a minute region in which light is detected in those microscopes.
  • a region where the illumination light is collected corresponds to a minute region.
  • this minute region is determined by the positional relationship between the objective lens and the pinhole.
  • the light is sequentially detected while moving the position of the light detection region in the sample solution, that is, while scanning the sample solution with the light detection region. Then, when the moving light detection region includes a light emitting probe that is bound or associated with a randomly moving particle, light from the light emitting probe is detected. As a result, the presence of one particle is detected (in some experiments, the luminescent probe is once bound to the particle to be detected (target particle) and then dissociated from the particle to be detected when detecting light). There may be cases.) Then, the light signals from the luminescent probes are individually detected in the sequentially detected light, whereby the presence of particles (particles combined with the luminescent probe) is detected individually and sequentially one by one. Various information regarding the state in the solution is obtained.
  • the number of particles detected individually during the movement of the position of the light detection region may be counted (particle counting).
  • information relating to the number density or concentration of particles in the sample solution can be obtained by combining the number of particles and the amount of movement of the position of the light detection region.
  • the number density or concentration of the particles can be specifically set. Can be calculated.
  • the absolute number density value or concentration value is not directly determined, but the relative number density or concentration ratio with respect to a plurality of sample solutions or a standard sample solution serving as a reference for the concentration or number density is calculated. Also good.
  • the scanning molecule counting method is configured to move the position of the light detection region by changing the optical path of the optical system. Therefore, the movement of the light detection region is quick, and mechanical vibration and hydrodynamic action are not substantially generated in the sample solution. As a result, it is possible to measure light in a stable state where the particles to be detected are not affected by mechanical action. In addition, when vibration or flow acts on the sample solution, the physical properties of the particles may change. Since it is not necessary to provide a configuration for circulating the sample solution, measurement and analysis can be performed with a small amount (about 1 to several tens of ⁇ L) of the sample solution as in the case of FCS, FIDA, and the like.
  • the step of individually detecting the particles it is determined whether or not a light-emitting probe combined with one particle has entered the light detection region from sequentially detected light signals. It may be performed based on the shape.
  • one luminescent probe is bonded to one particle, a plurality of luminescent probes are bonded to one particle, and one luminescent probe depending on an experiment mode. It also includes the case of a luminescent probe dissociated from a particle after binding to the particle. In an embodiment, typically, when a light signal having an intensity greater than a predetermined threshold is detected, it may be detected that a luminescent probe bound to one particle has entered the light detection region.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is based on the characteristics of the luminescent probe bound to the particles or the number density or concentration in the sample solution. It may be changed as appropriate.
  • the manner of light detected from the luminescent probe bound to the particles can vary depending on its properties or number density or concentration in the sample solution. In particular, as the moving speed of the light detection region increases, the amount of light obtained from the luminescent probe bonded to one particle decreases. Therefore, it is preferable that the moving speed of the light detection region is appropriately changed so that light from the light emitting probe bonded to one particle is measured with high accuracy or sensitivity.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is preferably a light emitting probe (target particle of the present invention) bonded to the particle to be detected.
  • a light emitting probe target particle of the present invention
  • it is set higher than the diffusion movement speed (average movement speed of particles due to Brownian motion) of the luminescent probe in a state of being bound to the target particles.
  • the scanning molecule counting method when the light detection region passes through the position where the light emitting probe bonded to one particle is present, the light emitted from the light emitting probe is detected to emit light. Detect probes individually.
  • the moving speed of the light detection region is set to be higher than the diffusion moving speed of the luminescent probe coupled to the particles. Specifically, it is set to move at a speed faster than the diffusion movement speed of the luminescent probe in a state of being bound to the target particle.
  • the luminescent probe coupled to one particle can be made to correspond to one optical signal (an optical signal indicating the presence of particles). Since the diffusion movement speed varies depending on the luminescent probe bonded to the particle, as described above, the movement speed of the light detection region is appropriately changed according to the characteristics of the luminescent probe bonded to the particle (particularly the diffusion constant). It is preferable.
  • the optical path of the optical system for moving the position of the light detection region may be changed by any method.
  • the position of the light detection region may be changed by changing the optical path using a galvanometer mirror employed in a laser scanning optical microscope.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be set arbitrarily.
  • the movement locus of the position of the light detection region may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • the light detection mechanism itself is configured to detect light from a light detection region of a confocal microscope or a multiphoton microscope, as in the case of an optical analysis technique such as FIDA. Therefore, the amount of the sample solution may be very small as in the case of optical analysis technology such as FIDA.
  • the photoanalysis technique of the scanning molecule counting method can be applied to a sample solution in which the number density or concentration of particles is significantly lower than the level required by an optical analysis technique such as FIDA.
  • each particle dispersed or dissolved in the solution is individually detected. Therefore, using the information, it is possible to quantitatively count particles, calculate the concentration or number density of particles in the sample solution, or obtain information on the concentration or number density. That is, according to the scanning molecule counting method, particles passing through the light detection region and detected light signals are detected one by one so that the particles are detected one by one. Counting moving particles can be performed. Therefore, it is possible to determine the concentration or number density of particles in the sample solution with higher accuracy than before.
  • the luminescent probes bound to the target particles in the sample solution can be detected even if the concentration of the s is lower than the concentration that can be determined based on the fluorescence intensity measured by a fluorescence spectrophotometer or a plate reader.
  • the inside of the sample solution is uniform without giving mechanical vibration or hydrodynamic action to the sample solution. Or the sample solution is observed in a mechanically stable state. Therefore, for example, the reliability of the quantitative detection result is improved as compared with the case where a flow is generated in the sample. Further, measurement can be performed in a state in which no influence or artifact due to a mechanical action is given to the particles to be detected in the sample solution. In addition, when a flow is given to a sample, it is difficult to always give a uniform flow rate, and the configuration of the apparatus becomes complicated. In addition, the amount of sample required increases significantly, and the particles, luminescent probes or conjugates or other substances in the solution may be altered or denatured by hydrodynamic effects due to flow.
  • the scanning molecule counting method is performed by an optical analyzer configured by combining an optical system of a confocal microscope capable of executing FCS, FIDA, and the like with a photodetector.
  • the optical analyzer 1 includes optical systems 2 to 17 and a computer 18 for controlling the operation of each part of the optical system and acquiring and analyzing data.
  • the optical system of the optical analyzer 1 may have the same configuration as that of an ordinary confocal microscope.
  • Laser light (Ex) emitted from the light source 2 and propagating through the single mode fiber 3 is emitted as light that diverges at an angle determined by a specific NA at the output end of the fiber.
  • the laser light is converted into parallel light by the collimator 4, reflected by the dichroic mirror 5 and the reflection mirrors 6 and 7, and incident on the objective lens 8.
  • the laser light emitted from the objective lens 8 is focused in the sample solution in the sample container or well 10, and a region (excitation region) having a high light intensity is formed.
  • particles to be observed and luminescent probes that bind to such particles are dispersed or dissolved.
  • a luminescent label such as a fluorescent dye is added
  • the luminescent probe When particles bound or associated with the luminescent probe (in some experimental modes, the luminescent probe once bound to the particle and then dissociated from the particle) enter the excitation region, the luminescent probe is excited and light is emitted during that time.
  • the emitted light (Em) passes through the objective lens 8 and the dichroic mirror 5, is reflected by the mirror 11, is collected by the condenser lens 12, passes through the pinhole 13, and passes through the barrier filter 14. At this time, only light components in a specific wavelength band are selected.
  • the emitted light is introduced into the multimode fiber 15, reaches the photodetector 16, is converted into a time-series electrical signal, and then is input to the computer 18. And the process for optical analysis is performed in the aspect demonstrated later.
  • the pinhole 13 is arranged at a position conjugate with the focal position of the objective lens 8. For this reason, only the light emitted from the focal region of the laser light, that is, the excitation region schematically shown in FIG. 1B, passes through the pinhole 13, and the light from other than the excitation region is blocked.
  • 1B is a light detection region in the present optical analyzer having an effective volume of about 1 to 10 fL, and is referred to as a confocal volume (typically The light intensity is a Gaussian or Lorentzian distribution with the center of the region as the apex, and the effective volume is the volume of a substantially elliptical sphere with the surface where the light intensity is 1 / e 2 as the boundary.
  • a confocal volume typically The light intensity is a Gaussian or Lorentzian distribution with the center of the region as the apex, and the effective volume is the volume of a substantially elliptical sphere with the surface where the light intensity is 1 / e 2 as the boundary.
  • the photodetector 16 an ultrasensitive photodetector that can be used for photon counting is preferably used.
  • a stage position changing device 17a for moving the horizontal position of the microplate 9 may be provided on the stage of the microscope (not shown) in order to change the well 10 to be observed.
  • the operation of the stage position changing device 17a may be controlled by the computer 18.
  • a mechanism for changing the optical path of the optical system and scanning the sample solution with the light detection region that is, moving the position of the focal region (light detection region) in the sample solution.
  • a mechanism for doing this is provided.
  • a mechanism for moving the position of such a light detection region for example, as schematically illustrated in FIG. 1C, a mirror deflector 17 that changes the direction of the reflection mirror 7 may be employed.
  • Such a mirror deflector 17 may have the same configuration as that of a galvanometer mirror device provided in a normal laser scanning microscope. Further, in order to achieve a desired movement pattern of the position of the light detection region, the mirror deflector 17 is driven in cooperation with light detection by the light detector 16 under the control of the computer 18.
  • the movement locus of the position of the light detection region may be arbitrarily selected from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, a curve, or a combination thereof.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be selected from various movement patterns in a program in the computer 18.
  • the position of the light detection region may be moved in the vertical direction by moving the objective lens 8 up and down.
  • the above-described optical analyzer is not configured to move the sample solution, but includes a configuration that moves the position of the light detection region by changing the optical path of the optical system. Therefore, mechanical vibration and hydrodynamic action are not substantially generated in the sample solution, the influence of the dynamic action on the observation object can be eliminated, and stable measurement can be performed. .
  • the above optical system is used as a multiphoton microscope.
  • the pinhole 13 may be removed.
  • the conjugate of the particle and the luminescent probe or the luminescent probe emits light regardless of the excitation light due to chemiluminescence or bioluminescence phenomenon
  • the optical systems 2 to 5 for generating the excitation light may be omitted.
  • the optical system of the confocal microscope is used as it is.
  • a plurality of excitation light sources 2 are provided so that the wavelength of the excitation light can be appropriately selected according to the wavelength of the light that excites the combined particle or light emission probe or the light emission probe. May be configured.
  • a plurality of photodetectors 16 are provided and a sample includes a combination of a plurality of types of particles having different wavelengths and a luminescent probe or a luminescent probe, the light from these is separately detected depending on the wavelength. May be.
  • a spectroscopic analysis technique such as FIDA is superior to a conventional biochemical analysis technique in that it requires an extremely small amount of sample and can perform inspection quickly.
  • the concentration and characteristics of the observation target particles are calculated based on fluctuations in fluorescence intensity. Therefore, in order to obtain an accurate measurement result, the concentration or number density of the observation target particles in the sample solution is a level at which about one observation target particle is always present in the light detection region CV during the measurement of the fluorescence intensity. It is required that a significant light intensity (photon count) is always detected during the measurement time.
  • the concentration or number density of the observation target particles is lower than that, for example, if the observation target particles are at a level that only occasionally enters the light detection region CV, a significant light intensity (photon count) is measured. It appears only in a part of the time, and it is difficult to calculate the fluctuation of the light intensity with high accuracy. Also, if the concentration of the observation target particle is much lower than the level at which one observation target particle is always present in the light detection region during measurement, the light intensity fluctuation calculation is affected by the background. The measurement time is long in order to easily obtain significant light intensity data sufficient for calculation. In contrast, the scanning molecule counting method detects characteristics such as the number density or concentration of observation target particles even when the concentration of the observation target particles is lower than the level required by a spectroscopic analysis technique such as FIDA. Can do.
  • the optical path is changed by driving a mechanism (mirror deflector 17) for moving the position of the light detection region, which is schematically shown in FIGS. 2A and 2B.
  • a mechanism mirror deflector 17 for moving the position of the light detection region, which is schematically shown in FIGS. 2A and 2B.
  • FIG. 4 light detection is performed while moving the position of the light detection region CV in the sample solution, that is, while scanning the sample solution by the light detection region CV.
  • FIGS. 2A and 2B during the movement of the light detection region CV (time t0 to t2 in FIG. 2B), one particle (in FIG. 2A, the fluorescent dye is bound as a luminescent probe). 2), a significant light intensity (Em) is detected as depicted in FIG. 2B.
  • Em significant light intensity
  • the movement of the position of the light detection region CV and the light detection are performed, and the significant light intensity is detected one by one as illustrated in FIG. Bound particles are detected individually. Then, by counting the number, it is possible to acquire the number of particles existing in the measured region, or information on the concentration or number density.
  • particles are detected one by one without performing statistical calculation processing like calculation of fluctuation of fluorescence intensity. Therefore, information on the concentration or number density of particles can be obtained even in a sample solution having a low concentration of particles to be observed to such an extent that it cannot be analyzed with sufficient accuracy by FIDA or the like.
  • the concentration of fluorescently labeled particles is determined from the fluorescence intensity measured by a fluorescence spectrophotometer or a plate reader. It is possible to measure to a lower concentration than when measuring.
  • concentration of fluorescently labeled particles with a fluorescence spectrophotometer or plate reader, it is usually assumed that the fluorescence intensity is proportional to the concentration of fluorescently labeled particles.
  • the concentration of the fluorescently labeled particles when the concentration of the fluorescently labeled particles is sufficiently low, the amount of noise signal with respect to the amount of signal due to light emitted from the fluorescently labeled particles increases (deterioration of the S / N ratio). As a result, the proportional relationship between the concentration of the fluorescently labeled particles and the amount of optical signal is lost, and the accuracy of the determined concentration value deteriorates.
  • the scanning molecule counting method in the step of detecting a signal corresponding to each particle from the detected optical signal, the noise signal is excluded from the detection result, and only the signal corresponding to each particle is counted to obtain the concentration. Calculated. Therefore, it is possible to detect even lower concentrations than when detecting the concentration under the assumption that the fluorescence intensity is proportional to the concentration of the fluorescently labeled particles.
  • the fluorescence intensity is fluorescently labeled according to the method of individually detecting and counting the particles in the sample solution as in the scanning molecule counting method. Compared with the previous method of determining the concentration under the assumption that it is proportional to the particle concentration, the measurement accuracy of the particle concentration on the higher particle concentration side is also improved.
  • a certain amount of the luminescent probe is added to the sample solution, if the concentration of the observation target particle increases, the luminescence that binds to the particles relatively The number of probes is reduced.
  • the fluorescence intensity per observation target particle is reduced, the proportional relationship between the concentration of the fluorescently labeled particles and the light amount is lost, and the accuracy of the determined concentration value is deteriorated.
  • the scanning molecule counting method in the step of detecting a signal corresponding to each particle from the detected optical signal, the influence of the reduction of the fluorescence intensity per particle is small, and the concentration is calculated from the number of particles. It is possible to detect even higher concentrations than when detecting the concentration under the assumption that the fluorescence intensity is proportional to the concentration of the fluorescently labeled particles.
  • ⁇ Measurement of light intensity of sample solution by scanning molecule counting method The measurement of the light intensity in the optical analysis of the scanning molecule counting method is that the mirror deflector 17 is driven during the measurement to move the position of the light detection region in the sample solution (scanning in the sample solution). You may perform in the aspect similar to the measurement process of the light intensity in FCS or FIDA. In the operation process, typically, after injecting the sample solution into the well 10 of the microplate 9 and placing it on the stage of the microscope, the user inputs an instruction to start measurement to the computer 18.
  • the computer 18 detects the program stored in the storage device (not shown) (the procedure for changing the optical path to move the position of the light detection region in the sample solution, and the light detection during the movement of the position of the light detection region).
  • the program stored in the storage device not shown
  • the mirror deflector 17 drives the mirror 7 (galvanomirror) and the light detection region in the well 10. Perform position movement.
  • the photodetector 16 converts the sequentially detected light into an electrical signal and transmits it to the computer 18.
  • time-series light intensity data is generated from the transmitted optical signal and stored in an arbitrary manner.
  • the photodetector 16 is an ultrasensitive photodetector that can detect the arrival of one photon. Therefore, the detection of light is executed in a manner in which the number of photons arriving at the photodetector is measured every predetermined unit time (BINTIME), for example, every 10 ⁇ s, over a predetermined time. Photon counting is acceptable.
  • the time-series light intensity data may be time-series photon count data.
  • the moving speed of the position of the light detection region during the measurement of the light intensity may be an arbitrary speed, for example, a predetermined speed set experimentally or to suit the purpose of analysis.
  • a predetermined speed set experimentally or to suit the purpose of analysis.
  • the movement of the position of the light detection region is executed in a manner in which the movement distance is grasped.
  • the movement speed is basically a constant speed. preferable.
  • the moving speed is not limited to this.
  • the moving speed is the same as that of the observation target particle (more precisely, the conjugate of the particle and the luminescent probe or the luminescent probe that is decomposed and released after the binding with the particle, in this embodiment, the luminescent probe is bound. It is preferable to set a value faster than the random movement of the target particles), that is, the moving speed by the Brownian movement.
  • the observation target particle of the photoanalysis technique of the scanning molecule counting method is a particle that is dispersed or dissolved in a solution and moves freely at random, the position moves with time by Brownian motion. Therefore, when the moving speed of the position of the light detection region is slower than the movement due to the Brownian motion of the particle, the particle randomly moves in the region as schematically illustrated in FIG. 3A. Therefore, the light intensity changes randomly as illustrated in FIG. 3B (as already mentioned, the excitation light intensity of the light detection region decreases outward with the center of the region as the apex). As a result, it becomes difficult to specify a significant change in light intensity corresponding to each observation target particle.
  • the moving speed of the position of the light detection region is set faster than the average moving speed (diffusion moving speed) due to the Brownian motion of the particles.
  • the particles cross the light detection region in a substantially straight line. Therefore, in the time-series light intensity data, as illustrated in FIG. 4B, the light intensity change profile corresponding to each particle is substantially uniform (when the particles pass through the light detection region approximately linearly).
  • the light intensity change profile is substantially the same as the excitation light intensity distribution. As a result, the correspondence between each observation target particle and the light intensity can be easily specified.
  • an observation target particle having a diffusion coefficient D (more precisely, a conjugate of a particle and a luminescent probe, or a luminescent probe that is decomposed and released after binding to the particle) has a photodetection region having a radius Wo due to Brownian motion.
  • the moving speed of the position of the light detection region may be set to a value sufficiently faster than that with reference to the Vdif.
  • Wo is about 0.62 ⁇ m
  • Vdif is 1. 0 ⁇ 10 ⁇ 3 m / s. Therefore, the moving speed of the position of the light detection region may be set to 15 mm / s, which is approximately 10 times that.
  • the moving speed of the position of the light detection region is set variously, and the profile of the change in light intensity is expected (typically, excitation light Preliminary experiments for finding conditions that are substantially the same as the intensity distribution may be repeatedly performed to determine a suitable moving speed of the position of the light detection region.
  • the computer 18 performs processing according to the program stored in the storage device (light signals from the individual luminescent particles are individually detected from the detected light). Detection procedure) may be performed and the following light intensity analysis may be performed.
  • the predetermined range for the threshold value Io and the time width ⁇ for the light intensity is a combination of the observation target particle and the luminescent probe that moves relative to the light detection region at a predetermined speed (or is decomposed after the combination with the particle). It is determined based on the profile assumed as the intensity of light emitted from a free luminescent probe.
  • the specific value may be arbitrarily set experimentally, and selectively depending on the characteristics of the conjugate of the observation target particle and the luminescent probe (or the luminescent probe that has been decomposed and released after binding to the particle). May be determined.
  • Counting of observation target particles is performed by counting the number of particles detected by the above-described detection target particle detection method using an arbitrary method. However, when the number of particles is large, for example, the processing illustrated in FIGS. 5 and 6B may be performed.
  • time series optical signal data photon count data
  • smoothing smoothing
  • the light emitted from the combination of the particle and the luminescent probe or the light emitted from the luminescent probe is stochastically emitted, and data values may be lost in a minute time. Therefore, such a missing data value can be ignored by such smoothing processing.
  • the smoothing process may be performed by a moving average method, for example. It should be noted that the parameters for executing the smoothing process, such as the number of data points averaged at a time in the moving average method and the number of moving averages, are the moving speed (scanning speed) of the position of the light detection region at the time of optical signal data acquisition. , BIN TIME may be set as appropriate.
  • a first-order differential value for the time of the time-series optical signal data after the smoothing process is calculated.
  • the time differential value of the time-series optical signal data has a large change in the value at the time of change of the signal value as illustrated in the middle “lower time differential” in FIG. 6B. Refer to such a time differential value. By doing so, the start point and end point of a significant signal (peak signal) can be advantageously determined.
  • a significant signal is sequentially detected on the time-series optical signal data, and it is determined whether or not the detected peak signal is a signal corresponding to the observation target particle.
  • peak signal a significant signal
  • the start point and the end point of one peak signal are searched and determined, A peak presence region is identified (step 130).
  • a bell-shaped function fitting is performed on the smoothed time-series optical signal data in the peak existence region (lower “bell-shaped function fitting” in FIG. 6B).
  • Parameters such as the peak intensity Imax of the mold function, the peak width (full width at half maximum) w, and the correlation coefficient (of the least squares method) in the fitting are calculated (step 140).
  • the bell-shaped function to be fitted is typically a Gaussian function, but may be a Lorentz-type function.
  • the calculated bell-shaped function parameter is assumed as a bell-shaped profile parameter drawn by an optical signal detected when a combination of one particle and the light-emitting probe or the light-emitting probe passes through the light detection region. It is determined whether it is within the range, that is, whether the peak intensity, the peak width, and the correlation coefficient are each within a predetermined range (step 150).
  • the range that is, whether the peak intensity, the peak width, and the correlation coefficient are each within a predetermined range
  • the calculated bell-shaped function parameter is within the range assumed in the optical signal corresponding to the combination of one particle and the luminescent probe or the luminescent probe.
  • the determined signal is determined to be a signal corresponding to one observation target particle.
  • a peak signal where the calculated bell-shaped function parameter does not exist within the assumed range is ignored as noise.
  • the search and determination of the peak signal in the processing of the above steps 130 to 160 is repeatedly executed over the entire area of the time series optical signal data. Each time one observation target particle is detected, it is counted as a particle.
  • the particle count value obtained so far is set as the number of observation target particles detected in the time series optical signal data.
  • (Iii) Determination of the number density or concentration of the observation target particles
  • the observation target particles are obtained by using the total volume of the region through which the light detection region passes during acquisition of the time-series optical signal data. Number density or concentration is determined.
  • the effective volume of the light detection region varies depending on the wavelength of the excitation light or detection light, the numerical aperture of the lens, and the adjustment state of the optical system. Therefore, it is generally difficult to calculate the number density or concentration of the observation target particles from the design value. Accordingly, it is not easy to calculate the total volume of the region through which the light detection region passes.
  • the light intensity measurement, particle detection, and counting described above are performed on a solution (reference solution) with a known particle concentration under the same conditions as the measurement of the sample solution to be examined.
  • the total volume of the region through which the light detection region has passed that is, the relationship between the number of detected particles and the concentration, may be determined from the number of detected particles and the concentration of the reference solution particles.
  • the particles of the reference solution are preferably luminescent labels (fluorescent dyes or the like) having the same luminescent properties as the particles formed by the observation target particles and the luminescent probe conjugate (or the luminescent probe released after binding to the observation target particles). Good.
  • Vt N / C (5) Is obtained.
  • the volume of the light detection region and the total volume of the region through which the light detection region has passed may be obtained by any method, for example, using FCS or FIDA, without depending on the above method.
  • the optical analysis apparatus of the present embodiment has information about the relationship between the concentration C of various standard particles and the number N of particles (formula (5)) for the assumed movement pattern of the light detection region. It may be configured such that the information of the relationship stored in advance in 18 storage devices and appropriately stored when the user of the device performs optical analysis can be used.
  • the scanning molecule counting method is a measuring method capable of measuring luminescent particles for each particle in a situation where molecules are discrete. For this reason, it is possible to measure even light emitting particles having a concentration of pM order or less. For this reason, even if the concentration of the target particles to be analyzed in the sample solution is very low, the target particles bound to the luminescent probe can be counted with high sensitivity by the above-described target particle detection method.
  • the scanning molecule counting method detection is performed by capturing a signal from a luminescent particle in a confocal region (that is, a light detection region) to be scanned, and the luminescent particles to be detected are discretely distributed. Detection is performed in the existing solution. For this reason, it may take a long time to catch the luminescent particles in the light detection region. In particular, when detecting extremely dilute luminescent particles, it is necessary to continue the measurement until a sufficient signal is captured in the light detection region. When the measurement time is short, the frequency of acquiring a signal from the luminescent particle to be analyzed is insufficient, and it is difficult to accurately measure only the luminescent particle. In other words, the measurement time of the scanning molecule counting method depends on the concentration of the measurement target, and the measurement time becomes long when measuring a sample solution in which the luminescent particles are extremely dilute.
  • the above target particle detection method is a method for detecting target particles that are dispersed in a sample solution and move randomly.
  • the target particles in the sample solution are labeled by binding the target particles in the sample solution with the luminescent probe, and then counting the target particles bound to the luminescent probe by the scanning molecule counting method. Is detected, the concentration of the target particles in the sample solution is increased by the concentration process.
  • the concentration of the observation target particles in the sample solution is increased by the concentration process before the measurement by the scanning molecule counting method, so that the target particles can be detected in a shorter measurement time. it can.
  • the concentration treatment for increasing the concentration of the target particles in the measurement solution may be performed at any time point before the measurement by the scanning molecule measurement method. Specifically, the concentration treatment may be performed on the test sample before mixing with the luminescent probe to prepare the sample solution, or the concentration treatment may be performed on the sample solution after preparation.
  • the target particle detection method (hereinafter referred to as the first detection method) of the first aspect of the present invention is a method for detecting particles that are dispersed in a sample solution and move randomly, and includes: Steps (a) to (c) are included.
  • C A step of counting the number of target particles bound to the luminescent probe present in the sample solution prepared in the step (b). Further, the light emission characteristics of the emitted light are different between the state where the luminescent probe is bound to the target particle and the state where the luminescent probe is present alone.
  • particles dispersed in a sample solution and moving randomly are particles such as atoms, molecules, or aggregates thereof dispersed or dissolved in the sample solution (either light emitting particles or non-light emitting particles). It is a particle that is not fixed to a substrate or the like and is freely moving in brown in the solution.
  • the target particles are particles that are dispersed in the sample solution and move randomly, and are particles for quantifying the concentration in the sample solution.
  • target particles include biomolecules such as proteins, peptides, nucleic acids, nucleic acid analogs, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, particulate biological objects such as viruses and cells, or non-living objects. And the like (eg, atoms, molecules, micelles, metal colloids, etc.).
  • the nucleic acid may be DNA, RNA, or an artificially amplified substance such as cDNA.
  • Nucleic acid-like substances are labeled with a substance in which the side chain of a natural nucleotide (naturally occurring nucleotide) such as DNA or RNA is modified with a functional group such as an amino group, or a protein or a low molecular weight compound. Substances and the like. More specifically, for example, Bridged Nucleic Acid (BNA), nucleotides in which the 4′-position oxygen atom of natural nucleotides is substituted with sulfur atoms, and hydroxyl groups in the 2′-position of natural ribonucleotides are substituted with methoxy groups. Nucleotides, Hexitol Nucleic Acid (HNA), peptide nucleic acid (PNA) and the like.
  • BNA Bridged Nucleic Acid
  • HNA Hexitol Nucleic Acid
  • PNA peptide nucleic acid
  • the luminescent probe used in the present embodiment is a substance that specifically or non-specifically binds or adsorbs to a target particle, and is released in a state of being bound to the target particle and a state of being alone.
  • the materials have different light emission characteristics.
  • a substance obtained by binding a luminescent substance to a substance that specifically or non-specifically binds or adsorbs to the target particle may be used.
  • the luminescent substance is typically a fluorescent substance, but may be a substance that emits light by phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, light scattering, or the like.
  • the fluorescent substance is not particularly limited as long as it emits fluorescence by emitting light of a specific wavelength, and can be appropriately selected from fluorescent dyes used in FCS, FIDA, and the like. .
  • the luminescent probe binds a luminescent substance such as a fluorescent substance or a substance obtained by binding a luminescent substance such as a fluorescent substance to an oligonucleotide that hybridizes with the target particle.
  • a luminescent substance such as a fluorescent substance or a substance obtained by binding a luminescent substance such as a fluorescent substance to an oligonucleotide that hybridizes with the target particle.
  • the oligonucleotide may be DNA, RNA, or an artificially amplified substance such as cDNA, and a nucleotide chain or base pair as in a natural nucleobase.
  • the substance may include a part or all of the nucleic acid-like substance that can be formed.
  • the target particle is a protein
  • a substance obtained by labeling an antigen or antibody for the target particle, a ligand or receptor for the target particle with a luminescent substance such as a fluorescent substance can be used as the luminescent probe.
  • a luminescent substance such as a fluorescent substance
  • the binding of the luminescent substance to a substance that specifically or non-specifically binds or adsorbs to target particles such as nucleic acids and proteins can be performed by a conventional method.
  • the luminescent probe used in the present embodiment may be a substance that nonspecifically binds to the target particle. From the point of accuracy of detection / quantification of target particles, a substance that specifically binds is preferable. Note that the luminescent probe that specifically binds to the target particle may be any substance that binds preferentially to the target particle rather than to other substances that have similar physical or chemical properties to the target particle. It need not be a substance that does not bind to any substance other than particles.
  • the target particle is a nucleic acid
  • the oligonucleotide labeled with a luminescent substance used as a luminescent probe may have a base sequence that is completely complementary to the base sequence of the target particle. You may have a base sequence which has a mismatch with a base sequence.
  • the luminescent probe has different emission characteristics between the state in which the luminescent probe is bound to the target particle and the state in which the luminescent probe is present alone. It means that the intensity of light of a specific wavelength differs depending on the existing state. Scanning molecule counting method by varying the intensity of light of a specific wavelength (for example, varying the fluorescence intensity) between a state where a luminescent probe is present alone and a state where the luminescent probe is bound to a target particle The two can be distinguished and detected.
  • the target particle is a protein
  • a dye whose fluorescence intensity or fluorescence wavelength is changed by binding to the protein and changing the surrounding environment for example, a fluorescent dye such as a hydrophobic probe ANS, MANS, or TNS
  • the light emitting probe may not emit light itself.
  • the luminescent probe is an oligonucleotide that hybridizes with the target particle, and fluorescence 2 that specifically binds to the double-stranded structure together with the luminescent probe in the sample solution.
  • the luminescence characteristics can be made different between the state where the luminescent probe is present alone and the state where the luminescent probe is bound to the target particles.
  • the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance that specifically binds to the double-stranded structure include a fluorescent intercalator and a groove binder to which a fluorescent substance is bound.
  • a luminescent probe there is a substance composed of at least two components, and a substance that emits fluorescence by changing the position of the at least two components by binding to a target particle. It may be adopted. Examples of such substances are fluorescent proteins that change structure when bound to a certain particle and emit strong fluorescence, or aggregate when bound to a certain particle to form a fluorescent metal complex. Molecule (ligand of the complex). According to such a configuration, in any case, the light emitting probe alone or the light emitting probe that is not bound to the target particle emits little light or emits light, but has a wavelength different from the conjugate of the target particle and the light emitting probe. Therefore, it is possible to selectively detect light from the conjugate of the target particle and the luminescent probe.
  • the luminescence characteristics of the luminescent probe present alone in the sample solution and the luminescent probe bonded to the target particle can be made different. it can.
  • FRET fluorescence energy transfer phenomenon
  • fluorescence emitted from a fluorescent substance serving as an energy donor is not detected or attenuated from a luminescent probe that exists alone. Therefore, by detecting the fluorescence emitted from the fluorescent substance serving as an energy donor, the target particles bound to the luminescent probe can be detected separately from the luminescent probe existing alone.
  • an oligonucleotide that forms an intramolecular structure in the state of a single-stranded nucleic acid molecule a fluorescent substance that serves as an energy donor in FRET, and an energy acceptor Beacon probe in which FRET occurs in the state of a single-stranded nucleic acid molecule and so that FRET does not occur in the state of an aggregate formed by hybridizing with another single-stranded nucleic acid molecule can be preferably used as a luminescent probe.
  • a fluorescent substance serving as an energy donor or a substance serving as an energy acceptor is bound to the 3 ′ end side, one remaining on the 5 ′ end side is bound, and the 3 ′ end side
  • Substances having complementary base sequences on the region and the 5 ′ end side and forming an intramolecular structure (so-called stem-loop structure) by forming base pairs in these base sequences are preferred.
  • region which forms the intramolecular base pair of a molecular beacon probe should just exist so that the area
  • the region on the 3 ′ end side and the region on the 5 ′ end side may or may not include the 3 ′ end or the 5 ′ end, respectively.
  • the number of bases and the base sequence in the region forming the base pair are lower than the stability of the formed base pair compared to the stability of the aggregate with the target particle, and can form a base pair under measurement conditions. Any degree is acceptable.
  • a fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance that specifically binds to a double-stranded structure by using a fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance that specifically binds to a double-stranded structure, and causing FRET between the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance and a fluorescent substance labeled with a luminescent probe, It is possible to distinguish between a luminescent probe present alone and a luminescent probe bound to a target particle. That is, one of the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance and the fluorescent substance that labels the luminescent probe serves as a FRET energy donor, and the other serves as a FRET energy acceptor. Fluorescence emitted from the fluorescent substance that labels the luminescent probe is detected from the luminescent probe present alone.
  • the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance binds to the luminescent probe bound to the target particle, the fluorescence emitted by FRET is detected from the conjugate. As a result, it can be detected separately from the luminescent probe present alone.
  • the luminescent probe When the amount of the fluorescent intercalator that enters between the base pairs of the aggregate of the luminescent probe and the target particle is too large, the background when detecting the fluorescence emitted by FRET becomes too high, and the detection May affect accuracy. For this reason, it is preferable to design the luminescent probe so that the region forming the double strand in the aggregate of the luminescent probe and the target particle is 400 bp or less.
  • two types of light emitting probes may be used.
  • the target particle is a nucleic acid or nucleic acid analog
  • two luminescent probes are designed to hybridize adjacent to the target particle, with one luminescent probe serving as an energy donor in FRET.
  • the other luminescent probe is labeled with a substance that becomes an energy acceptor in FRET.
  • FRET does not occur in the luminescent probe that exists alone, but by binding to the target particle, the two types of luminescent probes are close to each other, and FRET occurs.
  • bonded with the luminescent probe are detectable by detecting the fluorescence discharge
  • test sample provided in the present embodiment is not particularly limited as long as it is a sample expected to contain target particles, and may be a biological sample or an artificially prepared sample.
  • target particle is a nucleic acid molecule
  • examples of the test sample include a solution in which cells, tissues, and bacteria are solubilized and the nucleic acid component is dispersed in the liquid, and a solution containing the nucleic acid component amplified by the PCR method. Is mentioned.
  • the test sample is concentrated so as to increase the concentration of the target particles in the test sample.
  • the concentration method is not particularly limited, and a known chemical / molecular biological technique used when concentrating, isolating or purifying the same kind of substance as the target particle can be appropriately used.
  • the concentration of the target particles may be increased by removing only the solvent in the test sample by evaporating or evaporating the solvent by heating, heating, reduced pressure, or the like, or by removing the solvent by ultrafiltration. .
  • a concentrated test sample can be prepared by dissolving or dispersing in a small volume of a suitable solvent.
  • the solvent for dissolving the isolated / purified target particles is not particularly limited, but is preferably a solvent that does not inhibit the detection of the luminescent probe bound to the target particles by the scanning molecule counting method.
  • the solvent include phosphate buffer such as water and PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4), Tris buffer, and the like.
  • the measurement solution contains various substances such as a substance having autofluorescence, it may cause troubles such as generation of non-specific signals and inhibition of the light path. Become. Therefore, in this embodiment, rather than simply removing the solvent and concentrating, only the target particles are isolated from the test sample, or the target particles are isolated together with the target particle and a substance having a physical or chemical property approximate. -It is preferable to concentrate by purification.
  • the target particle is a nucleic acid molecule
  • a method for selectively collecting nucleic acid molecules from a test sample is not particularly limited, and can be appropriately selected from known nucleic acid purification methods.
  • nucleic acid molecules may be selectively precipitated by ethanol precipitation, and the resulting precipitate may be dissolved in a suitable solvent such as water.
  • the nucleic acid molecules in the test sample may be adsorbed on the inorganic support by bringing the test sample into contact with the inorganic support, and then the adsorbed nucleic acid molecules may be eluted from the inorganic support.
  • the inorganic support a known inorganic support capable of adsorbing nucleic acid molecules can be used.
  • the shape of the inorganic support is not particularly limited, and may be in the form of particles or a film.
  • the inorganic support include silica-containing particles (beads) such as silica gel, siliceous oxide, glass, and diatomaceous earth, and porous membranes such as nylon, polycarbonate, polyacrylate, and nitrocellulose.
  • silica-containing particles such as silica gel, siliceous oxide, glass, and diatomaceous earth
  • porous membranes such as nylon, polycarbonate, polyacrylate, and nitrocellulose.
  • magnetic particles having a surface of a metal particle such as ferrite coated with a polymer such as polystyrene are used, the surface of the magnetic particle is chemically modified to adsorb nucleic acid molecules.
  • a solvent for eluting the adsorbed nucleic acid molecules from the inorganic support a solvent usually used for eluting nucleic acid molecules from these known inorganic supports can be appropriately used.
  • the elution solvent purified water is particularly preferable.
  • a test sample in which nucleic acid molecules are concentrated by removing molecules other than nucleic acid molecules such as proteins from the test sample.
  • nucleic acid molecules such as proteins
  • the protein can be removed from the test sample by precipitating the denatured protein by centrifugation and collecting only the supernatant.
  • a concentrated test sample can be prepared. When the volume of the collected supernatant is smaller than the volume of the test sample before adding the protein denaturant, this supernatant may be used as a concentrated test sample as it is.
  • chaotropic salts used as protein denaturants include guanidine hydrochloride, guanidine isothiocyanate, sodium iodide, sodium perchlorate, and sodium trichloroacetate.
  • the surfactant used as a protein denaturing agent may be a nonionic surfactant, an anionic surfactant, or a cationic surfactant.
  • the nonionic surfactant include Tween 80, CHAPS (3- [3-Colamidopropyldimethylammonio] -1-propanesulfonate), Triton X-100, Tween 20, and the like.
  • anionic surfactant examples include sodium alkyl sulfate represented by SDS, sodium cholate, N-lauryl sarcosine and the like.
  • examples of the cationic surfactant include alkyl quaternized ammonium typified by CDAB.
  • the organic solvent used as a protein denaturant is preferably phenol. Phenol may be neutral or acidic. When acidic phenol is used, RNA can be selectively extracted into the aqueous layer rather than DNA.
  • a test sample in which nucleic acid molecules are concentrated can be prepared by aggregating a protein using a protein removing agent in a test sample and then collecting a liquid component by solid-liquid separation treatment. Specifically, after adding a protein remover to the test sample, the protein is aggregated by stirring or standing, and then a centrifugation treatment is performed to collect the supernatant.
  • a protein removing agent for example, a substance having high affinity for proteins such as an ion exchange resin can be used.
  • the concentration in the step (a) can be performed by specifically collecting the target particles from the test sample.
  • the target particles can be specifically recovered from the test sample by using a general chemical / molecular biological technique such as gel filtration, ultrafiltration, HPLC, or electrophoresis.
  • a general chemical / molecular biological technique such as gel filtration, ultrafiltration, HPLC, or electrophoresis.
  • Target particles can be specifically recovered.
  • a concentrated test sample can be prepared by dissolving or dispersing the released target particles in a suitable solvent in a volume smaller than that of the original test sample.
  • Examples of the substance that specifically binds to the target particle include an oligonucleotide that hybridizes with the target particle when the target particle is a nucleic acid molecule.
  • examples of the substance that specifically binds to the target particle include a molecule having a relationship between the target particle and an antigen and an antibody, or a ligand and a receptor.
  • the concentration of the target particles in the concentrated test sample prepared in step (a) may be higher than the concentration of the target particles in the test sample before concentration.
  • a sample solution having a higher concentration of target particles can be prepared.
  • the time required for the measurement in the scanning molecule counting method depends on the concentration of the target particles in the sample solution subjected to the measurement. That is, with the first detection method, measurement can be performed in a shorter time than when the test sample is not concentrated in advance.
  • step (b) a sample solution containing the test sample concentrated in step (a) and a luminescent probe that binds to the target particles is prepared, and in the sample solution, the target particles and the target particles are prepared. Bind to the luminescent probe.
  • a luminescent probe is added to a concentrated test sample to prepare a sample solution.
  • an appropriate solvent may be further added.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not inhibit the detection of light emitted from the luminescent probe bound to the target particle by the scanning molecule counting method, and is a buffer commonly used in this technical field. Therefore, it can be appropriately selected and used.
  • the buffer include a phosphate buffer such as PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4), a tris buffer, and the like.
  • the concentration or number density of the target particles in the sample solution in the step (c) is not particularly limited. From the viewpoint of shortening the measurement time of the scanning molecule counting method, it is preferable that the concentration of the target particles in the sample solution is high. However, when the concentration is too high, there is a possibility that the measurement accuracy is reduced. For this reason, it is preferable to prepare the sample solution in the step (b) so that the number density of the target particles in the sample solution is 1 molecule or less per volume (V d ) of the light detection region.
  • the concentration X T of target particles in a sample solution (M) is, X T ⁇ N A ⁇ V d ⁇ 1 (N A is Avogadro's number) is preferably satisfied.
  • the concentration X T (M) of the target particles in the sample solution preferably satisfies 1 ⁇ 10 ⁇ 4 ⁇ X T ⁇ NA A ⁇ V d ⁇ 1. For example, if V d was 1 fL, it is preferred that the concentration X T of target particles in the sample solution at a concentration of pM order.
  • the target particles and the luminescent probe can coexist in the same solution and can be bound together, after preparing the sample solution, simply incubating the sample solution for a predetermined time if necessary.
  • the target particle and the luminescent probe can be bound in the solution.
  • the target particle or the luminescent probe is a double-stranded nucleic acid molecule or a nucleic acid-like substance
  • denaturing a nucleic acid molecule or nucleic acid-like substance means dissociating a base pair.
  • a base pair formed by mutually complementary base sequences in a molecular beacon probe is dissociated and the intramolecular structure is released to form a single-stranded structure, or a double-stranded nucleic acid molecule is converted to a single-stranded nucleic acid molecule. It means to do.
  • the luminescent probe is an oligonucleotide containing a nucleic acid-like substance such as PNA, even if the target particle is a double-stranded nucleic acid molecule, the luminescent probe consists of the luminescent probe and the target particle without any special denaturation treatment. In some cases, aggregates can be formed.
  • the denaturation treatment examples include denaturation by high temperature treatment (thermal denaturation) and denaturation by low salt concentration treatment.
  • thermal denaturation high temperature treatment
  • low salt concentration treatment it is preferable to perform heat denaturation because the influence on a luminescent substance such as a fluorescent substance is relatively small and the operation is simple.
  • nucleic acid molecules and the like in the sample solution are denatured by subjecting the sample solution to high temperature treatment.
  • it can be denatured by keeping it at 90 ° C. for DNA and 70 ° C. for RNA for several seconds to 2 minutes, but the denaturation temperature differs depending on the length of the base of the target particle, etc. If possible, this temperature is not limited.
  • denaturation by low salt concentration treatment can be performed by adjusting the sample solution to have a sufficiently low salt concentration, for example, by diluting with purified water.
  • the target particles in the sample solution are associated with the luminescent probe.
  • the temperature of the sample solution is lowered to a temperature at which the target particles and the luminescent probe can specifically hybridize, thereby reducing the target particles and the luminescent probe in the sample solution. Meetings can be made as appropriate.
  • the salt concentration of the sample solution is increased to a concentration at which the target particle and the luminescent probe can specifically hybridize by adding a salt solution or the like.
  • the target particles in the sample solution can be associated with the luminescent probe as appropriate.
  • the temperature at which two single-stranded nucleic acid molecules can specifically hybridize can be determined from the melting curve of the aggregate consisting of the target particle and the luminescent probe.
  • the melting curve can be obtained, for example, by changing the temperature of a solution containing only the target particles and the luminescent probe from a high temperature to a low temperature and measuring the absorbance and fluorescence intensity of the solution. From the obtained melting curve, the temperature ranges from the temperature at which the two denatured single-stranded nucleic acid molecules started to form an aggregate to the temperature at which almost all became an aggregate. It can be set as the temperature which can be soybean.
  • the salt concentration in the solution from a low concentration to a high concentration instead of temperature, the melting curve is determined in the same manner, and the concentration at which two single-stranded nucleic acid molecules can specifically hybridize is determined. be able to.
  • the temperature at which two single-stranded nucleic acid molecules can specifically hybridize can generally be substituted with a Tm value (melting temperature).
  • Tm value melting temperature
  • the Tm value of the region that hybridizes with the target particle 50% of double-stranded DNA is dissociated into single-stranded DNA
  • Temperature can be calculated.
  • the temperature of the sample solution when forming an aggregate.
  • the liquid temperature of the sample solution can be lowered at a rate of temperature decrease of 0.05 ° C./second or higher.
  • a surfactant such as a surfactant, formamide, dimethyl sulfoxide, urea or the like to the sample solution in advance.
  • These compounds may be added alone or in combination of two or more. By adding these compounds, nonspecific hybridization can be prevented in a relatively low temperature environment.
  • step (c) the number of target particles bound to the luminescent probe in the prepared sample solution is counted by a scanning molecule counting method. Specifically, the sample solution after the target particles are bound to the luminescent probe is placed in the optical analyzer for the scanning molecule counting method. Then, the number of target particles bound to the luminescent probe is counted by detecting and analyzing light emitted from the luminescent probe in a state bound to the target particle by the above-described method. The counted number of target particles is the number of target particles contained in the measurement sample.
  • the concentration of the target particles in the sample solution is prepared by performing a concentration process on the sample solution after preparing the sample solution including the test sample and the luminescent probe.
  • the target particle detection method of the second aspect of the present invention (hereinafter referred to as the second detection method) is a method for detecting particles that are dispersed in a sample solution and randomly move. Steps (a ′) to (c ′) are included.
  • the concentration treatment is performed so as to increase the concentration of the target particles in the sample solution.
  • a ′ preparing a sample solution including a test sample and a luminescent probe that binds to the target particles;
  • B ′ binding the target particle and the luminescent probe in the sample solution prepared in the step (a ′);
  • C ′ A step of counting the number of target particles bound to the luminescent probe present in the sample solution prepared in the step (b ′).
  • Steps (a ′) and (b ′) can be performed in the same manner as in step (b).
  • the step (c ′) can be performed in the same manner as the step (c).
  • the concentration treatment performed after the step (a ′) is not particularly limited as long as it is a treatment that does not inhibit the binding between the target particle and the luminescent probe performed in the subsequent step (b ′), and concentrates the same kind of substance as the target particle. It can be used by appropriately selecting from known chemical and molecular biological techniques used for isolation or purification.
  • the concentration treatment performed after the step (b ′) is not particularly limited as long as it is a treatment that can be concentrated without damaging or reducing the conjugate of the target particle and the luminescent probe formed in the step (b ′). It can be appropriately selected from known chemical and molecular biological techniques used when concentrating, isolating or purifying the same kind of particles as the particles.
  • the target particle and the luminescent probe are isolated or purified from the test sample alone, or isolated and purified together with a substance having a physical or chemical property similar to that of the target particle and the luminescent probe, and then isolated.
  • a concentrated sample solution can be prepared by dissolving or dispersing in an appropriate solvent in a volume smaller than the volume of the sample solution before purification.
  • the concentration treatment performed after the step (a ′) or after the step (b ′) is performed in the step (a). It can be performed in the same manner as the concentration treatment exemplified in some cases.
  • the concentration or number density of the target particles in the sample solution in the step (c ′) is not particularly limited. Similar to the step (c) in the first detection method, the concentration of the target particles in the sample solution is preferably high from the viewpoint of shortening the measurement time of the scanning molecule counting method. However, when the concentration is too high, there is a possibility that the measurement accuracy is reduced. Therefore, it is preferable to concentrate the sample solution so that the number density of target particles in the sample solution is 1 molecule or less per volume (V d ) of the light detection region.
  • the concentration X T of target particles in a sample solution (M) is, X T ⁇ N A ⁇ V d ⁇ 1 (N A is Avogadro's number) is preferably satisfied.
  • Example 1 The target particles to be counted were compared between the case where the target particles in the test sample were directly detected by the scanning molecule counting method and the case where the target particles in the test sample were detected by the scanning molecule counting method after being concentrated.
  • a fluorescently labeled double-stranded nucleic acid molecule (800 bp) in which a nucleic acid molecule was used as a luminescent probe and a target particle and a luminescent probe were hybridized was used as a target particle bound to the luminescent probe.
  • a 1 nM solution of fluorescently labeled double-stranded nucleic acid molecules was prepared as a test sample. 200 ⁇ L each of the fluorescently labeled double-stranded nucleic acid molecule solution was dispensed into two 1.5 mL tubes. After adding 20 ⁇ L of 3M sodium acetate solution to each tube and stirring, 500 ⁇ L of 99.5% ethanol was added and stirred, and then allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Thereafter, each tube was centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant was removed.
  • TE buffer was counted as a sample solution.
  • a single molecule fluorescence measurement device MF20 (Olympus Corporation) equipped with an optical system of a confocal fluorescence microscope and a photon counting system was used as an optical analysis device. Then, time-series photon count data was obtained for each sample solution.
  • the excitation light was irradiated with a laser beam of 633 nm at a rotation speed of 6,000 rpm and 300 ⁇ W, and the detection light wavelength was set to 660 to 710 nm using a bandpass filter.
  • the signal obtained from the avalanche photodiode was BIN TIME of 10 ⁇ s, and the measurement time was 2 seconds or 20 seconds.
  • the time series data obtained by the measurement was smoothed by the Savinzky-Golay algorithm, and then the peak was detected by differentiation. Of the regions regarded as peaks, a region that can be approximated to a Gaussian function was extracted as a signal.
  • FIGS. 8A and 8B and Table 1 The counting results are shown in FIGS. 8A and 8B and Table 1.
  • FIG. 8A shows the measurement result of the number of photons.
  • FIG. 8B shows the measurement result of the number of peaks.
  • “Buffer” indicates the result of counting only the TE buffer as a control as a sample solution.
  • Example 2 When the fluorescently labeled double-stranded nucleic acid molecule used in Example 1 is used as a target particle combined with a luminescent probe, the target particle in the test sample is detected as it is by the scanning molecule counting method, and after concentration, the scanning molecule counting method The target particles to be counted were compared with those detected by.
  • 5 mL of a 200 fM fluorescently labeled double-stranded nucleic acid solution was prepared using TE buffer. Of this, 60 ⁇ L was directly used as a sample solution for measurement by the scanning molecule counting method (no concentration). The remaining volume (4940 ⁇ L) was used for Wizard SV Gel and PCR.
  • concentration factor is about 82.3 (4940 ⁇ L / 60 ⁇ L).
  • the number of fluorescently labeled double-stranded nucleic acid molecules in each sample solution was counted by a scanning molecule counting method. Moreover, the measurement was performed 5 times for each sample, and the average and standard deviation were calculated.
  • Example 3 When the fluorescently labeled double-stranded nucleic acid molecule used in Example 1 is used as a target particle combined with a luminescent probe, the target particle in the test sample is detected as it is by the scanning molecule counting method, and after concentration, the scanning molecule counting method The target particles to be counted were compared with those detected by. First, using a STEP buffer containing plasma (horse plasma), 5 mL each of 100 fM, 1 pM, and 10 pM fluorescently labeled double-stranded nucleic acid molecule solutions were prepared in three tubes. Of these, 60 ⁇ L in one tube was used as it was as a sample solution for measurement by the scanning molecule counting method (without purification).
  • the total amount in one of the remaining two tubes was purified using Genomic-tip 20 / G (manufactured by QIAGEN), and a solution eluted with 5 mL of TE buffer was used as a sample for measurement by scanning molecular counting. A solution (purified but not concentrated) was obtained. The entire amount in the remaining one tube was purified using Genomic-tip 20 / G (manufactured by QIAGEN), and a solution eluted with 500 ⁇ L of TE buffer was used as a sample solution for measurement by scanning molecular counting (with purification, With concentration).
  • Example 2 the number of fluorescently labeled double-stranded nucleic acid molecules in each sample solution was counted by a scanning molecule counting method. The measurement was performed 5 times for each sample, and the average and standard deviation were calculated.
  • the result of measuring the sample solution (with purification, without concentration) for 20 seconds is clearly detected than the result of measuring the sample solution (with purification, without concentration) for 2 seconds.
  • the results of measuring the sample solution (with purification and concentration) for 2 seconds detected more peaks than the results of measuring the sample solution (with purification and no concentration) for 20 seconds at all concentrations.
  • the number of detected peaks increased in a concentration-dependent manner. That is, by purifying and concentrating the test sample in advance before the measurement, a sufficient number of peaks could be obtained in a short time, and the measurement time could be shortened.
  • Example 4 Using a target particle bound to a single-stranded nucleic acid molecule and two probes, when detected by the scanning molecule counting method without changing the concentration of the target particle in the test sample, and after detection by the scanning molecule counting method In some cases, the target particles counted were compared.
  • a nucleic acid molecule (probe 1) or a single-stranded nucleic acid molecule (probe 2) having biotin bound to the 3 ′ end was used as a luminescent probe.
  • fluorescently labeled double-stranded nucleic acid molecules in which target particles and luminescent probes were hybridized were used as target particles bound to luminescent probes. These oligonucleotides were synthesized at the request of Sigma Genosys. Table 4 shows the base sequences of the single-stranded nucleic acid molecule and the luminescent probe.
  • the single-stranded nucleic acid molecule is 1 fM
  • the probe 1 is 20 pM
  • the probe 2 is 200 pM
  • Poly (deoxyinosine-deoxycyticlic) A sample solution (300 ⁇ L) was prepared so that acid (Sigma-Aldrich) was 0.1 U / mL (1 U is an amount such that the absorbance at 260 nm is 1.0 in water (optical path length is 1 cm)). Samples not containing single-stranded nucleic acid molecules were also prepared. The sample solutions were heated at 95 ° C.
  • the excitation light was irradiated with excitation light at a rotational speed of 9,000 rpm and 1 mW.
  • the measurement time was two conditions of 60 seconds and 600 seconds.
  • the measurement was performed 5 times for each sample, and the average and standard deviation were calculated.
  • the results of counting the number of peaks are shown in FIG. As a result, when a sample solution without concentration was measured for 60 seconds, a sufficient number of peaks was not detected. However, a sufficient number of peaks were detected when measured for 600 seconds. On the other hand, in the concentrated sample solution, a sufficient number of peaks equivalent to the case where the sample solution without concentration was measured for 600 seconds were detected by the measurement for 60 seconds. Further, the number of peaks obtained as a result of measuring the sample solution without concentration for 60 seconds was compared with the number of peaks obtained as a result of measuring the sample solution with concentration for 60 seconds.
  • the concentration of the target particles that exist only in a very low concentration in the sample solution can be measured in a short time by the scanning molecule counting method.
  • it can be used in the field of analysis / inspection of a sample having a very small concentration of a substance to be analyzed.
  • Optical analyzer confocal microscope
  • Light source 3 Single mode optical fiber
  • Collimator lens 5 Dichroic mirror 6, 7, 11 Reflection mirror 8
  • Objective lens 9
  • Microplate 10 Well (sample solution container)
  • DESCRIPTION OF SYMBOLS 12
  • Condenser lens 13
  • Pinhole 14
  • Barrier filter 15
  • Multimode optical fiber 16
  • Photo detector 17 Mirror deflector 17a
  • Stage position change apparatus 18 Computer

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　（ａ）被検試料を、前記被検試料中の標的粒子の濃度を高めるように、濃縮する工程と、（ｂ）濃縮された被検試料と、前記標的粒子に結合する発光プローブとを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを結合させる工程と、（ｃ）前記試料溶液中に存在する、発光プローブと結合した標的粒子の数を、走査分子計数法により計数する工程と、を有し、前記発光プローブが前記標的粒子に結合した状態と、前記発光プローブが単独で存在している状態と、で放出される光の発光特性が異なる標的粒子の検出方法。

Description

標的粒子の検出方法
　本発明は、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を検出する方法に関する。
　本願は、２０１１年６月２７日に、日本に出願された特願２０１１－１４２０３３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年の光の計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）を行うことができる超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定を行うことができる。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の分子間の相互作用又は分子間の結合・解離反応の検出を行う種々の装置又は方法が提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１、２、非特許文献１～３参照）では、レーザ共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザ光が集光された焦点領域であって、コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が行われる。そして、測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される、微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報が取得され、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象が検出される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献３)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon Counting Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献４）では、ＦＣＳと同様に、計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定される。そして、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定される。更に、特許文献５、６では、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献７では、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光を、フォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術が提案されている。
　特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度かつ微量でよい（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）。また、測定時間は大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとして利用されることが期待されている。
　一方で、解析対象が核酸分子の場合、標的対象である核酸分子を検出する前に、試料溶液中の核酸濃度を高める技術が知られている。例えば、試料溶液から溶媒を蒸発させて濃縮した後に、この試料溶液から目的の核酸分子を測定する方法が知られている（例えば、特許文献８参照。）。また、目的の成分を分離・濃縮する回転機構と、この特定の成分の濃度を測定するために蛍光発光検出を行う検出機構と、を有する化学分析装置を用いて、前記試料溶液中の核酸濃度を測定する方法が知られている（例えば、特許文献９参照。）。試料溶液を濃縮する方法以外にも、試料溶液から核酸分子を単離・精製することにより、核酸濃度を高めることができる。この方法としては、例えば、試料にアニオン性洗剤とカオトロピック塩を添加して核酸分子を沈殿させることにより、核酸分子が濃縮された沈殿物を回収する方法が知られている（例えば、特許文献１０参照。）。また、核酸分子を固定化する膜や陰イオン交換マトリクスを用いて、試料中の核酸分子を捕らえた後、この膜又はマトリクスから核酸分子をリリースする方法が知られている（例えば、特許文献１１又は１２参照。）。
特開２００５－０９８８７６号公報 特開２００８－２９２３７１号公報 日本国特許第４０２３５２３号公報 国際公開２００８－０８０４１７号公報 特開２００７－２０５６５号公報 特開２００８－１１６４４０号公報 特開平４－３３７４４６号公報 特開２００８－００００４５号公報 特開２００３－３４４２８８号公報 特表２００６－５２６５９１号公報 特表２００２－５２８０９３号公報 特表２００９－５１８０２０号公報
金城政孝、蛋白質 核酸 酵素、１９９９年、第４４巻、第９号、第１４３１～１４３８ページ。 メイヤー－アルムス（Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence Correlation Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、第２０４～２２４ページ。 加藤則子、他４名、遺伝子医学、２００２年、第６巻、第２号、第２７１～２７７ページ。
　上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術では、概して述べれば、計測された蛍光強度の時間的なゆらぎの大きさが統計的処理により算出され、そのゆらぎの大きさに基づいて試料溶液中の微小領域内に出入りする蛍光分子等の種々の特性が決定される。従って、上記の光分析技術に於いて有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象である蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、秒オーダーの長さの一回の計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するように、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているように調製されていることが好ましい（典型的には、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度であるので、蛍光分子等の濃度は、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であることが好ましい。）。換言すれば、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が統計的処理の可能な程度よりも大幅に下回るとき（例えば、１ｎＭを大幅に下回るとき）には、観測対象物が微小領域内に計測時間のうちに稀にしか進入しない状態が発生する。すると、蛍光強度の計測結果に於いて、観測対象物が微小領域内に全く存在していない状態が長期間に亘って含まれると共に、有意な蛍光強度の観測量が少なくなる。その結果、上記のような蛍光強度の統計的なゆらぎに基づく光分析技術では、有意な又は精度の良い分析結果を得ることが難しい。
　特許文献５、６に記載された、共焦点顕微鏡の光学系を用いた蛍光性物質の検出方法では、上記のような蛍光強度のゆらぎに関する統計的処理を行うことなく、数秒間に亘る計測時間に於ける有意な強度の蛍光信号の発生の有無により、試料中に於ける観測対象である蛍光分子等の有無が特定でき、有意な強度の蛍光信号の頻度と試料中の蛍光分子等の粒子数とに相関が得られることが開示されている。特に、特許文献６では、試料溶液中を攪拌するランダムな流れを発生させると、検出感度が向上することが示唆されている。しかしながら、これらの方法に於いても、拡散により又はランダムな流れにより確率的に微小領域内に進入する蛍光分子等の存在を検出することに留まっている。すなわち、微小領域内の蛍光分子等の粒子の振る舞いを把握することができず、例えば、粒子のカウンティングや粒子の濃度又は数密度を定量的に算出する技術は開示されていない。また、特許文献７に記載された技術は、フローサイトメータに於けるフロー中の蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子の存在を個別に検出する技術であり、試料溶液中に通常の状態にて溶解又は分散している分子やコロイドなどの粒子、即ち、試料溶液中にてランダムに運動している粒子の検出を行うための技術ではない。すなわち、試料溶液中に溶解又は分散した粒子の濃度又は数密度を定量的に算出する技術は開示されていない。また、特許文献７の技術は、フローサイトメータに於ける計測或いは基板上への蛍光粒子の固定化処理といった過程を含む。そのため、検査に必要な試料量は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術の場合に比して大幅に多くなるとともに、実施者に於いて複雑で高度な操作技術が要求される。
　かくして、本発明は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術にて実行されているような、統計的処理を含まず、観測対象粒子の濃度又は数密度が上記の光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することが可能な新規な光分析技術により、試料溶液中にて分散しランダムに運動する標的粒子を、より短時間の測定時間で検出する方法を提供することを目的とする。
　ここで、試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を、この粒子と結合した発光プローブから放出される光を指標として間接的に検出する場合において、発光プローブと結合した粒子の検出を、走査分子計数法を用いて行うことにより、試料溶液中の観測対象の粒子の濃度が、ＦＣＳ等の従来の光分析技術により検出される場合よりも低い場合であっても、感度よく発光プローブと結合した粒子を検出することができることが見出された。さらには、走査分子計数法による測定の前に、予め試料溶液中の観測対象粒子の濃度を高めておくことにより、より短時間の測定時間で標的粒子を検出し得ることが見出された。
　ここで、走査分子計数法は、特願２０１０－０４４７１４に於いて提案されている新規な光分析技術である。
　本発明の第一の態様によれば、標的粒子の検出方法は、　試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を検出する方法であって、
（ａ）被検試料を、前記被検試料中の標的粒子の濃度を高めるように、濃縮する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において濃縮された被検試料と、前記標的粒子に結合する発光プローブとを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを結合させる工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）において調製された試料溶液中に存在する、発光プローブと結合した標的粒子の数を計数する工程と、
を有し、
　前記発光プローブが前記標的粒子に結合した状態と、前記発光プローブが単独で存在している状態と、で放出される光の発光特性が異なり、
　前記工程（ｃ）における発光プローブと結合した標的粒子の数の計数は、
　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
　前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域中の前記標的粒子と結合した状態の前記発光プローブから放出される光信号を検出して、発光プローブと結合した標的粒子を個別に検出する工程と、
　前記個別に検出された発光プローブと結合した標的粒子の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記標的粒子の数を計数する工程と、
　により行われる。
本発明の第二の態様によれば、本発明の第一の態様に係る標的粒子の検出方法において、前記工程（ｃ）における試料溶液中の標的粒子の数密度が、前記光検出領域の体積（Ｖｄ）当たり１分子以下である。
　本発明の第三の態様によれば、本発明の第一の態様又は第二の態様のいずれかの態様に係る標的粒子の検出方法において、前記標的粒子が核酸分子であり、前記工程（ａ）が、前記被検試料から核酸分子を精製し、濃縮する工程である。
　本発明の第四の態様によれば、本発明の第一の態様又は第二の態様のいずれかの態様に係る標的粒子の検出方法において、前記工程（ａ）が、前記被検試料から、標的粒子を特異的に回収し、濃縮する工程である。
　本発明の第五の態様によれば、本発明の第一の態様から第四の態様のいずれかの態様に係る標的粒子の検出方法において、前記光検出領域の位置を移動する工程に於いて、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動される。
　本発明の第六の態様によれば、本発明の第一の態様から第五の態様のいずれかの態様に係る標的粒子の検出方法において、前記光検出領域の位置を移動する工程に於いて、前記光検出領域の位置が、前記発光プローブと結合した標的粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動される。
　本発明の第七の態様によれば、本発明の第一の態様から第六の態様のいずれかの態様に係る標的粒子の検出方法において、前記検出された光から個々の発光プローブと結合した標的粒子からの光信号を検出して、前記発光プローブと結合した標的粒子を個別に検出する工程に於いて、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、１つの発光プローブと結合した標的粒子が前記光検出領域に入ったことが検出される。
　本発明の第八の態様によれば、本発明の第一の態様から第七の態様のいずれかの態様に係る標的粒子の検出方法において、前記発光プローブが、互いに近接しているときに蛍光エネルギー移動現象を発生するエネルギー・ドナー部位とエネルギー・アクセプター部位とを有し、且つ、前記発光プローブが前記粒子に結合した状態と、前記発光プローブが前記粒子に結合していない状態と、の間で前記エネルギー・ドナー部位と前記エネルギー・アクセプター部位との距離が異なり、前記発光プローブが前記標的粒子に結合した状態と、前記発光プローブが単独で存在している状態と、で、前記発光プローブから放出される光の発光特性が異なる。
　本発明の第九の態様によれば、本発明の第一の態様から第八の態様のいずれかの態様に係る標的粒子の検出方法において、前記標的粒子が核酸分子であり、前記発光プローブが、前記標的粒子と特異的にハイブリダイズし、且つ、前記標的粒子が、蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・ドナーを構成する蛍光物質及びエネルギー・アクセプターを構成する物質の少なくとも一つが結合している１本鎖核酸分子である。
　本発明の第十の態様によれば、標的粒子の検出方法は、　試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を検出する方法であって、
（ａ’）被検試料と標的粒子に結合する発光プローブとを含む試料溶液を調製する工程と、
（ｂ’）前記工程（ａ’）において調製された試料溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを結合させる工程と、
（ｃ’）前記工程（ｂ’）において調製された試料溶液中に存在する、発光プローブと結合した標的粒子の数を計数する工程と、
を有し、
　前記発光プローブが、前記標的粒子に結合した状態と、単独で存在している状態とで放出される光の発光特性が異なり、
　前記工程（ｃ’）における発光プローブと結合した標的粒子の数の計数は、
　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
　前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域中の前記標的粒子と結合した状態の前記発光プローブから放出される光信号を検出して、発光プローブと結合した標的粒子を個別に検出する工程と、
　前記個別に検出された発光プローブと結合した標的粒子の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記標的粒子の数を計数する工程と、により行われ、
　前記工程（ａ’）の後又は前記工程（ｂ’）の後に、前記試料溶液中の標的粒子の濃度を高めるように、濃縮処理が行われる。
　上記の標的粒子の検出方法において用いられる走査分子計数法では、蛍光強度のゆらぎを算出するような統計的処理が実行されない。そのため、上記の標的粒子の検出方法により、解析対象である標的粒子が、ＦＣＳ等の従来の光分析技術によっては検出不可能なほど微量にしか試料中に存在していない場合であっても、試料中の前記標的粒子を検出することができる。さらに、上記の標的粒子の検出方法では、走査分子計数法による測定の前に、濃縮処理により試料溶液中の標的粒子の濃度が高められるため、濃縮処理が行われない場合よりも、より短時間の測定時間で標的粒子を検出することができる。
走査分子計数法のための光分析装置の内部構造の模式図である。 コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。 ミラー７の向きを変更して試料溶液内において光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 走査分子計数法のための光分析技術による光検出の原理を説明する模式図である。 走査分子計数法のための光分析技術により計測される光強度の時間変化の模式図である。 観測対象粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合のモデル図である。 観測対象粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合のフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 試料溶液内の光検出領域の位置を観測対象粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動させることにより観測対象粒子が光検出領域を横切る場合のモデル図である。 試料溶液内の光検出領域の位置を観測対象粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動させることにより観測対象粒子が光検出領域を横切る場合のフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順をフローチャートの形式で表した図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順における検出信号の信号処理工程の例を説明する図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順における検出信号の信号処理工程の例を説明する図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、ピーク存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）と、を示している（図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号として無視される。）。 実施例１において、各試料溶液において計数されたフォトン数を示した図である。 実施例１において、各試料溶液において計数されたピーク数を示した図である。 実施例２において、各試料溶液において計数されたピーク数を示した図である。 実施例３において、各試料溶液において計数されたピーク数を、蛍光標識核酸分子の濃度ごとに示した図である。 実施例４において、各試料溶液において計数されたピーク数を示した図である。
　まず、走査分子計数法について説明する。走査分子計数法は、微小領域により試料溶液内を走査しながら、試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）が微小領域内を横切るときに、微小領域中の発光粒子から発せられる光を検出し、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報を取得する技術である。走査分子計数法では、ＦＩＤＡ等のような光分析技術と同様に、測定に必要な試料が微量（例えば、数十μＬ程度）でもよい。また、走査分子計数法では、測定時間が短く、しかも、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子について、その濃度又は数密度等の特性を定量的に検出することができる。
　なお、発光粒子は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子を意味する。本発明の標的粒子の定量方法においては、標的粒子と発光プローブとが結合した粒子が、発光粒子である。
　本発明及び本願明細書において、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡において光が検出される微小領域である。対物レンズから照明光が照射される場合には、その照明光が集光された領域が微小領域に相当する。なお、この微小領域は、共焦点顕微鏡においては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。
　試料溶液内において光検出領域の位置を移動させながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している粒子に結合又は会合した発光プローブを包含したときには、発光プローブからの光が検出される。その結果、一つの粒子の存在が検出される（実験の態様によっては、発光プローブは、一旦、検出したい粒子（標的粒子）と結合した後、光の検出時には、検出したい粒子から解離している場合もあり得る。）。そして、逐次的に検出された光において発光プローブからの光信号が個別に検出されて、これにより、粒子（発光プローブと結合した粒子）の存在が一つずつ個別に逐次的に検出され、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得される。具体的には、例えば、上記の構成において、個別に検出された粒子を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された粒子の数が計数されてもよい（粒子のカウンティング）。上記構成によれば、粒子の数と光検出領域の位置の移動量とを組み合わせることにより、試料溶液中の粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られる。特に、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動させて、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できる。勿論、絶対的な数密度値又は濃度値が直接的に決定されずに、複数の試料溶液又は濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比が算出されてもよい。また、走査分子計数法においては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されている。そのため、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液において機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しない。その結果、検出対象となる粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測を行うことができる。なお、試料溶液中に振動や流れが作用すると、粒子の物性的性質が変化する可能性がある。そして、試料溶液を流通させる構成を備える必要がないので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の場合と同様に微量（１～数十μＬ程度）の試料溶液にて計測及び分析を行うことができる。
　上記の粒子を個別に検出する工程において、逐次的に検出される光信号から、１つの粒子に結合した発光プローブが光検出領域に入ったか否かの判定は、時系列に検出される光信号の形状に基づいて行われてもよい。なお、上記の粒子を個別に検出する工程では、１つの発光プローブが１つの粒子に結合している場合、複数の発光プローブが１つの粒子に結合している場合、及び、実験態様によって１つの粒子に結合した後、粒子から解離した発光プローブである場合も含まれる。実施の形態において、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する光信号が検出されたときに、１つの粒子に結合した発光プローブが光検出領域に入ったと検出されてもよい。
　また、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、粒子に結合した発光プローブの特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更されてよい。粒子に結合した発光プローブから検出される光の態様は、その特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、１つの粒子に結合した発光プローブから得られる光量は低減する。そのため、１つの粒子に結合した発光プローブからの光が精度よく又は感度よく計測されるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。
　更に、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる粒子に結合した発光プローブ（本発明の標的粒子の定量方法においては、標的粒子と結合した状態の発光プローブ）の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されているように、走査分子計数法では、光検出領域が、１つの粒子に結合した発光プローブが存在する位置を通過したときにその発光プローブから発せられる光を検出して、発光プローブを個別に検出する。しかしながら、粒子に結合した発光プローブが溶液中におけるブラウン運動によりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光プローブから複数回、光信号（検出したい粒子の存在を表す光信号）が検出される。そのため、検出された光信号と１つの検出したい粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記のように、光検出領域の移動速度を粒子に結合した発光プローブの拡散移動速度よりも高く設定する。具体的には、標的粒子と結合した状態の発光プローブの拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるように設定する。これにより、１つの粒子に結合した発光プローブを、１つの光信号（粒子の存在を表す光信号）に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、粒子に結合した発光プローブによって変わるので、上記のように、粒子に結合した発光プローブの特性（特に、拡散定数）に応じて、光検出領域の移動速度は適宜変更されることが好ましい。
　光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で行われてよい。
　例えば、レーザ走査型光学顕微鏡において採用されるガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置を変更してもよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択されてもよい。
　走査分子計数法では、その光検出機構自体は、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されている。そのため、試料溶液の量は、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合と同様に微量でよい。しかしながら、走査分子計数法においては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されない。そのため、走査分子計数法の光分析技術は、粒子の数密度又は濃度がＦＩＤＡ等の光分析技術で必要とされるレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用することができる。
　また、走査分子計数法では、溶液中に分散又は溶解した粒子の各々が個別に検出される。そのため、その情報を用いて、定量的に、粒子のカウンティング、試料溶液中の粒子の濃度又は数密度の算定、又は濃度又は数密度に関する情報の取得を行うことができる。すなわち、走査分子計数法によれば、光検出領域を通過する粒子と検出された光信号とを１対１に対応させて粒子が一つずつ検出されるため、溶液中に分散してランダムに運動する粒子のカウンティングを行うことができる。そのため、従来よりも、精度よく試料溶液中の粒子の濃度又は数密度を決定することができる。実際に、標的粒子と結合した状態の発光プローブを個別に検出しその数を計数して粒子濃度を決定する上記の標的粒子の検出方法によれば、試料溶液中の標的粒子と結合した発光プローブの濃度が、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測された蛍光強度に基づいて決定可能な濃度よりも更に低い濃度であっても、標的粒子を検出することができる。
　更に、光学系の光路を変更して試料溶液中を光検出領域で走査する態様によれば、試料溶液に対して機械的振動や流体力学的な作用を与えずに、試料溶液内が一様に観測され、或いは、試料溶液が機械的に安定した状態で観測される。そのため、例えば、試料に流れを発生させる場合に比して、定量的な検出結果の信頼性が向上する。また、試料溶液中の検出対象となる粒子に対して力学的な作用による影響又はアーティファクトが与えられない状態で計測を行うことができる。なお、試料に流れを与える場合には、常に一様な流速を与えることが困難であると共に、装置の構成が複雑となる。また、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の粒子、発光プローブ若しくは結合体又はその他の物質が変質又は変性する可能性がある。
＜走査分子計数法のための光分析装置の構成＞
　走査分子計数法は、図１Ａに模式的に例示されているように、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等を実行することができる共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせて構成される光分析装置により実現することができる。図１Ａに示すように、光分析装置１は、光学系２～１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８と、から構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様の構成でよい。光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザ光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度で発散する光となって放射される。レーザ光は、コリメーター４によって平行光に変換され、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射する。対物レンズ８の上方には、典型的には、１～数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置される。対物レンズ８から出射したレーザ光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である粒子と、このような粒子と結合する発光プローブ、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されている。発光プローブと結合又は会合した粒子（実験の態様によっては、粒子と一旦結合した後に粒子から解離した発光プローブ）が励起領域に進入すると、その間、発光プローブが励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過する。この際、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。さらに、放出された光は、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力される。そして、後に説明される態様にて光分析のための処理が施される。なお、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されている。そのため、図１Ｂに模式的に示されているようなレーザ光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１Ｂに例示されたレーザ光の焦点領域は、通常、１～１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり、コンフォーカル・ボリュームと称される（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）。また、走査分子計数法では、１つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブからの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出される。そのため、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用することができる超高感度の光検出器が用いられる。また、図示しない顕微鏡のステージには、観察するべきウェル１０を変更するために、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてもよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてもよい。上記の構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測を行うことができる。
　更に、上記の光分析装置の光学系においては、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する機構、即ち、試料溶液内において焦点領域（光検出領域）の位置を移動するための機構が設けられる。このような光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１Ｃに模式的に例示されているように、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてもよい。このようなミラー偏向器１７は、通常のレーザ走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様の構成でもよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい。或いは、光検出領域の位置の移動軌跡は、コンピュータ１８におけるプログラムにおいて、種々の移動パターンから選択されてもよい。なお、図示していないが、対物レンズ８を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されてもよい。上記のように、上記の光分析装置は、試料溶液を移動する構成ではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成を備える。そのため、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生せず、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することができ、安定的な計測を行うことができる。
　粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが、多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光が放出されるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが、化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２～５が省略されてよい。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが、りん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１においては、図示するように、複数の励起光源２が設けられ、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブを励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるように構成されてもよい。同様に、複数個光検出器１６が設けられ、試料中に波長の異なる複数種の粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが含まれている場合に、それらからの光が波長によって別々に検出されてもよい。
＜走査分子計数法の光分析技術の原理＞
　ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従来の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、観測対象粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定される。そのため、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、蛍光強度の計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし観測対象粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、観測対象粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、有意な光強度（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、観測対象粒子の濃度が計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算において、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。これに対して、走査分子計数法では、観測対象粒子の濃度がＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、観測対象粒子の数密度又は濃度等の特性を検出することができる。
　走査分子計数法の光分析技術では、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図２Ａ及び図２Ｂにて模式的に描かれているように、試料溶液内において光検出領域ＣＶの位置を移動させながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。
　そうすると、例えば、図２Ａ及び図２Ｂに示すように、光検出領域ＣＶが移動する間（図２Ｂ中、時間ｔ０～ｔ２）において１つの粒子（図２Ａ中、発光プローブとして蛍光色素が結合している。）の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、図２Ｂに描かれているように有意な光強度（Ｅｍ）が検出される。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出が実行され、その間に出現する図２Ｂに例示されているように、有意な光強度が一つずつ検出されることによって、発光プローブの結合した粒子が個別に検出される。そして、その数がカウントされることにより、計測された領域内に存在する粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報を取得することができる。このような走査分子計数法の光分析技術の原理においては、蛍光強度のゆらぎの算出のように、統計的な演算処理が行われず、粒子が一つずつ検出される。そのため、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析することができない程度に、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報を取得することができる。
　また、走査分子計数法のように、試料溶液中の粒子が個別に検出され計数される方法によれば、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測される蛍光強度から蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合よりも、より低い濃度まで測定することができる。蛍光分光光度計やプレートリーダーによって蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合、通常、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例すると仮定される。しかしながら、その場合、蛍光標識された粒子の濃度が十分に低くなると、蛍光標識された粒子から発せられた光による信号の量に対するノイズ信号の量が大きくなる（Ｓ／Ｎ比の悪化）。その結果、蛍光標識された粒子の濃度と光信号量との間の比例関係が崩れ、決定される濃度値の精度が悪化する。他方、走査分子計数法では、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する工程において、検出結果からノイズ信号が排除され、個々の粒子に対応する信号のみを計数して濃度が算出される。そのため、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定の下で濃度を検出する場合よりも低い濃度まで検出することができる。
　更に、観測対象粒子の１つに複数の発光プローブが結合する場合には、走査分子計数法のように試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定の下で濃度を決定する従前の方法よりも、粒子濃度の高い側における粒子濃度の測定精度も向上する。観測対象粒子の一つに複数の発光プローブが結合する場合において、或る量の発光プローブが試料溶液に添加されているとき、観測対象粒子の濃度が高くなると、相対的に粒子に結合する発光プローブの数が低減する。その場合、一つの観測対象粒子当たりの蛍光強度が低減するために、蛍光標識された粒子の濃度と光量との間の比例関係が崩れ、決定される濃度値の精度が悪化する。他方、走査分子計数法では、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する工程において、一つの粒子当たりの蛍光強度の低減の影響は少なく、粒子数から濃度が算出されるので、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定の下で濃度を検出する場合よりも高い濃度まで検出することができる。
＜走査分子計数法による試料溶液の光強度の測定＞
　走査分子計数法の光分析における光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡにおける光強度の測定工程と同様の態様にて実行されてもよい。操作処理において、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力する。すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内において光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域における励起光の照射及び光強度の計測を開始する。このような計測が行われている間、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下において、ミラー偏向器１７は、ミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内において光検出領域の位置の移動を実行する。同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信する。コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された光信号から時系列の光強度データが生成されて保存される。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器である。そのため、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングでよい。また、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータでよい。
　光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意の速度でよく、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度でよい。検出された観測対象粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となる。そのため、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果を容易に解釈することができるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましい。しかしながら、移動速度は、これに限定されない。
　ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの観測対象粒子の個別の検出、或いは、観測対象粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、上記の移動速度は、観測対象粒子（より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ、本実施形態においては、発光プローブと結合した標的粒子）のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。走査分子計数法の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間とともに移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図３Ａに模式的に描かれているように、粒子が領域内をランダムに移動する。そのため、光強度が図３Ｂに描かれているようにランダムに変化する（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）。その結果、個々の観測対象粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。そうすると、図４Ａに描かれているように、粒子が光検出領域を略直線に横切る。そのため、時系列の光強度データにおいて、図４Ｂに例示するように、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となる（粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。）。その結果、個々の観測対象粒子と光強度との対応を容易に特定することができる。
　具体的には、拡散係数Ｄを有する観測対象粒子（より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
（２Ｗｏ）２ ＝６Ｄ・Δｔ　　 …（１）
から、
Δｔ＝（２Ｗｏ）２ ／６Ｄ 　　…（２）
となる。そのため、観測対象粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ　　…（３）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されればよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０－１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度であれば、Ｖdifは、１．０×１０－３ｍ／ｓとなる。そのため、光検出領域の位置の移動速度は、その略１０倍の１５ｍｍ／ｓに設定されればよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々に設定して、光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
＜走査分子計数法による光強度の分析＞
　上記の処理により試料溶液の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８において、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理（検出された光から個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する手順）が行われ、下記のような光強度の分析が実行されてよい。
（ｉ）一つの観測対象粒子の検出
　時系列の光強度データにおいて、一つの観測対象粒子が光検出領域を通過する際の軌跡が、図４Ａに示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する光強度の変化は、図６Ａに模式的に描かれているように、光検出領域の光強度分布を反映したプロファイルを有する。なお、この光検出領域は光学系により決定される。光検出領域の光強度分布を反映したプロファイルは、通常、略釣鐘状を示す。そこで、観測対象粒子の検出の一つの手法では、光強度に対して閾値Ｉｏが設定され、その閾値を超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が行われる。光強度に対する閾値Ｉｏ及び時間幅Δτに対する所定の範囲は、光検出領域に対して所定の速度にて相対的に移動する観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）から発せられる光の強度として想定されるプロファイルに基づいて定められる。なお、具体的な値は、実験的に任意に設定されてよく、また、観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）の特性によって選択的に決定されてよい。
　また、観測対象粒子の検出の別の手法では、光検出領域の光強度分布が、
ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（－２ｔ２ ／ａ２ ） 　　…（４）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（４）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの観測対象粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が行われる。強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にあるときには、ノイズ又は異物として分析において無視される。
（ii）観測対象粒子のカウンティング
　観測対象粒子のカウンティングは、上記の観測対象粒子の検出の手法により検出された粒子の数を、任意の手法により、計数することにより行われる。しかしながら、粒子の数が大きい場合には、例えば、図５及び図６Ｂに例示された処理により行われてもよい。
　図５及び図６Ｂを参照して、時系列の光強度（フォトンカウント）のデータから粒子のカウンティングを行う手法の一つの例では、上記に説明された光強度の測定、即ち、光検出領域による試料溶液内の走査及びフォトンカウンティングを行って時系列光信号データ（フォトンカウントデータ）が取得された後（ステップ１００）、この時系列光信号データ（図６Ｂの最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が行われる（ステップ１１０、図６Ｂの中上段「スムージング」）。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブの発する光は確率的に放出され、微小な時間においてデータ値の欠落が生じ得る。そのため、このようなスムージング処理によって、前記のようなデータ値の欠落を無視できる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により行われてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法において一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光信号データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
　次いで、スムージング処理後の時系列光信号データにおいて、有意な信号が存在する時間領域（ピーク存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光信号データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光信号データの時間微分値は、図６Ｂの中下段「時間微分」に例示されているように、信号値の変化時点における値の変化が大きくなるので、このような時間微分値を参照することによって、有意な信号（ピーク信号）の始点と終点を有利に決定することができる。
　その後、時系列光信号データ上において、逐次的に、有意な信号（ピーク信号）が検出され、検出されたピーク信号が観測対象粒子に対応する信号であるか否かが判定される。
　具体的には、まず、時系列光信号データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのピーク信号の始点と終点とが探索され決定され、ピーク存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのピーク存在領域が特定されると、そのピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図６Ｂの下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のピーク強度Ｉｍａｘ、ピーク幅（半値全幅）ｗ、フィッティングにおける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが光検出領域を通過したときに検出される光信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、ピーク強度、ピーク幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。こうして、図７左に示されているように、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブに対応する光信号おいて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの観測対象粒子に対応する信号であると判定される。その結果、一つの観測対象粒子が検出された判断され、一つの粒子としてカウントされる（粒子数がカウントアップされる。ステップ１６０）。一方、図７の右側に示されているように、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内に存在しないピーク信号は、ノイズとして無視される。
　上記のステップ１３０～１６０の処理におけるピーク信号の探索及び判定は、時系列光信号データの全域に渡って繰り返し実行される。そして、一つの観測対象粒子が検出される毎に、粒子としてカウントされる。そして、時系列光信号データの全域のピーク信号の探索が完了すると（ステップ１７０）、それまで得られた粒子のカウント値が時系列光信号データにおいて検出された観測対象粒子の数とされる。
（iii）観測対象粒子の数密度又は濃度の決定
　観測対象粒子のカウンティングが行われると、時系列光信号データの取得の間に光検出領域の通過した領域の総体積を用いて、観測対象粒子の数密度又は濃度が決定される。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動する。そのため、観測対象粒子の数密度又は濃度を設計値から算定することは、一般に困難である。従って、光検出領域の通過した領域の総体積を算定することも簡単ではない。そこで、典型的には、粒子の濃度が既知の溶液（参照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングが行われ、検出された粒子の数と参照溶液の粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、観測対象粒子の検出数と濃度との関係が決定されてよい。
　参照溶液の粒子としては、好ましくは、観測対象粒子が形成する粒子及び発光プローブ結合体（又は観測対象粒子に結合後遊離した発光プローブ）と同様の発光特性を有する発光標識（蛍光色素等）でよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Ｃの参照溶液について、その粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ　　 …（５）
により得られる。また、参照溶液として、複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されてよい。そして、Ｖｔが与えられると、粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の粒子の数密度ｃは、
ｃ＝ｎ／Ｖｔ 　　…（６）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用して得られてもよい。また、本実施形態の光分析装置は、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Ｃと粒子の数Ｎとの関係（式（５））の情報がコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶され、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるように構成されてよい。
＜標的粒子の検出方法＞
　走査分子計数法は、分子が離散的な状況において、発光粒子を一粒子毎に測定することができる測定方法である。そのため、ｐＭオーダー以下の濃度が比較的低い発光粒子に対しても測定を行うことができる。このため、上記の標的粒子の検出方法により、試料溶液中の解析対象の標的粒子の濃度が非常に低い場合であっても、発光プローブと結合した標的粒子を高感度に計数することができる。
　一方で、走査分子計数法は、走査される共焦点領域（すなわち、光検出領域）中で発光粒子からのシグナルを捕らえることにより検出が行われる上に、検出対象となる発光粒子が離散的に存在している溶液中で検出が行われる。このため、光検出領域に発光粒子を捕らえるまでに多くの時間を必要とする場合がある。特に、極めて希薄な発光粒子を検出する場合、前記光検出領域に充分なシグナルを捕らえるまで、測定を続ける必要がある。測定時間が短い場合には、解析対象である発光粒子からのシグナルを獲得する頻度が不足し、この発光粒子のみを正確に測定することが困難である。換言すれば、走査分子計数法の測定時間は、測定対象の濃度に依存し、発光粒子が極めて希薄な試料溶液を測定する場合、測定時間が長くなる。
　上記の標的粒子の検出方法は、試料溶液中にて分散しランダムに運動する標的粒子を検出する方法である。上記の標的粒子の検出方法では、試料溶液中の標的粒子を発光プローブで結合させて標識させ、さらに走査分子計数法によって発光プローブと結合した標的粒子を計数することにより、試料溶液中の標的粒子を検出する際に、試料溶液中の標的粒子の濃度が濃縮処理により高められる。上記の標的粒子の検出方法では、走査分子計数法による測定の前に、濃縮処理により試料溶液中の観測対象粒子の濃度が高められるため、より短時間の測定時間で標的粒子を検出することができる。
　測定溶液中の標的粒子の濃度を高める濃縮処理は、走査分子計測法による測定の前であれば、いずれの時点で行われてもよい。具体的には、発光プローブと混合して試料溶液を調製する前の被検試料に対して濃縮処理を行ってもよく、調製後の試料溶液に対して濃縮処理を行ってもよい。
　具体的には、本発明の第１の態様の標的粒子の検出方法（以下、第１の検出方法）は、試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を検出する方法であって、下記工程（ａ）～（ｃ）を有する。
（ａ）被検試料を、前記被検試料中の標的粒子の濃度を高めるように、濃縮する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において濃縮された被検試料と、前記標的粒子に結合する発光プローブとを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを結合させる工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）において調製された試料溶液中に存在する、発光プローブと結合した標的粒子の数を計数する工程。
　また、前記発光プローブが前記標的粒子に結合した状態と、前記発光プローブが単独で存在している状態とで放出される光の発光特性が異なる。
　本実施形態において、「試料溶液中に分散しランダムに運動する粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの粒子（発光する粒子又は発光しない粒子のいずれであってもよい。）であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子を意味する。
　標的粒子は、試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子であって、試料溶液中の濃度を定量するための粒子である。標的粒子としては、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、核酸類似物質、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物又は非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）等が挙げられる。核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させた物質でもよい。
　核酸類似物質としては、ＤＮＡやＲＮＡのような天然型ヌクレオチド（天然に存在するヌクレオチド）の側鎖等がアミノ基等の官能基により修飾された物質や、タンパク質や低分子化合物等で標識された物質等が挙げられる。より具体的には、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（ＢＮＡ）や、天然型ヌクレオチドの４’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの２’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチドやＨｅｘｉｔｏｌ　Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。
　本実施形態において用いられる発光プローブは、標的粒子と、特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質であって、標的粒子に結合した状態と、単独で存在している状態と、において、放出される光の発光特性が異なる物質であれば、特に限定されない。例えば、標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質に、発光物質を結合させた物質であってもよい。発光物質としては、典型的には、蛍光物質であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する物質でもよい。蛍光物質としては、特定の波長の光を放射することにより蛍光を放出する物質であれば特に限定されず、ＦＣＳやＦＩＤＡ等で使用されている蛍光色素の中から適宜選択して用いることができる。
　例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、発光プローブは、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに蛍光物質等の発光物質を結合させた物質、蛍光物質等の発光物質を結合させた核酸結合性タンパク質、核酸に結合する色素分子等が挙げられる。オリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させた物質であってもよく、天然の核酸塩基と同様にヌクレオチド鎖や塩基対を形成することが可能な核酸類似物質を一部又は全部に含む物質であってもよい。また、標的粒子がタンパク質である場合には、発光プローブとしては、標的粒子に対する抗原若しくは抗体、標的粒子に対するリガンド若しくはレセプターを、蛍光物質等の発光物質で標識した物質を用いることができる。なお、核酸やタンパク質等の標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質への発光物質の結合は、常法により行うことができる。
　本実施形態において用いられる発光プローブは、標的粒子と非特異的に結合等する物質であってもよい。標的粒子の検出・定量の精度の点からは、特異的に結合等する物質であることが好ましい。なお、標的粒子と特異的に結合する発光プローブとしては、物理的又は化学的性質が標的粒子と類似した他の物質に対する結合よりも、標的粒子と優先的に結合する物質であればよく、標的粒子以外の物質と全く結合しない物質である必要はない。例えば、標的粒子が核酸である場合には、発光プローブとして用いる発光物質で標識したオリゴヌクレオチドは、標的粒子の塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有していてもよく、当該標的粒子の塩基配列とミスマッチを有する塩基配列を有していてもよい。
　また、発光プローブが標的粒子に結合した状態と発光プローブが単独で存在している状態とにおいて、発光プローブの発光特性が異なるとは、発光プローブが標的粒子に結合した状態と発光プローブが単独で存在している状態とで、特定の波長の光の強度が異なることを意味する。発光プローブが単独で存在している状態と、発光プローブが標的粒子と結合した状態とで、特定の波長の光の強度を異ならせる（例えば、蛍光強度を異ならせる）ことにより、走査分子計数法において両者を区別して検出することができる。
　標的粒子がタンパク質である場合には、タンパク質と結合して周囲環境が変化することにより蛍光強度や蛍光波長が変化する色素（例えば、疎水性プローブＡＮＳ、ＭＡＮＳ、ＴＮＳといった蛍光色素）を、発光プローブとして用いることができる。また、発光プローブは、それ自体が発光していなくてもよい。例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、発光プローブを標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとし、試料溶液中に発光プローブとともに、２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質を添加しても、発光プローブが単独で存在している状態と、発光プローブが標的粒子と結合した状態とで、発光特性を異ならせることができる。２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質としては、蛍光性インターカレーターや、蛍光物質を結合させたグルーブバインダー等が挙げられる。
　その他にも、例えば、発光プローブとして、少なくとも二つの構成要素から成る物質であって、標的粒子に結合することにより、前記の少なくとも二つの構成要素の互いの位置が変化して蛍光を発する物質が採用されてもよい。そのような物質の例としては、或る粒子に結合すると、構造変化して強い蛍光を放出するようになる蛍光性タンパク質や、或る粒子に結合すると、集合して蛍光性金属錯体を形成する分子（錯体の配位子）が挙げられる。このような構成によれば、いずれの場合も、発光プローブ単体若しくは標的粒子に結合していない発光プローブは、殆ど発光しないか、発光しても、標的粒子及び発光プローブの結合体と波長が異なるため、標的粒子及び発光プローブの結合体からの光を選択的に検出することができる。
　また、蛍光エネルギー移動現象（ＦＲＥＴ）を利用することにより、試料溶液中に於いて単独で存在している発光プローブと、標的粒子に結合した状態である発光プローブとの発光特性を異ならせることができる。例えば、標的粒子と結合する物質に、ＦＲＥＴにおけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質及びエネルギー・アクセプターと成る物質（蛍光物質や消光物質）を、発光プローブが単独で存在している状態ではＦＲＥＴが生じ、標的粒子と結合した状態ではＦＲＥＴが生じなくなるように結合させた物質を、発光プローブとして用いることができる。標的粒子と結合した発光プローブからは、ＦＲＥＴが起こらないため、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から蛍光が放出される。一方で、単独で存在している発光プローブからは、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光は検出されないか、もしくは減弱している。そこで、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光を検出することにより、発光プローブと結合した標的粒子を、単独で存在している発光プローブと区別して検出することができる。
　例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、１本鎖核酸分子の状態の際に分子内構造体を形成するオリゴヌクレオチドに、ＦＲＥＴにおいてエネルギー・ドナーと成る蛍光物質とエネルギー・アクセプターと成る物質とを、１本鎖核酸分子の状態ではＦＲＥＴが起こり、他の１本鎖核酸分子とハイブリダイズして形成された会合体の状態ではＦＲＥＴが起こらないように結合させた分子ビーコンプローブを、発光プローブとして好ましく用いることができる。本実施形態においては、３’末端側にエネルギー・ドナーと成る蛍光物質又はエネルギー・アクセプターと成る物質が結合されており、５’末端側に残る一方が結合されており、かつ３’末端側の領域と５’末端側とに互いに相補的な塩基配列を有し、これらの塩基配列において塩基対を形成することによって、分子内構造体（いわゆるステム－ループ構造）を形成する物質が好ましい。なお、分子ビーコンプローブの分子内塩基対を形成する互いに相補的な領域は、標的粒子とハイブリダイズする領域を挟むようにして存在していればよい。そのため、３’末端側の領域及び５’末端側の領域は、それぞれ、３’末端又は５’末端を含んでいる領域であってもよく、含まない領域であってもよい。また、塩基対を形成する領域の塩基数や塩基配列は、形成された塩基対の安定性が、標的粒子との会合体の安定性よりも低く、且つ測定条件下で塩基対を形成し得る程度であればよい。
　また、２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質を用い、蛍光性２本鎖核酸結合物質と発光プローブを標識した蛍光物質との間にＦＲＥＴを起こすことによっても、単独で存在している発光プローブと、標的粒子と結合している発光プローブとを区別することができる。すなわち、蛍光性２本鎖核酸結合物質と発光プローブを標識する蛍光物質のいずれか一方がＦＲＥＴのエネルギー・ドナーと成り、他方がＦＲＥＴのエネルギー・アクセプターと成る。単独で存在している発光プローブからは、発光プローブを標識する蛍光物質から放出される蛍光が検出される。これに対して、標的粒子と結合している発光プローブには蛍光性２本鎖核酸結合物質が結合するため、結合体からは、ＦＲＥＴにより放出される蛍光が検出される。その結果、単独で存在している発光プローブとは区別して検出することができる。
　なお、発光プローブと標的粒子との会合体の塩基対の間に入り込む蛍光性インターカレーターの量が多すぎる場合には、ＦＲＥＴにより放出される蛍光を検出する際のバックグラウンドが高くなりすぎ、検出精度に影響を及ぼす可能性がある。このため、発光プローブと標的粒子との会合体中の２本鎖を形成している領域が、４００ｂｐ以下となるように、発光プローブを設計することが好ましい。
　その他、本実施形態においては、２種類の発光プローブが使用されてもよい。例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合に、２種類の発光プローブを、標的粒子に対して互いに隣接してハイブリダイズするように設計し、一方の発光プローブをＦＲＥＴにおけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質で標識し、他方の発光プローブをＦＲＥＴにおけるエネルギー・アクセプターと成る物質で標識させる。この場合、単独で存在している発光プローブではＦＲＥＴは起こらないが、標的粒子に結合することにより、２種類の発光プローブは互いに近接し、ＦＲＥＴが起こる。このため、ＦＲＥＴにより放出される蛍光を検出することにより、発光プローブと結合した標的粒子を検出することができる。
　また、本実施形態に供される被検試料は、標的粒子を含むことが期待される試料であれば特に限定されず、生体試料でもよく、人工的に調製された試料でもよい。標的粒子が核酸分子の場合には、被検試料としては、例えば、細胞や組織、細菌を可溶化し、核酸成分を液中に分散させた溶液、ＰＣＲ法により増幅した核酸成分を含む溶液等が挙げられる。
　以下、工程ごとに説明する。
　まず、工程（ａ）として、被検試料を、被検試料中の標的粒子の濃度を高めるように、濃縮する。濃縮方法は特に限定されず、標的粒子と同種の物質を濃縮、単離、又は精製する際に用いられている公知の化学的・分子生物学的手法等を適宜利用することができる。例えば、加温・加熱又は減圧等により溶媒を蒸発又は蒸散させる方法、限外ろ過により溶媒を除去する方法等により、被検試料中の溶媒のみを除去し、標的粒子の濃度を高めてもよい。また、被検試料中から標的粒子のみを、又は標的粒子を標的粒子と物理的又は化学的性質の近似する物質と共に単離・精製した後、単離・精製前の被検試料の容量よりも少ない容量の適当な溶媒に溶解又は分散させることにより、濃縮された被検試料を調製することができる。単離・精製された標的粒子を溶解等させる溶媒は特に限定されないが、走査分子計数法による標的粒子と結合した発光プローブの検出を阻害しない溶媒であることが好ましい。この溶媒としては、例えば、水、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等が挙げられる。
　走査分子計数法においては、測定溶液中に、自家蛍光を有する物質を初めとする様々な物質が含まれている場合、非特異的なシグナルの発生や透過する光路の阻害等の障害の原因となる。このため、本実施形態においては、単に溶媒を除去して濃縮するよりも、被検試料中から標的粒子のみを、又は標的粒子を標的粒子と物理的又は化学的性質の近似する物質と共に単離・精製することによって濃縮するほうが好ましい。
　標的粒子が核酸分子の場合には、被検試料から核酸分子のみを選択的に回収し、回収された核酸分子を適当な溶媒に溶解させることにより、濃縮された被検試料を調製することができる。被検試料からの核酸分子の選択的な回収方法は、特に限定されず、公知の核酸精製方法の中から適宜選択して用いることができる。例えば、エタノール沈殿法により核酸分子を選択的に沈殿させ、得られた沈殿物を水等の適当な溶媒に溶解させてもよい。また、被検試料を無機支持体に接触させることにより、被検試料中の核酸分子を無機支持体に吸着させた後、吸着させた核酸分子を無機支持体から溶出させてもよい。
　上記の無機支持体には、核酸分子を吸着することができる公知の無機支持体を用いることができる。また、無機支持体の形状も特に限定されず、粒子状でもよく、膜状でもよい。無機支持体としては、例えば、シリカゲル、シリカ質オキシド、ガラス、珪藻土等のシリカ含有粒子（ビーズ）や、ナイロン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ニトロセルロース等の多孔質膜等が挙げられる。さらには、フェライト等の金属粒子表面にポリスチレン等のポリマーがコートされた磁性粒子を用いた場合にも、磁性粒子の表面の化学修飾が施され、核酸分子を吸着させることができる。吸着させた核酸分子を無機支持体から溶出させる溶媒としては、これらの公知の無機支持体から核酸分子を溶出するために通常用いられている溶媒を適宜用いることができる。この溶出用溶媒としては、特に精製水が好ましい。なお、核酸分子を吸着させた無機支持体を適当な洗浄バッファーを用いて洗浄した後に、無機支持体から核酸分子を溶出させることが好ましい。
　被検試料からタンパク質等の核酸分子以外の分子を除去して、核酸分子が濃縮された被検試料を調製することもできる。例えば、被検試料にカオトロピック塩、有機溶媒、界面活性剤等の、通常タンパク質の変性剤として用いられている化合物を１種類又は２種類以上添加して被検試料中のタンパク質を変性させた後、遠心分離処理により、変性タンパク質を沈殿させて上清のみを回収することにより、被検試料からタンパク質を除去することができる。前記無機支持体を用いて、得られた上清から核酸を回収することにより、濃縮された被検試料を調製することができる。回収された上清の容量が、タンパク質の変性剤を添加する前の被検試料の容量よりも少ない場合には、この上清をそのまま濃縮された被検試料として用いてもよい。
　タンパク質の変性剤として用いられるカオトロピック塩としては、例えば、塩酸グアニジン、グアニジンイソチオシアネート、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びトリクロロ酢酸ナトリウム等が挙げられる。タンパク質の変性剤として用いられる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤であってもよく、陰イオン性界面活性剤であってもよく、陽イオン性界面活性剤であってもよい。非イオン性界面活性剤として、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ＣＨＡＰＳ（３－［３－コラミドプロピルジメチルアンモニオ]－１－プロパンスルホネート）、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ２０等が挙げられる。陰イオン性界面活性剤としては、例えば、ＳＤＳに代表されるアルキル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、Ｎ－ラウリルサルコシン等が挙げられる。陽イオン性界面活性剤としては、例えば、ＣＤＡＢに代表されるアルキル４級化アンモニウム等が挙げられる。タンパク質の変性剤として用いられる有機溶媒としては、フェノールであることが好ましい。フェノールは中性であってもよく、酸性であってもよい。酸性のフェノールを用いた場合には、ＤＮＡよりもＲＮＡを選択的に水層に抽出することができる。
　その他、被検試料にタンパク質除去剤を用いてタンパク質を凝集させた後、固液分離処理によって液体成分を回収することによって、核酸分子が濃縮された被検試料を調製することができる。具体的には、被検試料にタンパク質除去剤を添加した後、攪拌若しくは静置することによってタンパク質を凝集させた後、遠心分離処理を行い、上清を回収する。
　タンパク質除去剤としては、例えば、イオン交換樹脂等のタンパク質に対して親和性の高い物質を用いることができる。
　また、被検試料から標的粒子を特異的に回収することで、工程（ａ）における濃縮を行うこともできる。例えば、ゲルろ過法、限外ろ過法、ＨＰＬＣ法、電気泳動法といった一般的な化学的・分子生物学的手法を用いることにより、被検試料から標的粒子を特異的に回収することができる。その他、被試験料を標的粒子と特異的に結合する物質を保持した担体に接触させることにより、被検試料中の標的粒子を担体に結合させた後、担体から標的粒子をリリースすることにより、標的粒子を特異的に回収することができる。リリース後の標的粒子を、元々の被検試料の容量よりも少ない容量の適当な溶媒に溶解又は分散させることにより、濃縮された被検試料を調製することができる。標的粒子と特異的に結合する物質としては、例えば、標的粒子が核酸分子の場合、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。また、標的粒子がタンパク質分子の場合、標的粒子と特異的に結合する物質としては、標的粒子と抗原及び抗体、又はリガンドと受容体の関係にある分子が挙げられる。
　工程（ａ）において調製された濃縮された被検試料中の標的粒子の濃度は、濃縮前の被検試料中の標的粒子の濃度よりも高ければよい。予め被検試料を濃縮することにより、続く工程（ｂ）において、標的粒子の濃度がより高い試料溶液を調製することができる。前述のように、走査分子計数法における測定に要する時間は、測定に供される試料溶液中の標的粒子の濃度に依存する。つまり、第１の検出方法では、予め被検試料を濃縮しない場合よりも、より短時間で測定を行うことができる。
　次いで、工程（ｂ）として、工程（ａ）において濃縮された被検試料と、前記標的粒子に結合する発光プローブと、を含む試料溶液を調製し、この試料溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを結合させる。具体的には、まず、濃縮された被検試料に発光プローブを添加して、試料溶液を調製する。この際、必要に応じて、適当な溶媒をさらに添加してもよい。この溶媒は、走査分子計数法による標的粒子と結合した発光プローブから放出される光の検出を阻害しない溶媒であれば、特に限定されず、この技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。
　このバッファーとしては、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等が挙げられる。
　工程（ｃ）における試料溶液中の標的粒子の濃度又は数密度は、特に限定されない。走査分子計数法の測定時間短縮の点からは、試料溶液中の標的粒子の濃度は高いほうが好ましい。但し、濃度が高すぎる場合には、逆に測定精度が低下する可能性がある。このため、試料溶液中の標的粒子の数密度が、前記光検出領域の体積（Ｖｄ）当たり１分子以下となるように、工程（ｂ）において試料溶液を調製することが好ましい。例えば、試料溶液中の標的粒子の濃度ＸＴ（Ｍ）は、ＸＴ・ＮＡ・Ｖｄ≦１（ＮＡはアボガドロ定数）を満たすことが好ましい。また、測定時間を十分に短縮するため、試料溶液中の標的粒子の濃度ＸＴ（Ｍ）は、１×１０－４≦ＸＴ・ＮＡ・Ｖｄ≦１を満たすことが好ましい。例えば、Ｖｄが１ｆＬであった場合、試料溶液中の標的粒子の濃度ＸＴはｐＭオーダーの濃度であることが好ましい。
　標的粒子と発光プローブとを同じ溶液中に共存させるだけで、両者を結合させることができる場合には、試料溶液を調製した後、必要に応じて所定時間、試料溶液をインキュベートするだけで、試料溶液中で、標的粒子と発光プローブとを結合させることができる。
　一方で、標的粒子や発光プローブが二本鎖構造の核酸分子又は核酸類似物質である場合には、試料溶液中の核酸等を変性させた後、標的粒子と発光プローブとを会合させることが好ましい。なお、「核酸分子又は核酸類似物質を変性させる」とは、塩基対を解離させることを意味する。例えば、分子ビーコンプローブ中の互いに相補的な塩基配列によって形成された塩基対を解離させ、分子内構造を解いて１本鎖構造にすることや、２本鎖核酸分子を１本鎖核酸分子とすることを意味する。なお、発光プローブがＰＮＡ等の核酸類似物質を含むオリゴヌクレオチドである場合、標的粒子が二本鎖核酸分子であったとしても、特段の変性処理を行わずに、発光プローブと標的粒子とからなる会合体を形成することができる場合がある。
　変性処理としては、高温処理による変性（熱変性）又は低塩濃度処理による変性等が挙げられる。中でも、蛍光物質等の発光物質への影響が比較的小さく、操作が簡便であるため、熱変性を行うことが好ましい。具体的には、熱変性では、試料溶液に対し高温処理を施すことにより、試料溶液中の核酸分子等を変性させる。一般的には、ＤＮＡで９０℃、ＲＮＡでは７０℃で数秒間から２分間程度、保温することによって変性させることができるが、標的粒子の塩基の長さ等により変性する温度は異なり、変性することが可能であれば、この温度は限定されない。一方、低塩濃度処理による変性は、例えば、精製水等により希釈することによって、試料溶液の塩濃度が十分に低くなるように調整することによって行うことができる。
　必要に応じて変性を行った後、前記試料溶液中の標的粒子と発光プローブとを会合させる。
　熱変性を行った場合には、高温処理後、試料溶液の温度を、標的粒子と発光プローブとが特異的にハイブリダイズできる温度まで低下させることにより、試料溶液中の標的粒子と発光プローブとを適宜会合させることができる。また、低塩濃度処理による変性を行った場合には、塩溶液を添加する等により、試料溶液の塩濃度を、標的粒子と発光プローブとが特異的にハイブリダイズできる濃度にまで上昇させることによって、試料溶液中の標的粒子と発光プローブとを適宜会合させることができる。
　なお、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、標的粒子と発光プローブとからなる会合体の融解曲線から求めることができる。融解曲線は、例えば、標的粒子と発光プローブとのみを含有する溶液の温度を、高温から低温へと変化させ、溶液の吸光度や蛍光強度を測定することにより求めることができる。得られた融解曲線から、変性した２本の１本鎖核酸分子が会合体を形成し始めた温度から、ほぼ全てが会合体となった温度までの範囲の温度を、両者が特異的にハイブリダイズできる温度とすることができる。温度に代えて、溶液中の塩濃度を低濃度から高濃度への変化させることで、同様にして融解曲線を決定し、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる濃度を求めることができる。
　２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、一般にはＴｍ値（融解温度）で代用することができる。例えば、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、発光プローブの塩基配列情報から、標的粒子とハイブリダイズする領域のＴｍ値（２本鎖ＤＮＡの５０％が１本鎖ＤＮＡに解離する温度）を算出することができる。
　また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、会合体を形成させる際に、試料溶液の温度を比較的ゆっくりと低下させることが好ましい。例えば、試料溶液の温度を７０℃以上にして核酸分子を変性させた後、試料溶液の液温を、０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることができる。
　また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、予め試料溶液中に、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又は尿素等を添加しておくことも好ましい。これらの化合物は、１種のみを添加してもよく、２種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的なハイブリダイゼーションの発生を防止することができる。
　その後、工程（ｃ）として、調製された試料溶液中の発光プローブと結合した標的粒子の数を、走査分子計数法により計数する。具体的には、標的粒子を発光プローブと結合させた後の試料溶液を、前記の走査分子計数法のための光分析装置に設置する。そして、前記の手法により、標的粒子と結合した状態の発光プローブから放出される光を検出し解析することにより、発光プローブと結合した標的粒子の数を計数する。計数された標的粒子数が、測定試料中に含まれている標的粒子の数である。
　また、本実施形態の標的粒子の検出方法においては、被検試料と発光プローブとを含む試料溶液を調製した後に、試料溶液に対して濃縮処理を行うことにより、試料溶液中の標的粒子の濃度を高めても、第１の検出方法と同様の効果が得られる。
　具体的には、本発明の第２の態様の標的粒子の検出方法（以下、第２の検出方法）は、試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を検出する方法であって、下記工程（ａ’）～（ｃ’）を有する。さらに、本発明の第２の態様の標的粒子の検出方法では、工程（ａ’）の後又は工程（ｂ’）の後に、試料溶液中の標的粒子の濃度を高めるように、濃縮処理が行われる。
（ａ’）被検試料と標的粒子に結合する発光プローブとを含む試料溶液を調製する工程と、
（ｂ’）前記工程（ａ’）において調製された試料溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを結合させる工程と、
（ｃ’）前記工程（ｂ’）において調製された試料溶液中に存在する、発光プローブと結合した標的粒子の数を計数する工程。
　工程（ａ’）及び（ｂ’）は、前記工程（ｂ）と同様にして行うことができる。また、工程（ｃ’）は前記工程（ｃ）と同様にして行うことができる。
　工程（ａ’）の後に行う濃縮処理は、続く工程（ｂ’）において行われる標的粒子と発光プローブとの結合を阻害しない処理であれば特に限定されず、標的粒子と同種の物質を濃縮、単離、又は精製する際に用いられている公知の化学的・分子生物学的手法等の中から適宜選択して用いることができる。工程（ｂ’）の後に行う濃縮処理は、工程（ｂ’）において形成された標的粒子と発光プローブとの結合体を損なう又は減少させることなく濃縮可能な処理であれば特に限定されず、標的粒子と同種の物質を濃縮、単離、又は精製する際に用いられている公知の化学的・分子生物学的手法等の中から適宜選択して用いることができる。
　具体的には、例えば、加温・加熱又は減圧等により溶媒を蒸発又は蒸散させる方法、限外ろ過により溶媒を除去する方法等により、被検試料中の溶媒のみを除去し、標的粒子の濃度を高めてもよい。また、被検試料中から標的粒子及び発光プローブを、単独で単離・精製した後、又は標的粒子及び発光プローブと物理的又は化学的性質の近似する物質と共に単離・精製した後、単離・精製前の試料溶液の容量よりも少ない容量の適当な溶媒に溶解又は分散させることにより、濃縮された試料溶液を調製することができる。
　標的粒子と発光プローブがいずれも核酸分子である場合には、工程（ａ’）の後又は工程（ｂ’）の後に行われる濃縮処理は、前記工程（ａ）において、標的粒子が核酸分子である場合に例示された濃縮処理と同様にして行うことができる。
　工程（ｃ’）における試料溶液中の標的粒子の濃度又は数密度は、特に限定されない。第１の検出方法における工程（ｃ）と同様、走査分子計数法の測定時間短縮の点からは、試料溶液中の標的粒子の濃度は高いほうが好ましい。但し、濃度が高すぎる場合には、逆に測定精度が低下する可能性がある。このため、試料溶液中の標的粒子の数密度が、前記光検出領域の体積（Ｖｄ）当たり１分子以下となるように、試料溶液を濃縮することが好ましい。例えば、試料溶液中の標的粒子の濃度ＸＴ（Ｍ）は、ＸＴ・ＮＡ・Ｖｄ≦１（ＮＡはアボガドロ定数）を満たすことが好ましい。
　次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
　被検試料中の標的粒子をそのまま走査分子計数法により検出した場合と、被検試料中の標的粒子を濃縮した後に走査分子計数法により検出した場合とで、計数される標的粒子を比較した。
　一本鎖核酸分子を標的粒子とし、一本鎖核酸分子と相補的な塩基配列を有し、かつ５’末端にＡＴＴＯ（登録商標）６４７Ｎ（ＡＴＴＯ－ＴＥＣ社製）を結合させた一本鎖核酸分子を発光プローブとし、標的粒子と発光プローブとがハイブリダイズした蛍光標識二本鎖核酸分子（８００ｂｐ）を、発光プローブと結合した標的粒子として用いた。
　まず、蛍光標識二本鎖核酸分子の１ｎＭ溶液を被検試料として調製した。蛍光標識二本鎖核酸分子溶液を、２本の１．５ｍＬチューブに２００μＬずつ分注した。各チューブに３Ｍの酢酸ナトリウム溶液を２０μＬ加えて攪拌した後、５００μＬの９９．５％エタノールを加えて攪拌した後、室温で１０分間静置した。その後、各チューブを２０，０００×ｇで１０分間遠心分離処理し、上清を除去した。得られた沈殿に７０％エタノールを５００μＬ加えて攪拌した後、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離処理し、上清を除去した。一方のチューブに得られた沈殿には２００μＬのＴＥバッファーを加え、他方のチューブに得られた沈殿には２０μＬのＴＥバッファーを加えて、それぞれ攪拌し、沈殿を溶解させた。２００μＬのＴＥバッファーから調製されたものを通常検体、２０μＬのＴＥバッファーから調製されたものを濃縮検体とした。
　各検体を試料溶液とし、蛍光標識二本鎖核酸分子の分子数を、走査分子計数法により計数した。また、対照として、ＴＥバッファーのみを試料溶液として計数した。具体的には、計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用いた。そして、上記の各試料溶液について、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、６３３ｎｍのレーザ光を用いて、回転速度６，０００ｒｐｍ、３００μＷで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて６６０～７１０ｎｍとした。アバランシェフォトダイオードから得られるシグナルを、ＢＩＮ ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は、２秒間又は２０秒間とした。
　測定によって得られた時系列データをＳａｖｉｎｚｋｙ－Ｇｏｌａｙのアルゴリズムでスムージングした後、微分によりピークの検出を行った。ピークとみなされた領域のうち、ガウス関数に近似できる領域をシグナルとして抽出した。
　計数結果を図８Ａ、図８Ｂ及び表１に示す。図８Ａはフォトン数の測定結果を示す。図８Ｂはピーク数の測定結果を示す。図８Ａ、図８Ｂ及び表１中、「バッファー」は対照としたＴＥバッファーのみを試料溶液として計数した結果を示す。この結果、濃縮検体の２秒測定のフォトン数・ピーク数は、濃縮していない通常検体の２０秒測定に相当する。すなわち、同じ被検試料であったとしても、走査分子計数法による測定の前に予め濃縮することにより、測定時間を短縮できることが明らかである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例２］
　実施例１で用いた蛍光標識二本鎖核酸分子を発光プローブと結合した標的粒子として用い、被検試料中の標的粒子をそのまま走査分子計数法により検出した場合と、濃縮した後に走査分子計数法により検出した場合とで、計数される標的粒子を比較した。
　まず、ＴＥバッファーを用いて、２００ｆＭの蛍光標識二本鎖核酸溶液を５ｍＬ調製した。このうち６０μＬを、そのまま走査分子計数法による計測の試料溶液（濃縮なし）とした。残った全量（４９４０μＬ）を、Ｗｉｚａｒｄ　ＳＶ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　
Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製し、６０μＬのＴＥバッファーで溶出した溶液を、走査分子計数法による計測の試料溶液（濃縮あり）とした。濃縮倍率は約８２．３倍（４９４０μＬ／６０μＬ）である。
　次いで、実施例１と同様の測定条件で、各試料溶液中の蛍光標識二本鎖核酸分子の分子数を、走査分子計数法により計数した。また、測定は各試料について５回行い、その平均と標準偏差を算出した。
　ピーク数の計数結果を図９及び表２に示す。この結果、濃縮なしの試料溶液を２秒測定した場合には、ピーク数が少なすぎたが、２０秒測定した場合には、充分なピーク数が検出された。これに対して、濃縮した試料溶液では、２秒測定によって、濃縮なしの試料溶液を２０秒測定した場合よりも多い、充分な数のピークが検出された。また、濃縮なしの２秒測定の結果得られたピーク数と、濃縮ありの２秒測定の結果得られたピーク数とを比較したところ、濃縮ありの２秒測定で得られたピーク数（９３０）を濃縮倍率（約８２．３倍）で除すると、約１１．３であり、濃縮なしの２秒測定の結果得られたピーク数とほぼ同等であった。つまり、濃縮倍率に合致するピーク数の増加が見られた。これらの結果から、従来の測定ではピーク数が不足する検体であっても、濃縮することで、より正確な検出が可能となることが確認される。なお、濃縮した後に２秒測定した場合には、ＳＤ値が大きく、バラツキが大きくなる。しかしながら、ＣＶ％は、濃縮なしの試料溶液を２０秒測定した場合で８．９％、濃縮ありの試料溶液を２秒測定した場合で１１．８％であり、大きな差はなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例３］
　実施例１で用いた蛍光標識二本鎖核酸分子を発光プローブと結合した標的粒子として用い、被検試料中の標的粒子をそのまま走査分子計数法により検出した場合と、濃縮した後に走査分子計数法により検出した場合とで、計数される標的粒子を比較した。
　まず、血漿（馬血漿）を含むＳＴＥＰバッファーを用いて、１００ｆＭ、１ｐＭ、１０ｐＭの蛍光標識二本鎖核酸分子溶液を５ｍＬずつ、３本のチューブに調製した。このうち１本のチューブ中の６０μＬを、そのまま走査分子計数法による計測の試料溶液（精製なし）とした。残る２本のうちの１本のチューブ中の全量を、Ｇｅｎｏｍｉｃ－ｔｉｐ　２０／Ｇ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、５ｍＬのＴＥバッファーで溶出した溶液を、走査分子計数法による計測の試料溶液（精製あり、濃縮なし）とした。残る１本のチューブ中の全量を、Ｇｅｎｏｍｉｃ－ｔｉｐ　２０／Ｇ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、５００μＬのＴＥバッファーで溶出した溶液を、走査分子計数法による計測の試料溶液（精製あり、濃縮あり）とした。
　次いで、実施例１と同様の測定条件で、各試料溶液中の蛍光標識二本鎖核酸分子の分子数を、走査分子計数法により計数した。また測定は各試料について５回行い、その平均と標準偏差を算出した。
　計数結果を図１０及び表３に示す。図１０及び表３中、「＋Ｐ」は試料溶液（精製なし）をそのまま２秒測定した結果を示す。また、「＋Ｐ精製」は試料溶液（精製あり、濃縮なし）を２秒測定した結果を示す。また、「＋Ｐ精製、２０秒測定」は試料溶液（精製あり、濃縮なし）を２０秒測定した結果を、「＋Ｐ精製、濃縮」は試料溶液（精製あり、濃縮あり）を２秒測定した結果を示す。この結果、試料溶液（精製なし）を２秒間測定した結果は、試料溶液（精製あり、濃縮なし）を２秒測定した結果よりも非常にピーク数が多かった。これは、試料溶液中の血漿により、非特異的なシグナルが多く形成される結果、バイアスがかかってしまったためと推察される。また、試料溶液（精製あり、濃縮なし）を２秒測定した結果、濃度依存的なピーク数が得られたが、最も薄い濃度である１００ｆＭ（０．１ｐＭ）では、ピーク数が不足した。これは、試料溶液中の蛍光標識二本鎖核酸分子の濃度が非常に薄いため、蛍光標識二本鎖核酸分子を検出する機会が少ないためと推察される。一方で、同じ試料溶液にも関わらず、試料溶液（精製あり、濃縮なし）を２秒測定した結果よりも、試料溶液（精製あり、濃縮なし）を２０秒測定した結果のほうが明らかに検出されたピーク数が多かった。つまり、測定時間を長くすることにより、ピーク数（検出の機会）は増加した。これに対して、試料溶液（精製あり、濃縮あり）を２秒測定した結果では、全ての濃度において、試料溶液（精製あり、濃縮なし）を２０秒測定した結果よりも多くのピーク数が検出され、かつ検出されたピーク数は濃度依存的に増加していた。すなわち、計測前に予め被検試料を精製かつ濃縮することにより、短時間で十分なピーク数を獲得することができ、測定時間を短縮することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例４］
　一本鎖核酸分子および２つのプローブと結合した標的粒子を用い、被検試料中の標的粒子の濃度を変えずに走査分子計数法により検出した場合と、濃縮した後に走査分子計数法により検出した場合とで、計数される標的粒子を比較した。
一本鎖核酸分子を標的粒子とし、一本鎖核酸分子と相補的な塩基配列を有し、かつ５’末端にＡＴＴＯ（登録商標）６４７Ｎ（ＡＴＴＯ－ＴＥＣ社製）を結合させた一本鎖核酸分子（プローブ１）、または３’末端にビオチンを結合させた一本鎖核酸分子（プローブ２）を発光プローブとして用いた。また、標的粒子と発光プローブとがハイブリダイズした蛍光標識二本鎖核酸分子を、発光プローブと結合した標的粒子として用いた。これらのオリゴヌクレオチドは、シグマジェノシス株式会社に依頼して合成した。一本鎖核酸分子および発光プローブの塩基配列を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
先ず、トリスバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，４００ｍＭ　ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）を用いて、一本鎖核酸分子が１ｆＭ、プローブ１が２０ｐＭ、プローブ２が２００ｐＭ、Ｐｏｌｙ（ｄｅｏｘｙｉｎｏｓｉｎｉｃ－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ）ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）が０．１Ｕ／ｍＬ（１Ｕは、水中(光路長は１ｃｍ)で２６０ｎｍの吸光度が１．０となる量）となるように試料溶液（３００μＬ）を調製した。一本鎖核酸分子を含まない試料も用意した。それらの試料溶液を９５℃で５分間加熱した後、平均０．１℃／分の速度で冷却し２５℃にした。
次に、上記試料溶液に０．１％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を１μＬ加え、ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，Ｃａｔ．ｎｏ．６５０）１０μｇと混和し、２５℃で９０分間、振とうさせながら反応させた。続いて、磁石を使って、５００μＬのトリスバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，４００ｍＭ　ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）を用いて３回洗浄した。その後、３０μＬおよび３００μＬの溶出バッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）を加え、５０℃で５分間放置した。磁石で磁気ビーズを集めた後、上清を回収した。回収した溶液を走査分子計数法による計測の試料溶液とした。３０μＬで溶出した溶液を“濃縮あり”とし、３００μＬで溶出した溶液を“濃縮なし”とした。
次いで、実施例１と同様の条件で、各試料溶液の標的粒子を走査分子計数法により計数した。また、対照として、トリスバッファーのみを試料溶液として計数した。但し、励起光は、回転速度９，０００ｒｐｍ、１ｍＷの励起光で照射した。また、測定時間は、６０秒間および６００秒間の２条件で行った。また、測定は各試料について５回行い、その平均と標準偏差を算出した。
ピーク数の計数結果を図１１及び表５に示す。この結果、濃縮なしの試料溶液を６０秒間測定した場合には、充分なピーク数が検出されなかった。しかし、６００秒間測定した場合には、充分なピーク数が検出された。これに対して、濃縮した試料溶液では、６０秒間の測定によって、濃縮なしの試料溶液を６００秒間測定した場合と同等の充分な数のピークが検出された。また、濃縮なしの試料溶液を６０秒間測定した結果得られたピーク数と、濃縮ありの試料溶液を６０秒間測定した結果得られたピーク数とを比較した。その結果、濃縮ありの試料溶液を６０秒間測定して得られたピーク数を濃縮倍率（１０倍）で除すると、約２２．５であり、濃縮なしの試料溶液を６０秒間測定した結果得られたピーク数とほぼ同等であった。つまり、濃縮倍率に合致するピーク数の増加が確認された。これらの結果から、実施例２と同様に、従来の測定ではピーク数が不足する検体であっても、濃縮することで、より正確な検出が可能となることが確認された。なお、濃縮した後に６０秒間測定した場合のＣＶ％は、１１．７％であり、濃縮なしの試料溶液を６００秒間測定した場合の１４．０％と、大きな差はなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　上記の標的粒子の検出方法によれば、試料溶液中の非常に低濃度にしか存在していない標的粒子の濃度を、走査分子計数法により短時間で測定することができるため、臨床検体等の、解析対象物質の濃度が微量である試料の解析・検査等の分野で利用することができる。
　１　光分析装置（共焦点顕微鏡）
　２　光源
　３　シングルモードオプティカルファイバー
　４　コリメータレンズ
　　５　ダイクロイックミラー
　　６、７、１１　反射ミラー
　　８　対物レンズ
　　９　マイクロプレート
　　１０　ウェル（試料溶液容器）
　　１２　コンデンサーレンズ
　　１３　ピンホール
　　１４　バリアフィルター
　　１５　マルチモードオプティカルファイバー
　　１６　光検出器
　　１７　ミラー偏向器
　　１７ａ　ステージ位置変更装置
　　１８　コンピュータ

Claims (10)

  1. 　　試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を検出する方法であって、
    　（ａ）被検試料を、前記被検試料中の標的粒子の濃度を高めるように、濃縮する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において濃縮された被検試料と、前記標的粒子に結合する発光プローブとを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを結合させる工程と、
    　（ｃ）前記工程（ｂ）において調製された試料溶液中に存在する、発光プローブと結合した標的粒子の数を計数する工程と、
    　を有し、
    前記発光プローブが前記標的粒子に結合した状態と、前記発光プローブが単独で存在している状態とで放出される光の発光特性が異なり、
    　前記工程（ｃ）における発光プローブと結合した標的粒子の数の計数は、
    　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
    　前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域中の前記標的粒子と結合した状態の前記発光プローブから放出される光信号を検出して、発光プローブと結合した標的粒子を個別に検出する工程と、
    　前記個別に検出された発光プローブと結合した標的粒子の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記標的粒子の数を計数する工程と、
    　により行われる標的粒子の検出方法。
  2. 　　前記工程（ｃ）における試料溶液中の標的粒子の数密度が、前記光検出領域の体積（Ｖｄ）当たり１分子以下である請求項１に記載の標的粒子の検出方法。
  3. 　　前記標的粒子が核酸であり、前記工程（ａ）が、前記被検試料から核酸を精製し、濃縮する工程である請求項１又は２記載の標的粒子の検出方法。
  4. 　　前記工程（ａ）が、前記被検試料から、標的粒子を特異的に回収し、濃縮する工程である請求項１又は２記載の標的粒子の検出方法。
  5. 　　前記光検出領域の位置を移動する工程に於いて、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動される請求項１～４のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
  6. 　　前記光検出領域の位置を移動する工程に於いて、前記光検出領域の位置が、前記発光プローブと結合した標的粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動される請求項１～５のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
  7. 　　前記検出された光から、個々の発光プローブと結合した標的粒子からの光信号を検出して、前記発光プローブと結合した標的粒子を個別に検出する工程に於いて、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、１つの発光プローブと結合した標的粒子が前記光検出領域に入ったことが検出される請求項１～６のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
  8. 　　前記発光プローブが、互いに近接しているときに蛍光エネルギー移動現象を発生するエネルギー・ドナー部位とエネルギー・アクセプター部位とを有し、且つ、前記発光プローブが前記粒子に結合した状態と、前記発光プローブが前記粒子に結合していない状態と、の間で前記エネルギー・ドナー部位と前記エネルギー・アクセプター部位との距離が異なり、
    　　前記発光プローブが前記標的粒子に結合した状態と、前記発光プローブが単独で存在している状態と、で、前記発光プローブから放出される光の発光特性が異なる請求項１～７のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
  9. 　　前記標的粒子が核酸であり、
    　前記発光プローブが、前記標的粒子と特異的にハイブリダイズし、且つ、前記発光プローブが、蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質及びエネルギー・アクセプターと成る物質の少なくとも一つが結合している１本鎖核酸である請求項１～８のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
  10. 　　試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を検出する方法であって、
    （ａ’）被検試料と標的粒子に結合する発光プローブとを含む試料溶液を調製する工程と、
    　（ｂ’）前記工程（ａ’）において調製された試料溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを結合させる工程と、
    　（ｃ’）前記工程（ｂ’）において調製された試料溶液中に存在する、発光プローブと結合した標的粒子の数を計数する工程と、
    　を有し、
    　前記発光プローブが、前記標的粒子に結合した状態と、単独で存在している状態とで放出される光の発光特性が異なり、
    　前記工程（ｃ’）における発光プローブと結合した標的粒子の数の計数は、
    　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
    　前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域中の前記標的粒子と結合した状態の前記発光プローブから放出される光信号を検出して、発光プローブと結合した標的粒子を個別に検出する工程と、
    　前記個別に検出された発光プローブと結合した標的粒子の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記標的粒子の数を計数する工程と、により行われ、
    　前記工程（ａ’）の後又は前記工程（ｂ’）の後に、前記試料溶液中の標的粒子の濃度を高めるように、濃縮処理が行われる標的粒子の検出方法。
PCT/JP2012/066393 2011-06-27 2012-06-27 標的粒子の検出方法 WO2013002261A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201280029647.6A CN103620388B (zh) 2011-06-27 2012-06-27 目标粒子的检测方法
JP2013522897A JP6013332B2 (ja) 2011-06-27 2012-06-27 標的粒子の計数方法
EP12805017.6A EP2725347B1 (en) 2011-06-27 2012-06-27 Method for detecting target particles
US14/091,943 US20140087482A1 (en) 2011-06-27 2013-11-27 Method for detecting target particles

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011142033 2011-06-27
JP2011-142033 2011-06-27

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US14/091,943 Continuation US20140087482A1 (en) 2011-06-27 2013-11-27 Method for detecting target particles

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013002261A1 true WO2013002261A1 (ja) 2013-01-03

Family

ID=47424152

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/066393 WO2013002261A1 (ja) 2011-06-27 2012-06-27 標的粒子の検出方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20140087482A1 (ja)
EP (1) EP2725347B1 (ja)
JP (1) JP6013332B2 (ja)
CN (1) CN103620388B (ja)
WO (1) WO2013002261A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016031234A (ja) * 2014-07-25 2016-03-07 高電工業株式会社 検体検査装置

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2752655A4 (en) * 2011-08-30 2015-06-17 Olympus Corp PROCEDURE FOR DETECTING TARGET PARTICLES
WO2013140890A1 (ja) 2012-03-21 2013-09-26 オリンパス株式会社 標的核酸分子の検出方法
US20180317833A1 (en) * 2015-10-23 2018-11-08 Eccrine Systems, Inc. Devices capable of fluid sample concentration for extended sensing of analytes
CN110376105B (zh) * 2019-07-10 2022-06-03 赛莱克斯(深圳)科技有限公司 一种用于确定临床样品中小颗粒特性和浓度的方法及装置
CN112461805A (zh) * 2020-11-16 2021-03-09 三诺生物传感股份有限公司 一种用于荧光强度基底计算的方法

Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04337446A (ja) 1991-05-15 1992-11-25 Hitachi Ltd 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置
JP2002528093A (ja) 1998-10-23 2002-09-03 キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 表面における核酸の単離及び精製のための方法並びに手段
JP2003344288A (ja) 2002-05-27 2003-12-03 Hitachi High-Technologies Corp 化学分析装置、核酸濃度測定装置及び核酸濃度測定方法
JP2005098876A (ja) 2003-09-25 2005-04-14 Institute Of Physical & Chemical Research ２成分相互作用分析方法
JP2006526591A (ja) 2003-06-04 2006-11-24 キアゲン アクティーゼルスカブ 核酸または核酸含有種の濃縮及び／または単離方法
JP2007006890A (ja) * 2005-06-30 2007-01-18 F Hoffmann La Roche Ag 発光修飾剤並びに核酸検出、増幅および分析におけるその使用
JP2007020565A (ja) 2005-06-13 2007-02-01 Kansai Bunri Sogo Gakuen 試料中のウイルスを検出する方法およびシステム
JP4023523B2 (ja) 1996-10-12 2007-12-19 オリンパス株式会社 比明度関数の決定によるサンプルの分析方法
JP2008000045A (ja) 2006-06-21 2008-01-10 Olympus Corp 核酸の検出方法
JP2008116440A (ja) 2006-10-13 2008-05-22 Shiga Pref Gov 試料中の蛍光性物質を検出する方法およびシステム
WO2008080417A1 (en) 2006-12-28 2008-07-10 Flult Biosystems Gmbh A method of determining characteristic properties of a sample containing particles
JP2008292371A (ja) 2007-05-25 2008-12-04 Institute Of Physical & Chemical Research 蛍光相関分光による複数成分相互作用の分析方法及び相互作用制御化合物のスクリーニング方法
JP2009518020A (ja) 2005-12-09 2009-05-07 キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 短鎖核酸の濃縮方法
JP2010044714A (ja) 2008-08-18 2010-02-25 Hataguchi Masahiro 業務管理システム及び業務管理方法
JP2010190730A (ja) * 2009-02-18 2010-09-02 Olympus Corp 相関分光分析方法及び相関分光分析装置
JP2011002415A (ja) * 2009-06-22 2011-01-06 Olympus Corp 蛍光相関分光装置
JP2011036150A (ja) * 2009-08-07 2011-02-24 Olympus Corp 標的核酸分子の定量方法及び標的核酸分子定量キット
JP2011508219A (ja) * 2007-12-19 2011-03-10 シンギュレックス・インコーポレイテッド 単一分子検出走査分析器およびその使用方法
WO2011108369A1 (ja) * 2010-03-01 2011-09-09 オリンパス株式会社 光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム
WO2012014778A1 (ja) * 2010-07-26 2012-02-02 オリンパス株式会社 発光プローブを用いて溶液中の希薄粒子を検出する方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100487116C (zh) * 2001-07-09 2009-05-13 旭化成株式会社 应用非织造织物纯化和检测核酸的方法
US6750963B2 (en) * 2002-05-21 2004-06-15 Agilent Technologies, Inc. Imaging systems for signals on a surface
EP1526373B1 (en) * 2002-06-21 2013-11-27 Olympus Corporation Biomolecule analyzer
DE60328193D1 (de) * 2003-10-16 2009-08-13 Sequenom Inc Nicht invasiver Nachweis fötaler genetischer Merkmale
JP2005328758A (ja) * 2004-05-20 2005-12-02 Hitachi Ltd 核酸増幅方法及びこれを利用した一塩基多型の解析
WO2007044029A2 (en) * 2004-12-03 2007-04-19 Nano Science Diagnostic, Inc. Method and apparatus for low quantity detection of bioparticles in small sample volumes
WO2006084283A2 (en) * 2005-01-31 2006-08-10 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Methods and devices for characterizing particles in clear and turbid media
JP2009288161A (ja) * 2008-05-30 2009-12-10 Olympus Corp 光測定装置及び光測定方法
GB2461026B (en) * 2008-06-16 2011-03-09 Plc Diagnostics Inc System and method for nucleic acids sequencing by phased synthesis
CN103733047B (zh) * 2011-08-11 2016-03-30 奥林巴斯株式会社 目标粒子的检测方法

Patent Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04337446A (ja) 1991-05-15 1992-11-25 Hitachi Ltd 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置
JP4023523B2 (ja) 1996-10-12 2007-12-19 オリンパス株式会社 比明度関数の決定によるサンプルの分析方法
JP2002528093A (ja) 1998-10-23 2002-09-03 キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 表面における核酸の単離及び精製のための方法並びに手段
JP2003344288A (ja) 2002-05-27 2003-12-03 Hitachi High-Technologies Corp 化学分析装置、核酸濃度測定装置及び核酸濃度測定方法
JP2006526591A (ja) 2003-06-04 2006-11-24 キアゲン アクティーゼルスカブ 核酸または核酸含有種の濃縮及び／または単離方法
JP2005098876A (ja) 2003-09-25 2005-04-14 Institute Of Physical & Chemical Research ２成分相互作用分析方法
JP2007020565A (ja) 2005-06-13 2007-02-01 Kansai Bunri Sogo Gakuen 試料中のウイルスを検出する方法およびシステム
JP2007006890A (ja) * 2005-06-30 2007-01-18 F Hoffmann La Roche Ag 発光修飾剤並びに核酸検出、増幅および分析におけるその使用
JP2009518020A (ja) 2005-12-09 2009-05-07 キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 短鎖核酸の濃縮方法
JP2008000045A (ja) 2006-06-21 2008-01-10 Olympus Corp 核酸の検出方法
JP2008116440A (ja) 2006-10-13 2008-05-22 Shiga Pref Gov 試料中の蛍光性物質を検出する方法およびシステム
WO2008080417A1 (en) 2006-12-28 2008-07-10 Flult Biosystems Gmbh A method of determining characteristic properties of a sample containing particles
JP2008292371A (ja) 2007-05-25 2008-12-04 Institute Of Physical & Chemical Research 蛍光相関分光による複数成分相互作用の分析方法及び相互作用制御化合物のスクリーニング方法
JP2011508219A (ja) * 2007-12-19 2011-03-10 シンギュレックス・インコーポレイテッド 単一分子検出走査分析器およびその使用方法
JP2010044714A (ja) 2008-08-18 2010-02-25 Hataguchi Masahiro 業務管理システム及び業務管理方法
JP2010190730A (ja) * 2009-02-18 2010-09-02 Olympus Corp 相関分光分析方法及び相関分光分析装置
JP2011002415A (ja) * 2009-06-22 2011-01-06 Olympus Corp 蛍光相関分光装置
JP2011036150A (ja) * 2009-08-07 2011-02-24 Olympus Corp 標的核酸分子の定量方法及び標的核酸分子定量キット
WO2011108369A1 (ja) * 2010-03-01 2011-09-09 オリンパス株式会社 光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム
WO2012014778A1 (ja) * 2010-07-26 2012-02-02 オリンパス株式会社 発光プローブを用いて溶液中の希薄粒子を検出する方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KATO, N. ET AL., GENE & MEDICINE, vol. 6, no. 2, 2002, pages 271 - 277
KINJO, M., PROTEINS, NUCLEIC ACIDS AND ENZYMES, vol. 44, no. 9, 1999, pages 1431 - 1438
MEYER-ALMS: "Fluorescence Correlation Spectroscopy", 2000, SPRINGER, pages: 204 - 224
See also references of EP2725347A4

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016031234A (ja) * 2014-07-25 2016-03-07 高電工業株式会社 検体検査装置

Also Published As

Publication number Publication date
JP6013332B2 (ja) 2016-10-25
EP2725347A1 (en) 2014-04-30
CN103620388B (zh) 2016-05-11
US20140087482A1 (en) 2014-03-27
CN103620388A (zh) 2014-03-05
EP2725347B1 (en) 2018-09-26
EP2725347A4 (en) 2015-02-25
JPWO2013002261A1 (ja) 2015-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5877155B2 (ja) 発光プローブを用いて溶液中の希薄粒子を検出する方法
JP6013328B2 (ja) 標的粒子の定量方法
JP6010034B2 (ja) 標的粒子の検出方法
JP6013332B2 (ja) 標的粒子の計数方法
JP6104267B2 (ja) 標的粒子の検出方法
JP6013335B2 (ja) 標的粒子の計数方法
JP6010029B2 (ja) 蛍光粒子の検出方法
JP6013339B2 (ja) 膵液を含む生体試料中の標的粒子の検出方法
JP6157326B2 (ja) 光検出を用いた単一発光粒子検出方法
JP6013327B2 (ja) 生体試料中の核酸分子の検出方法
JP2014048098A (ja) 走査分子計数法におけるノイズ低減方法、及び標的粒子の検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201280029647.6

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12805017

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013522897

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE