CN112461805A - 一种用于荧光强度基底计算的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及荧光免疫检测技术领域，更具体地说，涉及一种用于荧光强度基底计算的方法。本发明所述用于荧光强度基底计算的方法，通过先确定所述荧光强度散点图中T峰、C峰的峰值位置点，以及T峰、C峰的起始位置点、终止位置点，然后将对应峰起始点和峰终止点连线得到该线关于输出数据序号对应的线性函数，即T峰、C峰分别得到其对应的基底函数；采用本发明所述用于荧光强度基底计算的方法，使得在计算浓度时计算T峰、C峰的峰值或T峰、C峰的峰面积先减去其对应的固定基底或减去其对应的基底函数进行校正，其相较现有固定基底计算方法更有利于降低浓度检测的误差，并有效解决在检测较低浓度样本时仪器测不出值的技术问题。

Description

一种用于荧光强度基底计算的方法
技术领域
本发明涉及荧光免疫检测技术领域，更具体地说，涉及一种用于荧光强度基底计算的方法。
背景技术
在采用荧光免疫分析仪进行荧光免疫检测的过程中，系统所产生的基底信号被叠加至检测到的荧光强度数据中，会对测量精度有较大影响。基底信号即噪声基底，又叫干扰信号，其取决于系统中目标检测物质的自发荧光、光电探测器的暗电流和运放失调电压等因素。此外，测试过程中产生的基底信号还可能受试条层析等影响，从而出现基底信号曲线出现凹凸不平的现象，因此为了提高测量的准确性，需要去除基底信号。
现有技术采用传统减去固定基底数据的方法，会导致计算的T峰面积、峰值以及C峰面积、峰值存在较大误差，甚至在检测较低浓度样本时，存在仪器测不出值的情况。
故，现有技术具有较大的改进空间。
发明内容
本发明的目的是为了弥补现有技术的不足，提出一种用于荧光强度基底计算的方法。
为了达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种用于荧光强度基底计算的方法，包括以下步骤：
(1)采用荧光免疫分析仪以设定的测试频率f、测试时间t对试剂卡进行测试，按序输出荧光强度数据，从而在以输出数据序号X为横坐标、荧光强度值Y为纵坐标的坐标系上得到(f×t)个荧光强度点，得到对应的荧光强度散点图；
(2)确定所述荧光强度散点图中T峰、C峰的峰值位置点(XC，YC)；
(3)确定所述T峰、C峰的起始位置点(XS，YS)、终止位置点(XE，YE)；
(4)分别确定T峰、C峰的基底；所述T峰、C峰对应的基底的确定均包括以下步骤：将步骤(2)所得峰起始位置点(XS，YS)和峰终止位置点(XE，YE)连线，得到该线对应的线性函数f(X)，将所述线性函数f(X)作为基底B的计算函数；所述基底B为每个输出数据序号X对应于所述线性函数f(X)的函数值，即B＝f(X)，从而使得所述荧光散点图中波峰范围内每个荧光强度点均有对应的基底。
根据以上方案，步骤(4)还包括分别将T峰、C峰的峰值位置点的横坐标XC代入线性函数f(X)，得到T峰、C峰对应的基底BC＝f(XC)，以BC＝f(XC)作为波峰范围内的每个荧光强度点的基底。
根据以上方案，步骤(2)中所述T峰、C峰的峰值位置点(XC，YC)采用最大值或平均幅值法进行确定。所述最大值或平均幅值法为现有技术，在此不再详述。
根据以上方案，步骤(3)中所述T峰、C峰对应的峰起始位置点、终止位置点的确定均包括以下步骤：将峰值位置点的横坐标XC分别减去、加上峰宽W的一半，计算出峰起始位置点的横坐标XS和峰终止位置点的横坐标XE，即XS＝XC-0.5W、XE＝XC+0.5W，再根据XS、XE在所述荧光强度散点图中找到其对应的纵坐标，从而确定到峰起始位置点(XS，YS)和峰终止位置点(XE，YE)。
其中，峰宽W为一个预设值，在仪器出厂前，技术人员会根据仪器需要检测的项目种类，确定多个与检测项目一一对应的峰宽值。在实际检测过程中，根据检测项目的不同调用对应的峰宽值。技术人员在针对某一个检测项目来确定峰宽时，采用经验方式来确定，一般会采用如下方法进行：
设定一个初始峰宽值，针对某一浓度的样本进行多次检测(比如10次)，分别可以采集到多组原始荧光强度值(比如10组)，根据现有荧光强度值数据处理方式，针对这多组原始荧光强度值，计算出与浓度对应的某个原始荧光强度值作为最终荧光强度检测值，这样可以获得多个最终荧光强度检测值(比如10个)；在现有的最终荧光强度检测值计算过程中，会使用到初始峰宽值；计算这多个(比如10个)最终荧光强度检测值的变异系数CV，当变异系数CV在可接受范围内时(比如小于3％，或者小于1％等)，则将前面设定的初始峰宽值作为最终峰宽值；否则重新设定另外一个不同的初始峰宽值，按上述计算方式再次验证，直到找到合适的峰宽值。
初始峰宽值由技术人员的经验确定，验证的过程只是从一个大概范围内确定一个更准确的峰宽数值。变异系数CV的计算，可采用如下方法：
Figure BDA0002779059130000021
其中，n为统计的样本数量，即最终荧光强度检测值的个数(也即检测的次数)；xi为第i个最终荧光强度检测值；
Figure BDA0002779059130000022
为第n个最终荧光强度检测值的平均值。
根据以上方案，步骤(2)中所述T峰、C峰的峰值位置点(XC，YC)的确定，均包括以下步骤：计算峰预设检索范围内荧光强度点的斜率值Ki，将斜率值以其对应的输出数据序号X从小到大作为排列顺序进行排序得到对应的斜率数组；所述斜率值Ki按以下公式计算：
Figure BDA0002779059130000031
其中，x为输出数据序号；y为输出数据序号对应的荧光强度值；m为预设的已知整数，m≥1；i为输出数据序号；遍历所得的斜率数组找出斜率值的最大值和最小值，根据斜率值的最大值、最小值找到其对应的输出数据序号记为Xmax、Xmin，通过在Xmax与Xmin之间找到斜率值绝对值最小的值所对应的输出数据序号，该输出数据序号对应的荧光强度点即为峰值位置点(XC，YC)。
所述斜率值Ki用于表示输出数值序号i对应的荧光强度点与前后相邻的两个荧光强度点之间的数据变化趋势；所述斜率值除了采用上述公式计算外，也可采用现有技术的其他方法进行计算。
根据以上方案，所述m可根据实际需要选取任意正整数值，其取值越大，在计算斜率值公式时，选取的连续数据点越多，计算工作量也越大，理论上计算的斜率值应该越准确；然而在现实操作时所述m选取1或2已足够，因此本案所述m优选为1或2。
根据以上方案，步骤(3)中所述T峰、C峰对应的峰起始位置点、终止位置点的确定均包括以下步骤：根据所得的Xmax、Xmin找到其对应的荧光强度点，所述荧光强度点即为峰的起始位置点(XS，YS)、终止位置点(XE，YE)。
根据以上方案，步骤(1)中所述荧光免疫分析仪采用ADUCM360作为数据采集主芯片，所述设定的测试频率f为500Hz，所述测试时间t为3s。
本发明的有益效果在于：
本发明所述用于荧光强度基底计算的方法，通过先确定所述荧光强度散点图中T峰、C峰的峰值位置点，以及T峰、C峰的起始位置点、终止位置点，然后将对应峰起始点和峰终止点连线得到该线关于输出数据序号对应的线性函数，即T峰、C峰分别得到其对应的基底函数；采用本发明所述用于荧光强度基底计算的方法，使得在计算浓度时计算T峰、C峰的峰值或T峰、C峰的峰面积先减去其对应的固定基底或减去其对应的基底函数进行校正，其相较现有固定基底计算方法更有利于降低浓度检测的误差，并有效解决在检测较低浓度样本时仪器测不出值的技术问题。
附图说明
图1为本发明实施例1所得的荧光强度散点图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
本实施例以检测一个浓度偏低的样本为例，说明本实施例所述用于荧光强度基底计算的方法，及应用其进行计算浓度的操作。
一种用于荧光强度基底计算的方法，包括以下步骤：
(1)采用荧光免疫分析仪以设定的测试频率f、测试时间t对试剂卡进行测试，按序输出荧光强度数据，从而在以输出数据序号X为横坐标、荧光强度值Y为纵坐标的坐标系上得到(f×t)个荧光强度点，得到对应的荧光强度散点图；
进一步地，所述荧光免疫分析仪采用ADUCM360作为数据采集主芯片，所述设定的测试频率f为500Hz，所述测试时间t为3s，从而在以输出数据序号X为横坐标、荧光强度值Y为纵坐标的坐标系上得到1500个荧光强度点，得到对应的荧光强度散点图；具体的散点图见图1；
不同的检测项目可能C峰数据偏低，也可能T峰数据偏低。如图1所示，可能左侧波峰为C峰、右侧波峰为T峰，也可能右侧波峰为C峰、左侧波峰为T峰。此处按左侧波峰为C峰、右侧波峰为T峰来计算。
(2)确定所述荧光强度散点图中T峰、C峰的峰值位置点(XC，YC)；
(3)确定所述T峰、C峰的起始位置点(XS，YS)、终止位置点(XE，YE)；
(4)分别确定T峰、C峰的基底；所述T峰、C峰对应的基底的确定均包括以下步骤：将步骤(2)所得峰起始位置点(XS，YS)和峰终止位置点(XE，YE)连线，得到该线对应的线性函数f(X)，将所述线性函数f(X)作为基底B的计算函数；所述基底B为每个输出数据序号X对应于所述线性函数f(X)的函数值，即B＝f(X)，从而使得所述荧光散点图中波峰范围内每个荧光强度点均有对应的基底。
进一步地，步骤(4)还包括分别将T峰、C峰的峰值位置点的横坐标XC代入线性函数f(X)，得到T峰、C峰对应的基底BC＝f(XC)，以BC＝f(XC)作为波峰范围内的每个荧光强度点的基底。
进一步地，步骤(2)中所述T峰、C峰的峰值位置点(XC，YC)的确定，均包括以下步骤：计算峰预设检索范围内荧光强度点的斜率值Ki，将斜率值以其对应的输出数据序号X从小到大作为排列顺序进行排序得到对应的斜率数组；所述斜率值Ki按以下公式计算：
Figure BDA0002779059130000051
其中，x为输出数据序号；y为输出数据序号对应的荧光强度值；m为预设的已知整数，m＝1；i为输出数据序号；遍历所得的斜率数组找出斜率值的最大值和最小值，根据斜率值的最大值、最小值找到其对应的输出数据序号记为Xmax、Xmin，通过在Xmax与Xmax之间找到斜率值绝对值最小的值所对应的输出数据序号，该输出数据序号对应的荧光强度点即为峰值位置点(XC，YC)。
进一步地，步骤(3)中所述T峰、C峰对应的峰起始位置点、终止位置点的确定均包括以下步骤：根据所得的Xmax、Xmin找到其对应的荧光强度点，所述荧光强度点即为峰的起始位置点(XS，YS)、终止位置点(XE，YE)。
步骤(2)、(3)的计算结果见下表1：
表1
Figure BDA0002779059130000052
本实施例设定m＝1进行斜率值计算，本领域技术人员可根据实际需要设定不同正整数值，其计算结果与本实施例相差不大，因此本案不再累述。
上述步骤(4)在本实施例中的具体操作过程为：
1、将T峰的峰起始位置点(250，3869.22)和其终止位置点(500，4040.16)连线，该线对应的线性函数f(X)＝0.68376X+3698.28，即为T峰的基底B的计算函数B＝f(X)＝0.68376X+3698.28；同样地，将C峰的峰起始位置点(807，4891.56)和其终止位置点(1057，5319.68)连线，该线对应的线性函数f(X)＝1.71248X+3509.589，即为C峰的基底B的计算函数B＝f(X)＝1.71248X+3509.589，从而使得所述荧光散点图中波峰范围内每个荧光强度点均有对应的基底。
2、分别将T峰、C峰的峰值位置点的横坐标XC代入线性函数f(X)，得到T峰、C峰对应的基底BC＝f(XC)，即将T峰的峰值位置点的横坐标XC＝375代入线性函数f(X)＝0.68376X+3698.28，得到T峰对应的基底BC＝f(XC)＝0.68376×375+3698.28＝3984.69；将C峰的峰值位置点的横坐标XC＝932代入线性函数f(X)＝1.71248X+3509.589，得到C峰对应的基底BC＝f(XC)＝1.71248×932+3509.589＝5105.62，以BC＝f(XC)作为波峰范围内的每个荧光强度点的基底。
所述用于荧光强度基底计算的方法用于计算浓度时，包括以下步骤：计算T/C峰值比值或T/C峰面积比值；根据所得比值得到对应的浓度。将所得比值得到对应浓度的方法采用的是现有技术，在此不再详述。
其中，所述T/C峰值比值的计算，包括以下步骤：将T峰的位置点对应的纵坐标YC＝4341.27减去其对应的基底BC＝3984.69,得到校正后的T峰荧光强度值为4341.27-3954.69＝386.58；将C峰的位置点对应的纵坐标YC＝9318.05减去其对应的基底BC＝5105.62,得到校正后的C峰荧光强度值为9318.05-5105.62＝4212.43；校正后的T峰荧光强度值除以校正后的C峰荧光强度值得到T/C峰值比值为386.58/4212.43＝0.092。
其中，所述T/C峰面积比值的计算，包括以下步骤：将T峰的峰起始位置点(250，3869.22)至终止位置点(500，4040.16)的各荧光强度值的坐标分别减去其对应的固定基底B＝f(X)＝0.68376X+3698.28，得到校正后的荧光强度值，计算校正后的荧光强度值的总和得到校正后的T峰的峰面积；将C峰的峰起始位置点(807，4891.56)至终止位置点(1057，5319.68)的各荧光强度值的坐标分别减去其对应的固定基底B＝f(X)＝1.71248X+3509.589，得到校正后的荧光强度值，计算校正后的荧光强度值的总和得到校正后的T峰的峰面积；校正后的T峰的峰面积除以校正后的C峰的峰面积值得到T/C峰面积比值。
对比例1
采用一种现有固定基底计算方法，其步骤(1)同实施例1相同，不同在于其基底计算是通过取T峰位置点和C峰位置点中间点对应的荧光强度值(其对应的横坐标为653.5)作为固定基底。计算浓度时，将T峰位置点的纵坐标、C峰位置点的纵坐标分别减去固定基座得到校正后的T峰峰值、C峰峰值，其根据T/C峰值比值或T/C峰面积比值计算浓度的过程同实施例1。
从图1可见，若按此方法确定的固定基底值要比T峰峰值大，那么计算后的T峰校正荧光强度值为负值，仪器将其重置为0,则最终浓度的测试结果为0。
结合实施例1与对比例1可见，本发明所述用于荧光强度基底计算的方法在检测浓度偏低的样本时仍能出值从而检测到较为准确的浓度，其相较现有固定基底计算方法更有利于降低浓度检测的误差，并有效解决在检测较低浓度样本时仪器测不出值的技术问题。
以上所述仅是本发明的较佳实施方式，故凡依本发明专利申请范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均包括于本发明专利申请范围内。

Claims (8)

1.一种用于荧光强度基底计算的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用荧光免疫分析仪以设定的测试频率f、测试时间t对试剂卡进行测试，按序输出荧光强度数据，从而在以输出数据序号X为横坐标、荧光强度值Y为纵坐标的坐标系上得到(f×t)个荧光强度点，得到对应的荧光强度散点图；
(2)确定所述荧光强度散点图中T峰、C峰的峰值位置点(XC，YC)；
(3)确定所述T峰、C峰的起始位置点(XS，YS)、终止位置点(XE，YE)；
(4)分别确定T峰、C峰的基底；所述T峰、C峰对应的基底的确定均包括以下步骤：将步骤(2)所得峰起始位置点(XS，YS)和峰终止位置点(XE，YE)连线，得到该线对应的线性函数f(X)，将所述线性函数f(X)作为基底B的计算函数；所述基底B为每个输出数据序号X对应于所述线性函数f(X)的函数值，即B＝f(X)，从而使得所述荧光散点图中波峰范围内每个荧光强度点均有对应的基底。
2.根据权利要求要求1所述用于荧光强度基底计算的方法，其特征在于，步骤(4)还包括分别将T峰、C峰的峰值位置点的横坐标XC代入线性函数f(X)，得到T峰、C峰对应的基底BC＝f(XC)，以BC＝f(XC)作为波峰范围内的每个荧光强度点的基底。
3.根据权利要求要求1所述用于荧光强度基底计算的方法，其特征在于，步骤(2)中所述T峰、C峰的峰值位置点(XC，YC)采用最大值或平均幅值法进行确定。
4.根据权利要求要求1所述用于荧光强度基底计算的方法，其特征在于，步骤(3)中所述T峰、C峰对应的峰起始位置点、终止位置点的确定均包括以下步骤：将峰值位置点的横坐标XC分别减去、加上峰宽W的一半，计算出峰起始位置点的横坐标XS和峰终止位置点的横坐标XE，再根据XS、XE在所述荧光强度散点图中找到其对应的纵坐标，从而确定到峰起始位置点(XS，YS)和峰终止位置点(XE，YE)。
5.根据权利要求要求1所述用于荧光强度基底计算的方法，其特征在于，步骤(2)中所述T峰、C峰的峰值位置点(XC，YC)的确定，均包括以下步骤：计算峰预设检索范围内荧光强度点的斜率值Ki，将斜率值以其对应的输出数据序号X从小到大作为排列顺序进行排序得到对应的斜率数组；所述斜率值Ki按以下公式计算：
Figure FDA0002779059120000011
其中，x为输出数据序号；y为输出数据序号对应的荧光强度值；m为预设的已知整数，m≥1；i为输出数据序号；遍历所得的斜率数组找出斜率值的最大值和最小值，根据斜率值的最大值、最小值找到其对应的输出数据序号记为Xmax、Xmin，通过在Xmax与Xmin之间找到斜率值绝对值最小的值所对应的输出数据序号，该输出数据序号对应的荧光强度点即为峰值位置点(XC，YC)。
6.根据权利要求要求5所述用于荧光强度基底计算的方法，其特征在于，所述m为1或2。
7.根据权利要求要求5所述用于荧光强度基底计算的方法，其特征在于，步骤(3)中所述T峰、C峰对应的峰起始位置点、终止位置点的确定均包括以下步骤：根据所得的Xmax、Xmin找到其对应的荧光强度点，所述荧光强度点即为峰的起始位置点(XS，YS)、终止位置点(XE，YE)。
8.根据权利要求要求1所述用于荧光强度基底计算的方法，其特征在于，步骤(1)中所述荧光免疫分析仪采用ADUCM360作为数据采集主芯片，所述设定的测试频率f为500Hz，所述测试时间t为3s。
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