CN116973563B - 一种基于正交锁相放大的免疫荧光层析测定方法及装置 - Google Patents

一种基于正交锁相放大的免疫荧光层析测定方法及装置 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫检测技术领域，提供了一种基于正交锁相放大的免疫荧光层析测定方法及装置，包括：利用试剂条获取待测样品上荧光标记物因受激光照射而产生的荧光；将所述荧光转化为表征荧光标记物浓度的待测量信号，并基于正交锁相放大技术对所述待测量信号进行解调，从而得到所述待测样品的浓度。本发明的优点在于采用正交锁相放大处理，提取同频率的有用信号，抑制其他频率的信号，使得特异性频率的信号得到放大，提高了信噪比，从而提高了检测的灵敏度。

Description

一种基于正交锁相放大的免疫荧光层析测定方法及装置
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及一种基于正交锁相放大的免疫荧光层析测定方法及装置。
背景技术
荧光免疫层析是一种常用的生物分析技术，它利用荧光标记的抗体与待检测物相互作用，通过荧光信号来检测待检测物的存在。
荧光免疫层析的灵敏度有限。由于荧光信号的强度受到许多因素的影响，如荧光标记的数量、荧光染料的性质、样品的浓度等，因此荧光免疫层析的灵敏度相对较低。在低浓度的样品中，荧光信号可能会被掩盖或淹没在背景噪声中，从而导致检测结果不准确。
为了避免非特异性噪声对检测的影响，目前已经提出了基于时间分辨的免疫荧光层析检测技术。该技术采用镧系元素及其螯合剂作为标记物，在脉冲光的激发下，利用镧族荧光物质相对于非特异性荧光具有较长的衰变时间特性，从而实现了有用光信号与非特异性光噪声在时间上的分离，通过延时采样，极大地降低了本底荧光，从而提高了检测的灵敏度。然而，该技术需要对激光器进行窄脉冲控制，对激光器开启关闭响应速度要求高，需要达到us级。采样频率大幅提高，对硬件性能指标需要更高的要求。大大提高了仪器的生成成本。
发明内容
本发明要解决的技术问题目的在于提供一种基于正交锁相放大的免疫荧光层析测定方法，用以解决上述问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于正交锁相放大的免疫荧光层析测定方法，所述方法包括：
利用试剂条获取待测样品上荧光标记物因受激光照射而产生的荧光；
将所述荧光转化为表征荧光标记物浓度的待测量信号，并基于正交锁相放大技术对所述待测量信号进行解调，从而得到所述待测样品的浓度。
进一步的，得到所述待测样品的浓度的步骤包括：
根据预设调制频率生成两个正交参考信号；
将所述待测量信号分别与两个参考信号相乘，并通过运算和窄带低通滤波获得试剂条上按照扫描步长所形成的荧光信号强度序列；
在所述荧光信号强度序列中寻找T带和C带的峰型，并确定峰型的起止点；
基于所述峰型在扣除背景信号后计算T峰和C峰的峰面积，进而得到T峰值和C峰值；
根据所述峰值与浓度标准曲线计算得到待测样品的浓度。
进一步的，所述正交参考信号表示为：
；
其中，为调制频率，θ为初始相位。
进一步的，基于二阶导数曲线来确定T带和C带的峰型特征点，进而得到T峰和C峰的特征信息，所述特征信息为峰起止点。
进一步的，所述峰型特征点包括左峰脚拐点、峰顶点、右峰脚拐点。
进一步的，根据二阶导数曲线的最小值点作为峰顶点，二阶导数曲线的最大值点作为峰脚拐点，并通过峰脚拐点与峰顶点的差值得出峰起止点。
进一步的，通过峰起止点确定一条线性直线，以所述线性直线作为峰型所在的背景干扰值进行扣除。
进一步的，以峰起止点作为积分起止时间，并以每个扫描步长的信号值作为权重系数进行加权累加计算，从而得到T峰值和C峰值。
本发明另一方面还提供一种基于正交锁相放大的免疫荧光层析测定装置，包括至少一个处理器、以及至少一个存储器，其中，
所述存储器存储有计算机程序，当所述程序被所述处理器执行时，使得所述处理器能够执行上述的基于正交锁相放大的免疫荧光层析测定方法。
本发明与现有技术相比，至少包含以下有益效果：
（1）采用正交锁相放大处理，提取同频率的有用信号，抑制其他频率的信号，使得特异性频率的信号得到放大，提高了信噪比，从而提高了检测的灵敏度；
（2）本发明通过二阶导数曲线从待测量信号中找出能够表征待测样品浓度的T峰和C峰，从而能够将样本中非标记物激发的荧光信号扣除，以提高检测的准确度。
附图说明
图1是本发明所提供实施例中基于正交锁相放大的免疫荧光层析测定方法步骤流程图；
图2是本发明所提供实施例中荧光发光随时间变化的曲线图；
图3是本发明所提供实施例中得到待测样品的浓度的步骤流程图；
图4是本发明所提供实施例中正交锁相方法的流程示意图；
图5是本发明所提供实施例中试剂条荧光信号强度曲线序列示意图；
图6是本发明所提供实施例中光斑移动的示意图；
图7是本发明所提供实施例中峰型特征点搜索过程的示意图；
图8是本发明所提供实施例中背景信号扣除的示意图。
具体实施方式
需要说明，在本发明中如涉及“第一”、“第二”、“一”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“连接”、“固定”等应做广义理解，例如，“固定”可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
以下是本发明的具体实施例，并结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
在本实施例中，如图1所示，提供了一种基于正交锁相放大的免疫荧光层析测定方法，该方法包括：
S1、利用试剂条获取待测样品上荧光标记物因受激光照射而产生的荧光；
S2、将所述荧光转化为表征荧光标记物浓度的待测量信号，并基于正交锁相放大技术对所述待测量信号进行解调，从而得到所述待测样品的浓度。
正交锁相放大是根据有用信号的特征频率，设置参考信号频率，由于参考信号和有用信号存在一定相位差。因此设置了正弦和余弦两个正交参考信号，分别与测量信号进行乘法运算，提取同频率的有用信号，抑制其他频率的信号，实现特异性频率的信号得到放大，提高了信噪比，从而提高了检测的灵敏度。
采用正交锁相处理后，虽然提高了信噪比，但是提取的特异性信号中仍然包含了相干噪声，主要包括同频率的环境噪声、试剂条背景荧光信号、以及样本中非标记物激发的短寿命荧光信号，如图2所示。在上述干扰信号中同频率的环境噪声、试剂条背景荧光信号是可以通过背景基线进行扣除，但是样本中非标记物激发的荧光信号则无法扣除。
由此，本实施例在基于正交锁相放大对待测量信号进行解调后，还需要从待测量信号中找出T峰和C峰，并通过计算T峰值和C峰值确定待测样品的浓度。
其中，如图3所示，得到所述待测样品的浓度的具体步骤包括：
S21、根据预设调制频率生成两个正交参考信号；
S22、将所述待测量信号分别与两个参考信号相乘，并通过运算和低通滤波获得试剂条上按照扫描步长所形成的荧光信号强度序列；
S23、在所述荧光信号强度序列中寻找T带和C带的峰型，并确定峰型的起止点；
S24、基于所述峰型在扣除背景信号后计算T峰和C峰的峰面积，进而得到T峰值和C峰值；
S25、根据所述峰值与浓度标准曲线计算得到待测样品的浓度。
步骤S21中，调制频率的目的是将信号的特征频率从低频调制到高频，由于噪声的影响主要存在于低频，例如二极管的1/f噪声或机械噪声。因此，频率调制是将试剂条中荧光信号的发光频率转移到了信噪比较优的高频，以此达到抑制噪声的目的。
对于噪声抑制来说，调制频率高有利于提高信噪比，但是频率高同样对硬件性能 要求也提高了，需要更高的采样率、更大的存储空间。因此为了兼顾性能和成本，需要折衷 选择调制频率。
如图4所示，根据调制频率生成的两个正交参考信号：
；
其中：为调制频率，θ为初始相位，无需跟待测量信号同步。
假设待测量信号为：
；
其中：A为有用荧光信号的强度，为调制频率，φ为初始相位，N（t）为非特异性 干扰信号。
那么待测量信号与参考信号乘积可表示为：
。
通过积化和差可得：
。
通过窄带低通滤波处理后：
。
因此荧光信号的强度为：
。
荧光免疫分析是对试剂条上每个位置点进行激光扫描测量，因此每个扫描步长将输出一个荧光信号强度A(i)，其中i为位置扫描步长。扫描完整的试剂条可以得到荧光信号强度序列数组x(n)。
如图5所示，试剂条扫描序列中包含了相干背景信号、T带、C带信号，其中T带、C带受光斑扫描平移的影响，信号从左到右是先增强后减弱。
如图6所示，当光斑直径≥T带或C带的宽度时，T带或C带的信号近似高斯峰；当光斑直径＜T带或C带的宽度时，T带或C带的信号将出现平顶峰。
为了提高信号强度，一般采用光斑直径≥带宽的方式，但这种方式形成的T、C峰信号中包含了带宽以外的信号，需要进一步扣除。
在步骤S23的峰型搜索中，首先需要确定带宽的起始线和结束线，两条线对应峰型的左峰脚点和右峰脚点，而峰位则对应带中心。
由于现实信号中背景基线并非是水平、平滑的，因此需要通过二阶导数曲线来确定上述峰型特征点，以消除基线干扰对特征点的影响。
如图7所示，信号处理首先要确定T峰、C峰的位置信息，即峰型的特征点信息。通过二阶导数确定左峰脚拐点、峰顶点、右峰脚拐点。根据二阶导数曲线的最小值点作为峰顶点，二阶导数曲线的最大值点作为峰脚拐点，并通过峰脚拐点与峰顶点的差值得出峰起止点。
峰脚拐点仅代表了该曲线在此处的最大曲率点，与峰起止点仍然不同，但是通过峰脚拐点与峰顶点的差值可以估算出峰起止点。
；
其中，Pst为峰起始点，Pen为峰结束点，PIL为左峰脚拐点，PIR为右峰脚拐点，PT为峰顶点。按标准高斯峰，K=0.8时，峰起止点幅值已经低于1%峰高值，可近似作为峰起止点。
光斑从进入T带和C带区域前，其检测信号是纯粹的背景干扰信号，当光斑进入T带和C带区域后检测信号是带内检测物质的荧光信号和背景干扰信号，此时背景信号可以认为保持不变，因为带内和带外的背景干扰信号可以认为是一致的。
如图8所示，背景干扰信号的扣除可以通过T峰和C峰的左右峰脚点的连线进行扣除，扣除后的信号强度即为带内荧光信号的强度。
通过光斑的运动过程可知，峰位对应的强度值包含了最大带内面积的荧光信号，因此单独采用峰高值是合理的。但是为了提高测量结果的稳定性，将光斑进入带内的所有信号均纳入T/C峰的累加计算，因为最终结果是T/C比值，因此这种处理并不影响最终结果，但可以提高稳定性。
在实际应用中，由于不同荧光强度的信号检测重复性不同，因此信号累加时需增加权重系数，以调节测量重复性的差异。
由此，在扣除背景信号后，以峰起止点作为积分起止时间，计算峰面积。并以每个扫描步长的信号值作为权重系数进行加权累加计算T峰值和C峰值，从而根据所述峰值与浓度标准曲线计算得到待测样品的浓度。
本实施例中还提供一种基于正交锁相放大的免疫荧光层析测定装置，其包括至少一个处理器、以及至少一个存储器，其中，
所述存储器存储有计算机程序，当所述程序被所述处理器执行时，使得所述处理器能够执行上述的基于正交锁相放大的免疫荧光层析测定方法。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (2)

1.一种基于正交锁相放大的免疫荧光层析测定方法，其特征在于，所述方法包括：
利用试剂条获取待测样品上荧光标记物因受激光照射而产生的荧光；
将所述荧光转化为表征荧光标记物浓度的待测量信号，并基于正交锁相放大技术对所述待测量信号进行解调，从而得到所述待测样品的浓度；
得到所述待测样品的浓度的步骤包括：
根据预设调制频率生成两个正交参考信号；所述正交参考信号表示为：
其中，为调制频率，θ为初始相位，t为时间；
将所述待测量信号分别与两个参考信号相乘，并通过运算和窄带低通滤波获得试剂条上按照扫描步长所形成的荧光信号强度序列；
在光斑直径大于等于带宽的前提下，从所述荧光信号强度序列中寻找T带和C带的峰型，并基于二阶导数曲线来确定T带和C带的峰型特征点，进而得到T峰和C峰的特征信息，所述特征信息为峰起止点；
所述峰型特征点包括左峰脚拐点、峰顶点、右峰脚拐点；根据二阶导数曲线的最小值点作为峰顶点，二阶导数曲线的最大值点作为峰脚拐点，并通过峰脚拐点与峰顶点的差值得出峰起止点；
通过峰起止点确定一条线性直线，以所述线性直线作为峰型所在的背景干扰值进行扣除；
基于所述峰型在扣除背景信号后以峰起止点作为积分起止时间，并以每个扫描步长的信号值作为权重系数进行加权累加计算，从而得到T峰值和C峰值；
根据所述峰值与浓度标准曲线计算得到待测样品的浓度。
2.一种基于正交锁相放大的免疫荧光层析测定装置，包括至少一个处理器以及至少一个存储器，其中，
所述存储器存储有计算机程序，当所述程序被所述处理器执行时，使得所述处理器能够执行权利要求1所述的基于正交锁相放大的免疫荧光层析测定方法。
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