CN111471588A - 一种实时荧光定量pcr仪模块 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种实时荧光定量PCR仪模块，能够实现温度控制，并能够通过荧光信号采集系统实时采集信号，可对PCR扩增全过程进行实时动态检测。本发明将主要功能高度集成，实时荧光定量PCR仪采用不同数量的模块可以根据需要设计成多种检测通道的仪器，仪器可广泛应用于医院，实验室和环境监测部门。

Description

一种实时荧光定量PCR仪模块

技术领域

本发明涉及一种实时荧光定量PCR仪模块，能够实现温度控制，并能够通过荧光信号采集系统实时采集信号，可对PCR扩增全过程进行实时动态检测。这一模块将主要功能高度集成，实时荧光定量PCR仪采用不同数量的模块可以根据需要设计成多种检测通道的仪器，仪器可广泛应用于医院，实验室和环境监测部门。

背景技术

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种在体外特异性扩增靶DNA序列的技术，其基本过程为模板双链DNA的变性、引物与模板DNA的退火和在DNA聚合酶引导下的链延伸反应三个阶段的多次循环。每一次循环后的扩增产物均可作为下一轮循环的模板，聚合酶链反应(PCR)是分子生物学中最强大的技术之一。在实时定量PCR中，PCR产物是在每个循环中检测的，通过监测反应的指数放大阶段的反应，用户可以非常精确地确定目标的初始数量。理论上讲，PCR可以指数级地扩增DNA，每个扩增周期目标分子的数量都会翻一番。

在实时PCR中，DNA的量在每个循环后通过激发荧光染料后测量，这些染料产生的荧光信号与PCR产物分子(扩增子)的数量成正比。通过与已知标准进行比较，循环次数和PCR最终产物的数量可以用来计算遗传物质的初始数量，这样可以解决稳健定量的需要。此外，每种实时PCR都必须有热循环器来精确的控制倍增过程。

中国发明专利CN103160426A公告的“一种新型PCR基因扩增仪模块机构”公开了一种PCR基因扩增仪模块机构，包括模块本体,还设置有与模块本体紧密连接的模块导热均板以及设置在模块导热均板上的多个传感器固定柱,所述的模块本体上设置有若干试管孔槽,试管孔槽的底部与试管孔槽开口方向相反的一侧设有若干个对应于试管孔槽的导热柱,所述的导热柱的端面与模块导热均板的板面贴压在一起。我们提出的核心模块在能够实现的功能和所采用零件种类和数量上不同与以上发明，每个模块仅包含一套温度控制，一套荧光激发和检测，一个试管孔槽，多个这样的模块组成的仪器可以实现多通道的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种实时荧光定量PCR仪加热模块，以解决现有技术中PCR基因扩增仪模块机构存在的结构问题，实现仪器在基于核心功能部分模块化的基础上进行多通道检测。采用该模块组装的仪器能够用于从制备的生物样品中鉴定DNA/RNA，在短短20分钟内提供高度准确和一致的测试结果，每个通道都可以独立的编程，这样检测仪可以同时运行不同方案、不同时间的多个实验，每个独立可编程通道执行四色实时荧光检测。

本发明实现其技术目的所采用的技术方案是：一种实时荧光定量PCR仪模块，包括模块本体，其特征在于模块本体设有

反应管插入口，所述反应管插入口设于模块本体的上部，用于插入反应器；反应管内置温度传感器，用于实时感测该区域的温度。

加热器，所述加热器设于反应管下方，用于给反应器加热；

荧光激发模块和荧光检测模块，位于加热器的下方，用于实现在PCR反应过程实现稳健定量的需要；

冷却装置，所述冷却装置位于模块本体内，所述冷却装置设有进水口和出水口，进水口上设有截止阀，所述冷却装置用于冷却反应管；

电路板，所述电路板设置于模块本体的下部，与加热器、荧光激发模块和荧光检测模块电连接，电路板上设控制单元，实现对加热器、荧光激发模块和荧光检测模块的控制。

进一步地，加热器由两个由陶瓷材料制成的加热板组成。

本发明实现冷却/加热，荧光激发和检测，每个模块都能够进行独立控制，经过热优化的反应管与模块的设计相结合，可实现非常快速的热循环和更快的扩增和检测，多个处理模块之间可以以链式形式连接在一起。这种模块化设计非常适合需要对测试样品进行自动、重复、快速加热和冷却循环的研究，如PCR和RT-PCR。进而用组装后的成品仪器可以使用杂交探针或插层染料检测特定序列。

附图说明

图1为本发明以水作为病毒源的样本制作过程示意图；

图2为本发明以空气作为病毒源的样本制作过程示意图；

图3为本发明病毒检测仪流程示意图；

图4为本发明实时荧光定量PCR仪的核心模块主要零件结构图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

分子诊断检测准确率高，周转时间快，有可能减少无效医疗服务的发生，提高患者预后，改善疾病管理，并使患者得到个性化护理。分子诊断学中的许多技术都是基于从生物样本(如血液或唾液)中提取和扩增的特定核酸的检测和鉴定，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。这使得预测一个人未来将感染的疾病，确定传染性病原体的身份和毒性，或者确定一个人对药物的反应成为可能。PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，这种方法最大特点是能够将微量DNA或RNA中的特定序列经过复制大幅增加，或“放大”，几千到上百万倍,用荧光染料标记寡核苷酸标记生成的产物，通过对产物进行分析和周期测定，监测指数放大过程，可以确定目标病毒的初始数量，具有很好的特异性和敏感性。实时荧光定量PCR仪的操作分为以下的四个基本步骤：

1.样本制备；

2.核酸提取；

3.核酸扩增；

4.产物检测

1.样本制备

需要先制作不同的需要检测的生物学样本后才能进一步分析，不同的样本源需要采取不同的方式制作样本，从动物身上采集的样本应包括肠道内容物(粪便)或泄殖腔拭子和口咽拭子。当病毒源3是水时需要特殊的采集和过滤装置，以被病毒污染的水源为例进行样本制作，目前对水体进行氯化消毒是最常用的方法，但不能很容易地从处理后的水中去除病毒。因此有必要在处理前对水中的病毒进行检测，以确定消毒剂的投加量，确保处理后水的卫生安全水平。因为病毒通常都是有害的操作者1在接近病毒源3前都要采取适当的个人防护2措施，对于水这种病毒源可通过孔径很小的超滤膜5作为采样介质进行截留,借助于带负电的过滤器，应用带正电的过滤器，借助8％的聚乙二醇从溶液中沉淀病毒，过滤后使用甘氨酸洗脱溶液4将病毒从过滤器中洗脱出来，超滤膜的截留率可达到100％，高效地富集环境中的极微量病毒,然后用于检测，其余的可作为杂质处理6。

当病毒源3是空气时的病毒采集方式目前以固体撞击式和过滤式居多，过滤器收集结合PCR的检测方法相对于传统的撞击式收集器结合细胞培养的方法更具优势。便携过滤式收集器可以进行长时间(40h)的样品收集，而撞击式收集器只能进行短时间(15～20min)的收集。普通的过滤式滤膜采用纤维素类滤膜，因为病毒颗粒较小，容易在缝隙中卡住而洗脱难度大，导致实际检测到的病毒载量小于实际采集到的病毒数量。并且操作难度大，洗脱液用量大，后续浓缩也成问题。可以采用明胶制成的单层超滤膜5，可溶于水，标称孔径3μm，区别于普通的3μm滤膜，明胶膜厚度为250μm，是普通纤维素类滤膜的两倍以上，电镜下可见疏松多孔结构，用于深层过滤，可以有效截留粒径较小的微生物。依据ISO14698验证对病毒具有99.94％的截留率，通过设置合适的流速与采样体积，对空气中的病毒进行截留。采样结束后使用缓冲液溶解明胶膜，收集样品中的病毒，并进行下一步PCR检测，可以灵敏检测出空气中低浓度的病毒，检测限为10-50个病毒/L空气。

2.核酸提取

许多样本类型用于遗传分析，如血液、尿液、痰液和组织样本。诊断测试确定所需样本的类型，因为并非所有样本都代表疾病过程。这些样品含有多种成分，但通常只有一种成分是我们感兴趣的。例如，在血液中，高浓度的红细胞会抑制病原体的检测。因此，通常需要在核酸测试开始时进行纯化和/或浓缩步骤。提取核酸的确切方法取决于要进行的样本和诊断分析。例如，提取病毒RNA的方案将与提取基因组DNA的方案有很大不同。然而，从靶细胞中提取核酸通常需要一个细胞裂解步骤，然后是核酸纯化。细胞裂解步骤破坏细胞和核膜，释放遗传物质。这通常是用裂解剂来完成的，比如十二烷基硫酸钠，它还可以破坏细胞中存在的大量蛋白质。RNA纯化试剂7可以从各种可接受的样本中提取病毒RNA。采用在专有树脂条件下的旋转柱层析法可从化学分解容器8中分离出高质量的RNA，其中不含其他细胞成分。

3.核酸扩增

目标DNA或RNA可能以非常少量的形式存在于提取的材料中，特别是如果目标是致病来源的话。核酸扩增11提供了选择性地扩增低浓度特定靶标到可检测水平的能力，最常用的核酸扩增技术是聚合酶链反应(PCR)。PCR是一种在复杂DNA背景下扩增靶DNA序列的强大技术，它是一个指数过程，只要维持反应的条件是可以接受的，它就会继续进行。操作时使用即用型R检测试剂盒对纯化的RNA进行扩增。这种试剂是一种逆转录酶的酶，它将RNA转录成cDNA，然后扩增得到的cDNA，再使用耐热聚合酶试剂10扩增病毒的特异性片段。

该反应的组件包括：

1.一对引物-短链DNA，约有10-30个核苷酸与目标序列两侧的区域互补。

2.DNA聚合酶，一种合成DNA的耐热酶。

3.脱氧核糖核苷三磷酸(Dntps),提供与新合成的DNA链结合的核苷酸。

4.缓冲液-为DNA合成提供最佳的化学环境。

聚合酶链反应通常包括将这些反应物放在一个装有提取的核酸的小试管(10-50微升)中。试管被放置在热循环器中,一种使反应在一系列不同温度控制9下持续不同时间的仪器。每个热循环的标准方案包括变性阶段、退火阶段和延伸阶段。除这种三步方案之外，还可以采用结合退火和延伸阶段的两步热方案。变性阶段通常包括将反应温度提高到90-95℃以使DNA链变性；在退火阶段将温度降低到50-60℃以便引物退火；然后在延伸阶段将温度提高到60-72℃作为引物延伸的最佳温度。这一过程循环重复约20-40次，最终结果是在引物之间产生数百万个目标序列拷贝。这里PCR方法包含多种形式，如多重PCR、接头引物PCR、直接PCR、串联PCR、实时PCR和逆转录酶PCR等。保持样品混合物靠近加热器，并使用非常小的流体体积，可以在核酸扩增过程中进行快速的热循环。每个热循环(即变性、退火和引物延伸)在不到30秒内完成，以这样的速度进行热循环可以使测试模块在不到10分钟的时间内完成核酸扩增过程。

4.产物检测

核酸扩增完成后，对扩增产物进行产物检测15，以确定是否产生了预期的扩增子(目标核酸的扩增数量)，分析产物的方法从简单地通过凝胶电泳确定扩增子的大小，到利用DNA杂交鉴定扩增子的核苷酸组成。

凝胶电泳是检查核酸扩增过程是否产生预期扩增片段的最简单方法之一。凝胶电泳使用施加在凝胶基质上的电场来分离DNA片段。带负电荷的DNA片段将以不同的速率通过基质，这主要取决于它们的大小。电泳完成后，可以对凝胶中的片段进行染色，使其可见。溴化乙锭是一种常用的染料，在紫外光照射下会发光。片段的大小是通过与DNA大小标记(DNA梯形图)进行比较来确定的，DNA梯形图包含已知大小的DNA片段，在扩增子旁边的凝胶上运行。因为寡核苷酸引物结合到目标DNA两侧的特定位点，所以扩增产物的大小可以作为凝胶上已知大小的条带进行预测和检测。为了确定扩增子的特性，或者如果已经产生了几个扩增子，通常采用DNA探针杂交扩增子。DNA杂交是指通过互补碱基配对形成双链DNA。DNA杂交FBR阳性鉴定特定扩增产物需要使用长度约为20个核苷酸的DNA探针。如果探针具有与扩增子(靶)DNA序列互补的序列，则杂交将在温度、pH和离子浓度的有利条件下进行。如果发生杂交，则原始样本中存在我们感兴趣的基因或DNA序列。

光学检测是检测杂交最常用的方法。要么标记放大器，要么标记探针，以便通过荧光或电化学发光来发光。这些过程在产生发光部分的激发态的方法上有所不同，但都能实现核苷酸链的共价标记。在电化学发光(ECL)中，光是由发光体分子或配合物在电流刺激下产生的。在荧光学中，是激发光的照射导致发射。使用在荧光分子吸收的波长处提供激发光的照明源和检测单元来检测荧光。检测单元包括用于检测发射信号的荧光激发和检测11(诸如光电倍增管或电荷耦合器件(CCD)阵列)和用于防止激励光被包括在荧光激发和检测输出中的机构(诸如波长选择滤波器)。荧光分子响应于激发光发射斯托克斯移位的光，该发射的光由检测单元收集。斯托克斯频移是指发射光和被吸收的激发光之间的频差或波长差。微阵列使FBR数十万个DNA杂交实验可以同时进行。微阵列是一种强大的分子诊断工具，有可能在一次测试中筛查FBR数千种遗传性疾病或检测大量传染性病原体的存在。微阵列由许多不同的DNA探针组成，它们以斑点的形式固定在底物上。目标DNA(扩增子)首先用荧光或发光分子标记(在核酸扩增过程中或之后)，然后施加到探针阵列。微阵列在温度可控、潮湿的环境中孵育数小时或数天，同时探针与扩增子之间进行杂交。孵育后，必须在一系列缓冲液中洗涤微阵列以除去未结合的链。一旦清洗，使用气流(通常是氮气)干燥微阵列表面。杂交和洗涤的严格性至关重要。不够严格可能会导致高度的非特异性结合。过于严格可能会导致适当的结合失败，从而导致敏感性降低。杂交是通过检测标记的与互补探针形成杂交的扩增子的光发射来识别的，因此需要荧光激发和检测12。

使用微阵列扫描仪检测来自微阵列的荧光，该微阵列扫描仪通常是计算机控制的反向扫描荧光共聚焦显微镜，其通常使用荧光染料的激光FBR激励和荧光激发和检测(例如光电倍增管或CCD)来检测发射的信号。荧光分子发出由检测单元收集的斯托克斯移位光。必须收集发射的荧光，将其与未吸收的激发波长分离，并将其传输到探测器。在微阵列扫描仪中，通常使用共焦布置来通过位于图像平面的共焦针孔来消除额外信息。这仅允许检测光的特定部分，防止来自物体焦平面上方和下方的光进入检测器，从而提高了信噪比。探测器将检测到的荧光光子转换为电能，随后将电能转换为数字信号。该数字信号转换为表示来自给定像素的荧光强度的数字。阵列的每个特征由一个或多个这样的像素组成。扫描的最终结果是阵列表面的图像。每个探针在微阵列上的确切序列和位置是已知的，因此可以同时识别和分析杂交的靶序列。加湿器13在操作期间可以防止试剂的蒸发，湿度传感器14检测试剂周边的湿度，并控制加湿器的启动和停止，湿度传感器具有电容梳状结构，随着湿度的增加，电极之间的气隙的介电常数增加，因此电容也增加。

本发明的实时荧光定量PCR仪模块将第3步核酸扩增和第4步产物检测所涉及的零部件高度集成到一起。

请参见图4，图中表明了实时荧光定量PCR仪的核心模块主要零件结构：15.反应管插入口；16.加热器；17.荧光激发；18.荧光检测，19.截止阀，20.进水口，21.出水口，22.电路板，而以上仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但且不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

一次性反应管插入反应管插入口15，加热器16从而为PCR的倍增提供温度条件。温度控制部分包含加热和制冷的零件，由两个由陶瓷材料制成的加热板组成的加热器16实现升温，陶瓷材料具有高导热性，以确保温度均匀和快速传热。电阻加热器元件使用厚膜技术沉积在陶瓷板上，直接连接到每个板上的热敏电阻监控其温度。冷却是通过内置的水冷管来完成的，因此包含进水口20和出水口21，水流过后将对反应管进行降温，达到设定温度后将关闭截止阀19。热循环室的温度由仪器固件控制。固件集成了一个控制回路，以确保板的快速加热，并控制它们的温度超调到所需的点附近，从而使反应管中的流体温度能够快速而精确地改变。以下为加热和冷却部分的温度控制精度：

加热温升(最大)：10℃/秒，从50℃到95℃；

冷却温降低(最大)：2.5℃/秒，从95℃到50℃；

温度精度：0.5℃，从60℃到95℃；

温度持续精度：距设定时间1.0秒。

荧光激发模块17和荧光检测模块18包括高强度发光二极管(LED)、硅光电探测器和适当的滤波器来激发和检测四个不同的光谱波段。该光学系统包括四色激励器模块和四色探测器模块。这些块被定位在设备内，使得它们的孔与反应管的光学窗口匹配，从而允许对反应混合物进行激发和发射检测，染料检测下限:<2nm,四个通道的激发和检测光谱带为：

表1:光通道的激励和检测范围

虽然光学处理部分使用上表中提到的五种染料进行校准，但如果执行用户定义的光学校准，则可以使用激发和发射波长在这些范围内的其他染料。通过使用标记了不同荧光染料的探针，在一个反应混合物中可以同时扩增和检测多达四种染料和靶标。每个模块中有四个光纤通道，每一个通道用LED的特定光谱带照亮反应混合物，并检测来自特定区域内的反应混合物的排放光谱带，光学系统总是从所有四个通道收集数据。由于荧光染料的发射光谱可能会重叠，因此特定染料的存在将导致在多个通道中产生信号，需要采用适当的校准和数据分析算法来从每种染料中分离出信号。定量内部控制(QIC)-用于校正每个通道的分析偏差而导致的实际上的分析性能的差异。它还可以校正由于试剂的可变性造成的差异，以及由于样品成分造成的任何轻微抑制。当通道被指定为QIC时，指定为检测的所有通道的周期阈值将归一化为QIC的周期阈值，在指定的周期范围内监控此通道的阈值差异。目标的标准曲线将通过绘制循环阈值与对数浓度的关系图来生成。

采用独特的聚丙烯反应管能够获得最佳的热和光学特性，细反应管允许快速加热和冷却反应混合物，从而快速扩增，该反应管还包括沿该管的底边彼此成90°角的两个光学检测窗口，这些光学窗口模块光学检测分析块贴邻，以允许进行荧光激发和发射检测。用于监控反应室温度的热敏电阻偏差范围是±0.50℃，在制造过程中，加热系统的温度在60℃和95℃两个温度下测量，校正加热器原始热敏电阻读数微小误差的校准系数存储在每个模块的存储器中。使用标准浓度的物质来校准光学系统，对于每个光通道，从荧光染料产生的原始信号中减去单独由缓冲器产生的背景荧光信号(来自非结合探针的初始荧光信号，非特异性探针或样品的自体荧光裂解，背景信号不是由扩增产物产生的。)以确定光谱特性，这种减去背景的方法用于调整所有对象的显示信号，它将采样数恢复到共同的起始点零，用软件分别计算并减去平均的背景荧光信号。

实时PCR提供了在对数线性阶段而不是反应终点期间分析数据的能力。实时PCR采用非序列特异性嵌入染料(注：溴化乙锭不能用作该系统中的嵌入染料)或荧光染料标记序列特异性探针，以实时显示和监控扩增产物。荧光与周期数的关系图产生一条称为生长曲线的S形曲线。为了进行实时PCR分析，反应的对数线性阶段被用来确定每个样品的循环阈值(Ct)，Ct最基本的定义是背景上方荧光显著增加的第一个周期。在实际应用中，可以用一种以上的方法测定Ct，以提供PCR扩增样品的准确比对。通过执行实时PCR分析，可以提供对DNA和RNA的可重复的定性和定量分析。改变阈值将改变Ct，可以将阈值设置得非常接近背景荧光，以实现更快的回答或更灵敏的检测极限。设置得太接近背景荧光，背景噪声可能会超过阈值，并被错误地报告为Ct，阈值可以设置为更高的荧光，这样可以避免错误，但可能会降低灵敏度。因此选择二次导数进行曲线分析，它表示生长曲线斜率的变化率。二阶导数的最高点代表生长曲线的最大曲率点。如果二阶导数峰高于阈值，则报告Ct。如果峰值低于阈值，则不报告Ct。阈值可以设置为显著高于背景荧光，而不会影响Ct。因为Ct由生长曲线的形状确定，并且与荧光信号的大小无关，所以二阶导数分析更具重现性。

Claims (2)

1.一种实时荧光定量PCR仪模块，包括模块本体，其特征在于模块本体设有

反应管插入口，所述反应管插入口设于模块本体的上部，用于插入反应器；

反应管内置温度传感器，用于实时感测该区域的温度；

加热器，所述加热器设于反应管下方，用于给反应器加热；

荧光激发模块和荧光检测模块，位于加热器的下方，用于实现在PCR反应过程实现稳健定量的需要；

冷却装置，所述冷却装置位于模块本体内，所述冷却装置设有进水口和出水口，进水口上设有截止阀，所述冷却装置用于冷却反应管；

电路板，所述电路板设置于模块本体的下部，与加热器、荧光激发模块和荧光检测模块电连接，电路板上设控制单元，实现对加热器、荧光激发模块和荧光检测模块的控制。

2.如权利要求1所述的实时荧光定量PCR仪模块，其特征在于加热器由两个由陶瓷材料制成的加热板组成。

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