JP2023547498A - マルチプレックス核酸検出のためのジェネリックカートリッジおよび方法 - Google Patents

マルチプレックス核酸検出のためのジェネリックカートリッジおよび方法 Download PDF

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Abstract

本発明の分野は概して、マルチプレックス反応設定における核酸標的の検出に関する。特に、本明細書に開示されるのは、ジェネリック検出カートリッジ内のカスタム遺伝子標的パネルを使用してマルチプレックスＰＣＲ検出を実施するための方法、キット、部品のキット、システムまたはそれらの構成要素である。開示される方法およびキットは、典型的には、変異、ＳＮＰｓ、病原性配列、エピジェネティック病変などを含む多数、すなわち数十のパーソナライズおよび／またはカスタマイズされた遺伝子標的のための自動化されたマルチプレックスＰＣＲベースの検出アッセイを速やかに設計するために利用することができる。開示される方法および製品の根底にある一般原理は：（１）ジェネリックレポーターが予め搭載されたパネル・アグノスティックジェネリック検出カートリッジ；およびそれとは別に（２）ＰＣＲ増幅条件下の標的存在下、カートリッジの内部でジェネリックレポーターと特異的に反応し、かつそれからシグナルを生成することができる分子の生成につながる標的特異的マルチプレックスＰＣＲオリゴヌクレオチドプールの提供である。その結果、本明細書に開示される方法および製品は、標準的な診断アッセイ開発パイプラインを非常に単純化し、したがって、カスタム選択された遺伝子検査パネルを以前に可能であったよりも速い速度で検査室および患者にもたらすのに非常に有利である。

Description

本発明の分野は、概して、マルチプレックス反応設定における核酸標的の検出に関する。特に、本明細書に開示されるのは、ジェネリック検出カートリッジ内のカスタム遺伝子標的パネルを使用してマルチプレックスＰＣＲ検出を実施するための方法、キット、部品のキット、システムおよびそれらの構成要素である。開示される方法およびキットは、典型的には、変異、ＳＮＰｓ、病原性配列、エピジェネティック病変などを含む多数、すなわち数十のパーソナライズおよび／またはカスタマイズされた遺伝子標的のための自動化されたマルチプレックスＰＣＲベースの検出アッセイを速やかに設計するために利用することができる。開示される方法および製品の根底にある一般原理は：（１）ジェネリックレポーターが予め搭載されたパネル・アグノスティックジェネリック検出カートリッジ；およびそれとは別に（２）ＰＣＲ増幅条件下の標的存在下、カートリッジの内部でジェネリックレポーターと特異的に反応し、かつそれからシグナルを生成することができる分子の生成につながる標的特異的マルチプレックスＰＣＲオリゴヌクレオチドプールの提供である。その結果、本明細書に開示される方法および製品は、標準的な診断アッセイ開発パイプラインを非常に単純化し、したがって、カスタム選択された遺伝子検査パネルを以前に可能であったよりも速い速度で検査室および患者にもたらすのに非常に有利である。
背景
個体における感染、臓器移植拒絶反応またはがんのような遺伝子的に多様な疾患状態をモニターすることを可能にするパーソナライズされた診断アッセイの迅速かつ端的な開発が世界的に必要とされている。そのようなアッセイは、患者に特異的な遺伝情報に基づき、高い信頼性を提供し、かつ費用効果が高いままであるべきである。現在存在する方法は、あまりに時間および資源集約的であり、その結果、適した解決策を提供できない。
がん分野では、既に２１世紀の最初の数年から、本発明者らは、がん型特異的診断および処置から、個体の根底にあるジェネティクスおよび免疫応答に強く焦点を当てた診断および汎がん治療へのより個別化されたアプローチへのパラダイムシフトを目の当たりにしている（Hanahan and Weinberg, 2011, Cell 144:646-674）。したがって、現在、がんは、１つの一様な疾患ではなく、多くの異なる遺伝子的に決定された後天性病的増殖症候群に関する包括的な用語であり、ここで、がん型毎だけでなく、個々のがん毎でさえユニーク遺伝子変異プロファイルを有するように見受けられることがより広く認識されている（Ciriello et al., 2013, Nat Gen 45:1127-1133）。したがって、多くのがんにおけるＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、またはＥＧＦＲ遺伝子中のものなどの検出可能かつ治療的に標的化可能なドライバー変異が依然として非常に頻繁に蔓延しているにも関わらず、相当な数のがん症例が残っており、ここで、個々に焦点を合わせた試験は、患者の管理および転帰に大いに恩恵をもたらし得る。
そのような個別化されたスクリーニングを実施する１つの方法は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）による。ＮＧＳ解析は、徐々により手頃な価格になりつつあるのにも関わらず、依然として比較的費用がかかり、かつデータ解釈のために専門家の関与を必要とし、それは、一般医には通常手が届かない。また、ＮＧＳ結果を得るための待ち時間は、依然として相当なものである。したがって、ＮＧＳは、通例のまたは定期的なフォローアップがん治療には大部分は不適な技法であり、しばらくの間は恐らく依然としてそのままであろう。現存する完全に自動化されたシステムの速度、感度、使いやすさ、および利用可能性を考えると、恐らく最良の解決策は、選択された標的のｑＰＣＲベースの検出により提供され得る。さらに、これらの完全に自動化されたシステムは、試験の世界的展開を可能にし、それは、試験を患者により身近にし、かつ全世界の患者のアクセスを確保する。優れた変異パネル特異的診断試験は、最先端のアッセイ開発パイプラインを有する、Biocartis NVを含む幾つかの提供者からがん患者が容易に利用可能であるが、パーソナライズされたカスタム標的特異的カートリッジの提供は、メーカーの利益性マージンを下回る。限られた資金および投資回収という考慮事項にも関わらず、新しい診断カートリッジを現在の開発手順に付することは、個人の観点からは長すぎる標準的な開発および製造リードタイムを依然として伴う。その結果、パーソナライズされた遺伝子アッセイをはるかに速く、かつより安価に開発することにより、個人のためのがんフォローアップ治療を、特に分子サーベイランス試験、手術後および微小残存病変（ＭＲＤ）モニタリングのために変化させることが緊急に必要とされている。
多くの製造会社にロックダウンを課し（それは、タイムラインおよび市場投入までの期間の延長にさらに寄与した）、ヘルスケアおよび疾患モニタリングシステムへの多くの患者のアクセスを大幅に制限した２０２０年の世界的なＣｏｖｉｄパンデミックの突然の発生に伴って、カスタムｑＰＣＲ検出ベースの試験のより速く、かつ費用効果がより高い開発に新しい手法がかつてないほど必要とされていることが明らかになった。特に、検出を困難にする、絶えず変異する全く新しいウイルス性病原体としてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の出現に鑑みて、そのような新しい手法が、人体以外からの配列の検出に一般に適用可能であり、かつ急速に変化する配列の検出を含むように極めてカスタマイズ可能かつ容易に適合可能であることが特に望ましかった。
臨床サンプルと共にカートリッジに導入して、対象の標的をカートリッジ内で検出することができる大規模マルチプレックスｑＰＣＲ標的に特異的でカスタマイズ可能なオリゴヌクレオチドプールと適合し、かつジェネリックレポーターを含むジェネリックな、すなわち標的アグノスティックな一般的な検出カートリッジを含む新しいプラットホームを提供することにより、そのようなアプローチを本発明者らは開発したと本発明者らは考える。本明細書に提示されるアプローチには、これらに限定されないが：液体生検を使用するパーソナライズされた分子サーベイランス試験、パーソナライズされた療法選択、処置および／または再発モニタリング、手術後のフォローアップ、ＭＲＤの検出、補助療法後およびさらには再発のケースの再発モニタリング、耐性変異の獲得および処置に対する反応のモニタリングを含むパーソナライズされた腫瘍モニタリングにおいて、ならびに細胞療法、パーソナライズされたがんワクチンおよびネオ抗原標的免疫療法において、これまでにない用途が見つかるであろうと本発明者らは考える。本明細書に開示される方法および製品は、移植モニタリングまたは出生前検査を含むがん適用外における使用、同様に、非ヒト配列の検出（例えばウイルス性および細菌性病原体を検出するために）感染性疾患の分野、敗血症の検出、マイクロバイオームのキャラクタリゼーションおよび多くのその他における使用に等しく適用可能である。
本開示は、ポイントオブケア（ＰｏＣ）機器のためのジェネリック検出カートリッジ内のカスタマイズされた遺伝子標的パネルを使用して遺伝子標的のマルチプレックス検出を実施するための方法、キット、部品のキット、システム、およびそれらの構成要素を提供する。開示される方法および製品の根底にある一般原理は、少なくとも２つの以下の別々の構成要素を提供することに基づいている：
（１）ジェネリック配列の存在を検出するように構成されたジェネリックレポーターが予め搭載されたパネル・アグノスティックジェネリック検出カートリッジ；およびそれとは別に
（２）ＰＣＲ増幅条件下の標的の存在下で、ジェネリック配列を含み、その結果、カートリッジの内部でジェネリックレポーターと特異的に反応し、かつそれからシグナルを生成することができる分子（さらには検出可能な分子と呼ばれる）の生成につながる標的特異的マルチプレックスＰＣＲオリゴヌクレオチドプール。
上記で説明した概念は、現在の診断アッセイ開発の実施において非常に新しい。現在までのところ、本出願人の知る限りでは、適切な検出反応、および標的治療可能な変異など、アッセイ遺伝子標的により事前定義されたものに対して特異的なオリゴヌクレオチド試薬を予め搭載させる、アッセイ特異的サンプル・ツー・リザルト診断カートリッジが存在するのみである。現存するカートリッジは、それらの定義された遺伝子標的の検出において優れて迅速かつ高感度であり得るが、それらの設計は、最適化、検証、試験など、ならびに材料コストおよび待ち時間に関して、例えば、オリゴヌクレオチドプローブのような標的特異的試薬または他の時には非常に精巧な増幅および／または検出システムのために、相当な労力が伴う。加えて、固定された診断パネルを含む作業カートリッジが開発されると、その標的特異的試薬を、例えばパネルに追加の標的を含むように、さらに変更したり、または適合させたりすることは簡単ではない。例えば、変更された製品の性能を妨げないために、新たに導入されるオリゴヌクレオチドと初期のオリゴヌクレオチドの間のあらゆる負の相互作用をまず排除しなければならない。追加の問題が選択中に生じたり、または色素もしくはクエンチャー間の潜在的な不適合性が、現存する溶液およびあらかじめ最適化された溶液へのプローブのような新しい標的特異的レポーターの添加後に生じたりする可能性がある。問題は、多くのレベルで生じる可能性があり、したがって、アップデートを行ったり、または特定の使用者のニーズに合わせたりするための現存する標的特異的アッセイへの見たところ些細な変更の導入でも簡単ではなく、相当な製品再設計の労力を必要とすることがあることを認識しなければならない。
キット、部品のキット、カートリッジ、システムおよび構成要素を含む、本明細書に提示される方法および製品は、すべての必要なサンプル加工および増幅反応が予め搭載された、サンプル・ツー・リザルトジェネリック検出カートリッジを提供することにより、上記の欠点の幾つかまたはすべてに対処するが、現存するアッセイ特異的カートリッジの診断標的特異的試薬の代わりに、ジェネリック検出カートリッジは、ジェネリック配列タグの存在を検出するように構成された一般的なレポーター（例えば標識プローブ）を含む。設計または再設計の労力を避け、開発コストならびに標的特異的レポーターの合成および送達のための待ち時間を削減するために、そのようなジェネリック検出カートリッジは、前もって大規模に試験し、特徴付け、生産し、かつ必要とされるとき病院、診療所、または試験センターなどのクライアントに迅速に供給するために備蓄することができる。次いで、顧客は、前記カートリッジと適合するカスタム選択された標的特異的オリゴヌクレオチドサブセットの所望のミックスを定義し、注文することができる。オリゴヌクレオチドサブセットは、標的特異的プライマーまたはプライマー対を含むことができるが、選択される増幅反応に応じて、プライマーまたはプローブとして作用する１種または複数種の追加のオリゴヌクレオチドを含むこともできる。ジェネリックレポーターを搭載したジェネリックカートリッジとのオリゴヌクレオチドサブセットミックスの適合性は、以下に依存するであろう：（ｉ）カートリッジの内部で１つのマルチプレックス増幅反応において実施するそれらの能力；および（ｉｉ）カートリッジの内部の定義されたジェネリックレポーターに関連し、かつそれにより検出可能なジェネリック配列タグを含む核酸産物を、その標的の存在下で生成する各標的特異的オリゴヌクレオチドサブセットの構成。
その結果、使用者の観点から、一般的な方法と比べた上記で説明した概念の差は、固定された診断パネルに対して特異的な試薬が既に予め搭載されたカートリッジを含む単一のパッケージの代わりにジェネリックカートリッジおよび標的特異的オリゴヌクレオチドプールを含む２（以上）構成品を使用者が受け取ることである。その結果、生物学的サンプルのみをアッセイ特異的カートリッジに挿入する代わりに、使用者は、標的特異的オリゴヌクレオチドのミックスも挿入する；図１に概略的に示されており、かつ現在の方法に対して最小限の追加の取扱い負担のみを構成する手順。
反対に、アッセイ設計観点から、ジェネリックカートリッジベースのアプローチは、本発明者らの推定では少なくとも数カ月から１年、ある種の例では最長数年、新しいアッセイの提供時間を大幅に短縮する膨大な可能性を有する。この理由は、核酸単離反応およびレポーターシステムをジェネリックカートリッジタイプ毎に標準化し、標的特異的オリゴヌクレオチドサブセットのミックスとの効率的なマルチプレクシング反応の確立に集中する設計の労力を排することができるためである。
しかし、高レベルのマルチプレクシングを達成するのは困難であるという広く確立された考えが当分野にある。例えば、５つの増幅チャンバーを有する現在市販されているBiocartis Ｉｄｙｌｌａ（商標）カートリッジ内で、例えば２０種の異なるバリアントを検出したい当業者は、並行して１つまたは幾つか、すなわち、すべてのチャンバー内でそれぞれ、２０プレックス反応を行うことすら考えずに、５つの並行な４プレックス（各チャンバー内で１つ）を設計することを自然に目指すことになる。特に、所与のシステムが、増幅チャンバーに紐付けられ、かつその中のレポーターからのシグナルを取り込むために適合された一定数の波長固有の検出チャネルを有する場合、検出チャネルの数を超える数種の標的とのマルチプレックス反応をそのような増幅チャンバー内で行うことを当業者が考えることもありそうにない。
マルチプレックス増幅において標的の数の増加を考えることは、低コピー標的が関わるとき、さらにいっそう可能性が低くなる。それの顕著な例には、血漿または尿を含む体液サンプルからの循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）中に存在するバリアントが含まれる。適切なモニタリング試験は、患者からのサンプル中の１％以下、好ましくは０．１％以下のｃｆＤＮＡの検出を可能にすべきである。１％のバリアントまたはそれ未満を検出することができるシングルプレックスｑＰＣＲアッセイの開発は既に困難であることは当業者に周知である。その結果、標的バリアントのそれぞれについて１％のバリアントを検出することができるマルチプレックスｑＰＣＲアッセイの開発は、ｑＰＣＲ反応において使用される異なるプライマーおよびプローブが互いに干渉し、それによってアッセイの性能を低下させることがあるのでさらにいっそう困難であることが当業者には分かるであろう。
さらに、プライマー設計に一般に利用可能なツールは、依然として大部分は、プライマーおよびプローブ挙動を予測する初歩的な熱力学プロファイリングモデルに基づく。しかし、実際には、反応条件は、バッファ添加剤、プライマー－鋳型ミスマッチの取扱いに関係する酵素特異的挙動、ＰＣＲランプ速度およびサイクルタイムの影響などを含む、熱力学モデルにおいて考慮されなかった構成要素を典型的に含む。その結果、利用可能なオリゴヌクレオチドツールがプライマーおよびプローブ挙動の予測に特に適していないことも広く認識されており、それは、１％未満のバリアントがマルチプレックスＰＣＲで検出されるべきである高性能アッセイにとって特に決定的である。
マルチプレクシングが提起する広く認識された課題に関する上記の３つの主な理由のために、本発明者らは、本明細書に提示されるジェネリック検出カートリッジ概念の開発を誰も現在まで試みていないと考える。しかし、本発明者らは、本明細書に提示される概念の実現可能性を試験し、サンプルと共にそこに導入されるマルチプレクシングカスタム設計遺伝子標的パネルと適合する極めて有望なジェネリックカートリッジプロトタイプを作成した。本発明に開示されるジェネリック検出カートリッジの根底にある設計原理、ならびにそれに基づく方法、キット、構成要素、および使用は、１つまたは複数のＰＣＲチャンバーを有する任意のランダムアクセスサンプル・ツー・レポートデバイスを含むすべてのｑＰＣＲベースの検出手法に一般に適用可能である。それらの利点には、設計の労力、材料コスト、および注文待ち時間の大幅な削減が含まれる。これらおよび他の特徴ならびに利点は、続いて説明される。
概要
本開示は、ジェネリック検出カートリッジ内のカスタマイズされた遺伝子標的パネルを使用して遺伝子標的のマルチプレックス検出を実施するための方法、キット、部品のキット、システム、およびそれらの構成要素を提供する。開示される方法および製品の根底にある一般原理は、少なくとも２つの以下の別々の構成要素を提供することに基づいている：
（１）ジェネリック配列の存在を検出するように構成されたジェネリックレポーターが予め搭載されたパネル・アグノスティックジェネリック検出カートリッジ；およびそれとは別に
（２）ＰＣＲ増幅条件下の標的の存在下で、ジェネリック配列を含み、その結果、カートリッジの内部でジェネリックレポーターと特異的に反応し、かつそれからシグナルを生成することができる分子（さらには検出可能な核酸産物と呼ばれる）の生成につながる標的特異的マルチプレックスＰＣＲオリゴヌクレオチドプール。
特に、第１の一般的な態様において、マルチプル遺伝子標的を検出するための方法であって：
－マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのミックスを提供することであって、前記サブセットのそれぞれが、遺伝子標的に対して特異的であり、かつ前記サブセットにユニークなジェネリック配列タグ（「ユニークジェネリック配列タグ」または「ＵＧＳＴ」）を含んでおり、
前記サブセットのそれぞれが、核酸増幅条件下および遺伝子標的の存在下で、ユニークジェネリック配列タグを含む検出可能な核酸産物を生成するように適合されている、
ミックスを提供すること；
－ミックスとは別に、
（ｉ）生物学的サンプルおよび／またはミックスを受け入れるための入口ポート、
（ｉｉ）入口ポートの下流に置かれた核酸単離区画、
（ｉｉｉ）核酸増幅のための試薬；
（ｉｖ）核酸単離区画の下流に置かれた１つまたは複数の核酸増幅区画、および
（ｖ）複数種のジェネリックレポーターであって、複数種のジェネリックレポーターのうちの１種ずつが、検出可能な核酸産物のうちの１種に含まれるユニークジェネリック配列タグに対して特異的な（相補的な）ジェネリック配列を含み、かつ前記検出可能な核酸産物の存在下でシグナルを生成するように適合されている、複数種のジェネリックレポーター；
を含む一体型流体カートリッジを提供することであって、
ミックスおよび生物学的サンプルまたは抽出された核酸が、使用者によりカートリッジに挿入される、
一体型流体カートリッジを提供すること
を含み、
－生物学的サンプルまたは抽出された核酸およびミックスの挿入後にカートリッジを操作することであって、生物学的サンプルからの核酸単離、続いて、ミックスを含むマルチプレックス核酸増幅を（カートリッジの内部で）実施することを含む、操作すること；
－少なくとも１種の検出可能な核酸産物が前記増幅から生成される場合に、一体型流体カートリッジの内部に含まれる複数種のジェネリックレポーターのうちの少なくとも１種から生成されるシグナルを検出すること
をさらに含む、方法が開示される。
更なる一般的な態様において、キットまたは部品のキットであって、
別々の構成要素として提供され：
－マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのミックスであって、前記サブセットのそれぞれが、遺伝子標的に対して特異的であり、かつ遺伝子標的が検出される生物の遺伝情報中に存在しない配列として定義される、前記サブセットにユニークなユニークジェネリック配列タグを含んでおり、
前記サブセットのそれぞれが、核酸増幅条件下および遺伝子標的の存在下で、ユニークジェネリック配列タグを含む検出可能な核酸産物を生成するように適合されている、
マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのミックス；および
－一体型流体カートリッジであって、
（ｉ）生物学的サンプルおよび／またはミックスを受け入れるための入口ポート；
（ｉｉ）入口ポートの下流に置かれた核酸単離区画；
（ｉｉｉ）核酸増幅のための試薬；
（ｉｖ）核酸単離区画の下流に置かれた１つまたは複数の核酸増幅区画、および
（ｖ）複数種のジェネリックレポーターであって、複数種のジェネリックレポーターのそれぞれが、ユニークジェネリック配列タグのうちの１つに対して特異的な（相補的であり得る）ジェネリック配列を含み、かつユニークジェネリック配列タグを含む検出可能な核酸産物の存在下でシグナルを生成するように適合されている、複数種のジェネリックレポーター
を含む、一体型流体カートリッジ
を含む、キットまたは部品のキットが開示される。
更なる一般的な態様において、システム、またはシステムの部分であって、前記システムが、別々の構成要素として：
自動化されたシステムと係合可能なカートリッジであって：
ａ）入口ポート、
ｂ）核酸単離区画；
ｃ）核酸増幅区画、好ましくは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つもしくは８つ、またはさらにそれ以上の核酸増幅区画など、１つを超える核酸増幅区画；
を含み、
入口ポートが、核酸単離区画と流体接続しており、核酸単離区画が、（１つまたは複数の）核酸増幅区画と流体接続しており；
（１つまたは複数の）核酸増幅区画が、ジェネリックレポーター分子を含み、ジェネリックレポーター分子が、一本鎖ＤＮＡであり、かつ：
ｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第１のメンバー；
ｉｉ）ステム－ループ構造；
ｉｉｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第２のメンバー；
ｉｖ）ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）結合部位；
ｖ）ポリメラーゼ伸長ブロッカー；
を含む、カートリッジ、
オリゴヌクレオチド混合物であって：
ａ）標的核酸の増幅のために構成された標的特異的増幅プライマー対、好ましくは標的特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーがアレル特異的である；
ｂ）メディエータープローブであって、５’から３’までに：
ｉ）ＵＧＳＴを含み、ＵＧＳＴの配列が、ジェネリックレポーター分子のＵＧＳＴ結合部位に対して相補的である第１のポーション；
ｉｉ）増幅されるべき標的核酸配列の第１の鎖に対して相補的である第２のポーション；
好ましくは、ポリメラーゼ伸長ブロッカー
を含む、メディエータープローブ
を含む、オリゴヌクレオチド混合物
を含む、システム、またはシステムの部分が開示される。
更なる一般的な態様において、システム、またはシステムの部分であって、前記システムが、別々の構成要素として：
－自動化されたシステムと係合可能なカートリッジであって：
ａ）入口ポート、
ｂ）核酸単離区画；
ｃ）核酸増幅区画、好ましくは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つもしくは８つ、またはさらにそれ以上の核酸増幅区画など、１つを超える核酸増幅区画；
を含み、
入口ポートが、核酸単離区画と流体接続しており、核酸単離区画が、（１つまたは複数の）核酸増幅区画と流体接続しており；
（１つまたは複数の）核酸増幅区画が、ジェネリックレポーター分子を含み、ジェネリックレポーター分子が、一本鎖ＤＮＡであり、かつ：：
ｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第１のメンバー；
ｉｉ）ステム－ループ構造；
ｉｉｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第２のメンバー；
ｉｖ）ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）結合部位；
ｖ）ポリメラーゼ伸長ブロッカー；
を含む、カートリッジ、
オリゴヌクレオチド混合物であって：
ａ）標的特異的増幅プライマー対であって、標的特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーが、標的に結合されたときステム－ループ構造を含み、好ましくは標的特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーがアレル特異的である、標的特異的増幅プライマー対、および；
ｂ）メディエータープローブであって、５’から３’までに：
ｉ）ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）を含む第１のポーション；
ｉｉ）アレル特異的プライマーのステム－ループ構造またはその相補体に対して相補的である第２のポーション；
好ましくは、ポリメラーゼ伸長ブロッカー
を含む、メディエータープローブ
を含む、オリゴヌクレオチド混合物
を含む、システム、またはシステムの部分が開示される。
更なる一般的な態様において、システム、またはシステムの部分であって、前記システムが、別々の構成要素として：
－カートリッジを受け入れるように構成された装置であって、
カートリッジが、
ａ）入口ポート、
ｂ）核酸単離区画；
ｃ）核酸増幅区画、好ましくは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つもしくは８つ、またはさらにそれ以上の核酸増幅区画など、１つを超える核酸増幅区画；
を含み、
入口ポートが、核酸単離区画と流体接続しており、核酸単離区画が、（１つまたは複数の）核酸増幅区画と流体接続しており；
（１つまたは複数の）核酸増幅区画が、ジェネリックレポーター分子を含み、
ジェネリックレポーター分子が、一本鎖ＤＮＡであり、かつ：
ｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第１のメンバー；
ｉｉ）ステム－ループ構造；
ｉｉｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第２のメンバー；
ｉｖ）ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）結合部位；
ｖ）ポリメラーゼ伸長ブロッカー；
を含む、装置、
－オリゴヌクレオチド混合物であって：
ａ）標的特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーがアレル特異的である、標的核酸の増幅のために構成された標的特異的増幅プライマー対；
ｂ）メディエータープローブであって、５’から３’までに：
ｉ）ＵＧＳＴを含み、ＵＧＳＴの配列が、ジェネリックレポーター分子のＵＧＳＴ結合部位に対して相補的である第１のポーション；
ｉｉ）増幅されるべき標的核酸配列の第１の鎖に対して相補的である第２のポーション；
を含み、
好ましくは、ポリメラーゼ伸長ブロッカー
を含む、メディエータープローブ
を含む、オリゴヌクレオチド混合物
を含む、システム、またはシステムの部分が開示される。
更なる一般的な態様において、システム、またはシステムの部分であって、前記システムが、標的配列の有無、標的配列中の変異の有無、標的配列の特異的アレル、病原体および同種のものを決定するように構成された、システム、またはシステムの部分が開示される。
幾つかの実施形態において、カートリッジの核酸増幅区画は、核酸増幅のための試薬を含む。
幾つかの実施形態において、核酸単離区画は、核酸抽出／精製試薬を含むか、または核酸抽出／精製試薬を含む別々の区画と流体接触している。
幾つかの実施形態において、カートリッジは、核酸増幅区画内に複数種のジェネリックレポーター分子を含み、複数種のジェネリックレポーター分子の各ＵＧＳＴ結合部位は異なる。
幾つかの実施形態において、複数種のジェネリックレポーター分子のそれぞれは、異なるレポーターを含む。
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド混合物は、各プライマー対が、異なる標的に対して特異的であり、好ましくは各プライマー対の少なくとも１つのメンバーがアレル特異的プライマーを含む、複数種の標的特異的増幅プライマー対；および複数種のメディエータープローブであって、ｉ）各メディエータープローブの第１のポーションが、複数種のジェネリックレポーター分子中の１種のジェネリックレポーター分子のＵＧＳＴ結合部位に対して相補的なＵＧＳＴを含み；ｉｉ）各メディエータープローブの第２のポーションが、増幅されるべき複数の標的核酸配列の異なる標的核酸の第１の鎖に対して相補的である、複数種のメディエータープローブを含む。
更なる一般的な態様において、システム、またはシステムの部分であって、前記システムが、別々の構成要素として：
－カートリッジを受け入れるように構成された装置であって、カートリッジが、
ａ）入口ポート、
ｂ）核酸単離区画；
ｃ）核酸増幅区画、好ましくは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つもしくは８つ、またはさらにそれ以上の核酸増幅区画など、１つを超える核酸増幅区画；
を含み、
入口ポートが、核酸単離区画と流体接続しており、核酸単離区画が、（１つまたは複数の）核酸増幅区画と流体接続しており；
（１つまたは複数の）核酸増幅区画が、ジェネリックレポーター分子を含み、ジェネリックレポーター分子が、一本鎖ＤＮＡであり、かつ：
ｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第１のメンバー；
ｉｉ）ステム－ループ構造；
ｉｉｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第２のメンバー；
ｉｖ）ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）結合部位；
ｖ）ポリメラーゼ伸長ブロッカー；
を含む、装置、
オリゴヌクレオチド混合物であって：
ａ）標的特異的増幅プライマー対であって、標的特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーが、標的に結合されたときステム－ループ構造を含み、好ましくは標的特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーがアレル特異的である、標的特異的増幅プライマー対、および；
ｂ）メディエータープローブであって、５’から３’までに：
ｉ）ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）を含む第１のポーション；
ｉｉ）アレル特異的プライマーのステム－ループ構造またはその相補体に対して相補的である第２のポーション；
を含み、
好ましくは、ポリメラーゼ伸長ブロッカー
を含む、メディエータープローブ
を含む、オリゴヌクレオチド混合物
を含む、システム、またはシステムの部分が開示される。
本明細書に開示されるシステムの幾つかの実施形態において、アレル特異的プライマーはＡＲＭＳプライマーを含む。
更なる一般的な態様において、標的核酸を検出するための方法が開示される。幾つかの実施形態において、方法は：
－標的特異的プライマー対を使用して対象からの核酸サンプルを増幅することであって、好ましくは標的特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーがアレル特異的であり、増幅反応が、メディエータープローブおよびジェネリックレポーター分子の存在下で実施され；
ａ）メディエータープローブが、５’から３’までに：
ｉ）ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）を含む第１のポーション；
ｉｉ）標的核酸の第１の鎖に対して相補的である第２のポーション；
好ましくはポリメラーゼ伸長ブロッカー
を含み；
ｂ）ジェネリックレポーター分子が：
ｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第１のメンバー；
ｉｉ）ステム－ループ構造；
ｉｉｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第２のメンバー；
ｉｖ）メディエータープローブのＵＧＳＴに対して相補的であるＵＧＳＴ結合部位；
ｖ）ポリメラーゼ伸長ブロッカー；
を含み、
フルオロフォア／クエンチャー対のメンバーが、フルオロフォアをクエンチするためにステム－ループ構造を介して置かれる、
増幅すること；
－標的核酸の存在下でフルオロフォア／クエンチャー対のフルオロフォアにより産生されるシグナルを検出し、それによって標的核酸の存在を検出すること
を含む。更なる一般的な態様において、標的核酸を検出するための方法が開示される。
幾つかの実施形態において、標的核酸を検出するための方法は：
－標的特異的プライマー対を使用して対象からの核酸サンプルを増幅することであって、
標的特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーは、標的に結合されたときステム－ループ構造を含み、好ましくは標的特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーがアレル特異的であり、
増幅反応が、メディエータープローブおよびジェネリックレポーター分子の存在下で実施され；
ａ）メディエータープローブが、５’から３’までに：
ｉ）ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）を含む第１のポーション；
ｉｉ）アレル特異的プローブのステム－ループ構造またはその相補体に対して相補的である第２のポーション；
好ましくはポリメラーゼ伸長ブロッカー
を含み；
ｂ）ジェネリックレポーター分子が：
ｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第１のメンバー；
ｉｉ）ステム－ループ構造；
ｉｉｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第２のメンバー；
ｉｖ）メディエータープローブのＵＧＳＴに対して相補的であるＵＧＳＴ結合部位；
ｖ）ポリメラーゼ伸長ブロッカー；
を含み、
フルオロフォア／クエンチャー対のメンバーが、フルオロフォアをクエンチするためにステム－ループを介して置かれる、
増幅すること；
－標的核酸の存在下でフルオロフォア／クエンチャー対のフルオロフォアにより産生されるシグナルを検出し、それによって標的核酸の存在を検出すること
を含む。
本明細書に開示される方法の幾つかの実施形態において、アレル特異的プライマーはＡＲＭＳプライマーを含む。
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるシステムまたは方法は、ＫＩＦ１１遺伝子の非コード領域を含むＫＩＦ１１遺伝子配列の少なくとも一部分を含むリファレンス標的核酸配列を含むリファレンスシステムを含む。幾つかの実施形態において、リファレンスシステムは、配列番号６９～８０のうちの１つまたは複数、好ましくは以下：配列番号６９および７０；配列番号７１および７２；配列番号７３および７４；配列番号７５および７６；配列番号７７および７８；ならびに配列番号７９および８０から選択されるプライマー対を含み；好ましくは増幅された領域は、配列番号８１～８６から選択されるプローブにより、好ましくは配列番号８７および８８から選択されるジェネリックレポーターを介して、検出される。
幾つかの実施形態において、開示されるシステム、方法、キット、およびそれらの構成要素は、先行技術の方法と比較して優れた結果を提供する。例として、ただし、これらに限定されないが、幾つかの実施形態において、開示されるシステム、方法、キット、および構成要素は、より安価（ＮＧＳに対してなど）であり、使用するのがより容易（任意の他のアプローチ、例えば、プレートベースのシステムでのｑＰＣＲまたはＮＧＳに対してなど）であり、かつ／または設計および市販するのがより速い（任意の他のアプローチに対してなど、上記参照）。
さらに別の一般的な態様において、方法、キット、それらの構成要素の使用、および続きに記載されるそれらのそれぞれの実施形態が、例えば、マルチプル遺伝子標的、恐らく患者から得られるサンプル中のマルチプル遺伝子標的の検出を含むがこれに限定されない有利な適用のために提供される。患者は、がん患者、感染性疾患を患う患者、移植者、または妊娠中の将来の母親であり得る。患者ががん患者である場合、開示される方法、キット、および構成要素の有利な使用には、これらに限定されないが、ポストＮＧＳ解析患者サーベイランス、処置もしくは療法に対する反応モニタリング、微小残存病変（ＭＲＤ）検出もしくはモニタリング、手術後フォローアップ、または個別化されたがんネオ抗原標的免疫療法選択が含まれる。
さらに別の一般的な態様において、対象からの標的核酸を検出するための方法であって：
標的特異的プライマー対を使用して対象からの核酸サンプルを増幅することであって、
標的特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーが、（好ましくはアレル特異的であり、かつ）標的に結合されたときステム－ループ構造を含み（「ＦｕｓｅＴａｇ」）、
増幅反応が、ジェネリックレポーター分子（２）の存在下で実施され；
ａ）ＦｕｓｅＴａｇが、５’から３’までに：
ｉ）ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）を含む第１のポーション；
ｉｉ）ステム－ループ構造；
ｉｉｉ）標的に対して相補的であり、かつ好ましくはアレル特異的である第２のポーション；
を含み、
ｂ）ジェネリックレポーター分子（２）が：
ｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第１のメンバー；
ｉｉ）ステム－ループ構造；
ｉｉｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第２のメンバー；
ｉｖ）ＦｕｓｅＴａｇのＵＧＳＴに対して相補的であるＵＧＳＴ結合部位；
ｖ）ポリメラーゼ伸長ブロッカー；
を含み、
フルオロフォア／クエンチャー対のメンバーが、フルオロフォアをクエンチするためにステム－ループ構造を介して置かれる、
増幅すること；
標的核酸の存在下でフルオロフォア／クエンチャー対のフルオロフォアにより産生されるシグナルを検出し、それによって標的核酸の存在を検出すること
を含む、方法が提供される。
別の態様において、サンプル中のＫＩＦ１１核酸に対して前記サンプル中の標的核酸の数を定量化するための方法であって：
１．ＫＩＦ１１増幅反応においてＫＩＦ１１特異的プライマー対を使用してサンプルに含まれるＫＩＦ１１核酸を増幅することであって、
ｉ．ＫＩＦ１１特異的プライマー対のメンバーのそれぞれが、エクソン、イントロン内に位置するＫＩＦ１１領域、またはＫＩＦ１１遺伝子の非コード配列に対して－互いに独立して－相補的であり；
ｉｉ．ＫＩＦ１１増幅反応が、ＫＩＦ１１検出可能なプローブの存在下で実施される、
ＫＩＦ１１核酸を増幅すること；
２．ＫＩＦ１１増幅反応においてＫＩＦ１１検出可能なプローブにより産生されるシグナルを検出すること；
３．２．のシグナルを定量化すること；
４．標的増幅反応において標的特異的プライマー対を使用してサンプルからの標的核酸を増幅することであって；
ｉ．標的増幅反応が、標的検出可能なプローブの存在下で実施される、
標的核酸を増幅すること；および
５．標的増幅反応において標的検出可能なプローブにより産生されるシグナルを検出すること；
６．５．のシグナルを定量化すること；
７．３．の定量化されたシグナルに対して６．の定量化されたシグナルを標準化し、それによってサンプル中のＫＩＦ１１核酸に対してサンプル中の標的核酸の数を定量化すること
を含む、方法が開示される。
その上更なる態様において、サンプル中のｇＤＮＡ混入を決定するための方法であって：
１．ＫＩＦ１１増幅反応において第１および第２のＫＩＦ１１特異的プライマー対を使用してサンプルに含まれるＫＩＦ１１核酸を増幅することであって、
ａ．第１のＫＩＦ１１特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーが、ＫＩＦ１１イントロンまたはＫＩＦ１１遺伝子の非コード配列に対して相補的であり；
ｂ．第１のＫＩＦ１１特異的プライマー対を使用する増幅反応が、第１のＫＩＦ１１検出可能なプローブの存在下で実施され；
ｃ．第２のＫＩＦ１１特異的プライマー対のメンバーのそれぞれが、ＫＩＦ１１エクソン内に位置し；
ｄ．第２のＫＩＦ１１特異的プライマー対を使用する増幅反応が、第２のＫＩＦ１１検出可能なプローブの存在下で実施される、
増幅すること；
２．第１および第２のＫＩＦ１１増幅反応において第１および第２のＫＩＦ１１検出可能なプローブにより産生されるシグナルを検出すること；
３．第１および第２のＫＩＦ１１増幅反応のシグナルを定量化すること；
４．第２の増幅シグナルの定量化されたシグナルに対して第１の増幅反応の定量化されたシグナルを標準化し、それによってサンプル中のｇＤＮＡ混入を決定することであって、好ましくはサンプルが、ミトコンドリアＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｆＤＮＡ、無細胞腫瘍ＤＮＡまたはｓｉＲＮＡサンプルである、決定すること
を含む、方法が開示される。
その上更なる態様において、サンプル中の核酸の完全性を決定するための方法であって：
１．ＫＩＦ１１増幅反応において第１および第２のＫＩＦ１１特異的プライマー対を使用してサンプルに含まれるＫＩＦ１１核酸を増幅することであって、
ａ．第１のＫＩＦ１１特異的プライマー対のメンバーのそれぞれが、エクソン、イントロン内に位置するＫＩＦ１１領域、またはＫＩＦ１１遺伝子の非コード配列に対して－互いに独立して－相補的であり；
ｂ．第１のＫＩＦ１１特異的プライマー対を使用する増幅反応が、第１のＫＩＦ１１検出可能なプローブの存在下で実施され；
ｃ．第２のＫＩＦ１１特異的プライマー対のメンバーのそれぞれが、エクソン、イントロン内に位置するＫＩＦ１１領域、またはＫＩＦ１１遺伝子の非コード配列に対して－互いに独立して－相補的であり；
ｄ．第２のＫＩＦ１１特異的プライマー対を使用する増幅反応が、第２のＫＩＦ１１検出可能なプローブの存在下で実施され；
ｅ．好ましくは、第１および第２のＫＩＦ１１特異的プライマー対の増幅反応により生成されるアンプリコンが、干渉しないほど十分に遠くに位置し、例えば、アンプリコンが、少なくとも１キロ塩基対など、少なくとも７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐまたはさらにそれ以上など、少なくとも６００塩基対（ｂｐ）である、
増幅すること；
２．前記核酸増幅反応のそれぞれにおいて閾値を決定することであって、
○その強度が反応において増幅される核酸配列の量に関係する少なくとも１つのシグナルを増幅反応中の複数の異なる時間に測定すること；
○閾値を表す、導関数の特徴に関連するサイクル数を決定することによる、
決定すること；
３．第１および第２のＫＩＦ１１増幅反応の閾値（閾値サイクル数）を比較すること；
を含み、
４．第１および第２のＫＩＦ１１増幅反応の閾値サイクル数の間の差（ΔＣｑ）が、ゲノムＤＮＡの完全性の尺度であり；
任意選択でステップ２が、
○シグナルの測定から増幅曲線を導出すること；
○増幅曲線の導関数を計算し、かつ導関数の特徴を確認すること；
○増幅曲線の二次導関数を計算すること
を含むことができ、
特徴が、二次導関数の正のピークを含む、
方法が開示される。
その上、更なる態様において、ｇＤＮＡ断片化を決定するための方法であって、
・第１、第２および第３の増幅反応により、好ましくはＰＣＲにより識別可能な長さの３種の（第１、第２および第３の）ＫＩＦ１１アンプリコンを生成すること；
・前記第１、第２および第３の増幅反応のＣｑ値を決定すること；
・前記第１、第２および第３の増幅反応のＣｑを比較すること；
を含み、
・前記第１、第２および第３の増幅反応の間のＣｑ値の差が、ｇＤＮＡ断片化の指標である、
方法が開示される。
その上、更なる態様において、ｇＤＮＡ断片化を決定するための方法であるが、白血球由来のよりインタクトなゲノムＤＮＡで無細胞ＤＮＡまたは無細胞腫瘍ＤＮＡの混入を評価するために使用することもできる方法であって、
・第１の増幅反応により第１のＫＩＦ１１アンプリコン（「短い」）を生成すること；および
・第２の増幅反応により第２のＫＩＦ１１アンプリコン（「長い」）を生成すること；
・前記第１および前記第２の増幅反応のＣｑ値を決定すること；
・前記第１および前記第２の増幅反応のΔＣｑ値を決定すること；
を含み、
・ΔＣｑが、ｇＤＮＡ断片化の指標である、
方法が開示される。
その上、更なる態様において、プライマーならびに増幅プロトコルおよび結果の分析を含む説明書を含むキットのゲノムリファレンス遺伝子ＫＩＦ１１の一領域を増幅するための使用であって、プライマーが、以下：配列番号６９～８０、好ましくは以下：配列番号６９および７０；配列番号７１および７２；配列番号７３および７４；配列番号７５および７６；配列番号７７および７８；ならびに配列番号７９および８０から選択されるプライマー対であり；好ましくは、増幅された領域が、配列番号８１～８６から選択されるプローブにより、好ましくは配列番号８７および８８から選択されるジェネリックレポーターを介して、検出される、使用が開示される。
その上、更なる態様において、加工、単離および増幅プロセスを品質管理する方法であって：
・サンプル加工；
・核酸単離；
・増幅反応により識別可能に異なる長さの３種のＫＩＦ１１アンプリコンを生成すること；
・前記ＫＩＦ１１アンプリコンのそれぞれのＣｑ値を決定すること；
を含み、
ＫＩＦ１１アンプリコンのＣｑ値が、加工、単離および増幅の品質管理の尺度である、
方法が開示される。
その上、更なる態様において、キットであって：
（ａ）ＫＩＦ１１遺伝子のアンプリコンにアニーリングするように設計された少なくとも１種のプローブ；
（ｂ）アニーリング反応を行うために必要とされる製品および試薬；ならびに
（ｃ）使用説明書；
を含み、
プローブが、少なくとも一部分が本明細書に記載されるアンプリコンに対して特異的であるプローブである、
キットが開示される。
その上、更なる態様において、生物学的サンプルの自動化された加工のためのシステムであって：
・１つまたは複数のサンプル加工モジュールを含むように構成されたエンクロージャであって、各サンプル加工モジュールが、本明細書に記載される取外し可能なカートリッジを保持するように構成され、前記システムが、ＰＣＲを実施して、１種または複数種の標的遺伝子の存在および／または量を決定し、かつ任意選択で、対応する取外し可能なサンプルカートリッジ内で１つまたは複数の標的ＤＮＡ配列のレベルを決定するようにサンプル加工モジュールを動作させるように構成され、対応する取外し可能なサンプルカートリッジ内のサンプルに対する前記加工が：
・前記カートリッジの生物学的サンプルを受け入れるための入口ポート内にサンプルを提供すること；および前記カートリッジを使用することを含む方法を実施する、エンクロージャ：
・入口ポート内で受け取られた生物学的サンプルから核酸を単離するための手段であって、生物学的サンプルを受け入れるための前記入口ポートと流体連通に入ることができる、手段；
・生物学的サンプルを受け入れるための前記入口ポートと流体接続し、かつその下流に置かれた、ＰＣＲを実施するための試薬および／またはバッファを含む複数のチャンバーであって；
・ＰＣＲミックスを含むチャンバーを含み；
・ＫＩＦ１１遺伝子のすべてまたは一領域を増幅するためのプライマーを含む少なくとも１つのチャンバーを含み；かつ
・前記ＫＩＦ１１遺伝子のすべてまたは一領域を検出するためのプローブを含む、
前記複数のチャンバー、
・前記標的核酸を検出および／または定量化するために前記チャンバー内で核酸増幅を実施すること
を含み、
前記ＫＩＦ１１遺伝子が、内部標準として使用され、それによって前記標的核酸を検出および／または定量化する、
システムが開示される。
好ましい態様において、方法、使用、キット、部品のキット、システムおよびそれらの構成要素において、標的特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーは、アレル特異的であり、かつ標的に結合されたときステム－ループ構造を含む。
その上、更なる態様において、ＰＣＲを実施して、１種または複数種の標的遺伝子を検出および／または定量化し、かつ任意選択で核酸を検出および／または定量化するためのキットであって、本明細書に記載されるカートリッジおよび任意選択で使用説明書を含む容器を含む、キットが開示される。
十分に理解するために、添付図面と併せて以下の詳細な説明が参照される。
すべてのジェネリック試薬（すなわち、パネル特異的ではない試薬）がジェネリックカートリッジ内部に存在し、一方、パネル特異的試薬およびサンプルが、ジェネリックカートリッジのサンプル入口ポートを通じて使用者により加えられる一般的なワークフローを示す図である。 メディエータープローブＰＣＲの反応機構を示す図であり、ポリメラーゼによるフォワード（ＦＷ）プライマーの伸長は、メディエータープローブの標的特異的構成要素の加水分解および遊離メディエーターの遊離につながる。次のステップにおいて、遊離メディエーターは、ジェネリックレポーターに結合することができる。ジェネリックレポーターのフルオロフォアとクエンチャーは交換することができることに留意されたい（図示せず）。遊離メディエーターが伸長したら、クエンチャーもしくはフルオロフォア修飾の置換および／またはクエンチャーもしくはフルオロフォア結合ヌクレオチドの加水分解により蛍光シグナルが生成される（図示せず）。非加水分解メディエータープローブおよびジェネリックレポーターは、ポリメラーゼ（四角により記号で示される）により伸長させることができないことに留意されたい；ＲＥプライマーはリバースプライマーである。 ９６ウェルフォーマットｑＰＣＲ装置においてシングルプレックス（すなわち、１種の標的を増幅するのに必要とされるプライマーのみを含む）ならびにマルチプレックス（すなわち、複数の標的を増幅するのに必要とされるプライマーを含む）でＡＲＭＳプライマーを使用する変異検出に関する性能を示す図であり、標的は、凡例に示されるＰＣＲ反応（１０，０００コピーのゲノム野生型ＤＮＡ、ならびにプライマーおよびメディエータープローブおよびジェネリックレポーターのオリゴヌクレオチド混合物、ならびにポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよびＰＣＲ塩を常に含む）において様々な濃度の合成変異体標的（ＥＧＦＲ Ｇ７１９Ａ；ＥＧＦＲ ＩｎｓＦＱＥＡ、ＥＧＦＲ Ｌ８６１Ｑ）として加えられる。生曲線を示し；Ｘ軸：ＰＣＲサイクルの数、Ｙ軸：任意の蛍光単位；。黒四角は、１０，０００コピーのゲノム野生型ＤＮＡが存在するが、合成変異体標的は加えられない条件を表す。 ９６ウェルフォーマットｑＰＣＲ装置においてシングルプレックス（すなわち、１種の標的を増幅するのに必要とされるプライマーのみを含む）ならびにマルチプレックス（すなわち、複数の標的を増幅するのに必要とされるプライマーを含む）でＡＲＭＳプライマーを使用する変異検出に関する性能を示す図であり、標的は、凡例に示されるＰＣＲ反応（１０，０００コピーのゲノム野生型ＤＮＡ、ならびにプライマーおよびメディエータープローブおよびジェネリックレポーターのオリゴヌクレオチド混合物、ならびにポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよびＰＣＲ塩を常に含む）において様々な濃度の合成変異体標的（ＥＧＦＲ Ｇ７１９Ａ；ＥＧＦＲ ＩｎｓＦＱＥＡ、ＥＧＦＲ Ｌ８６１Ｑ）として加えられる。Ｃｑ値を示し；Ｘ軸：ＰＣＲサイクルの数、Ｙ軸：任意の蛍光単位；。黒四角は、１０，０００コピーのゲノム野生型ＤＮＡが存在するが、合成変異体標的は加えられない条件を表す。 一体型サンプル・ツー・リザルト装置においてマルチプレックス（すなわち、複数の標的を増幅するのに必要とされるプライマー、ならびにメディエータープローブを含むオリゴヌクレオチド混合物を含む）でＡＲＭＳプライマーを使用する変異検出に関する性能を示す図であり、標的は、プライマーおよびメディエータープローブ、ならびにＰＣＲチャンバーあたり約７，０００コピーのゲノムＤＮＡを含むように前もって定量化されたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）臨床サンプルを含むオリゴヌクレオチド混合物と一緒に、サンプル入口ポートを通じて、様々な濃度の合成変異体標的として加えられる。ジェネリックレポーター、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰは、カートリッジの異なるチャンバー内でスポットされる。変異体（合成標的）：ＰＣＲあたり１００（１．４％）－５０（０．７％）－１０（０．１％）－０（０．０％）コピー。ＰＣＲ塩は、ジェネリックであり、かつカートリッジの試薬容器のうちの１つの中に存在する液化バッファの部分である。ＲＦＵ＝相対蛍光単位、すなわち、一体型サンプル・ツー・リザルト装置のｑＰＣＲ構成要素から得られるシグナル； 一体型サンプル・ツー・リザルト装置においてマルチプレックス（すなわち、複数の標的を増幅するのに必要とされるプライマー、ならびにメディエータープローブを含むオリゴヌクレオチド混合物を含む）で野生型ゲノムＤＮＡの検出に関する性能を示す図であり、プライマーおよびメディエータープローブ、ならびにＦＦＰＥ臨床サンプルまたは抽出されたＤＮＡのいずれかを含むオリゴヌクレオチド混合物がサンプル入口ポートを通じて加えられた。ジェネリックレポーター、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰがカートリッジの異なるチャンバー内でスポットされた。ＰＣＲ塩は、ジェネリックであり、かつカートリッジの試薬容器のうちの１つの中に存在する液化バッファの一部であった。Ｙ軸はシグナル強度を表し、Ｘ軸はサイクル数を表し、Ａ～Ｅは異なるＰＣＲ区画を表す。 近隣のマーカーの判別を可能にする概念を示す図であり、ここで、ＡＲＭＳプライマーは、ステムが標的配列から任意選択で構成され得るステム－ループ構造を含み、プライマーの３’－末端が、標的配列に対して特異的な配列を含むステム－ループ構造を含むＡＲＭＳプライマーの１つの設計を示す。メディエータープローブの結合部位は、ＡＲＭＳプライマー（「ステム－ループを含むＦＷプライマー」と示される）と（少なくとも部分的に）重複する。標的が増幅されないとき、メディエータープローブは、標的配列に結合することができず、したがって、シグナルを生成することができない。メディエータープローブは、ＡＲＭＳプライマーがステム－ループ構成内にありしたがってメディエータープローブにとってアクセス不可能であるためそれに結合することもできない。標的が増幅されるとき、ステム構造は、ポリメラーゼによりアンフォールドすることができ、それによってメディエータープローブのための結合部位を生成する。結合されると、他のプライマーが伸長するとき遊離メディエーターが放出され、遊離メディエーターは、スポットされたジェネリックレポーターに結合し、シグナルを生成することができる。 近隣のマーカーの判別を可能にする概念を示す図であり、ここで、ＡＲＭＳプライマーは、ステムが標的配列から任意選択で構成され得るステム－ループ構造を含み、ステム－ループ構造がプライマーの５’末端を定義し、それをジェネリック末端タグとして使用することができるステム－ループ構造を含むＡＲＭＳプライマーの代替の設計を示す。パネルＡと同様、メディエータープローブ２の結合部位は、ＡＲＭＳプライマー（「Ｇ１２Ｃプライマー」と示される）と（少なくとも部分的に）重複する。標的が増幅されないとき、メディエータープローブ２は、標的配列に結合することができず、したがって、シグナルを生成することができない。メディエータープローブ２は、ＡＲＭＳプライマー（Ｇ１２Ｃプライマー）がステム－ループ構成内にありしたがってメディエータープローブにとってアクセス不可能であるためそれに結合することもできない。標的が増幅されるとき、ステム構造は、ポリメラーゼによりアンフォールドすることができ、それによってメディエータープローブのための結合部位を生成する。結合されると、他のプライマーが伸長するとき遊離メディエーターが放出され、遊離メディエーターは、スポットされたジェネリックレポーターに結合し、シグナルを生成することができる。メディエータープローブ１の存在は任意であるが、ポジティブコントロールとして使用することができ、かつ／または標的を検出するための選択肢を増やすために使用することができる。メディエータープローブは、５’から３’の対応するジェネリックレポーター分子（ユニバーサルレポーター）のＵＧＳＴ結合部位に対して相補的なユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）を含む第１のポーション、標的に対して相補的であるか（メディエータープローブ１）、またはＡＲＭＳプライマーに対して相補的である（メディエータープローブ２）第２のポーション、およびポリメラーゼ伸長ブロッカー（四角いボックスにより示される）からなる。ジェネリックレポーター分子（ユニバーサルレポーター）は、一本鎖ＤＮＡであり、かつ：ｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第１のメンバー；ｉｉ）ステム－ループ構造；ｉｉｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第２のメンバー；ｉｖ）ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）結合部位；およびｖ）ポリメラーゼ伸長ブロッカーを含む。 近隣のマーカーの判別を可能にする概念を示す図であり、ここで、ＡＲＭＳプライマーは、ステムが標的配列から任意選択で構成され得るステム－ループ構造を含み、近隣のマーカーの判別を可能にする「ＦｕｓｅＴａｇ」概念を示す。パネルＢと比較して、フォワードＡＲＭＳプライマーは修飾されており（「ＦｕｓｅＴａｇ」プライマー）、ここで５’から３’までに：放出されたとき図６Ｃに遊離メディエーター２として示されるユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）を含む第１のポーション；ステム－ループ構造；および標的に対して相補的である（かつ好ましくはアレル特異的である）第２のポーションを含む。特異的標的がＦｕｓｅＴａｇプライマーにより増幅されないとき、ユニークジェネリック配列タグ（メディエーター２）は放出されず、したがって、シグナルを生成することができない。しかし、メディエータープローブ１は、マルチプレックス反応混合物中に存在する別のフォワードプライマーにより依然として加水分解され得る。 マルチプレックス（すなわち、複数の標的を増幅するのに必要とされるプライマー、ならびにメディエータープローブを含むオリゴヌクレオチドプールを含む）で図６に示された概念に従ってＫＲＡＳ Ｇ１２ＤからＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃと野生型バックグラウンドを判別する実証を示す図であり、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃの選択的増幅を可能にするステムループを含むＡＲＭＳプライマーが、リバースプライマー、ならびに組み込まれたＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ ＡＲＭＳプライマーのステムループ部分に結合するように設計されたメディエータープローブと一緒に加えられる。ミックスは、ポリメラーゼおよび機能的ＰＣＲ反応を起こすのに必要とされるすべての他の構成要素と共に１０，０００ゲノムコピーの野生型ＤＮＡも含む。合成ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異体標的（パネルＡ参照）または合成ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異体標的（パネルＡ参照）のいずれかが１０倍滴定系列で（推定入力５０００－５００－５０－０コピー／ＰＣＲで）ミックスに加えられる。ミックスは、９６ウェル ｑＰＣＲ適合プレートの異なるウェルに加えられる。ＰＣＲ曲線を表す。観察データは、ＡＲＭＳプライマー内のステムループが１０，０００ゲノムコピーの野生型ＤＮＡ中最低５００コピー以下までＫＲＡＳ Ｇ１２ＤからＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃおよび野生型バックグラウンドの判別を可能にすることを示す。 マルチプレックス（すなわち、複数の標的を増幅するのに必要とされるプライマー、ならびにメディエータープローブを含むオリゴヌクレオチドプールを含む）で図６に示された概念に従ってＫＲＡＳ Ｇ１２ＤからＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃと野生型バックグラウンドを判別する実証を示す図であり、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃの選択的増幅を可能にするステムループを含むＡＲＭＳプライマーが、リバースプライマー、ならびに組み込まれたＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ ＡＲＭＳプライマーのステムループ部分に結合するように設計されたメディエータープローブと一緒に加えられる。ミックスは、ポリメラーゼおよび機能的ＰＣＲ反応を起こすのに必要とされるすべての他の構成要素と共に１０，０００ゲノムコピーの野生型ＤＮＡも含む。合成ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異体標的（パネルＢ左部分参照）または合成ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異体標的（パネルＢ右部分参照）のいずれかが１０倍滴定系列で（推定入力５０００－５００－５０－０コピー／ＰＣＲで）ミックスに加えられる。ミックスは、９６ウェル ｑＰＣＲ適合プレートの異なるウェルに加えられる。図７ＡのＰＣＲ曲線のＣｑ値を示す。観察データは、ＡＲＭＳプライマー内のステムループが１０，０００ゲノムコピーの野生型ＤＮＡ中最低５００コピー以下までＫＲＡＳ Ｇ１２ＤからＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃおよび野生型バックグラウンドの判別を可能にすることを示す。 マルチプレックス（すなわち、複数の標的を増幅するのに必要とされるプライマー、ならびにメディエータープローブを含むオリゴヌクレオチドプールを含む）で図６に示された概念に従ってＫＲＡＳ Ｇ１２ＤからＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃと野生型バックグラウンドを判別する実証を示す図であり、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃの選択的増幅を可能にするステムループを含むＡＲＭＳプライマーが、リバースプライマー、ならびに組み込まれたＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ ＡＲＭＳプライマーのステムループ部分に結合するように設計されたメディエータープローブと一緒に加えられる。ミックスは、ポリメラーゼおよび機能的ＰＣＲ反応を起こすのに必要とされるすべての他の構成要素と共に１０，０００ゲノムコピーの野生型ＤＮＡも含む。ＰＣＲチャンバーあたり約１０，０００コピーのゲノムＤＮＡを含むように前もって定量化されたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）野生型サンプルおよび示される様々なコピー数の合成変異体標的の存在下の一体型サンプル・ツー・リザルト装置におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃのためのステムループを含む同じＡＲＭＳプライマーの性能を示す。 ＫＩＦ１１ベースのＱＣプレックスを使用してどのように断片化の程度を検証することができるかを示す図であり、右手のパネルは、良好な品質サンプルを示し；このケースでは、すべての曲線（１、２、および３）が、同じＣｑ値あたりの閾値を通る。中央のパネルにおいて、中間（２）および最も長い（３）アンプリコンの曲線は、右に（すなわち、より高いＣｑ値の方向に）シフトする。これは、サンプルが、より少ない「長い」ＤＮＡを含み、したがって、断片化されていることを意味する。左手のパネルは、最も長いアンプリコン（３）のｑＰＣＲ結果が存在しないことおよび中間のアンプリコン（２）がより高いＣｑ値へシフトすることから理解することができるように、極めて断片化されたサンプルを表す。 メディエーター反応により検出されたときの長いＫＩＦ１１アンプリコンと短いＫＩＦ１１アンプリコンの間のデルタＣｑが、評価されたＦＦＰＥサンプルにおけるＤＮＡ断片化の程度と強く相関することを示す図であり、短いＫＩＦ１１アンプリコンの近似曲線は、円を有する線で示され、一方、長いＫＩＦ１１アンプリコンの近似曲線は、通常の線で示される。パネルＡは以下の通り示す：断片化なし、高品質ｇＤＮＡサンプル、デルタＣｑ（長い－短い）：０．２。 メディエーター反応により検出されたときの長いＫＩＦ１１アンプリコンと短いＫＩＦ１１アンプリコンの間のデルタＣｑが、評価されたＦＦＰＥサンプルにおけるＤＮＡ断片化の程度と強く相関することを示す図であり、短いＫＩＦ１１アンプリコンの近似曲線は、円を有する線で示され、一方、長いＫＩＦ１１アンプリコンの近似曲線は、通常の線で示される。パネルＢは以下の通り示す：低断片化サンプル；デルタＣｑ（長い－短い）１．２（左）および０．９（右）。 メディエーター反応により検出されたときの長いＫＩＦ１１アンプリコンと短いＫＩＦ１１アンプリコンの間のデルタＣｑが、評価されたＦＦＰＥサンプルにおけるＤＮＡ断片化の程度と強く相関することを示す図であり、短いＫＩＦ１１アンプリコンの近似曲線は、円を有する線で示され、一方、長いＫＩＦ１１アンプリコンの近似曲線は、通常の線で示される。パネルＣは以下の通り示す：中断片化サンプル；デルタＣｑ（長い－短い）４．７（左）および５．６（右）。 メディエーター反応により検出されたときの長いＫＩＦ１１アンプリコンと短いＫＩＦ１１アンプリコンの間のデルタＣｑが、評価されたＦＦＰＥサンプルにおけるＤＮＡ断片化の程度と強く相関することを示す図であり、短いＫＩＦ１１アンプリコンの近似曲線は、円を有する線で示され、一方、長いＫＩＦ１１アンプリコンの近似曲線は、通常の線で示される。パネルＤは以下の通り示す：高断片化サンプル；デルタＣｑ（長い－短い）９．４（左）およびＮ／Ａ（検出されない長いアンプリコン；右）。 ４種の異なる標的について９６ウェルフォーマットｑＰＣＲ装置においてシングルプレックスＰＣＲでＦｕｓｅＴａｇプライマーを使用する変異検出を示す図であり、左上：ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ；右上：ＥＧＦＲ Ｅ７０９Ｋ；左下：ＥＧＦＲ Ｓ７６８Ｉ；右下：ＥＧＦＲ Ｌ８６１Ｑ；Ｘ軸は、ＰＣＲサイクルの数を示し；Ｙ軸は、蛍光（任意単位）を示す。標的は、ＰＣＲ反応（２，０００コピーのゲノム野生型ＤＮＡ、ならびにユニバーサルレポーター、ならびにポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよびＰＣＲ塩を常に含む）において２００コピーの合成変異体標的として加えられる。黒線は、ｇＤＮＡバックグラウンドにおける２００コピーの増幅結果を表し、灰色線は、ゲノム野生型ＤＮＡが存在するが、合成変異体標的は加えられない場合である。 ｇＤＮＡバックグラウンドにおける９６ウェルフォーマットｑＰＣＲ装置においてマルチプレックスＰＣＲでＦｕｓｅＴａｇプライマーを使用する変異検出を示す図であり、標的は、プライマーおよびメディエータープローブ、ならびに１０００コピーのゲノム野生型ＤＮＡを含むオリゴプールと一緒に、様々な濃度の合成変異体標的として加えられる。ジェネリックレポーター、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよびＰＣＲ塩（例えばＭｇＣｌ２）は、ＦＦＰＥサンプルからＤＮＡを放出するために必要とされるであろう構成要素を含む液化バッファと一緒に各反応に加えられる。三角は、５００コピーのＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ標的；黒丸は、１００コピーの標的；菱形は、２０コピーの標的を示す。四角は、ネガティブコントロール、すなわち、０コピーの標的を示す。Ｘ軸は、ＰＣＲサイクルの数を示し；Ｙ軸は、蛍光（任意単位）を示す。
詳細な説明
本開示は、ジェネリック検出カートリッジ内のカスタマイズされた遺伝子標的パネルを使用して遺伝子標的のマルチプレックス検出を実施するための方法、キット、部品のキット、システム、およびそれらの構成要素を提供する。
システム、またはシステムの部分、方法、キット、部品のキット、およびそれらの構成要素を使用して、単一のサンプル入口源のみを必要とする機器において単一のＰＣＲ反応チャンバー内で判別することができる蛍光シグナルの数を超えることができるマルチプレックスでジェネリック（すなわち、標的特異的ではなく、したがって、大量ひいては安価に購入することができる）蛍光標識レポーターを使用して、１つまたは複数の標的配列の存在を検出することができることが示された。対照的に、同時代の技術は、単一のＰＣＲ反応において判別することができる蛍光シグナルの数により制限される（例えば、従来の技術によるＩｄｙｌｌａ（商標）のケースでは、異なるＰＣＲチャンバーのそれぞれに何が入るかの区別がない（１つのサンプル入口のみが存在する）ため、６つのシグナルを判別することができる）。本技術により、ジェネリック蛍光標識レポーターを使用することができる一方、同時に、機器において利用可能であるすべてのＰＣＲ反応チャンバーにわたってマルチプレックス能力を利用することができる。
第１の一般的な態様において、マルチプル遺伝子標的を検出するための方法であって：マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのミックスを提供することであって、前記サブセットのそれぞれが、遺伝子標的に対して特異的であり、かつ前記サブセットにユニークなジェネリック配列タグを含んでおり、
前記サブセットのそれぞれが、核酸増幅条件下および遺伝子標的の存在下で、ユニークジェネリック配列タグを含む検出可能な核酸産物を生成するように適合されている、マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのミックスを提供すること；ミックスとは別に、（ｉ）生物学的サンプルおよび／またはミックスを受け入れるための入口ポート、（ｉｉ）入口ポートの下流に置かれた核酸単離区画、（ｉｉｉ）核酸増幅のための試薬；（ｉｖ）核酸抽出チャンバーの下流に置かれた１つまたは複数の核酸増幅区画、および（ｖ）複数種のジェネリックレポーターであって、複数種のジェネリックレポーターのうちの１種ずつが、検出可能な核酸産物のうちの１種に含まれるユニークジェネリック配列タグに対して特異的なジェネリック配列を含み、かつ前記検出可能な核酸産物の存在下でシグナルを生成するように適合されている、複数種のジェネリックレポーター；を含む一体型流体カートリッジを提供することであって、ミックスおよび生物学的サンプルまたは単離された核酸が、使用者によりカートリッジに挿入される、一体型流体カートリッジを提供することを含み、生物学的サンプルおよびミックスの挿入後にカートリッジを操作することであって、生物学的サンプルからの核酸単離、続いてミックスを含むマルチプレックス核酸増幅を（カートリッジの内部で）実施することを含む、操作すること；少なくとも１種の検出可能な核酸産物が前記増幅から生成される場合に一体型流体カートリッジの内部に含まれる複数種のジェネリックレポーターのうちの少なくとも１種から生成されるシグナルを検出することをさらに含む、方法が提供される。
本明細書において使用されるとき、「遺伝子標的」という用語（文脈により特に要求されていない限り、本明細書において「標的核酸」と交換可能に使用される）は、診断アッセイによる検出または調査の標的にされ得る任意の遺伝子、転写物、一般の核酸、または上記のいずれかの断片もしくは形態を指す。遺伝子標的の例には、これらに限定されないが、遺伝子（時には「標的遺伝子」と呼ばれる）、遺伝子変異体、遺伝子内の特定の変異もしくは短ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）、アレル型、または遺伝子バリアントが含まれる。本明細書において使用されるとき、「バリアント」という用語は、任意の遺伝子バリアント、すなわち、既知であるか、または遺伝子サンプルにわたって異なると予想される任意の遺伝子的特徴を指し得る。本明細書において使用される「バリアント」という用語は、「遺伝子標的」の一種と解釈することができ、かつ特定の変異、ＳＮＰｓ、または複製および欠失を含む遺伝子再編成を指し得る。遺伝子再編成、複製および欠失は、１つまたは少数の塩基対（ｂｐ）の領域などの小さい領域、または複数キロ塩基対（ｋｂｐ）にわたって広がる大きい染色体欠損などの大きい領域に影響し得る。本文脈において、「バリアント」という用語は、典型的には、対象においてモニタリングを必要とする組織と正常組織の間の既知の遺伝子的差異を指すことになり、かつ分子生物学およびバイオテクノロジーの分野において使用されるそれらの標準的な意味に従って「特異的アレル」、「変異」、「ＳＮＰ」、「バリアント」という用語と同義の用語として取り扱うことができる。アレル特異的であるプライマー対のメンバーが本明細書において参照されるとき、前記メンバーは、適切な条件下で特異的アレルを結合するが、遺伝子の任意の他のアレルを結合しない。同様に、アレル特異的プローブが本明細書において参照されるとき、前記プローブは、適切な条件下で遺伝子の特異的アレルを結合および／または検出するが、任意の他のアレルを結合および／または検出しない。
本明細書において使用されるとき、「オリゴヌクレオチド」という用語は、比較的短い、またはオリゴマーの、通常２００ヌクレオチド（「ｎｔ」）未満の核酸に関する。オリゴヌクレオチドは、しばしば合成的であり、かつ修飾塩基のように様々な修飾を含むことができ、または異なる機能性などの様々な分子にコンジュゲートすることができる。本明細書において使用されるとき、「オリゴヌクレオチドサブセット」という用語は、「遺伝子標的」に対して特異的であるオリゴヌクレオチドの機能的に関連付けられた群と解釈されるべきである。オリゴヌクレオチドサブセット中のオリゴヌクレオチドは、通常、恐らく遺伝子標的の増幅または検出を可能にするために、遺伝子標的をカバーするか、またはそれに隣接する配列の中または周囲で用途に応じてハイブリダイズすることになる。典型的な標的特異的オリゴヌクレオチドサブセットは、少なくとも１種のプライマー、恐らくプライマー対を、そして恐らく遺伝子バリアントまたはメディエータープローブなどの遺伝子標的に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブも含むことになる。概して、「オリゴヌクレオチド混合物」という用語は、標的特異的増幅プライマー対（「オリゴヌクレオチドサブセット」）およびプローブ、好ましくは標的特異的プローブ、さらにより好ましくはメディエータープローブを表すために本明細書において使用されることになる。本明細書において使用されるとき、「マルチプルオリゴヌクレオチドサブセット」または「マルチプル遺伝子標的」または「マルチプルオリゴヌクレオチド混合物」中の「マルチプル」という用語は、１つを超える、例えば複数の遺伝子標的を指すと理解されるべきである。マルチプレックス増幅またはマルチプレックスＰＣＲの文脈において、「マルチプル」という用語は、通常、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０の倍数の範囲内など、１超を指すことになる。次いで、「マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのミックス」という用語は、互いに混合されたマルチプルオリゴヌクレオチドサブセットを含む組成物、恐らく溶液または少なくともその部分的に乾燥した形態（例えば凍結乾燥した形態）と解釈されるべきである。ある文脈において、「ミックス」という用語は、マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットを含む「パネル」または「セット」を指すこともある。
本明細書において使用される「核酸」という用語およびその同義語「ポリヌクレオチド」は、当分野における通常の意味が与えられ、かつヌクレオチドモノマー間のホスホジエステル結合により互いに結合された主としてリボヌクレオチドまたは主としてデオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。（デオキシ）ヌクレオチドは、（デオキシ）ヌクレオシドのリン酸化型であり、それは、最も一般に、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、またはウリジンを含む。これらのヌクレオシドは、リボースまたはデオキシリボースである五炭糖、およびアデニン、グアニン（プリン類である）、シトシン、チミン、またはウラシル（ピリミジン類である）のいずれかである窒素塩基（「核酸塩基」、または単に、「塩基」）からなる。これらの塩基（またはそれらのヌクレオシド、もしくは後者のヌクレオチド）が核酸鎖中で続く配列は、「核酸配列」と呼ばれ、かつ核酸鎖の化学的配向を指して、いわゆる５’－末端から３’－末端方向に慣習的に示される。「５’」は、核酸配列の読み取りが始まる最初の（デオキシ）リボース環の５’炭素への参照に由来し、「３’」は、核酸配列の読み取りが終わる最後の（デオキシ）リボース環の３’炭素に由来する。核酸配列は、例えば、ＡＴＡＴＧＣＣであり得、それは、本明細書において５’－ＡＴＡＴＧＣＣ－３’核酸配列を指すと解釈されるべきである。同じ慣習の下、後者の配列は、配列５’－ＧＧＣＡＴＡＴ－３’、または単にＧＧＣＡＴＡＴに対して相補的になる。核酸には、これらに限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡまたはメチル化ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびそれらの様々な修飾バージョンを含むＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。核酸は、異なるタイプの生物から得られる生物学的サンプルのような天然源から最も一般に得ることができる。一方、人為的な既知の方法のいずれか（例えばＰＣＲ）において核酸を合成したり、組み換えたり、またはさもなければ産生したりすることもできる。
本明細書において使用されるとき、カートリッジとは別に提供されるマルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのミックス、または前記ミックスとは別に提供されるカートリッジという特定の文脈における「別に」という用語は、使用者がミックスまたはその一部分をカートリッジに挿入する瞬間までミックスとカートリッジの間に存在する物理的な接続はないことが理解されるべきである。例えば、ミックスをバイアルまたは管または任意の他の容器の内部で液体形態にて提供することができる。そのような例では、使用者は、そのような容器を開け、ミックスを含むその内容物をカートリッジ内に注ぐか、または例えばピペットにより移す可能性がより高いであろう。あるいは、ミックスは、セルロースなどの固形培地、または一片のパーチメント上にスポットおよび／または吸収され、前記培地上に結合されながらカートリッジ内に提供され得る。ビーズ、溶解可能なタブレット、またはカプセルなどを含む他の代替も存在する。これらの事象のいずれかにおいて、本発明の文脈におけるミックスは、生物学的材料または単離された核酸もカートリッジ内に提供する前に、同時に、または後にカートリッジの内部に使用者により移されるまでそこに物理的に含まれない。可能な例において、ミックスおよびカートリッジは、例えばそれらが異なる日に使用者に販売または出荷されるとき、異なる時点で提供することさえできる。
本明細書において使用されるとき、「生物学的サンプル」という用語、または単に「サンプル」は、それが生物から新たに得られたか（すなわち新鮮な組織サンプル）、または当技術分野において既知の任意の方法により保存されたか（例えば冷凍またはＦＦＰＥサンプル）どうかに関わらず、核酸および／または細胞材料を含む生物源の様々な検体または溶液を含むことが意図される。生物学的サンプルの例には以下が含まれる：哺乳類細胞などの細胞の培養物（ただし真核微生物の培養物も）、体液、体液沈殿物、洗浄検体、細針吸引物、生検サンプル、組織サンプル、がん細胞、患者から得られる他のタイプの細胞、疾患もしくは感染のために試験および／もしくは処置される個体からの組織からの細胞もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞、または法医学的サンプル。体液サンプルの非限定的な例には、全血、骨髄、脳脊髄液（ＣＳＦ）、腹水、胸水、リンパ液、血清、血漿、尿、乳糜、便、射精液、痰、乳頭吸引液、唾液、スワブ検体、洗浄もしくは灌流液および／またはブラシ検体が含まれる。ある態様において、サンプルは、ミトコンドリアＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｆＤＮＡ、無細胞腫瘍ＤＮＡまたはｓｉＲＮＡサンプルである。
本明細書において使用されるとき、「液体生検」または「液体生検サンプル」という用語は、任意の非組織標本、特に対象から得られる体液サンプルを指すと理解されるものとする。液体生検源には、これらに限定されないが、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄（ＣＳＦ）液、羊水、唾液、汗、涙、母乳、精液、便、胸水、腹水または洗液などの他の体液などが含まれる。液体生検サンプル中の核酸の分析は、動的疾患または他の生理的状態のモニタリングを可能にする費用がかかり、侵襲的で、かつしばしば有痛性の組織および／または腫瘍生検の必要を最小限にすることができる。例えば、がん患者において、液体生検から抽出される無細胞腫瘍ＤＮＡまたはＲＮＡが、変異、転座またはコピー数変化、および特異的がんマーカーの発現の検出において場合によっては使用され得る。血液（血漿、血清または全血も同様）は、ヒトにおける液体生検サンプル分析において使用される最も一般に記載される流体である。がん患者において、血液が、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、ならびに腫瘍組織により放出されるそれぞれ循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）および循環腫瘍ＲＮＡ（ｃｔＲＮＡ）を含む無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）および無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）の源であり、それらを使用して、患者の腫瘍中に存在する変異を検出することができる。ＤＮＡは、メチル化され得るか、またはメチル化され得ない。しかし、注目すべきことに、ｃｔＤＮＡは、血液中に存在するｃｆＤＮＡのごく一部しか含まず、それは、稀な変異を検出するために核酸分析用のサンプル体積を最大化することの重要性を強調する。さらに、ｃｆＤＮＡは、常に低品質であり、ヌクレオソームのおおよそのサイズ（１４０ｂｐ～１７０ｂｐ）まで断片化されている。その結果、腎臓、前立腺、ならびに上部および下部尿路上皮癌を含むある種のがん型については、尿などの代替の液体生検アプローチが、腫瘍由来材料のより豊富な源であり得る。尿は、収集の容易さ（訓練された医療スタッフを必要としない）、患者の不快感がないこと（患者コンプライアンスの向上）などの他の特有の利益も有し、かつ血液と比較して混入タンパク質がより少ないことがある。
また、本明細書において使用されるとき「核酸単離」という用語は、生物学的材料から核酸を放出して、それを増幅に利用可能にする任意の形態と解釈されるべきである。本開示の範囲内で、用語は、生物学的サンプルの液化または任意の核酸抽出またはシリカなどの固体担体での精製が関与する任意の手順を包含し得る。
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」という用語は、サーマルサイクリングならびに少なくともプライマー、典型的にはプライマー対、およびＤＮＡポリメラーゼの使用に依存する一般的な検査室の核酸増幅技法を指すと理解されるべきである。「定量的ＰＣＲ」または単に「ｑＰＣＲ」は、本明細書において、ＰＣＲに基づく実験技術の定義が与えられ、標的ＤＮＡ分子を増幅し、恐らく同時に検出または定量化するために使用される。反応の産物がその最後に、すなわちサーマルサイクリングが完了した後に検出される標準的なＰＣＲとは対照的に、ｑＰＣＲの重要な特徴は、反応が「リアルタイム」で進行するときＤＮＡ産物がサーマルサイクリング中に検出されることであり；したがって、ｑＰＣＲの別名「リアルタイムＰＣＲ」。現在、多くの異なるタイプのｑＰＣＲが存在する。例えば、逆転写（ＲＴ）ステップから開始するとき、ｑＰＣＲを使用して、メッセンジャーＲＮＡの数を定量化することができ、それにより、逆転写酵素ｑＰＣＲまたはＲＴ－ｑＰＣＲと呼ばれる。本明細書において使用されるとき、逆転写ＰＣＲ（しばしばＲＴ－ＰＣＲとも略される）との混同を避けるために「定量的ＰＣＲ」または単に「ｑＰＣＲ」という用語が「リアルタイムＰＣＲ」または「ＲＴ－ＰＣＲ」という用語よりも優先して使用される。ほとんどのｑＰＣＲが、蛍光が関与するリアルタイムで産物増幅を検出するための以下の最も一般的な方法のうちの１つを使用する：（ａ）任意の二本鎖ＤＮＡとの非特異的蛍光色素のインターカレーション、（ｂ）蛍光は、二本鎖ＤＮＡに結合すると核酸結合蛍光色素により生成される、（ｃ）プライマーの伸長中にプローブの消化によりフルオロフォアが放出される、または（ｄ）核酸合成中に標的に結合した後に蛍光を発するプローブに結合された蛍光色素による。反応混合物から発せられる蛍光は、増幅反応が起こるときリアルタイムでモニターされるが、初期の増幅サイクルでは蛍光が弱すぎてバックグラウンドと区別できない。サーマルサイクリング中に生成された蛍光シグナルは、適切な光学的検出システムにより検出され、バックグラウンド閾値を超えた瞬間から反応がプラトーに達するまで追跡される。標的配列のコピー数は、相対的または絶対的な定量化手法のいずれかを使用して、典型的には、得られた増幅曲線の形状を分析すること（標準曲線手法）、標準リファレンスとの比較により、またはシグナルが幾つかの閾値（しばしばＣｔ値と呼ばれるが、時にはＣｐ値またはＣｑ値とも呼ばれる）を超えたときに決定することにより推定することができる。相対的な定量化では、Ｃｔまたは標準曲線解析を使用して所与のサンプルにおいて推定される標的核酸レベルは、別のリファレンスサンプル、例えば、未処理のコントロールサンプルにおいて同じ標的に対して得られた値と比べて表される。逆に、絶対的な定量化では、ｑＰＣＲシグナルは、標準曲線を使用した入力コピー数に関係するか、またはより最近のデジタルＰＣＲ法に従って計算することもできる。今のところ、最初の手法は、よりいっそう普及しており、得られた値をあらかじめ作られた標準曲線と比較することによる標的ＤＮＡ量の推定の基礎をなす。これらおよび他のｑＰＣＲ定量化手法は、当技術分野において広く知られており、それらの計算は、所与の用途およびｑＰＣＲシステムに応じて、より小さく、またはより大きく異なり得る。
蛍光は群を抜いて最も一般に使用される方法であるが、任意の測定可能な特性をｑＰＣＲにおいて使用することができる。
本明細書において使用されるとき、増幅反応の「定量化サイクル」または「Ｃｑ」値は、サイクル軸に対する増幅曲線の位置を示す、蛍光が閾値に達するのに必要とされる部分的サイクル数と定義される。Ｃｑは、標的の出発濃度に直接関係し、Ｃｑ値の差は、出発濃度比に関係するので、Ｃｑ値は、サンプル中にある標的核酸の量と逆であり、サンプル中の標的コピーの数と関連する。より低いＣｑ値（典型的には２９サイクルを下回る）は、多量の標的核酸を示す。より高いＣｑ値（３８サイクルを上回る）は、より少量の標的核酸を意味する。
ΔＣｑは、本明細書に開示される様々な方法、キット、部品のキット、システム、または構成要素において計算され、濃度のｌｏｇ比、すなわち、リファレンス核酸、例えば、ＫＩＦ１１遺伝子またはその領域などの濃度に標準化された標的核酸の濃度のｌｏｇである。幾つかの実施形態において、ΔＣｑは、ゲノムＤＮＡの存在（完全性または混入）の尺度として第１および第２、場合によっては第３のＫＩＦ１１増幅反応の閾値サイクル数（Ｃｑ）の間で計算される。
ＫＩＦ１１アンプリコンは、LivakおよびSchmittgen（2001 Methods 25:402-8）により開発されたｑＰＣＲ結果のダブルΔＣｑ解析またはＰｆａｆｆｌ（2004 Quantification strategies in real-time PCR. In M. W. Pfaffl, A-Z of quantitative PCR. La Jolla, CA, USA: International University Line）により開発されたような相対的な定量化のための標準曲線法に基づく解析において例外的に有用であることが確認された。
一般に、ｑＰＣＲ測定のＣｑ結果は、標的核酸の出発濃度に、特に同じ実験において、第一に依存する。したがって、ｑＰＣＲ結果は、ΔＣｑおよびダブルΔＣｑ値として報告することができ、それぞれ遺伝子発現比および実験間の倍率変化を表す。したがって、ΔＣｑ＝０は、標的核酸およびリファレンス遺伝子の出発濃度が同じであることを示す。例えば核酸の完全性、ｇＤＮＡによる混入、ｇＤＮＡ断片化、プロセス制御などの事前に設定された要求を満たす実験を考えるためのΔＣｑおよびダブルΔＣｑの値は、特定のニーズに従って当業者により確立することができる。
増幅反応における、検出可能なプローブにより産生されるシグナル、例えば蛍光などの出力シグナルの定量化は、しばしば、有限数の要素、例えば丸めおよび切り捨てなどにより、大きいセットからの入力値をより小さいセットの出力値にマッピングするプロセスに関し、当業者に既知の任意の手段により、好ましくは専用のソフトウェアを使用したデジタルシグナル加工を介して実施することができる。
標準化は、増幅反応において標的核酸により産生されたシグナルなど、異なるスケールで測定された値を、増幅反応においてリファレンスプローブ、例えばＫＩＦ１１により得られたシグナルなど、概念的に共通のスケールに調整するプロセスを指す。例えば、増幅反応において標的核酸により得られた値は、ＫＩＦ１１遺伝子増幅反応の値に調整され、好ましくは標的核酸およびＫＩＦ１１遺伝子は、同じ増幅反応において増幅され、かつ／または同じサンプルから得られる。
閾値は、ポジティブなＰＣＲ結果を表す、蛍光シグナルなどの検出可能なシグナルが基底閾値レベル（「バックグラウンドノイズ」）を超えるのに必要とされる増幅サイクルの数または増幅の経過時間を表す。閾値は、サーマルサイクリング増幅反応において閾値サイクル数であり得、または閾値は、等温核酸増幅反応において時間値（例えば、増幅の経過時間）であり得る。閾値は、当業者に既知の任意の手段により決定することができる。定量的ＰＣＲを実施するために、閾値サイクル値は、試験および校正サンプルにおいて増幅される各標的核酸について決定される。閾値を決定するために使用される方法が、再現性のある値を与えることが重要である。増幅曲線の対数期における閾値を位置付けることにより、そのような再現性が達成可能である。好ましくは、閾値は、増幅曲線の一次または二次導関数から導出される。
閾値は、増幅曲線の一次導関数の正のピークに関連するサイクル数または時間値を計算することにより決定することができる。閾値（例えば、サーマルサイクリング増幅における閾値サイクル数または等温増幅における時間値）は、二次曲線のピークの位置により表すこともできる。核酸配列増幅の閾値は、以下により決定することができる：（ｉ）測定されたシグナルから核酸配列の増幅曲線を導出すること；（ｉｉ）増幅曲線の導関数を計算すること；（ｉｉｉ）導関数、例えば一次および／または二次導関数の特徴を確認すること；および（ｉｖ）導関数の特徴に関連する閾値を決定すること。
本明細書において使用されるとき、「プライマー」という用語は、例えば精製された制限消化物におけるように天然に存在するか、合成的に産生されたかを問わずオリゴヌクレオチドを指し、それは、核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれたとき、すなわち、適切なバッファ（「バッファ」は、ｐＨ、イオン強度、補因子などを含む）中および適した温度の異なるヌクレオチド三リン酸およびポリメラーゼの存在下で核酸配列合成の開始点として作用することができる。プライマーのヌクレオチドのうちの１つまたは複数を、例えば、メチル基、ビオチンもしくはジゴキシゲニン部分、蛍光タグの付加により、または放射性ヌクレオチドもしくは検出可能なユニバーサルマーカーを使用することにより修飾することができ、そのケースでは、プライマーは、プローブとして作用することができる。本明細書において使用されるとき、交換可能に使用される「バリアント特異的プライマー」または「アレル特異的プライマー」という用語は、バリアント配列に特異的に結合するプライマーを指す。類似して、「バリアント特異的プライマー対」という用語は、ＰＣＲ反応において、バリアントが存在する場合のみアンプリコンを産生することが意図されるプライマー対を指す。バリアント特異的プライマー対は、例えば、バリアントが存在し、かつバリアント特異的プライマーが適した結合場所を有する場合にのみアンプリコンが生成されるようにバリアント特異的プライマーを含んでよい。あるいは、バリアント特異的プライマー対は、バリアントが存在する場合に正しい向きおよび適した距離でのみ結合する２種のプライマーを含んでよい。例えば、バリアントが欠失である場合、欠失の非存在下でプライマー対のプライマー間の距離が大きすぎてＰＣＲ反応においてアンプリコンを生成できないことがある。欠失の存在下で、バリアント特異的プライマー対の標的に結合したプライマーは、アンプリコン生成に適正な距離を有する。同じ概念は、遺伝子再構成に適用され得る。バリアント特異的プライマーの一種は、いわゆる「ＡＲＭＳ－プライマー」である。ＡＲＭＳは、増幅不応性変異系（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を表し、点変異または多型の同定のためにＰＣＲが頻繁に適用され、そこではＤＮＡがアレル特異的プライマーにより増幅される。ＡＲＭＳ ＰＣＲは、ＡＲＭＳプライマーおよび通常は一般的なＰＣＲプライマーを含む１対のプライマーを使用する。ＡＲＭＳプライマーは、通常、以下の空間的特徴を有することになる：（１．）通常約２０～４０ｂｐの長さ；（２．）プライマーの３’末端のヌクレオチドは、通常、標的ヌクレオチドに対して相補的であり、すなわち、Ｃに対してＧ、またはＧに対してＣ、およびＡに対してＴ、またはＴに対してＡ。この位置でのミスマッチは、増幅を劇的に低減し得る。Ａ：Ｇ、Ｇ：Ａ、およびＣ：Ｃミスマッチは、最悪の効果を有するのに対し、他のミスマッチは、様々な程度の効果を有する。例えばＡ－Ｔ置換を有する変異では、変異体アレルへのＡＲＭＳプライマーは、ヌクレオチドＴに対して最も相補的なヌクレオチドを有するべきであり、すなわち、Ａを有するべきである。同じ位置の正常アレルのプライマーは、ヌクレオチドＡに対して相補的であるべきであり、すなわち、Ｔを有するべきである；（３．）恐らく、その特異性をさらに向上させる、ＡＲＭＳプライマーの最後の５～１０ヌクレオチドのうちの１つにおける追加の１つまたは複数のミスマッチ。幾つかの実施形態において、ＡＲＭＳプライマーなどのアレル特異的プライマーは、標的核酸配列にハイブリダイズされたときステム－ループ構造を含む（例えば、図６参照）。「アンプリコン」という用語は、遺伝子断片または標的配列の１つまたは複数のコピーの産生（遺伝子断片または標的配列の増幅）の結果を指し、それは、ＰＣＲによるなど当業者に既知の任意の手段により生成することができる。この文脈において、増幅反応は、遺伝子標的または標的核酸の１つまたは複数のコピーの産生を指す。本明細書において使用されるとき、アンプリコンという用語は、「ＰＣＲ産物」という用語を包含する。
開示される方法、キット、部品のキット、システム、または構成要素は、自動化されたシステム、恐らくＰｏＣシステムまたは機器のためのカートリッジに関する。本明細書において使用されるとき、「カートリッジ」という用語は、チャンバーおよび／またはチャネルの自己完結型のアセンブリと理解されるべきであり、それは、そのようなカートリッジを受け入れるか、または接続するのに適しているより大きい装置の内部または外側に１つのフィッティングとして移すか、または移動することができる単一の物体として形成される。カートリッジおよびその装置は、自動化されたシステム（さらには自動化されたプラットホームと呼ばれる）を形成すると見なすことができる。幾つかの実施形態において、システムは、オリゴヌクレオチド混合物、レポーター分子、およびバッファ、塩、酵素などのような増幅反応のための試薬（「ＰＣＲミックス」）など、１種または複数種の反応構成要素をさらに含む。カートリッジに含まれる幾つかの部品は、しっかりと接続されてよく、一方、他の部品は、カートリッジの他の構成要素に対して柔軟に接続され、かつ移動可能でよい。類似して、本明細書において使用されるとき「流体カートリッジ」という用語は、液体、好ましくは流体を処置、加工、排出、または分析するのに適した少なくとも１つのチャンバーまたはチャネルを含むカートリッジと理解されるものとする。そのようなカートリッジの一例は、国際公開第２００７００４１０３号に記載されている。有利に、流体カートリッジはマイクロ流体カートリッジであり得る。概して、本明細書において使用されるとき「流体」または時には「マイクロ流体」という用語は、少なくとも１つまたは２つの寸法（例えば、幅および高さまたはチャネル）において小さい、典型的にはサブミリメートルスケールに幾何学的に制限される流体の挙動、制御、および操作を扱うシステムおよび配置を指す。そのような少量の流体は、小さいサイズおよび低エネルギー消費を必要とするマイクロスケールで移動、混合、分離またはさもなければ加工される。マイクロ流体システムは、マイクロ空気圧システム（圧力源、液体ポンプ、マイクロバルブなど）およびマイクロ、ナノ－およびピコリットル量の取扱いのためのマイクロ流体構造物（マイクロ流体チャネルなど）などの構造物を含む。本文脈において例示的かつ非常に適した流体システムが欧州特許第１８９６１８０号明細書、欧州特許第１９０４２３４号明細書、および欧州特許第２４１９７０５号明細書に記載された。上記に沿って、「チャンバー」という用語は、少なくとも１つの壁により画定され、かつこの区画に帰属する機能を実施するために必要な手段を含む、流体またはマイクロ流体アセンブリ内の任意の幾何学的形状の機能的に定義された任意の区画と理解されるべきである。これらの趣旨に沿って、「増幅チャンバー」は、実施に適しており、かつ核酸の増幅を実施するために（マイクロ）流体アセンブリ内に目的を持って設けられた前記アセンブリ内の区画と理解されるべきである。増幅チャンバーの例には、ＰＣＲチャンバーおよびｑＰＣＲチャンバーが含まれる。上記に従って、代替の実施形態において、そのようなカートリッジは、オリゴヌクレオチドジェネリックプローブを含んでよい。複数のバージョンを含む「チャンバー」および「区画」という用語は、文脈により特に要求されていない限り、本明細書において交換可能に使用される。
「プローブ」という用語は、概して、前記プローブの任意の測定可能な特性に関し、それは、プローブが分析物と相互作用するときに変化し、そのため、プローブと分析物の間の相互作用を研究することができる。プローブは、好ましくは、タグを例えば放射性標識または化学標識されることにより、さらにより好ましくは蛍光標識されることにより有する核酸である。標的検出可能なプローブの測定可能な特性は、標的が増幅されるとき、例えば、測定可能なシグナルを産生しながら、変化することになり、同様に、ＫＩＦ１１検出可能なプローブの測定可能な特性は、ＫＩＦ１１が増幅されるとき、例えば、測定可能なシグナルを産生しながら、変化することになる。好ましくは、標的検出可能なプローブにより産生されるシグナルは、ＫＩＦ１１検出可能なプローブにより産生されるシグナルと異なり、シグナルの区別を可能にする。本明細書において使用されるとき、「ジェネリックレポーター」という用語（本明細書において「ジェネリックレポーター分子」という用語と交換可能に使用される）は、少なくともその部品に対して少なくとも部分的に、好ましくは実質的に相補的なユニークジェネリック配列タグとのそのハイブリダイゼーションの結果として検出可能なシグナルまたはシグナルの変化を生成することができる任意のオリゴヌクレオチドプローブと解釈されるべきである。単純化において、ジェネリックレポーターは、ジェネリック配列タグに対して特異的な標識プローブと解釈することができる。幾つかの実施形態において、ジェネリックレポーターは、以下の要素を含む一本鎖ＤＮＡ分子を含む：フルオロフォア／クエンチャー対の第１のメンバー；ステム－ループ構造；フルオロフォア／クエンチャー対の第２のメンバー；メディエータープローブのＵＧＳＴに対して相補的であるＵＧＳＴ結合部位；ポリメラーゼ伸長ブロッカー；ここで、フルオロフォア／クエンチャー対のメンバーは、メディエータープローブのＵＧＳＴの結合および伸長の非存在下でフルオロフォアをクエンチするためにステム－ループを介して置かれる。例示的な、非限定的なジェネリックレポーター分子が図２および図６に示されている。
本明細書において使用されるとき、「メディエータープローブ」という用語は、５’から３’までに以下の要素：ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）を含む第１のポーション；標的核酸の第１の鎖に対して相補的である配列、またはアレル特異的プライマーの一部分に対して相補的である配列（もしくはアレル特異的プライマーの一部分の相補体）を含む第２のポーションを含む一本鎖ＤＮＡ配列を指す。例として、幾つかの実施形態において、アレル特異的プライマーは、その標的にハイブリダイズされたときステム－ループ構造を含む。増幅すると、プライマーのステム－ループ配列は、（１つまたは複数の）増幅された配列の部分になる（例えば、図６参照）。幾つかの実施形態において、メディエータープローブのＵＧＳＴは、そのようなステム－ループ配列またはその相補体のすべてまたは一部分に対して相補的である。
本明細書において使用されるとき、「ヘアピン」としても既知の「ステム－ループ」という用語は、特に、反対方向に読み取られたときヌクレオチド配列中の通常相補的な同じ鎖の２つの領域が塩基対合して、不対ループで終わる二重らせんを形成するとき、プライマーおよびプローブなどの一本鎖核酸中で起こる分子内塩基対合を指す。構造は、ステム－ループまたはヘアピンループである。
「ジェネリック配列タグ」という用語は、遺伝子標的が検出される生物の遺伝情報中に存在しないか、または無視できる量ほどに少なく恐らく存在する、通常はオリゴヌクレオチドの長さ範囲内の配列と理解されるべきである。可能なユニーク配列タグの例には、これらに限定されないが、ヌロマー、スクランブル合成配列、異なる／系統的に遠い生物由来の配列、固有分子識別子（Ｕｎｉｑｕｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ）などが含まれる。（ミックスからの）（オリゴヌクレオチド）サブセット」に「ユニーク」であるジェネリック配列タグの文脈において、厳密に１つのジェネリック配列タグが、１つの「遺伝子標的」に対して特異的である厳密に１つの「オリゴヌクレオチドサブセット」に対応することが理解されるべきである。本明細書において使用されるとき、「オリゴヌクレオチドサブセット」は、標的に対して特異的なオリゴヌクレオチドを含み、かつ限定することなく、１つまたは複数の増幅プライマー、およびメディエータープローブなどの１つまたは複数のプローブを含む。
本明細書において使用されるとき、「検出可能な核酸産物」という用語は、前記標的に対して特異的なオリゴヌクレオチドサブセットでの遺伝子標的の増幅反応からの産物または副産物を指す。検出可能な核酸産物は、ジェネリックレポーター、例えば標識を有するプローブであるジェネリックレポーターにより検出することができる「ユニークジェネリック配列タグ」（「ＵＧＳＴ」）を含むことにより検出可能であると理解されるべきである。検出可能な核酸産物の一例は、ジェネリック配列タグ配列を組み込んでおり、かつマルチプルオリゴヌクレオチドサブセットからのサブセットの部分を形成するプライマーまたはプライマー対により生成されるアンプリコンであり得る。代替の検出可能な核酸産物が切断され得、またはさもなければアンプリコン、プライマー、またはプローブの放出された部分であり得、前記放出された部分は、その配列にジェネリック配列タグを組み込んでいる。そのような検出可能な核酸産物の特定の例は、切断（例えば、ポリメラーゼの５’－３’エキソヌクレアーゼ活性によるなど）により放出され、かつユニークジェネリック配列タグなどのジェネリック配列タグを含むメディエータープローブの第１のポーションである。
簡潔には、使用者が生物学的サンプルをカートリッジに挿入するだけでなく、マルチプルカスタム標的特異的オリゴヌクレオチドサブセットの別に提供されたミックスも挿入する方法が開示される。これは、標的特異的オリゴヌクレオチドがカートリッジの内部に提供される既存のアッセイ特異的カートリッジによる手順とは対照的である。しかし、本発明に開示される例では、カートリッジ内でマルチプレックス核酸増幅を可能にするために、標的特異的オリゴヌクレオチドサブセットのミックスが、ミックスにより定義される対象の遺伝子標的を場合によっては含むサンプルと等しく、使用者によりカートリッジ内に提供されなければならない。少なくとも１種の検出可能な核酸産物が前記増幅から生成される例において、シグナルが生成され、カートリッジ内に含まれる複数種のジェネリックレポーターのうちの少なくとも１種から検出され得る。
本明細書に提示されるアプローチは、非常に迅速なカスタムアッセイ設計を可能にし、それによって遺伝子標的パネルを顧客によって完全に定義することができる。完全にクライアントによって定義されたパネルを設計し、かつそれを標準的なパネル特異的カートリッジ内に移すこの柔軟性を達成することは、診断カートリッジメーカーの現在の生産パイプラインの現実下で決して可能ではない。恐らくシングルユーザーによる比較的少数の使用のために標準的なパネル特異的カートリッジを市場に出すことに投資される多大な労力およびコストは、利益がまったくないだけでなく、恐らく、かかった投資コストのリターンをもたらすことすらないであろう。しかし、主な投資がジェネリック検出カートリッジに費やされ、カスタマイズされたパネル設計を後で比較的容易に合理化することができる開示される概念の範囲内で、恐らく機械学習によるアルゴリズムの助けを借りて、腫瘍患者をモニターするためのパーソナライズされたパネルを実行に移すことが実現可能になりつつある。例えば、開示される方法の興味深い例では、生物学的サンプルが得られた個体からの、かつカートリッジ内に提供されたサンプルに対してあらかじめ実施された次世代シーケンシング（ＮＧＳ）解析において同定された遺伝子標的に対して、少なくとも１つ、好ましくはより多くのマルチプルオリゴヌクレオチドサブセットが特異的である。そのような例では、例えば、患者からの腫瘍サンプルが、重要な腫瘍関連病変を決定するためにＮＧＳによりまず分析される。結果に基づいて、対象の選択された同定された病変および遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチド試薬を含む標的特異的オリゴヌクレオチドサブセットのカスタムパネルを比較的速やかに設計および生産することができる。この瞬間から、ジェネリック検出カートリッジ、カスタム設計されたパネル、および前記患者からのサンプル、例えば血液または血漿を使用して、選択された病変および遺伝子の状態を容易に、かつ高い費用効果でモニターすることができる。このように、手術または一連の処置後、ＮＧＳ解析を繰り返す必要なく、医療行為または処置の変更を必要とするあらゆる可能性のある場合のために患者の腫瘍状態および反応が分子レベルでモニターおよび監視される。
先の例と適合する開示される方法、キット、部品のキット、システム、および構成要素の次の例では、複数種のジェネリックレポーターが、好ましくは１つまたは複数の核酸増幅区画の内部で固定化されることにより、一体型流体カートリッジの内部で固定化されている。所与のジェネリックカートリッジの設計に応じて、固定化は、当技術分野において既知のような共有結合または親和性相互作用により行うことができて、制御された液体流下チャネルを有するモノリシックまたはエッチングされたチップのような構造に基づくジェネリックカートリッジにおいて有用であり得る。代替の選択肢は、マトリックス含有スポット溶液中の試薬を提供するものであり、それは、ガラス状態または類似のものに後で乾燥または凍結乾燥して、試薬を固定化するだけでなく、それらを保護し、かつそれらの貯蔵寿命を安定化することができる。水性溶液と接触すると、そのような乾燥されたマトリックスは水和され、その中に捕捉された試薬を放出する。これに沿って、開示される方法、システム、構成要素、キット、部品のキットの一例では、複数種のジェネリックレポーターがスポット溶液中に固定化される。
そのような固定化が１つまたは複数の増幅チャンバーの内部で行われる場合、他の試薬がジェネリックレポーターと一緒にスポットミックスに自然に含まれ得、それは、例えばｄＮＴＰならびに／またはポリメラーゼおよび逆転写酵素のような酵素を含むことができる。安定性の考慮に応じて、異なる試薬を含む１つまたは複数のスポットを選択される区画内に置くことができる。
開示される方法、キット、部品のキット、システム、および構成要素の上記の例のいずれかと適合する別の可能な例において、スポット溶液、例えばメチル化感受性酵素を含むスポット溶液が提供される。これらの趣旨に沿って、メチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）またはメチル化依存性制限酵素（ＭＤＲＥ）をスポット溶液に加えることができる。単離されたＤＮＡおよびマルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのミックスを含む混合物がＰＣＲチャンバーに入るとき、ＭＳＲＥ／ＭＤＲＥは、ある一定の温度（２０～５０℃、典型的には３０～３７℃）でインキュベートされたとき非メチル化／メチル化認識部位を消化する。次のステップにおいて、ＤＮＡ、標的特異的オリゴヌクレオチドサブセット、およびＭＳＲＥ／ＭＤＲＥの混合物は、ＭＳＲＥ／ＭＤＲＥを失活させるために５０～１１０℃の間、典型的には７０～９９℃の間の温度まで加熱される。同時に、任意選択で、ホットスタートＰＣＲ酵素を活性化することができ、その後、典型的なｑＰＣＲサイクリングプロトコルが続く。このアプローチを使用して、任意のメチル化シグネチャーを同じジェネリック検出カートリッジ内で容易に検出することができる。
ジェネリックレポーターおよび／または他の試薬のスポッティングは、単純であり、かつ長期の貯蔵寿命と正に相関する。試薬タイプに応じて、異なるスポット（ｓｐｏｒｔ）溶液組成物、または固定化の手段を使用することができる。ＭＳＲＥ／ＭＤＲＥのような試薬のスポッティングまたは固定化の位置は、所与のカートリッジインフラストラクチャー、ヒーターの位置などに応じて異なる区画またはチャネル内で決めることもできる。例えば、それらを増幅チャンバーの上流に設けることもできる。
所与の区画内で異なる試薬を置き、プロセスを行う選択は概して、特定のジェネリックカートリッジの内部設計に依存することになる。先の例のいずれかと適合する開示される方法、キット、部品のキット、システム、および構成要素の次の可能な例において、マルチプレックス核酸増幅および複数種のジェネリックレポーターのうちの少なくとも１種からのシグナルの生成が、１つまたは複数の増幅区画の内部で実施される。そのような配置は、増幅中に生成される検出可能な核酸産物をジェネリックレポーターのすぐ近くに置くだけでなく、リアルタイムで反応および標的検出をモニターすることを可能にする。フローセルを使用し、かつ増幅とシグナル検出を分離する他の配置も代わりに想定することができる。
本明細書に開示される方法、キット、部品のキット、システム、および構成要素の別の可能な例において、生物学的サンプルおよびマルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのミックスから単離された核酸は、一体型流体カートリッジの内部で少なくとも２つ以上の異なる増幅区画内に移動することができる。これは、少なくとも２つの例において有益である。１つ目、同じ反応のデュプリケートまたはトリプリケートのような繰返しが考慮される場合、例えばぎりぎり検出可能な低コピー数標的の場合、または２つ目、増幅チャンバーに関連し、かつその中に提供されたレポーターからのシグナルを取り込むために適合された定義された、または一定数の波長固有の検出チャネルを有する自動化されたシステムの場合。後者の例では、２つを超える増幅区画の間で核酸およびオリゴヌクレオチドプール混合物を分離することにより、異なるジェネリックレポーターが同じチャネル内で検出可能な色素とコンジュゲートすることができるにも関わらず、異なる増幅区画内に異なるジェネリックレポーターを提供またはスポットすることにより、マルチプレックス反応からより多くの標的を検出することができる。したがって、この例の可能な例において、異なるジェネリックレポーターが、同じカートリッジ内の異なる増幅区画内に提供される。
さらに上記の例の一例では、検出可能な核酸産物の存在下で生成されるシグナルは、発光色素から生成することができ、恐らくここで、異なるジェネリックレポーターを含む異なる増幅区画は、１組の同じか、または少なくとも部分的に重複する発光色素を含む。これらの趣旨に沿って、各区画が４つの異なるチャネル（例えば、赤色、黄色、緑色、および青色）内でモニターされる３つの増幅区画を有するジェネリック検出カートリッジを本発明者らが想像する場合、核酸およびオリゴヌクレオチドプール混合物は、３つの区画の間で分離されるであろう。３つの区画のそれぞれにおいて、同じマルチプレックス増幅が起こるであろうし、各区画内で４種の異なるジェネリックレポーターが４つの異なるチャネル（赤色、黄色、緑色、および青色）内で増幅の検出可能な核酸産物の存在をシグナル化し得る。区画あたり４種の異なるジェネリックレポーターの各群がマルチプレックスからの異なる標的に対して特異的であり得ることから、マルチプレックスからの１２種の異なる標的は、各区画が４つのチャネル内で検出を可能にする３つの増幅区画にわたって１２種の異なる検出事象に関連し得る。最後の２つの例の可能な実施形態において、時間の考慮のためにミックスを含むマルチプレックス核酸増幅を前記２つ以上の増幅区画のそれぞれにおいて同時に実施することができる。
別の態様において、マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのうちの１種または複数種が、ユニークジェネリック配列タグを含む少なくともプライマーを含み、検出可能な核酸産物が、前記ユニークジェネリック配列タグを含むアンプリコンである開示される方法、キット、部品のキット、システム、および構成要素が提供される。この単純な実施形態において、オリゴヌクレオチドサブセットは、そのような対あたりプライマーのうちの１種が、例えばステム－ループ構造内に、ジェネリック検出カートリッジ内でジェネリックレポーターにより検出可能であるジェネリック配列タグを含む標的特異的プライマー対を単に含むことができる。この例において、検出可能な核酸産物は、マルチプレックス増幅の部分として生成されるアンプリコン自体である。
開示される方法の完全に異なる代替の実施形態において、マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのうちの１種または複数種が、少なくとも１種のプライマーおよび少なくとも１種のメディエータープローブを含み、前記メディエータープローブがユニークジェネリック配列タグを含み、検出可能な核酸産物が、前記ユニークジェネリック配列タグを含む切断された遊離メディエーターであるキット、部品のキット、システム、および構成要素が提供される。この実施形態は、FreiburgのAlbert Ludwig Universityによる欧州特許第２７７６５８５号明細書に開示され、かつ図２に概略的に示されるメディエーター反応原理に基づく。それは、以下の実施例の部に記載されるプロトタイプカートリッジにおいて非常に効率的に機能すると評価されている。本発明者らは、それをＡＲＭＳプライマーと組み合わせることにより元の原理をさらに変更し、それは、結果として感度の改善につながった。したがって、後者の例の幾つかの実施形態において、少なくとも１種のプライマーはＡＲＭＳプライマーである。
密接して位置した変異をより良く判別するために、ステムが標的配列から任意選択で構成され得るステム－ループ構造を含むようにある種の標的特異的ＡＲＭＳプライマーがさらに修飾された。本発明者らは、それがステム－ループ修飾ＡＲＭＳプライマーと少なくとも部分的に重複するようにメディエータープローブをさらに修飾した。概念は図６に示されている。上のパネルＡにおいて、ＡＲＭＳプライマーの５’末端は、標的配列に対して相補的な配列を含むのに対し、下のパネルＢにおいて、ＡＲＭＳプライマーの５’末端は、ジェネリック末端タグとして役目を果たすステム－ループ－ステム構造で終わり、それは、そのようなプライマーの合理化された設計の利点を有する。ＡＲＭＳプライマーのステムの３’構成要素は、標的配列から誘導される配列を有することができるか、または別の配列であり得る。標的が増幅されないとき、メディエータープローブは、標的配列に結合することができず、したがって、シグナルを生成することができない。メディエータープローブは、ＡＲＭＳプライマー内にあるその相補的な配列がステム－ループ構成の内にありしたがってメディエータープローブにとってアクセス不可能であるためそれに結合することもできない。標的が増幅されるとき、ステム構造は、ポリメラーゼによりアンフォールドすることができ、それによってメディエータープローブのための結合部位を生成する。結合されると、他のプライマーが伸長するとき遊離メディエーターが放出され、遊離メディエーターは、スポットされたジェネリックレポーターに結合し、シグナルを生成することができる。上記に沿って、最後の２つの例の特定の実施形態において、ＡＲＭＳプライマーは、ステム－ループ構造を含み、好ましくは、メディエータープローブ配列は、前記ステム－ループ構造に含まれる配列とさらに少なくとも部分的に重複する。
別の例において、生物学的サンプルからの核酸単離が、マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのミックスの存在下で、恐らく核酸抽出区画内で実施される方法が提供される。この特定の例では、使用者がカートリッジ内に生物学的サンプルと一緒にマルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのミックスを加えることができ、それは時間を節約する。驚くべきことに、本発明者らは、それが、Ｉｄｙｌｌａ（商標）ベースのジェネリックカートリッジプロトタイプで液化プロトコルを含む核酸単離プロトコルを用いて非常によく機能することを観察した。代替は、マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのミックスをまず提供すること、およびそれを内部のカートリッジ空間内により深くポンピングすること、その後、ミックスがカートリッジ内の所望の区画を得たら生物学的サンプル添加が続き、それらのみ核酸単離プロトコルを開始することを含む。別の代替は、カートリッジ内に２つの入口ポートをミックス用に１つおよび生物学的サンプル用に１つ含むものでもよい。
幾つかの例では、生物学的サンプルが固体組織サンプル、恐らく固定固体組織サンプル、好ましくはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルである方法、使用、キット、部品のキット、システム、および構成要素が提供される。そのような例では、核酸単離は、前記固体組織サンプルの液化を有利に含み得るか、またはそれからなり得る。
代替例において、生物学的サンプルが液体生検サンプルである方法、使用、キット、部品のキット、システム、および構成要素が提供される。前記例の特定の実施形態において、核酸単離が無細胞核酸の単離を含む方法、使用、キット、部品のキット、システム、および構成要素が提供される。後者の実施形態の更なる実施形態において、核酸単離は、核酸抽出、好ましくは固体担体での核酸抽出を有利に含み得るか、またはそれからなり得る。
更なる例において、マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのミックスからのオリゴヌクレオチドサブセットの少なくとも一部分が、機械学習または人工知能を含むコンピュータ実装方法により設計される方法、使用、キット、部品のキット、システム、および構成要素が提供される。
制御は、特に標的遺伝子の増幅などの高感度の技法を使用するとき、任意の実験およびそのような実験に基づく任意の決定の頑強性にとって重要である。しかし、制御遺伝子の増幅の成功は、標的遺伝子自体の完全性に関する間接的な情報を提供するのみであることに留意することが必要である。したがって、適切な制御遺伝子の選択は、賢明に実施されなければならない。少なくとも１つの要件は、がんを含む広範囲の疾患にわたって体細胞変異またはコピー数変化などの変化を制御遺伝子が起こしやすくないことである。また、典型的な設定では、リファレンス遺伝子に対するデータの標準化を必要とする標的遺伝子の変化に従うことにより、様々な疾患状況における処置選択肢の効果が評価される。したがって、リファレンス遺伝子の選択における重要な前提条件は、処置によりそれらが影響されるべきではないことである。現在までのところ、最も一般に使用されるリファレンス遺伝子はハウスキーピング遺伝子（ＨＫＧ）である。しかし、ランダムなＨＫＧに対するデータの標準化は、処置条件を比較するために使用される標準化因子の計算を誤り、したがって、サンプル間の生物学的差異を隠すことがある。実際、コピー数、リファレンス遺伝子の安定性、対象の標的遺伝子および疾患の間の関係が既知ではない限り、適切なリファレンス遺伝子の選択は困難である。本明細書において本発明者らは、キネシンファミリーメンバー１１遺伝子（「ＫＩＦ１１」；ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：３８３２）が、公開データが利用可能であるほぼすべてのがん型におけるコピー数変化および体細胞変異ならびにＳＮＰｓに関してゲノム的に非常に安定であることを確認した。ＫＩＦ１１が、あらゆる包括的な集団にわたって一貫した性能を提供する可能性が高い非常に有望なジェネリックコントロールとして確認された。
大部分のがん型の中でＫＩＦ１１が驚くほど安定なゲノム領域であると本発明者らが確認したので、ＫＩＦ１１遺伝子またはＫＩＦ１１領域などのその部分は、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＮＧＳ、ＣＧＨなどの広範囲の方法において、同時に使用されるハウスキーピングリファレンス遺伝子の代替または追加として、例えば、Lemmaら（Identification and Validation of Housekeeping Genes for Gene Expression Analysis of Cancer Stem Cells, PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0149481 February 19, 2016）に記載されたように、普遍的に適したゲノムリファレンス標的（リファレンス遺伝子）として使用することができる。対応する遺伝子内の変異の存在を評価するためのリファレンス遺伝子として役目を果たす異なる遺伝子のそれぞれの安定な領域を使用し、次いで、それが試験機器のマルチプレックス面積においてより多くの試薬およびより広い空間の使用を必要とすることになるのとは対照的に、そのような普遍的に適したリファレンス遺伝子の使用は、異なる遺伝子内の変異の存在を評価するとき単一のリファレンス遺伝子のみを使用することを可能にするので、多重遺伝子パネルにおいて特に有用である。
幾つかの例では、マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのミックスが、ＫＩＦ１１遺伝子内の領域に対して特異的なサブセットを含む方法、使用、キット、部品のキット、システム、または構成要素が提供される。それらの可能な実施形態において、ＫＩＦ１１遺伝子内の前記領域は、ゲノムリファレンス遺伝子として使用されるか、またはあるいは、前記サブセットにより生成されるＫＩＦ１１アンプリコンは、ゲノムリファレンス遺伝子として使用される。本例の好ましい実施形態は、ヒトＫＩＦ１１遺伝子に関するが、恐らく、その他の哺乳類ホモログにも関し得る。特定の例において、ＫＩＦ１１内の領域は、ＫＩＦ１１遺伝子の以下のエクソン６、８、１８、２１、イントロン６、エクソン２１－イントロン２１境界または非コード領域内のいずれかに位置する。更なる実施形態において、マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのうちの１種または複数種が、ヒトＫＩＦ１１遺伝子内の領域に対して特異的なプライマーを含み、好ましくはマルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのうちの少なくとも２種が、ヒトＫＩＦ１１遺伝子中の異なる領域に対して特異的なプライマーを含み、前記プライマーが、識別可能に異なる長さの２種のＫＩＦ１１アンプリコンを生成するように設計される方法、使用、キット、部品のキット、システム、または構成要素が提供される。本明細書において使用される「ＫＩＦ１１アンプリコン」という用語は、ＫＩＦ遺伝子またはＫＩＦ１１領域のアンプリコンを指し、ここで、アンプリコンは、それぞれＫＩＦ１１遺伝子またはＫＩＦ１１領域の増幅反応の結果である。「ＫＩＦ１１領域」は、ＫＩＦ１１遺伝子の断片または部分を指す。ＫＩＦ１１遺伝子は、オープンリーディングフレームを指し、かつ５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）ならびに５’および３’位の制御配列を含む。したがって、「ＫＩＦ１１遺伝子の非コード領域」という用語は、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）ならびに５’および３’位の制御配列を意図する。
大部分のがん型の中でＫＩＦ１１が驚くほど安定なゲノム領域であると本発明者らが確認したので、本明細書に開示される方法、使用、キット、部品のキット、システム、または構成要素に関係なく、任意のＤＮＡまたはＲＮＡ増幅反応のための、特にがんにおける、ゲノムリファレンス標的またはハウスキーピング遺伝子リファレンスとしてのＫＩＦ１１の使用が本明細書に概して開示される。特定の例において、ＫＩＦ１１内の領域は、ＫＩＦ１１遺伝子の以下のエクソン６、８、１８、２１、イントロン６、エクソン２１－イントロン２１境界または非コード領域内のいずれかに位置し、かつ適したゲノムリファレンス標的領域として本明細書に同じく開示される。
ある実施形態において、ｇＤＮＡの完全性を評価するためのリファレンス遺伝子としてＫＩＦ１１またはＫＩＦ１１領域を使用することができる。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の完全性は、ｇＤＮＡ品質の定義にとって決定的な役割を果たし、かつＰＣＲ、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）または全ゲノムシーケンシングアプローチなどの下流の分子の適用に影響し得る。主にサンプルＤＮＡ保管、反復凍結融解、管への保持、蒸発および／または変性などの分析前手順のために、幾つかの要因がｇＤＮＡの完全性に影響する。湿度、温度、および温度のばらつき、ヌクレアーゼおよび他の化学薬剤の持続性、ならびに輸送中およびｇＤＮＡ抽出中に発生し得る他の準最適条件などの追加の要因もｇＤＮＡの完全性を損なう可能性がある。ｇＤＮＡの完全性は、特に偽陰性を避けるための、実験の頑強性および再現性の決定要因である。完全性が損なわれないｇＤＮＡなどの高品質ｇＤＮＡは、本質的に純粋であり、インタクトであり、二本鎖であり、高濃度であり、かつ／または混入されていないが、ｇＤＮＡに基づく所期の実験手順に少なくとも適しているｇＤＮＡを指す。ＫＩＦ１１を使用する本明細書において提供される方法は、ｇＤＮＡ断片化を決定するのに特に適している。本明細書において使用されるとき、「ｇＤＮＡ断片化の非存在」は、非ｇＤＮＡ断片化、例えばインタクトのｇＤＮＡを含む、本発明の方法で検出不可能なｇＤＮＡ断片化を意図する。
ＫＩＦ１１アンプリコンを生成するＫＩＦ１１遺伝子内の領域およびＫＩＦ１１特異的プライマー対のメンバー（例えばフォワードおよびリバースプライマー）の位置ならびに本発明において使用されるＫＩＦ１１アンプリコンの長さは、当業者のニーズに従って決定することができる。例えば、（１つまたは複数の）ｇＤＮＡ標的のアンプリコン長が、短いＫＩＦ１１アンプリコンのおよその長さである場合、この短いＫＩＦ１１アンプリコンをポジティブコントロールとして含めることができる。（１つまたは複数の）標的のアンプリコン長が可変である場合、当業者は、識別可能な長さの２種のＫＩＦ１１アンプリコン、例えば、それぞれ５０～１４０塩基の間および１４１～２８０塩基の間のアンプリコンなど、「短い」ＫＩＦ１１アンプリコンと「長い」ＫＩＦ１１アンプリコンの両方を含むことを選んでよい。あるいは、当業者は、第１のＫＩＦ１１アンプリコンが、ＫＩＦ１１遺伝子のコード領域内に完全に位置するＫＩＦ１１領域から生成され、第２のアンプリコンが、非コード領域内に位置するＫＩＦ１１領域から生成される識別可能な長さの２種のＫＩＦ１１アンプリコンを含むことを選んでよい。
当業者は、識別可能に異なる長さのＫＩＦ１１アンプリコンなど、本発明のＫＩＦ１１アンプリコンの生成に適切なプライマーおよびＰＣＲ条件の設計に十分に精通している。好ましくは、６２塩基、８９塩基、９８塩基、１３６塩基、２０４塩基またはさらに２８０塩基など、５０～２８０塩基、好ましくは６０～２５０塩基の間のＫＩＦ１１アンプリコン長が目標とされる。ＫＩＦ１１アンプリコンの生成に適切なプライマーを設計するとき、当業者は以下を考慮し得る。好ましくは、低い－ΔＧ値を有するステムループ二次構造は、アンプリコンにおいて避けられる。好ましくは、アンプリコンは、構造的に安定な区域内にある。好ましくは、回文配列は、アンプリコンにおいて避けられる。好ましくは、Ｇ：Ｃが豊富な領域は、アンプリコンにおいて避けられ、例えば、およそ５０％のＧ：Ｃ含量が目標とされる。好ましくは、反復領域は、アンプリコンにおいて避けられる。好ましくは、イントロン－エクソン境界にわたる標的領域または非コード領域内の標的領域が意図される。驚くべきことに、イントロン６領域などのイントロン配列ならびにＫＩＦ１１コード配列の非コード配列３’が例外的に安定していることが見出された。可能な実施形態において、ヒトＫＩＦ１１遺伝子内の領域は、ＫＩＦ１１遺伝子の以下のエクソン６、８、１８、２１、エクソン２１－イントロン２１境界、またはイントロン６または非コード配列内のいずれかに位置する。フォワードおよびリバースプライマーの好ましいサブセットが表５に記載されている。
無細胞ＤＮＡまたは無細胞腫瘍ＤＮＡを分析するとき、特に、使用中のアッセイがｇＤＮＡ配列とｃｆ／ｃｔＤＮＡ配列を判別しない場合、ｇＤＮＡ混入がないようにすることが重要である。ｇＤＮＡの混入を避けるため、適切な血漿サンプル調製および保管が推奨される。しかし、このサンプル調製は、１００％有効ではない可能性があり、またはアッセイの誤差もしくはオペレーターのミスが起こりやすい可能性がある。ｇＤＮＡが存在しないか、またはごく低レベルのｇＤＮＡが存在するよう品質管理するために、本明細書に記載されるようにＫＩＦ１１アンプリコンの存在を決定することは、ｇＤＮＡ（良好な完全性を有する）の非存在を評価するのに非常に好都合であることが見出された。また、ある種の標的の発現のレベルを分析するとき、またはプロキシによりＲＮＡのレベルを決定するとき、特に、使用中のアッセイがｇＤＮＡ配列とｃＤＮＡ配列を判別しない場合、ｇＤＮＡ混入がないようにすることが重要である。ｇＤＮＡの混入を除くため、ＤＮａｓｅＩでのサンプルの酵素処理が推奨される。しかし、この酵素処理は、１００％有効ではない可能性があり、またはアッセイの誤差もしくはオペレーターのミスが起こりやすい可能性がある。ｇＤＮＡの除去を品質管理するために、本明細書に記載されるようにＫＩＦ１１アンプリコンの存在を決定することは、ｇＤＮＡの非存在を評価するのに非常に好都合であることが見出された。
別の態様において、キット、部品のキット、システム、またはそれらの構成要素であって、別々の構成要素として提供され：
－マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのミックスであって、前記サブセットのそれぞれが、遺伝子標的に対して特異的であり、かつ前記サブセットにユニークなジェネリック配列タグを含んでおり、
前記サブセットのそれぞれが、核酸増幅条件下および遺伝子標的の存在下で、ユニークジェネリック配列タグを含む検出可能な核酸産物を生成するように適合されている、
マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのミックス；および
－一体型流体カートリッジであって：
（ｉ）生物学的サンプルを受け入れるための入口ポート；恐らくミックスを受け入れるための第２の入口ポート；
（ｉｉ）入口ポートの下流に置かれた核酸単離区画であって、恐らく、カートリッジの内部に液化バッファなどの核酸単離区画のための少なくとも試薬を含むか、またはそれと流体的に接続されるように配置された核酸単離区画；
（ｉｉｉ）核酸増幅のための試薬；
（ｉｖ）核酸単離区画（例えば核酸抽出チャンバー）の下流に置かれた１つまたは複数の核酸増幅区画、および
（ｖ）複数種のジェネリックレポーターであって、複数種のジェネリックレポーターのそれぞれが、（オリゴヌクレオチドサブセットにユニークであり、かつ検出可能な核酸産物のうちの１種に含まれる）ユニークジェネリック配列タグのうちの１つに対して特異的なジェネリック配列を含み、かつユニークジェネリック配列タグを含む検出可能な核酸産物の存在下でシグナルを生成するように適合されている、複数種のジェネリックレポーター
を含む、一体型流体カートリッジ
を含む、キット、部品のキット、システム、またはそれらの構成要素が開示される。
ポリメラーゼ伸長ブロッカーは、標的配列に対して相補的ではなく、したがって、塩基対合せず、かつ酵素によって伸長することができず、かつ／またはプライマー自体として関与することなく伸長中のポリメラーゼを阻害する、オリゴヌクレオチド（例えばプライマー）の３’末端に塩基を加えることにより伸長不可能に作られたオリゴヌクレオチドを指す。３ＳｐＣ３などの様々なポリメラーゼ伸長ブロッカーが実施例の部に例示されたが、当技術分野において既知の任意のポリメラーゼ伸長ブロッカー、例えば、３’－スペーサーＣ３、３’－リン酸、３’－ｄｄＣ、３’－逆方向末端を使用することができる。
幾つかの例では、複数種のジェネリックレポーターがカートリッジの内部で固定化されているキット、部品のキット、システム、またはそれらの構成要素が提供される。
更なる例において、マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのミックスからのオリゴヌクレオチドサブセットが、少なくともプライマーおよびメディエータープローブを含み、好ましくはプライマーがＡＲＭＳプライマーであるキット、部品のキット、システム、またはそれらの構成要素が提供される。幾つかの実施形態において、ＡＲＭＳプライマーが、ステム－ループ構造を含み、メディエータープローブ配列が、前記ステム－ループ構造に含まれる配列と少なくとも部分的に重複する更なる例が提供される。
幾つかの他の例において、マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのうちの１種または複数種が、ヒトＫＩＦ１１遺伝子内の領域に対して特異的なプライマーを含み、好ましくはマルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのうちの少なくとも２種が、ヒトＫＩＦ１１遺伝子内の異なる領域に対して特異的なプライマーを含み、前記プライマーが、識別可能に異なる長さの２種のＫＩＦ１１アンプリコンを生成するように設計されたキット、部品のキット、システム、またはそれらの構成要素が提供される。可能な実施形態において、ヒトＫＩＦ１１遺伝子内の領域は、以下のエクソン６、８、１８、２１、またはエクソン２１－イントロン２１境界内のいずれかに位置する。
さらに開示されるのは、マルチプル遺伝子標的、恐らくがん患者からのサンプル中のマルチプル遺伝子標的を、恐らくポストＮＧＳ解析患者サーベイランスの一環として、または微小残存病変モニタリングにおいて検出する、開示される方法、キット、部品のキット、システム、またはそれらの構成要素の使用である。
実施例
１．ジェネリックに適用可能なゲノムリファレンス遺伝子座の同定
本出願の目標は、非常に可変性かつ恐らくゲノム的に不安定な疾患および標的のための多種多様なカスタム設計されたパネルを取り扱うことができるジェネリックプラットホームを提供することであったので、本発明者らは、頑強なゲノムリファレンス遺伝子座または遺伝子を同定することをまず試みた。特に腫瘍性疾患は、ゲノム再編成が頻繁に起こり、本発明者らの広範な腫瘍診療において、本発明者らは、多くの異なるハウスキーピング遺伝子座を試験しており、各アッセイについてリファレンス遺伝子またはその群が腫瘍型の機能において最も良く選択されると考える。しかし、本明細書において所望の用途の一般的な性質を考慮して、本発明者らは、点変異およびコピー数変化を含む異なる遺伝的変異によって広範囲のがん型にわたって最小限に影響される遺伝子座のスクリーニングに着手した。本発明者らの広範な文献ならびに本発明者らおよび他者のデータのインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）解析は、本発明者らが潜在的に腫瘍学的に「安定な」遺伝子の上位１００位をランク付けすることを可能にした。これらの上位にランク付けされた潜在的なリファレンス遺伝子座を、パブリックウェブポータルhttps://www.cbioportal.orgを介して検索されたＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベースにおいて体細胞変異に関してさらに解析した。
解析は、選択をより少数の標的までさらに絞ることを可能にし、その結果として、本発明者らが現在まで試験またはスクリーニングした腫瘍サンプルにおいて、ＫＩＦ１１が体細胞変異またはコピー数変化により非常に稀にしか影響されない極めて有望なゲノムリファレンス遺伝子であるように見受けられることを本発明者らは確認し、大規模に検証した。前立腺がんの２～７％（ＴＣＧＡが、研究によって増幅または欠失を報告した）および神経鞘腫瘍の９％（増幅）のわずかな例外と共に、「安定な」汎がんリファレンスコントロールとしてのＫＩＦ１１の適合性も本発明者らの解析の時点でＴＣＧＡに含まれた２２８の研究の多種多様な腫瘍において確認することができた。後者の解析は、腫瘍サンプルなどの非常に多種多様なゲノム的に不安定なサンプルのためにジェネリックに安定な制御遺伝子座として使用される場合にゲノムリファレンス遺伝子として以前に報告されていないＫＩＦ１１の驚くべき適合性を裏付けるように見受けられる。ＫＩＦ１１の発現増加が、多くの異なるがん型において広く報告されており、それが、異なるがん型における癌遺伝子または潜在的な腫瘍マーカーであると提案されてもいるので、本発明者らの知見は、さらにいっそう驚くべきものである（Daigo et al., 2018 Int J Oncol 52:155-165; Pei et al. 2017 Oncol Lett 6618-6626 https://doi.org/10.3892/ol.2017.7053; Imai et al. 2016 Pathobiology 84:16-24）。その報告された転写過剰発現にも関わらず、本発明者らの調査およびＴＣＧＡによって得られたデータに基づいて、ＫＩＦ１１ゲノム遺伝子座は例外的に安定なように見受けられ、前立腺がんまたは神経鞘腫瘍のアッセイを設計するときのみ、選択される調節領域としてのＫＩＦ１１のゲノム安定性のリスクを取り除くために追加の研究が推奨されるであろう。
本発明者らの知見をさらに確証するため、本発明者らは、広範囲のサンプルおよびオンラインデータベースにおける選択されたＫＩＦ１１領域の安定性を大規模に試験した。特に、一般的な遺伝子変異（ＳＮＰｓ）について、本発明者らは、イントロン６、エクソン６、２１、後者の周囲のイントロン－エクソン境界、ならびに長いアンプリコン（それぞれ２４３ｂｐおよび２８０ｂｐ）を収容することができる２つの最も長いエクソン８および１８に特に焦点を合わせた。
結論として、公開データが利用可能であるほぼすべてのがん型におけるコピー数変化および体細胞変異、ならびに調査されたエクソンおよびエクソン２１－イントロン２１境界のＳＮＰｓに関して、ＫＩＦ１１はゲノム的に非常に安定であるように見受けられる。その結果、ＫＩＦ１１は、あらゆる広範囲の集団にわたって一貫した性能を提供する可能性が高い非常に有望なジェネリックコントロールであるように見受けられる。
２．ジェネリックレポーターを含むマルチプレックス増幅反応の選択
ジェネリックレポーターを含む原理証明の核酸増幅手法の選択のために、幾つかのアプローチを評価した。例には、これらに限定されないが、Biocartis NVの国際公開第２０２０／１６５１８０号に記載される異方性ループヘアピンプライマー、例えば欧州特許第２７５３７１７号明細書、欧州特許第２８１７４２１号明細書、および欧州特許第１９４８８２２号明細書に記載されるＰＡＳＳプライマーとSpeeDx LtdのＭＮＡｚｙｍｅ技術の可能な組合せ、または図２に概略的に示された、FreiburgのAlbert Ludwig Universityによる欧州特許第２７７６５８５号明細書に記載されるメディエータープローブ反応が含まれる。
数十以上の標的特異的プライマー対および恐らくプローブを潜在的に含む高標的数マルチプレックスを実施する所望の目標を念頭に置いて、本発明者らは、ＡＲＭＳプライマーとメディエータープローブ反応の組合せに基づくアッセイを開発した。現在までのところ、メディエータープローブ反応は、単に、標準的なプライマー、すなわち、変異選択的またはバリアント選択的ではなく、かつ対象の変異／ＳＮＰがその中に存在するかどうかに関わらず核酸領域を増幅するプライマーと組み合わせて使用されてきた。その結果、現在までのところ、バリアント特異的な検出に関心がある場合、メディエータープローブは、対象の変異またはＳＮＰと部分的に重複するように設計されるであろう。しかし、本発明者らは、メディエータープローブの頑強なアレル選択性を確保するために前記アプローチがそれらの広範な最適化を必要とすることを見出した。特に、これは、一般に、ＳＮＰｓの検出に関して１％以下の感度に達することを可能にせず、それを高感度の変異検出アッセイに不適にするであろう。したがって、本発明者らは、ＡＲＭＳプライマーが変異体標的分子の選択的増幅のために使用され、メディエータープローブが対象の変異と重複しないようにメディエータープローブ反応ベースのアッセイを変更した。ＡＲＭＳプライマーは、例えば、より困難な標的のために、複雑なマルチプレックス設定において感度／特異性の結果の微調整を可能にし得ると本発明者らが仮定したウォブルおよび／またはループを含むことができる。
本明細書に提示されるアプローチの強い判別力を示す結果が図３に示されており、ＥＧＦＲ遺伝子内のＳＮＰｓおよびインデルの高感度の検出のためにＡＲＭＳプライマーおよびメディエータープローブの使用を組み合わせる３プレックスアッセイの性能を示す。結果は、合成変異体標的の滴定系列が頑強に増幅され、かつ１０．０００コピーのゲノム野生型バックグラウンドにおいて明らかに検出可能であったことを示す。３プレックスアッセイは、３プレックスアッセイの標的の幾つかについてブランク限界（ＬＯＢ、図中、黒四角で示される）から十分に判別されて、最低１０変異体標的コピーを検出することができた。
３．プロトタイプジェネリックカートリッジの構成
Biocartis NVが所有し、かつそれらの自動化された分子検査システムＩｄｙｌｌａ（商標）と適合する流体サンプル加工カートリッジに基づいてジェネリックカートリッジプロトタイプを調製した。標準的なカートリッジは、サンプル入口ポート、ならびに選択される手法に従ってサンプル加工および核酸単離のための流体経路と連絡している試薬および廃棄物のための複数の内部区画を含む単一の使い捨ての実体として製造される。流体経路は、増幅試薬が予め搭載され、かつ流体経路の上流区域内で単離されたような核酸の一部分を受け入れるように構成された５つの独立した核酸ＰＣＲ増幅チャンバー内で終わる。増幅チャンバーは、対象の遺伝子標的の存在をシグナル化する発光色素を用いて実施されるＰＣＲなどの核酸増幅中に生成されたシグナルの検出を可能にする透明な壁が備えられている。サンプルがカートリッジ内に提供され、カートリッジがＩｄｙｌｌａ（商標）システムに送り込まれたら、生物学的サンプルの破壊、例えば液化または固相抽出カラムのいずれかによる核酸単離、続いて標的核酸増幅、およびシグナル検出を含む全サンプル・ツー・リザルト加工プログラムがシステムの内部で完全に自動化されて編成される。
第１の原理証明のジェネリックカートリッジプロトタイプを作成するために、Biocartis NVの名義の欧州特許第２９５８９９７号明細書に記載されているように、固定固体組織サンプル（例えばＦＦＰＥサンプル）の液化のために最適化された試薬およびバッファを上記のようなＩｄｙｌｌａ（商標）カートリッジに搭載した。次に、異なるように標識された５種のユニークジェネリックレポーターのスポット溶液をｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼなどを含むＰＣＲ試薬と一緒にスポットし、カートリッジの５つの増幅チャンバーのうちの１つずつの中でメーカーのプロトコルに従って乾燥した。Ｍｇ２＋およびＰＣＲに必要とされるバッファを液化のために使用されるバッファにまとめた。
ジェネリックカートリッジプロトタイプとは別に、６１種の標的特異的オリゴヌクレオチドサブセットのミックスを以下のように設計した。ミックス中の６１種のサブセットの各標的特異的オリゴヌクレオチドサブセットは、１種のフォワードプライマー、１種のリバースプライマー、および１種のメディエータープローブを含んでいた。ポジティブコントロール標的としてのＫＩＦ１１に対して特異的なサブセットを除いて、アレル選択的ＡＲＭＳプライマー、すなわち、対象の１種のアレルに特異的に結合する６１種のプライマーとしてフォワードプライマーを典型的に設計した。この例において、１種の特異的アレルは、たとえそれがミックス中の別のサブセットによって標的にされる別のアレルと同じ遺伝子に関し得るとしても、標的と見なされる。その結果、異なる標的－アレル特異的サブセットが、この例におけるように同じ配列を有するオリゴヌクレオチドを共有することが可能である。すなわち、各サブセット中のリバースプライマーおよびメディエータープローブは、大部分が非アレル選択的であり、むしろ対象のアレルに近い遺伝子内の領域に結合するように設計された。この実験において、６１種の標的特異的オリゴヌクレオチドサブセットのミックスは、異なる配列の６１種のフォワードプライマー（異なる遺伝子および同じ遺伝子の異なるアレルを含む６１種の遺伝子標的を定義する）、９種の異なるリバースプライマー、および９種の異なるメディエータープローブを含んでいた。この理由は、異なるアレルがＡＲＭＳフォワードプライマーの特異性により判別される、同じ遺伝子内の異なるアレル標的に対して特異的なサブセットの部分を構成するように幾つかのリバースプライマーおよびメディエータープローブを設計したためである。カートリッジレイアウトは、以下の表１の３～５列に記載されており、９種の特異的標的を検出することができる位置が示されている。オリゴヌクレオチドの配列が表２に示されている。ミックス中の濃度は、依頼に応じてBiocartis NVから入手することができるが、当業者により決定することができる。
Figure 2023547498000002
Figure 2023547498000003
Figure 2023547498000004
ジェネリックカートリッジプロトタイプの増幅チャンバー内でスポットされたときジェネリックレポータープローブのうちの厳密に１つに対して相補的な（すなわち、ジェネリックレポーター分子のユニークジェネリック配列タグ結合部位に対して相補的な）各メディエーター配列（またはユニークジェネリック配列タグを含むか、もしくはそれからなる「遊離メディエーター」）を標的特異的配列に共有結合させて、９種のメディエータープローブのうちの１種を一緒に生成した。メディエーター配列は、例えば、１０～３０ヌクレオチド長のヌロマー（すなわち、ヒトゲノム内で生じないスクランブル配列）として設計することができるが、非ヌロマーも考慮することができる。メディエーター配列の長さは様々であり得るが、それらが、それらの対応するジェネリックレポーターと相互作用することにより特異的シグナルを与え、かつ他のジェネリックレポーターと交差反応しないと予測される場合、許容される範囲内と見なされる。そのようなメディエーター配列の例は、Wadleら（2015, Biomolecular Detection and Quantification 7:1-8, Real-time PCR probe optimization using design of experiments approach）に見出すことができる。メディエーター配列として本明細書において使用される配列も依頼に応じてBiocartisから入手することができる。
メディエーター反応による６１プレックスがジェネリックカートリッジプロトタイプにおいて標的特異的シグナルを生成するのに適しているか検証するために、以下の構成要素を各プロトタイプカートリッジの溶解チャンバー内にそのサンプル入口ポートを介して一緒に加えた：
（ｉ）プライマー対およびメディエータープローブを含む６１種の標的特異的オリゴヌクレオチドサブセットのミックス２７ｕｌ；
（ｉｉ）ＦＦＰＥスライス、ゲノムＤＮＡ抽出物、またはサンプルなしコントロールに対応するｍｉｌｌｉＱ水から選択されるモックサンプル材料；
（ｉｉｉ）対象の変異を含む合成標的（ＰＣＲチャンバーあたり１０－５０－１００コピー）または合成標的なし（ネガティブコントロール）。
次いで、ジェネリックプロトタイプカートリッジをＩｄｙｌｌａ（商標）装置に挿入し、完全に自動化された試験を開始した。これらの試験中、Ｉｄｙｌｌａ（商標）プラットホームは、溶解チャンバー内へのサンプル調製バッファのポンピングを実行し、均質な液化物を得るために溶解チャンバーの内容物に加熱および高周波超音波（ＨｉＦＵ）処理を加える。次のステップにおいて、液化物は、加熱された領域を通る遅いポンピングにより熱失活され、その後、５つの並列増幅チャンバーのうちの１つずつへの核酸標的および標的特異的オリゴヌクレオチドサブセットのミックスを含む熱失活された液化物の一部分の移送が続く。この時点で、オリゴヌクレオチドミックスを含む６１プレックスのために適合されたＰＣＲサイクリングプロトコルが開始され、それは、本明細書に提示される設定において、結果として、適当な標的遺伝子またはアレルが所与の液化物ポーション中に存在する場合、遊離メディエーターの生成につながる。遊離メディエーターは、増幅チャンバー内でスポットされたとき、それらのそれぞれの相補的なジェネリック（ｇｅｎｅｒａｌ）レポータープローブにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション事象は、結果として蛍光シグナルの生成につながり、それは、アニーリング／伸長ステップ中に測定され、その後、オフセットおよびドリフトに関して、かつ増幅を検出することができる最初のサイクルの決定のためにデータを補正する標準的な後加工が続く。２つの単純なパラメータを有する決定木を使用して、弱すぎる蛍光シグナル（ベースラインにおけるシグナルに対するプラトーにおけるシグナルの比は０．１超であるべきであることを参照されたい）を有していた曲線、または予想された範囲（１５＜Ｃｑ＜３６参照）内にないＣｑを有していた曲線を除いた。
感度を試験するため、ＰＣＲチャンバーあたり０－１０－５０－１００コピー（ＰＣＲチャンバーあたり７０００ゲノムコピーを含むサンプルにおいて使用されたとき０．０－０．１－０．７－１．４％変異体コピーに対応する）の滴定系列において合成標的ＨＥＲ２ ｅｘ２０ｉｎｓを使用して上記の手順を実施した。いずれも対象の変異に対して陰性であることが前もって確認されたＰＣＲチャンバーあたり７０００ゲノムコピーまたはＰＣＲチャンバーあたり１０００コピーのゲノムＤＮＡを含む高バックグラウンド臨床サンプルと合成標的を混和した。得られた例示的な増幅曲線が図４および図５に示されている。
上記の例において使用された増幅プライマー、メディエータープローブ、およびジェネリックレポーターの配列が表３に記載されている。
Figure 2023547498000005
第一に、図４中のＨＥＲ２ ｅｘ２０ｉｎｓにより例示されるように、データは予想外にも、本明細書に提示される方法論により、最低１０コピー／ＰＣＲのマーカーを検出することが可能であることを示す。したがって、方法は、マルチプレクシングの複雑さを考えると、驚くほど高感度である。さらに、試験された５０超のプロトタイプカートリッジにわたって偽陽性は検出されなかったので、本方法はまた、厳しい特異性基準を満たすと結論付けることができる。
さらに、たとえ生物学的サンプルと一緒に提供されたプライマー対およびメディエータープローブによる並行した同一のマルチプレックス反応においてマーカーが増幅チャンバーのすべてにわたって増幅されても特定のチャンバー内で１つの特定のマーカーを検出することが可能であることをデータは示す。例えば、ＥＧＦＲ Ｇ７１９Ａは、チャンバーＡからのチャネル２内で検出されるが、他のチャンバー内では検出されず；ＥＧＦＲ Ｓ７６８Ｉは、チャンバーＢからのチャネル２内で検出されるが、他のチャンバー内では検出されない。同様に、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒは、チャンバーＣからのチャネル１内で検出されるが、他のチャンバー内では検出されず；ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃは、チャンバーＤからのチャネル１内で検出されるが、他のチャンバー内では検出されない。データはさらに、同じチャンバー内の２種の変異体を判別することが可能であることを示す。すなわち、Ｃ７９７Ｓは、チャンバーＢからのチャネル４内で検出され、かつチャンバーＢからの他のチャネル内で検出されず；ＥＧＦＲ Ｓ７６８Ｉは、チャンバーＢからのチャネル２内で検出され、かつチャンバーＢからの他のチャネル内で検出されない。最後に、データはまた重要なことに、異なるジェネリックレポーターを使用して単一の増幅チャンバー内で同時に複数種のマーカーを検出することが可能であることを示す。これを示すため、本明細書でそれぞれ論じられる標的を、すべての増幅チャンバー内でサンプル加工コントロールとして使用したポジティブコントロールゲノムリファレンス遺伝子と組み合わせて常に検出した。
４．マルチプレックス増幅のための改善されたプライマー－プローブシステムの開発
幾つかの例では、近接する変異が異なる臨床作用につながり得るので、それらを判別することは価値があり得る。この一例には、特異的ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ標的療法に応答し得るＫＲＡＳ変異体腫瘍の検出のための変異アッセイを使用することが望まれている場合、他のＫＲＡＳ Ｇ１２またはＧ１３変異からＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを判別する必要が含まれる。慣例的には、複数のチャンバーを有するサンプル・ツー・リザルトプラットホームにおいて、これは、他のＫＲＡＳ Ｇ１２またはＧ１３変異のためのＡＲＭＳプライマーと異なるチャンバー内でＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ増幅のためのＡＲＭＳプライマーをスポットして取り計らわれる。しかし、すべての標的特異的オリゴヌクレオチドがサンプル入口ポートを通じて一緒に加えられる状況において作業するとき、特定のＡＲＭＳプライマー間で空間的分離を保つことは可能ではない。したがって、本発明者らは、ステムが標的配列から任意選択で構成され得るステム－ループ構造を含むようにＡＲＭＳプライマーをさらに修飾した。本発明者らは、メディエータープローブが修飾ＡＲＭＳプライマーと少なくとも部分的に重複する一方、標準的なメディエータープローブ設計において、増幅のために使用されるプライマーの下流にプローブが常にあるようにメディエータープローブをさらに修飾した。メディエータープローブの結合部位がＡＲＭＳプライマー内に完全に入る状況の概念が図６に示されているが、メディエータープローブの結合部位の部分がＡＲＭＳプライマーの外側になることを想定することができる。ＡＲＭＳプライマーのステムの３’構成要素は、標的配列から誘導される配列を有することができるか、または別の配列であり得る。標的が増幅されないとき、メディエータープローブは、標的配列に結合することができず、したがって、シグナルを生成することができない。メディエータープローブは、ＡＲＭＳプライマー内にあるその相補的な配列がステム－ループ構成の内にありしたがってメディエータープローブにとってアクセス不可能であるためそれに結合することもできない。標的が増幅されるとき、ステム構造は、ポリメラーゼによりアンフォールドすることができ、それによってメディエータープローブのための結合部位を生成する。結合されると、他のプライマーが伸長するとき遊離メディエーターが放出され、遊離メディエーターは、スポットされたジェネリックレポーターに結合し、シグナルを生成することができる。
２種以上のメディエータープローブの使用が著しく検出可能性を高めることが当業者には明らかになるであろう。例えば、２種のメディエータープローブのケースでは、４つの異なる条件を互いに区別することができ、例えば
Figure 2023547498000006
結果は図７に示されており、概念の頑強性ならびに普遍的に有用性を示し、すなわち、概念は本発明のジェネリックカートリッジに限定されないが、マルチプレックス増幅反応において広く使用することができる。
５．ＦｕｓｅＴａｇの開発
例４に記載されたプライマー－プローブシステムの更なる開発において、本発明者らは、頑強性をさらに向上させ、かつ同時にコストを低減するためにシステムの単純化に着手した。これを、ステム－ループプライマーとメディエータープローブ２を１つの「ＦｕｓｅＴａｇ」プライマーに組み合わせ、したがって、例４の改善されたプライマー－プローブシステムと比較して構成要素の数を減らすことにより達成した。さらに、ＦｕｓｅＴａｇプライマーは、－費用のかかる－ポリメラーゼ伸長ブロッカー（図中、四角いボックスにより示される）など修飾を含まず、それは高速合成および反復を可能にする。ＦｕｓｅＴａｇは、ＦＬＥＸ Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎカートリッジを用いて作業するとき、近接するマーカーの判別を可能にする。
図６Ｃは、近隣のマーカーの判別を可能にする「ＦｕｓｅＴａｇ」概念を示す。修飾フォワードＡＲＭＳプライマー（「ＦｕｓｅＴａｇ」プライマー）は、ここで５’から３’までに：放出されたとき図６Ｃに遊離メディエーター２として示されるユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）を含む第１のポーション；ステム－ループ構造；および標的に対して相補的である（かつ好ましくはアレル特異的である）第２のポーションを含む。特異的標的がＦｕｓｅＴａｇプライマーにより増幅されないとき、ユニークジェネリック配列タグ（メディエーター２）は放出されず、したがって、シグナルを生成することができない。しかし、メディエータープローブ１は、マルチプレックス反応混合物中に存在する別のフォワードプライマーにより依然として加水分解され得る。
ポリメラーゼによるＦｕｓｅＴａｇプライマーの伸長は、メディエータープローブ１の標的特異的構成要素の加水分解および遊離メディエーター１の遊離につながる。その後のＰＣＲサイクルにおいてポリメラーゼによるリバース（ＲＥ）プライマーの伸長は、ＦｕｓｅＴａｇプライマーの二本鎖部分の加水分解につながり、結果としてユニークジェネリック配列タグ（遊離メディエーター２）の遊離につながる。
遊離メディエーター１と遊離メディエーター２の両方がそれらの対応するユニバーサルレポーターに結合することができる。フルオロフォアとクエンチャーは交換することができることに留意されたい（図６Ｃに図示せず）。遊離メディエーターが伸長したら、クエンチャーもしくはフルオロフォア修飾の置換および／またはクエンチャーもしくはフルオロフォア結合ヌクレオチドの加水分解により蛍光シグナルが生成される（図示せず）。非加水分解メディエータープローブおよびジェネリックレポーターは、ポリメラーゼ（四角により記号で示される）により伸長させることができないことに留意されたい。
概念をシングルプレックスセットアップでまず試験した。図１０は、４種の異なる標的について９６ウェルフォーマットｑＰＣＲ装置においてシングルプレックスＰＣＲ（すなわち、１種の標的を増幅するのに必要とされるプライマーのみを含む）でＦｕｓｅＴａｇプライマーを使用する変異検出に関する性能を示す。標的を、２，０００コピーのゲノム野生型ＤＮＡ、ならびにユニバーサルレポーター、ならびにポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよびＰＣＲ塩（ＭｇＣｌ２を含む）を常に含んでいたＰＣＲ反応において２００コピーの合成変異体標的として加えた。異なる標的、すなわち、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ、ＥＧＦＲ Ｅ７０９Ｋ、ＥＧＦＲ Ｓ７６８ＩおよびＥＧＦＲ Ｌ８６１Ｑを含む４つの異なる組合せを試験した。様々なＦｕｓｅＴａｇプライマーの配列が表４に示されている。
Figure 2023547498000007
ｇＤＮＡバックグラウンドにおける２００コピーの増幅結果は、図１０に黒線により示されている。ゲノム野生型ＤＮＡが存在したが、合成変異体標的を加えなかったコントロール反応が灰色線により示されている。結果は、ネガティブコントロールを超える標的特異性を示す。
ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＥＧＦＲ Ｃ７９７Ｓの２種の変異体バリアント、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍの２種の変異体バリアント、およびＥＧＦＲ Ｇ７１９Ｓを用いて実験を繰り返した。それらはすべて本質的に同じ結果、すなわち、ネガティブコントロールを超える標的特異性（データは示さず）を与える。
結論として、結果は、独立して使用される標的であり得るジェネリックタグとしての「ＦｕｓｅＴａｇ」概念の一般的な実現可能性の証拠となる。
「ＦｕｓｅＴａｇ」概念の普遍的な実用性をさらに示すため、マルチプレックスＰＣＲでの変異検出に関する性能を調べた。特に、９６ウェルフォーマットｑＰＣＲ装置における複数の標的を増幅するのに必要とされるプライマー、ならびにメディエータープローブを含むオリゴヌクレオチドプールを含む混合物を試験した。標的を、プライマーおよびメディエータープローブ、ならびに１０３コピーのゲノム野生型ＤＮＡを含む混合物と一緒に様々な濃度の合成変異体標的として加えた。ジェネリックレポーター、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよびＰＣＲ塩（ＭｇＣｌ２を含む）を、ＦＦＰＥサンプルからＤＮＡを放出するために必要とされるであろう構成要素を含む液化バッファと一緒に各反応に加えた。「ＦｕｓｅＴａｇ」プライマーＦＥＢ＿ＦＭＧ＿ＢＲＡＦ＿Ｔ２＿Ｆ０４１が表４に示されている（他の構成要素は示されていない）。
ｇＤＮＡバックグラウンドにおける５００（三角）、１００（黒丸）、および２０（菱形）コピーの増幅結果が図１１に示されている。ゲノム野生型ＤＮＡが存在したが、合成変異体標的を加えなかった（０コピー）コントロール反応が黒四角により示されている。結果は、マルチプレックスの文脈においてネガティブコントロールを超える標的特異性を示す。
結論として、結果は、広範囲の用途における「ＦｕｓｅＴａｇ」概念の有効性および特異性を示す。
６．ＤＮＡ断片化評価のためのＫＩＦ１１を使用する品質管理（ＱＣ）増幅の開発
核酸断片化の決定または白血球からのゲノムＤＮＡでの血漿からの短い無細胞ＤＮＡの混入の評価のようなある特定の用途のために、本発明者らは、ＡＢＣＢ、ＲＮａｓｅＰ、およびＴＦＲＣを含む３つの異なるハウスキーピング遺伝子に基づく品質管理トリプレックスを初めに想定した。しかし、これらおよび他の試験された遺伝子が満足のいくレベルの安定性を示さないことに気づいたため、ＫＩＦ１１が驚くべきことに変異を含まない安定なゲノム領域であると確認した後、本発明者らは、ＫＩＦ１１の異なるエクソンに基づく初期のトリプレックス断片化アッセイを再開発した。単一の安定な領域への切替えは、幾つかの異なるリファレンス遺伝子を使用した場合に発生し得るコピー数のばらつきを避けるのに有益と仮定した。したがって、ＫＩＦ１１の異なるエクソンを使用して、６２ｂｐ、９８ｂｐ、および１３６ｂｐである識別可能に異なる長さの３種のアンプリコンの増幅および検出それぞれのためのプライマーおよびプローブを開発した。Ｉｄｙｌｌａ（商標）カートリッジの内部のサイクリングの条件は、依頼に応じてBiocartisから入手することができるものの、サイクリングの条件は、当業者により容易に決定することができる。ＦＦＰＥサンプル由来のＤＮＡ、血液からのヌクレオソームＤＮＡ、インタクトのゲノムＤＮＡなどを含む、異なる程度のＤＮＡ断片化を有するサンプルに対してＱＣトリプレックスを試験した。図８に示されるように、ＫＩＦ１１ベースのＱＣトリプレックスは、特定のサンプル中に存在するＤＮＡの断片化の程度ひいては品質の信頼性の高い指標を与える。
上記の例において使用された増幅プライマー、メディエータープローブ、およびジェネリックレポーターの配列が表５に記載されている。
Figure 2023547498000008
７．メディエーター反応ベースのｑＰＣＲにおけるＫＩＦ１１を使用するＤＮＡ断片化の決定
次のステップは、上記のようなプロトタイプジェネリックカートリッジのために適合されたＫＩＦ１１およびメディエーター反応読み取りによるその検出に基づくＤＮＡ断片化制御ｑＰＣＲ増幅の開発であった。そうするために、ＫＩＦ１１の異なるエクソンを標的とする短い（８２ｂｐ）および長い（２０４ｂｐ）ＰＣＲアンプリコンを、それらに対応する２種のメディエータープローブと一緒に設計した。それぞれチャネル５およびチャネル１内に置かれた異なる発光色素とコンジュゲートされたその特異的ジェネリックレポーターを標的とするようにメディエータープローブのそれぞれを設計した。２種のアンプリコンおよびメディエーターに関連するｑＰＣＲシグナルを同じ反応において検出することができるように、各プロトタイプカートリッジの同じ増幅チャンバー内にレポーターの両方を提供した。長いアンプリコンｑＰＣＲ曲線と短いアンプリコンｑＰＣＲ曲線の間のＣｑ差（デルタＣｑ）の決定をＤＮＡ断片化の尺度として使用した。オーソゴナルｄｄＰＣＲベースの方法を使用してＤＮＡ断片化レベルをあらかじめ決定した１組の臨床ＦＦＰＥサンプルに対して「ＫＩＦ１１ ＤＮＡ断片化デュプレックス」の性能を決定した。ポジティブコントロールとして、断片化されないと予想される白血球由来の高品質ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）（Promega）に対してもアッセイを試験した。結果は図９に示されており、図中、円を有する線は、短いアンプリコンを表し、通常の線は、長いアンプリコンを表す。閾値（水平線）を使用してＣｑ値を決定した。結果は明らかに、メディエーター反応により検出されたときの長いＫＩＦ１１アンプリコンと短いＫＩＦ１１アンプリコンの間のデルタＣｑ値は、評価されたＦＦＰＥサンプルにおけるＤＮＡ断片化の程度と強く相関すること、および本明細書において開発された断片化デュプレックスは、本明細書に提示される概念のジェネリックカートリッジに容易に使用可能であることを示す。そのようなデュプレックスは、パーソナライズされたオリゴヌクレオチドパネルに陽性増幅コントロールを提供するのに非常によく適しているだけでなく、断片化されたサンプルを検出するその能力のおかげで、それは、サンプル品質の機能において最終結果の信頼性の指標を提供することもできる。次いで、ＦＦＰＥサンプルにおける広範な断片化は脱アミノアーチファクトと相関するので、いずれもホルマリン固定によって引き起こされるため、本ＫＩＦ１１デュプレックスアッセイは、脱アミノアーチファクトの予測にも適している可能性がある。最後に、循環している胎児、腫瘍、または臓器提供者のＤＮＡ標的パネルを標的とするもののような血漿からのｃｆＤＮＡベースのアッセイについて、本明細書に提示される断片化アッセイも恐らく、例えば、血漿サンプル中の白血球からのゲノムＤＮＡの混入に関する情報を提供するのに適している。
結論として、本発明者らは、本明細書においてファスト・トラクトかつ極めて汎用的な診断アッセイおよび製品開発への非常に珍しいアプローチの実用的な原理証明の実証を提供した。本発明者らは、本明細書に提示される概念は、カスタマイズされたカートリッジの設計、製造およびＱＣリリースの必要をなくすので、迅速で、カスタマイズされ、かつ個別化された分子検査手法のための全く新しい場を開く膨大な可能性を有すると考える。特に、本明細書に開示される方法、キット、部品のキット、および使用は、新しいアッセイを患者にもたらすための開発コストおよび時間を大幅に削減することができる。必須の医療および診断製品の生産を世界的に停止および遅延させ、処置決定および十分な医療を求めている多くの人々へのアクセスを遅延させた２０２０年の世界的なパンデミックの突然の発生によって示されたように、特に現在、そのような開発促進が非常に求められている。

Claims (47)

  1. マルチプル遺伝子標的を検出するための方法であって：
    －マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのミックスを提供することであって、前記サブセットのそれぞれが、遺伝子標的に対して特異的であり、かつ前記サブセットにユニークなジェネリック配列タグ（ユニークジェネリック配列タグ）を含んでおり、
    前記サブセットのそれぞれが、核酸増幅条件下および前記遺伝子標的の存在下で、前記ユニークジェネリック配列タグを含む検出可能な核酸産物を生成するように適合されている、
    ミックスを提供すること；
    －前記ミックスとは別に、
    （ｉ）生物学的サンプルおよび／または前記ミックスを受け入れるための入口ポート、
    （ｉｉ）前記入口ポートの下流に置かれた核酸単離区画、
    （ｉｉｉ）核酸増幅のための試薬；
    （ｉｖ）前記核酸単離区画の下流に置かれた１つまたは複数の核酸増幅区画、および
    （ｖ）複数種のジェネリックレポーターであって、前記複数種のジェネリックレポーターのうちの１種ずつが、前記検出可能な核酸産物のうちの１種に含まれる前記ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）に対して特異的なジェネリック配列を含み、かつ前記検出可能な核酸産物の存在下でシグナルを生成するように適合されている、複数種のジェネリックレポーター；
    を含むカートリッジを提供することであって、
    生物学的サンプルおよび前記ミックスが、使用者により前記カートリッジに挿入される、
    カートリッジを提供すること
    を含み、
    －前記生物学的サンプルおよび前記ミックスの挿入後に前記カートリッジを操作することであって、前記生物学的サンプルからの核酸単離、続いて、前記ミックスを含むマルチプレックス核酸増幅を実施することを含む、操作すること；
    －少なくとも１種の検出可能な核酸産物が前記増幅から生成される場合に、前記カートリッジの内部に含まれる前記複数種のジェネリックレポーターのうちの少なくとも１種から生成されるシグナルを検出すること
    をさらに含む、方法。
  2. 前記マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのうちの少なくとも１種が、前記生物学的サンプルが得られた個体からのサンプルに対して実施される次世代シーケンシング（ＮＧＳ）解析において同定された遺伝子標的に対して特異的である、請求項１記載の方法。
  3. 前記生物学的サンプルおよびマルチプルオリゴヌクレオチドサブセットの前記ミックスから単離された前記核酸が、一体型流体カートリッジの内部で少なくとも２つ以上の異なる増幅区画内に移動する、請求項１または２記載の方法。
  4. 異なるジェネリックレポーターが、前記異なる増幅区画内に提供される、請求項３記載の方法。
  5. 前記マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのうちの１種または複数種が、少なくとも１種のプライマーおよび少なくとも１種のメディエータープローブを含み、前記メディエータープローブが、５’から３’までに：
    ｉ）ＵＧＳＴを含み、前記ＵＧＳＴの配列が、ジェネリックレポーター分子のＵＧＳＴ結合部位に対して相補的である第１のポーション；
    ｉｉ）増幅されるべき前記遺伝子標的の第１の鎖に対して相補的である第２のポーション；
    を含み、
    前記検出可能な核酸産物が、前記ユニークジェネリック配列タグを含む切断された第１のポーションである、
    請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
  6. 前記少なくとも１種のプライマーがＡＲＭＳプライマーである、請求項５記載の方法。
  7. 前記ＡＲＭＳプライマーが、ステム－ループ構造を含み、好ましくは、メディエータープローブ配列が、前記ステム－ループ構造に含まれる配列、またはその相補体と少なくとも部分的に重複する、請求項６記載の方法。
  8. 前記生物学的サンプルからの前記核酸単離が、マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットの前記ミックスの存在下で実施される、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
  9. 前記オリゴヌクレオチドサブセットの少なくとも一部分が、機械学習を含むコンピュータ実装方法により設計される、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
  10. 前記マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのうちの１種が、ヒトＫＩＦ１１遺伝子中の領域に対して特異的なプライマーを含み、前記プライマーにより生成されるＫＩＦ１１アンプリコンが、ゲノムリファレンス遺伝子として使用される、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
  11. キットであって、
    別々の構成要素として提供され：
    －マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのミックスであって、前記サブセットのそれぞれが、遺伝子標的に対して特異的であり、かつ前記遺伝子標的が検出される生物の遺伝情報中に存在しない配列として定義される、前記サブセットにユニークなユニークジェネリック配列タグを含んでおり、
    前記サブセットのそれぞれが、核酸増幅条件下および前記遺伝子標的の存在下で、前記ユニークジェネリック配列タグを含む検出可能な核酸産物を生成するように適合されている、
    マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのミックス；および
    －一体型流体カートリッジであって、
    （ｉ）生物学的サンプルおよび／または前記ミックスを受け入れるための入口ポート；
    （ｉｉ）前記入口ポートの下流に置かれた核酸単離区画；
    （ｉｉｉ）核酸増幅のための試薬；
    （ｉｖ）前記核酸単離区画の下流に置かれた１つまたは複数の核酸増幅区画、および
    （ｖ）複数種のジェネリックレポーターであって、前記複数種のジェネリックレポーターのそれぞれが、前記ユニークジェネリック配列タグのうちの１つに対して特異的なジェネリック配列を含み、かつ前記ユニークジェネリック配列タグを含む前記検出可能な核酸産物の存在下でシグナルを生成するように適合されている、複数種のジェネリックレポーター
    を含む、一体型流体カートリッジ
    を含む、キット。
  12. マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットの前記ミックスからのオリゴヌクレオチドサブセットが、少なくともプライマーおよびメディエータープローブを含み、好ましくは、前記プライマーがＡＲＭＳプライマーである、請求項１１記載のキット。
  13. 前記ＡＲＭＳプライマーが、ステム－ループ構造を含み、前記メディエータープローブ配列が、前記ステム－ループ構造に含まれる配列と少なくとも部分的に重複する、請求項１２記載のキット。
  14. 前記マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのうちの１種または複数種が、ヒトＫＩＦ１１遺伝子中の領域に対して特異的なプライマーを含み、好ましくは、前記マルチプルオリゴヌクレオチドサブセットのうちの少なくとも２種が、ヒトＫＩＦ１１遺伝子中の異なる領域に対して特異的なプライマーを含み、前記プライマーが、識別可能に異なる長さの２種のＫＩＦ１１アンプリコンを生成するように設計される、請求項１１から１３までのいずれか１項記載のキット。
  15. マルチプル遺伝子標的、好ましくはがん患者から得られるサンプル中のマルチプル遺伝子標的を、より好ましくはＮＧＳ解析後の前記患者のサーベイランスの一環として、または微小残存病変モニタリングにおいて検出するための、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法の使用または請求項１１から１４までのいずれか１項記載のキットの使用。
  16. システム、またはシステムの部分であって、前記システムが、別々の構成要素として：
    自動化されたシステムと係合可能なカートリッジであって：
    ａ）入口ポート、
    ｂ）核酸単離区画；
    ｃ）核酸増幅区画；
    を含み、
    前記入口ポートが、前記核酸単離区画と流体接続しており、前記核酸単離区画が、前記核酸増幅区画と流体接続しており；
    前記核酸増幅区画が、ジェネリックレポーター分子を含み、前記ジェネリックレポーター分子が、一本鎖ＤＮＡであり、かつ：
    ｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第１のメンバー；
    ｉｉ）ステム－ループ構造；
    ｉｉｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第２のメンバー；
    ｉｖ）ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）結合部位；
    ｖ）ポリメラーゼ伸長ブロッカー；
    を含む、カートリッジ、
    オリゴヌクレオチド混合物であって：
    ａ）標的核酸の増幅のために構成された標的特異的増幅プライマー対；任意選択で前記標的特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーがアレル特異的である；
    ｂ）メディエータープローブであって、５’から３’までに：
    ｉ）ＵＧＳＴを含み、前記ＵＧＳＴの配列が、前記ジェネリックレポーター分子の前記ＵＧＳＴ結合部位に対して相補的である第１のポーション；
    ｉｉ）増幅されるべき標的核酸配列の第１の鎖に対して相補的である第２のポーション；
    ｉｉｉ）任意選択で、ポリメラーゼ伸長ブロッカー
    を含む、メディエータープローブ
    を含む、オリゴヌクレオチド混合物
    を含む、システム、またはシステムの部分。
  17. システム、またはシステムの部分であって、前記システムが、別々の構成要素として：
    自動化されたシステムと係合可能なカートリッジであって：
    ａ）入口ポート、
    ｂ）核酸単離区画；
    ｃ）核酸増幅区画；
    を含み、
    前記入口ポートが、前記核酸単離区画と流体接続しており、前記核酸単離区画が、前記核酸増幅区画と流体接続しており；
    前記核酸増幅区画が、ジェネリックレポーター分子を含み、前記ジェネリックレポーター分子が、一本鎖ＤＮＡであり、かつ：
    ｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第１のメンバー；
    ｉｉ）ステム－ループ構造；
    ｉｉｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第２のメンバー；
    ｉｖ）ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）結合部位；
    ｖ）ポリメラーゼ伸長ブロッカー；
    を含む、カートリッジ、
    オリゴヌクレオチド混合物であって：
    ａ）標的特異的増幅プライマー対であって、前記標的特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーが、標的に結合されたときステム－ループ構造を含み、任意選択で前記標的特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーがアレル特異的である、標的特異的増幅プライマー対、および；
    ｂ）メディエータープローブであって、５’から３’までに：
    ｉ）ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）を含む第１のポーション；
    ｉｉ）前記プライマーの前記ステム－ループ構造またはその相補体に対して相補的である第２のポーション；
    ｉｉｉ）任意選択で、ポリメラーゼ伸長ブロッカー
    を含む、メディエータープローブ
    を含む、オリゴヌクレオチド混合物
    を含む、システム、またはシステムの部分。
  18. システム、またはシステムの部分であって、前記システムが、別々の構成要素として：
    カートリッジを受け入れるように構成された装置であって、
    前記カートリッジが、
    ａ）入口ポート、
    ｂ）核酸単離区画；
    ｃ）核酸増幅区画；
    を含み、
    前記入口ポートが、前記核酸単離区画と流体接続しており、前記核酸単離区画が、前記核酸増幅区画と流体接続しており；
    前記核酸増幅区画が、ジェネリックレポーター分子を含み、
    前記ジェネリックレポーター分子が、一本鎖ＤＮＡであり、かつ：
    ｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第１のメンバー；
    ｉｉ）ステム－ループ構造；
    ｉｉｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第２のメンバー；
    ｉｖ）ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）結合部位；
    ｖ）ポリメラーゼ伸長ブロッカー；
    を含む、装置、
    オリゴヌクレオチド混合物であって：
    ａ）標的核酸の増幅のために構成された標的特異的増幅プライマー対；任意選択で前記標的特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーがアレル特異的である；
    ｂ）メディエータープローブであって、５’から３’までに：
    ｉ）ＵＧＳＴを含み、前記ＵＧＳＴの配列が、前記ジェネリックレポーター分子の前記ＵＧＳＴ結合部位に対して相補的である第１のポーション；
    ｉｉ）増幅されるべき標的核酸配列の第１の鎖に対して相補的である第２のポーション；
    ｉｉｉ）任意選択で、ポリメラーゼ伸長ブロッカー
    を含む、メディエータープローブ
    を含む、オリゴヌクレオチド混合物
    を含む、システム、またはシステムの部分。
  19. 前記カートリッジの前記核酸増幅区画が、核酸増幅のための試薬（ＰＣＲミックス）を含む、請求項１６から１８までのいずれか１項記載のシステム。
  20. 前記カートリッジが、前記核酸増幅区画内に複数種のジェネリックレポーター分子を含み、前記複数種のジェネリックレポーター分子の各ＵＧＳＴ結合部位が異なる、請求項１６から１９までのいずれか１項記載のシステム。
  21. 前記複数種のジェネリックレポーター分子のそれぞれが、異なるタグを含む、請求項２０記載のシステム。
  22. 前記オリゴヌクレオチド混合物が：
    各プライマー対が、異なる標的に対して特異的である、複数種の標的特異的増幅プライマー対；および
    複数種のメディエータープローブであって、
    ｉ）各メディエータープローブの前記第１のポーションが、前記複数種のジェネリックレポーター分子中の１種のジェネリックレポーター分子のＵＧＳＴ結合部位に対して相補的なＵＧＳＴを含み；
    ｉｉ）各メディエータープローブの前記第２のポーションが、増幅されるべき複数の標的核酸配列の異なる標的核酸の第１の鎖に対して相補的であり、
    ｉｉｉ）任意選択で、各メディエータープローブが、ポリメラーゼ伸長ブロッカーを含む、
    複数種のメディエータープローブ
    を含む、請求項１６から２１までのいずれか１項記載のシステム。
  23. システムであって、
    カートリッジを受け入れるように構成された装置であって、前記カートリッジが：
    ａ）入口ポート、
    ｂ）核酸単離区画；
    ｃ）核酸増幅区画
    を含み、
    前記入口ポートが、前記核酸単離区画と流体接続しており、
    前記核酸単離区画が、前記核酸増幅区画と流体接続しており；
    前記核酸増幅区画が、ジェネリックレポーター分子を含み、前記ジェネリックレポーター分子が、一本鎖ＤＮＡであり、かつ：
    ｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第１のメンバー；
    ｉｉ）ステム－ループ構造；
    ｉｉｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第２のメンバー；
    ｉｖ）ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）結合部位；
    ｖ）ポリメラーゼ伸長ブロッカー；
    を含む、装置、
    オリゴヌクレオチド混合物であって：
    ａ）標的特異的増幅プライマー対であって、前記標的特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーが、標的に結合されたときステム－ループ構造を含み、任意選択で前記標的特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーがアレル特異的である、標的特異的増幅プライマー対、および；
    ｂ）メディエータープローブであって、５’から３’までに：
    ｉ）ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）を含む第１のポーション；
    ｉｉ）前記プライマーの前記ステム－ループ構造またはその相補体に対して相補的である第２のポーション；および
    ｉｉｉ）任意選択で、ポリメラーゼ伸長ブロッカー
    を含む、メディエータープローブ
    を含む、オリゴヌクレオチド混合物
    を含む、システム。
  24. 前記カートリッジの前記核酸増幅区画が、核酸増幅のための試薬（ＰＣＲミックス）を含む、請求項２３記載のシステム。
  25. 前記カートリッジが、前記核酸増幅区画内に複数種のジェネリックレポーター分子を含み、前記複数種のジェネリックレポーター分子の各ＵＧＳＴ結合部位が異なる、請求項２３または２４記載のシステム。
  26. 前記複数種のジェネリックレポーター分子のそれぞれが、異なるタグを含む、請求項２５記載のシステム。
  27. 前記オリゴヌクレオチド混合物が、
    各プライマー対が、異なる標的に対して特異的である、複数種の標的特異的増幅プライマー対；および
    複数種のメディエータープローブであって、
    ｉ）前記第１のポーションまたは各メディエータープローブが、前記複数種のジェネリックレポーター分子中の１種のジェネリックレポーター分子の前記ＵＧＳＴ結合部位に対して相補的なＵＧＳＴを含み；
    ｉｉ）各メディエータープローブの前記第２のポーションが、増幅されるべき複数の標的核酸配列の異なる標的核酸の第１の鎖に対して相補的であり；かつ
    ｉｉｉ）任意選択で、各メディエータープローブが、ポリメラーゼ伸長ブロッカーを含む、
    複数種のメディエータープローブ
    を含む、請求項２３から２６までのいずれか１項記載のシステム。
  28. 前記アレル特異的プライマーがＡＲＭＳプライマーを含む、請求項１６から２７までのいずれか１項記載のシステム。
  29. 対象からの標的核酸を検出するための方法であって：
    標的特異的プライマー対を使用して前記対象からの核酸サンプルを増幅することであって、増幅反応が、メディエータープローブおよびジェネリックレポーター分子の存在下で実施され；
    ａ）前記メディエータープローブが、５’から３’までに：
    ｉ）ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）を含む第１のポーション；
    ｉｉ）前記標的核酸の第１の鎖に対して相補的である第２のポーション；
    ｉｉｉ）任意選択で、ポリメラーゼ伸長ブロッカー
    を含み；
    ｂ）前記ジェネリックレポーター分子が：
    ｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第１のメンバー；
    ｉｉ）ステム－ループ構造；
    ｉｉｉ）前記フルオロフォア／クエンチャー対の第２のメンバー；
    ｉｖ）前記メディエータープローブの前記ＵＧＳＴに対して相補的であるＵＧＳＴ結合部位；
    ｖ）ポリメラーゼ伸長ブロッカー；
    を含み、
    前記フルオロフォア／クエンチャー対の前記メンバーが、前記フルオロフォアをクエンチするために前記ステム－ループ構造を介して置かれる、
    増幅すること；および
    前記標的核酸の存在下で前記フルオロフォア／クエンチャー対の前記フルオロフォアにより産生されるシグナルを検出し、それによって前記標的核酸の存在を検出すること
    を含む、方法。
  30. 対象からの標的核酸を検出するための方法であって：
    標的特異的プライマー対を使用して前記対象からの核酸サンプルを増幅することであって、
    前記標的特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーが、標的に結合されたときステム－ループ構造を含み、任意選択で、前記標的特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーがアレル特異的であり、
    増幅反応が、メディエータープローブおよびジェネリックレポーター分子の存在下で実施され；
    ａ）前記メディエータープローブが、５’から３’までに：
    ｉ）ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）を含む第１のポーション；
    ｉｉ）前記プライマーの前記ステム－ループ構造またはその相補体に対して相補的である第２のポーション；
    ｉｉｉ）任意選択で、ポリメラーゼ伸長ブロッカー
    を含み；
    ｂ）前記ジェネリックレポーター分子が：
    ｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第１のメンバー；
    ｉｉ）ステム－ループ構造；
    ｉｉｉ）前記フルオロフォア／クエンチャー対の第２のメンバー；
    ｉｖ）前記メディエータープローブの前記ＵＧＳＴに対して相補的であるＵＧＳＴ結合部位；
    ｖ）ポリメラーゼ伸長ブロッカー；
    を含み、
    前記フルオロフォア／クエンチャー対の前記メンバーが、前記フルオロフォアをクエンチするために前記ステム－ループを介して置かれる、
    増幅すること；および
    前記標的核酸の存在下で前記フルオロフォア／クエンチャー対の前記フルオロフォアにより産生されるシグナルを検出し、それによって前記標的核酸の存在を検出すること
    を含む、方法。
  31. 前記アレル特異的プライマーがＡＲＭＳプライマーを含む、請求項３０記載の方法。
  32. 対象からの標的核酸を検出するための方法であって：
    標的特異的プライマー対を使用して前記対象からの核酸サンプルを増幅することであって、
    前記標的特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーが、標的に結合されたときステム－ループ構造を含み、かつ任意選択でアレル特異的であり（「ＦｕｓｅＴａｇ」）、
    増幅反応が、ジェネリックレポーター分子の存在下で実施され；
    ａ）前記ＦｕｓｅＴａｇが、５’から３’までに：
    ｉ）ユニークジェネリック配列タグ（「ＵＧＳＴ」）を含む第１のポーション；
    ｉｉ）ステム－ループ構造；
    ｉｉｉ）前記標的に対して相補的であり、かつ好ましくはアレル特異的である第２のポーション；
    を含み、
    ｂ）前記ジェネリックレポーター分子が：
    ｉ）フルオロフォア／クエンチャー対の第１のメンバー；
    ｉｉ）ステム－ループ構造；
    ｉｉｉ）前記フルオロフォア／クエンチャー対の第２のメンバー；
    ｉｖ）前記ＦｕｓｅＴａｇの前記ＵＧＳＴに対して相補的であるＵＧＳＴ結合部位；
    ｖ）ポリメラーゼ伸長ブロッカー；
    を含み、
    前記フルオロフォア／クエンチャー対の前記メンバーが、前記フルオロフォアをクエンチするために前記ステム－ループ構造を介して置かれる、
    増幅すること；
    前記標的核酸の存在下で前記フルオロフォア／クエンチャー対の前記フルオロフォアにより産生されるシグナルを検出し、それによって前記標的核酸の存在を検出すること
    を含む、方法。
  33. 前記ＦｕｓｅＴａｇが、配列番号６２～６６から選択される、請求項３２記載の方法。
  34. 前記ジェネリックレポーター分子が、配列番号８７および８８から選択される、請求項１から１０および請求項２９から３３までのいずれか１項記載の方法。
  35. ＫＩＦ１１検出を含むコントロール反応を含む、請求項１から１０および請求項１６から３４までのいずれか１項記載のシステムまたは方法。
  36. 配列番号６９～８８を含む、請求項３２記載のシステムまたは方法。
  37. サンプル中のＫＩＦ１１核酸に対して前記サンプル中の標的核酸の数を定量化するための方法であって：
    １．ＫＩＦ１１増幅反応においてＫＩＦ１１特異的プライマー対を使用して前記サンプルに含まれるＫＩＦ１１核酸を増幅することであって、
    ｉ．前記ＫＩＦ１１特異的プライマー対のメンバーのそれぞれが、エクソン、イントロン内に位置するＫＩＦ１１領域、またはＫＩＦ１１遺伝子の非コード配列に対して－互いに独立して－相補的であり；
    ｉｉ．前記ＫＩＦ１１増幅反応が、ＫＩＦ１１検出可能なプローブの存在下で実施される、
    ＫＩＦ１１核酸を増幅すること；
    ２．前記ＫＩＦ１１増幅反応において前記ＫＩＦ１１検出可能なプローブにより産生されるシグナルを検出すること；
    ３．２．の前記シグナルを定量化すること；
    ４．標的増幅反応において標的特異的プライマー対を使用して前記サンプルからの前記標的核酸を増幅することであって；
    前記標的増幅反応が、標的検出可能なプローブの存在下で実施される、
    標的核酸を増幅すること；および
    ５．前記標的増幅反応において前記標的検出可能なプローブにより産生されるシグナルを検出すること；
    ６．５．の前記シグナルを定量化すること；
    ７．３．の定量化されたシグナルに対して６．の定量化されたシグナルを標準化し、それによってサンプル中のＫＩＦ１１核酸に対して前記サンプル中の標的核酸の数を定量化すること
    を含む、方法。
  38. サンプル中のｇＤＮＡ混入を決定するための方法であって：
    １．ＫＩＦ１１増幅反応において第１および第２のＫＩＦ１１特異的プライマー対を使用して前記サンプルに含まれるＫＩＦ１１核酸を増幅することであって、
    ａ．前記第１のＫＩＦ１１特異的プライマー対の少なくとも１つのメンバーが、ＫＩＦ１１イントロンまたはＫＩＦ１１遺伝子の非コード配列に対して相補的であり；
    ｂ．前記第１のＫＩＦ１１特異的プライマー対を使用する前記増幅反応が、第１のＫＩＦ１１検出可能なプローブの存在下で実施され；
    ｃ．前記第２のＫＩＦ１１特異的プライマー対のメンバーのそれぞれが、ＫＩＦ１１エクソン内に位置し；
    ｄ．前記第２のＫＩＦ１１特異的プライマー対を使用する前記増幅反応が、第２のＫＩＦ１１検出可能なプローブの存在下で実施される、
    増幅すること；
    ２．前記第１および第２のＫＩＦ１１増幅反応において前記第１および第２のＫＩＦ１１検出可能なプローブにより産生されるシグナルを検出すること；
    ３．前記第１および第２のＫＩＦ１１増幅反応の前記シグナルを定量化すること；
    ４．第２の増幅シグナルの定量化されたシグナルに対して前記第１の増幅反応の定量化されたシグナルを標準化し、それによって前記サンプル中のｇＤＮＡ混入を決定することであって、好ましくは、前記サンプルが、ミトコンドリアＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｆＤＮＡ、無細胞腫瘍ＤＮＡまたはｓｉＲＮＡサンプルである、決定すること
    を含む、方法。
  39. サンプル中の核酸の完全性を決定するための方法であって：
    １．ＫＩＦ１１増幅反応において第１および第２のＫＩＦ１１特異的プライマー対を使用して前記サンプルに含まれるＫＩＦ１１核酸を増幅することであって、
    ａ．前記第１のＫＩＦ１１特異的プライマー対のメンバーのそれぞれが、エクソン、イントロン内に位置するＫＩＦ１１領域、またはＫＩＦ１１遺伝子の非コード配列に対して－互いに独立して－相補的であり；
    ｂ．前記第１のＫＩＦ１１特異的プライマー対を使用する前記増幅反応が、第１のＫＩＦ１１検出可能なプローブの存在下で実施され；
    ｃ．前記第２のＫＩＦ１１特異的プライマー対のメンバーのそれぞれが、エクソン、イントロン内に位置するＫＩＦ１１領域、または前記ＫＩＦ１１遺伝子の前記非コード配列に対して－互いに独立して－相補的であり；
    ｄ．前記第２のＫＩＦ１１特異的プライマー対を使用する前記増幅反応が、第２のＫＩＦ１１検出可能なプローブの存在下で実施され；
    ｅ．好ましくは、前記第１および第２のＫＩＦ１１特異的プライマー対の前記増幅反応により生成されるアンプリコンが、干渉しないほど十分に遠くに位置し、例えば、前記アンプリコンが、少なくとも１キロ塩基対など、少なくとも７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐまたはさらにそれ以上など、少なくとも６００塩基対（ｂｐ）である、
    増幅すること；
    ２．前記核酸増幅反応のそれぞれにおいて閾値を決定することであって、
    ｉ．その強度が前記反応において増幅される核酸配列の量に関係する少なくとも１つのシグナルを前記増幅反応中の複数の異なる時間に測定すること；および
    ｉｉ．前記閾値を表す、導関数の特徴に関連するサイクル数を決定することによる、
    決定すること；
    ３．前記第１および第２のＫＩＦ１１増幅反応の前記閾値（閾値サイクル数）を比較すること；
    を含み、
    ４．前記第１および前記第２のＫＩＦ１１増幅反応の前記閾値サイクル数の間の差（ΔＣｑ）が、ゲノムＤＮＡの完全性の尺度である、
    方法。
  40. ｇＤＮＡ断片化を決定するための方法であって、
    ｉ．第１、第２および第３の増幅反応により、好ましくはＰＣＲにより識別可能な長さの３種の（第１、第２および第３の）ＫＩＦ１１アンプリコンを生成すること；
    ｉｉ．前記第１、第２および第３の増幅反応のＣｑ値を決定すること；
    ｉｉｉ．前記第１、第２および第３の増幅反応の前記Ｃｑを比較すること；
    を含み、
    前記第１、第２および第３の増幅反応の間のＣｑ値の差が、前記ｇＤＮＡ断片化の指標である、
    方法。
  41. ｇＤＮＡ断片化を決定するための方法であって、
    ｉ．第１の増幅反応により第１のＫＩＦ１１アンプリコン（「短い」）を生成すること；および
    ｉｉ．第２の増幅反応により第２のＫＩＦ１１アンプリコン（「長い」）を生成すること；
    ｉｉｉ．前記第１および前記第２の増幅反応のＣｑ値を決定すること；
    ｉｖ．前記第１および前記第２の増幅反応のΔＣｑ値を決定すること；
    を含み、
    前記ΔＣｑが、ｇＤＮＡ断片化の指標である、
    方法。
  42. プライマーならびに増幅プロトコルおよび結果の分析を含む説明書を含むキットのゲノムリファレンス遺伝子ＫＩＦ１１の一領域を増幅するための使用であって、前記プライマーが、以下：
    ｉ．配列番号６９および７０；
    ｉｉ．配列番号７１および７２；
    ｉｉｉ．配列番号７３および７４；
    ｉｖ．配列番号７５および７６；
    ｖ．配列番号７７および７８；および
    ｖｉ．配列番号７９および８０
    から選択されるプライマー対であり、
    好ましくは、増幅された領域が、配列番号８１～８６から選択されるプローブにより、好ましくは配列番号８７および８８から選択されるジェネリックレポーターを介して、検出される、
    使用。
  43. 加工、単離および増幅プロセスを品質管理するための方法であって：
    ｉ．サンプル加工；
    ｉｉ．核酸単離；
    ｉｉｉ．増幅反応により識別可能に異なる長さの３種のＫＩＦ１１アンプリコンを生成すること；
    ｉｖ．前記ＫＩＦ１１アンプリコンのそれぞれのＣｑ値を決定すること；
    を含み、
    前記ＫＩＦ１１アンプリコンの前記Ｃｑ値が、前記加工、単離および増幅の品質管理の尺度である、
    方法。
  44. コントロールとしてＫＩＦ１１を使用するためのキットであって：
    ｉ．ＫＩＦ１１遺伝子のアンプリコンにアニーリングするように設計された少なくとも１種のプローブ；
    ｉｉ．アニーリング反応を行うために必要とされる製品および試薬；ならびに
    ｉｉｉ．使用説明書；
    を含み、
    前記プローブが、少なくとも一部分が、本明細書に記載されるアンプリコンに対して特異的であるプローブである、
    キット。
  45. 生物学的サンプルの自動化された加工のためのシステムであって：
    ａ．１つまたは複数のサンプル加工モジュールを含むように構成されたエンクロージャであって、各サンプル加工モジュールが、本明細書に記載される取外し可能なカートリッジを保持するように構成され、前記システムが、ＰＣＲを実施して、１種または複数種の標的遺伝子の存在および／または量を決定し、かつ任意選択で、対応する取外し可能なサンプルカートリッジ内で１つまたは複数の標的ＤＮＡ配列のレベルを決定するように前記サンプル加工モジュールを動作させるように構成され、前記対応する取外し可能なサンプルカートリッジ内のサンプルに対する加工が：前記カートリッジの生物学的サンプルを受け入れるための入口ポート内にサンプルを提供すること；および前記カートリッジを使用することを含む方法を実施する、エンクロージャ；
    ｂ．前記入口ポート内で受け取られた前記生物学的サンプルから核酸を単離するための手段であって、前記生物学的サンプルを受け入れるための前記入口ポートと流体連通に入ることができる、手段；
    ｃ．生物学的サンプルを受け入れるための前記入口ポートと流体接続し、かつその下流に置かれた、ＰＣＲを実施するための試薬および／またはバッファを含む複数のチャンバーであって；
    ｉ．ＰＣＲミックスを含むチャンバーを含み；
    ｉｉ．ＫＩＦ１１遺伝子のすべてまたは一領域を増幅するためのプライマーを含む少なくとも１つのチャンバーを含み；かつ
    ｉｉｉ．前記ＫＩＦ１１遺伝子のすべてまたは一領域を検出するためのプローブを含むチャンバーを含む、
    前記複数のチャンバー、
    ｄ．前記標的核酸を検出および／または定量化するために前記チャンバー内で核酸増幅を実施すること
    を含み、
    前記ＫＩＦ１１遺伝子が、内部標準として使用され、それによって前記標的核酸を検出および／または定量化する、
    システム。
  46. ＰＣＲを実施して、１種または複数種の標的遺伝子を検出および／または定量化し、かつ任意選択で核酸を検出および／または定量化するためのキットであって、本明細書に記載されるカートリッジおよび任意選択で使用説明書を含む容器を含む、キット。
  47. （１）
    ＥＧＦＲフォワードプライマーが、配列番号１～３４から選択され、
    ＥＧＦＲリバースプライマーが、配列番号４４～４８から選択され；
    好ましくはＥＧＦＲアンプリコンが、配列番号５３～５７のうちのいずれか１つにより検出される、
    ＥＧＦＲプライマー対；
    （２）
    ＢＲＡＦフォワードプライマーが、配列番号３５および３６から選択され、
    ＢＲＡＦリバースプライマーが、配列番号４９であり；
    好ましくはＢＲＡＦアンプリコンが、配列番号５８により検出される、
    ＢＲＡＦプライマー対；
    （３）
    ＫＲＡＳフォワードプライマーが、配列番号３７～３９および６７～６８から選択され、
    ＫＲＡＳリバースプライマーが、配列番号５０であり；
    好ましくはＫＲＡＳアンプリコンが、配列番号５９により検出される、
    ＫＲＡＳプライマー対；
    （４）
    ＨＥＲ２フォワードプライマーが、配列番号４０～４２から選択され、
    ＨＥＲ２リバースプライマーが、配列番号５１であり；
    好ましくはＨＥＲ２アンプリコンが、配列番号６０により検出される、
    ＨＥＲ２プライマー対
    から選択されるプライマー対からの少なくとも１種のプライマーを含む、請求項１から１０、請求項２９から４１および請求項４３のいずれか１項記載の方法、請求項１６から２８までのいずれか１項記載のシステム、請求項１１から１４までのいずれか１項記載のキット。
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