CN105368932B - 基于焦磷酸测序技术的结核分枝杆菌（tb）耐药性基因的检测技术 - Google Patents

基于焦磷酸测序技术的结核分枝杆菌（tb）耐药性基因的检测技术 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于焦磷酸测序技术的结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的检测技术。具体而言，本发明涉及用于基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的测序引物。本发明还涉及包含测序引物的用于基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的试剂盒和微阵列。本发明还涉及测序引物在制备用于基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的试剂盒和微阵列中的用途。本发明还涉及使用测序引物检测样品中的结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的方法。

Description

基于焦磷酸测序技术的结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的检测 技术
技术领域
本发明涉及基于焦磷酸测序技术的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，TB）耐药性基因的检测技术。具体而言，本发明涉及用于基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的测序引物。本发明还涉及包含测序引物的用于基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的试剂盒和微阵列。本发明还涉及测序引物在制备用于基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的试剂盒和微阵列中的用途。本发明还涉及使用测序引物检测样品中的结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的方法。
背景技术
焦磷酸测序技术是一种基于酶与底物的级联反应进行检测并定量的序列分析技术。在整个反应体系中，以单链的PCR产物作为模板，测序引物与其退火结合，四种dNTP按照既定的顺序加到反应体系中。如果加入的dNTP与模板链上的碱基互补结合，在DNA聚合酶的作用下释放与掺入量等摩尔数的焦磷酸基团PPi。硫酸化酶催化释放的PPi与腺苷-5'-磷酸硫酸酐形成等量的腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine Triphosphate, ATP)，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化态转化，并发生光信号。仪器检测到的光信号则以荧光信号峰的方式反映在实时出现的测序图谱中。如加入的dNTP不能与模板互补结合，则直接被双磷酸酶降解，反应继续进入下一轮。通过上述过程的循环，单链的PCR产物得到互补并延伸，通过各碱基位置信号峰的有无判断碱基类型，通过信号峰的高度和面积判断碱基的数目。焦磷酸测序法适于对10-100bp长度序列进行定量分析，其重复性和精确性能与Sanger测序媲美，而检测速度则大大提高。多重焦磷酸测序技术在保持焦磷酸测序技术优势的同时，增强其对于相距100bp以上位点的检测能力。两个甚至多个测序反应在同一孔位中同时进行，通过科学的编排四种dNTP加入的顺序获得特异的检测序列，从而实现多个相距较远的位点的同时检测。
临床上对结核分枝杆菌引起的肺结核常用的一线药物包括异烟肼（INH）、利福平（RFP）、链霉素（SM）等。异烟肼其作用机制是被结核分枝杆菌内过氧化氢酶-过氧化物酶激活，作用于烯酰基载体蛋白还原酶，抑制分枝杆菌细胞壁生物合成而杀菌。katG基因是编码触酶-过氧化物酶的编码基因，其基因突变可导致过氧化氢酶-过氧化物酶活性下降甚至丧失。katG基因突变约占异烟肼耐药的50~70%。InhA基因编码还原型烟酰胺二核苷酸（NADH）依赖的烯酰基还原酶，其基因突变约占异烟肼耐药10~35%。
利福平是一种广谱抗菌药，可与DNA依赖的RNA聚合酶的β亚单位结合，抑制RNA聚合酶活性，进而抑制mRNA转录及蛋白合成起到抗菌作用。约95%的利福平耐药菌都是由于编码RNA聚合酶β亚基（rpoB）基因发生突变，从而不再与利福平结合而产生耐药性。rpoB基因突变主要发生在507-533位编码27个氨基酸密码子的81bp的区域内。
现已有多种生物学检测技术应用于结核分枝杆菌耐药检测，如噬菌体生物扩增法、常规药敏试验、DNA测序、基因芯片、PCR-限制性片断长度多态性分析、快速培养仪检测系统等。
噬菌体生物扩增法和常规药敏试验操作繁琐耗时长不易标准化。基因芯片样本的制备和标记较繁琐，仪器昂贵，检测成本高。PCR-限制性片断长度多态性分析只能分析已知序列特异位点的基因突变。快速培养仪检测系统仪器和试剂依赖进口，费用高昂。同时一些非测序方式需要依赖酶切或聚类的方式判读患者的基因突变情况，存在较大的分型错误的几率。直接测序虽然准确度高，但测序反应产生的DNA片段需要经过毛细管电泳分离，其后由检测系统检测荧光信号，耗时较长且检测成本较高。
焦磷酸测序法可对一定长度内序列进行实时定量分析，其重复性和精确性能与Sanger测序媲美，而检测速度大大提高，检测成本明显降低。此外，焦磷酸测序技术的检测灵敏度也远高于Sanger测序。目前该技术已广泛应用于微生物鉴定及分法医学鉴、遗传学分析、SNP检测等方面。因此，焦磷酸测序技术在结核分枝杆菌耐药基因（inhA、katG、rpoB）检测的应用与推广将具有极大价值与潜力。
然而，目前尚没有商业化实现焦磷酸测序技术在结核分枝杆菌（TB）耐药性基因检测的方案。
发明内容
本发明一方面涉及用于基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的测序引物，所述测序引物包含至少一个选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 3、9、15、19和23以及它们的任意组合。在一个实施方案中，所述测序引物具有至少一个选自以下的核苷酸序列，或者由或基本由至少一个选自以下的核苷酸序列组成：SEQ ID NO: 3、9、15、19和23以及它们的任意组合。在另一个实施方案中，所述测序引物针对的靶标序列为选自以下的序列：SEQ ID NO: 6、12、18、22和26以及它们的任意组合。
本发明一方面涉及用于基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的测序引物组，所述测序引物组包括：
包含或具有选自SEQ ID NO: 3、9、15、19和23之一的核苷酸序列的测序引物，和
包含或具有选自SEQ ID NO: 3、9、15、19和23的另外一个、另外两个、另三个或全部另外四个的核苷酸序列的测序引物。
本发明另一方面涉及一种用于基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的试剂盒或微阵列，其包含本发明的测序引物或测序引物组。本发明另一方面涉及本发明的测序引物或测序引物组在制备用于基于焦磷酸测序技术检测样品中的结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的试剂盒或微阵列中的用途。
在一个实施方案中，所述试剂盒或微阵列还包含至少一种选自以下的引物组：
1）引物组1，其包含具有由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的引物和具有由SEQID NO: 2所示的核苷酸序列的引物；
2）引物组2，其包含具有由SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列的引物和具有由SEQID NO: 8所示的核苷酸序列的引物；
3）引物组3，其包含具有由SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列的引物和具有由SEQID NO: 14所示的核苷酸序列的引物；和
4）它们的任意组合。
在一个实施方案中，所述试剂盒或微阵列还包含表明至少一种选自以下的待分析序列和分配顺序的说明书：
1）由SEQ ID NO: 4所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 5所示的分配顺序；
2）由SEQ ID NO: 10所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 11所示的分配顺序；
3）由SEQ ID NO: 16所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 17所示的分配顺序；
4）由SEQ ID NO: 20所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 21所示的分配顺序；和
5）由SEQ ID NO: 24所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 25所示的分配顺序。
本发明还涉及一种基于焦磷酸测序技术检测样品中的结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的方法，所述方法包括：
(1)提取和任选纯化样品中的DNA，
(2)将提取和任选纯化的DNA进行扩增，从而获得扩增产物，
(3)对步骤(2)的扩增产物进行焦磷酸测序。
在一个实施方案中，所述焦磷酸测序使用本发明的测序引物或测序引物组进行。在另一个实施方案中，所述扩增为PCR扩增，优选所述PCR扩增使用本发明的引物组。在又一个实施方案中，检测样品中的结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的方法可不用于诊断受试者的耐药性，例如可用于检测体外培养中的结核分枝杆菌是否变异，可用于检测环境来源的结核分枝杆菌样品是否具有耐药性。
在一个实施方案中，所述焦磷酸测序还使用至少一种选自以下的待分析序列和分配顺序：
1）由SEQ ID NO: 4所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 5所示的分配顺序；
2）由SEQ ID NO: 10所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 11所示的分配顺序；
3）由SEQ ID NO: 16所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 17所示的分配顺序；
4）由SEQ ID NO: 20所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 21所示的分配顺序；和
5）由SEQ ID NO: 24所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 25所示的分配顺序。
在一个实施方案中，所述样品为生物样品，优选所述样品为体液样品或组织样品，和更优选所述样品选自活组织检查样品、细胞培养物、经固化处理的样品（如石蜡包埋样品）、全血、血浆、血清、唾液、脑髓液、汗液、痰、肺泡灌洗液、尿液、粪便、分泌液、乳汁、腹膜液。
附图说明
图1为焦磷酸测序的一个技术流程及各主要元素示意图。
图2为使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 3)对inhA-15基因突变检测结果的截图(所检测样本为0%突变比例理论值的inhA基因野生型质粒)，其中横坐标代表分配序列，纵坐标代表仪器所采集到的荧光信号强度。
图3为使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 9)对katG315基因突变检测结果的截图(所检测样本为0%突变比例理论值的katG基因野生型质粒)，其中横坐标代表分配序列，纵坐标代表仪器所采集到的荧光信号强度。
图4为使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 15)对rpoB516基因突变检测结果的截图(所检测样本为0%突变比例理论值的rpoB基因野生型质粒)，其中横坐标代表分配序列，纵坐标代表仪器所采集到的荧光信号强度。
图5为使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 19)对rpoB526基因突变检测结果的截图(所检测样本为0%突变比例理论值的rpoB基因野生型质粒)，其中横坐标代表分配序列，纵坐标代表仪器所采集到的荧光信号强度
图6为使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 23)对rpoB531-533基因突变检测结果的截图(所检测样本为0%突变比例理论值的rpoB基因野生型质粒)，其中横坐标代表分配序列，纵坐标代表仪器所采集到的荧光信号强度
图7为使用包括本发明的测序引物在内的测序体系所检测到的inhA、katG和rpoB基因突变的检测值与理论值相比较的曲线图。
图8为使用与本发明测序引物(SEQ ID NO: 23)相似的测序引物(SEQ ID NO: 29)对rpoB531 533位点的测序结果的截图。C1孔使用01-S-20测序引物(SEQ ID NO: 29)，C5孔使用01-S-21测序引物(SEQ ID NO: 29)。
图9为使用本发明表2所示各测序引物对临床来源的非耐药和耐药样本的测序结果的截图。A：非耐药样本的katG315基因的测序结果，B：耐药样本的katG315基因的测序结果，C：非耐药样本的rpoB526基因的测序结果，D：耐药样本的rpoB526基因的测序结果，E：非耐药样本的rpoB531-533基因的测序结果，和F：耐药样本的rpoB531基因的测序结果，其中非耐药样本指临床上常规药敏试验显示对INH和/或RFP不耐药的样本，而耐药样本指临床上常规药敏试验显示对INH和/或RFP耐药的样本。
具体实施方式
参考用于说明的示例应用在下文中描述本发明的数个方面。应当理解的是，陈述许多具体细节、关系和方法来提供对本发明的充分理解。然而，在相关领域的普通技术人员将容易地认识到，可在不含一个或多个具体细节的情况下实施本发明或者可用其他方法来实施本发明。
本发明目的在于解决现有技术中对结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的检测的缺点，例如较大的分型错误、耗时较长或检测成本较高。本发明通过使用本发明的测序引物的焦磷酸测序技术而解决了上述问题。
使用本发明的测序引物的焦磷酸测序技术具有以下优点：
1）仪器及试剂通过系统优化，可达到最优的检测效果，且易标准化；
2）检测结果自动由软件给出，避免结果判断主观性；
3）操作过程简便且省时，检测全程150分钟，其中仪器自动运行时间130分钟，手工操作时间20分钟；
5）检测灵敏度可低至5%突变比例。
6）线性度高，能用于定量检测。
除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。在细胞和分子生物学中的普通术语的定义可以参见：余龙等译的基因VIII，标准书号：ISBN:978-7-03-014597-0，科学出版社出版（2005）；张瑾峰等译的细胞与分子生物学，中信出版社出版（2004），ISBN:978-7-50-860075-8；和王镜岩等编的生物化学，高等教育出版社出版（2002），ISBN:978-7-04-011088-3； Kendrew, J. 等人 (编),The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd. 出版 (1994),ISBN 0-632-02182-9;和Meyers, R.A. (编), Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc. 出版(1995), ISBN 1-56081-5698。虽然在实施本发明时可采用类似或等同于本文所述方法和材料的任何方法和材料，但是本文描述了具体的材料和方法。
样品
本文所用术语“样品”包括含有核酸分子的任何样品。样品可来源于生物来源(“生物样品”)，例如组织(例如活组织检查样品)、提取物或包括结核分枝杆菌的培养物和生物或生理流体，例如经固化处理的样品（如石蜡包埋样品）、全血、血浆、血清、唾液、脑髓液、汗液、痰、肺泡灌洗液、尿液、粪便、分泌液、乳汁、腹膜液等。获自来源的样品或在预处理以改进样品特征(例如从血液制备血浆、稀释痰液等)后的样品可直接使用。在本发明的某些方面，样品是痰或肺泡灌洗液。
可按照本发明进行分析和/或使用的样品包括临床来源的多核苷酸，例如DNA或RNA。
从样品中提取核酸的方法是本领域众所周知的，可用例如苯酚和氯仿进行DNA提取，或者使用市售DNA提取试剂进行提取。例如，可使用柱试剂盒(例如GENERATION (注册商标) Capture Column Kit Gentra)进行提取。
应该理解的是，核酸可通过本领域众常规的纯化方法来纯化，例如使用PrepSEQ™试剂盒(来自Applied Biosystems)和美国专利号5,234,809中的方法等等。
耐药性又称抗药性，系指微生物、寄生虫以及肿瘤细胞对于化疗药物作用的耐受性。在本发明中，耐药性是指结核分枝杆菌的耐药性，特别是指结核分枝杆菌对临床上对结核分枝杆菌引起的肺结核常用的一线药物(包括异烟肼（INH）、利福平（RFP）、链霉素（SM）等)的耐药性。耐药性基因在本发明的一些实施方案中是指基因inhA、katG和/或rpoB。
引物
本文所用的“引物”通常指与靶序列互补和退火的线性寡核苷酸。引物长度的下限按杂交能力而定，因为非常短的引物(例如小于5个核苷酸)在大多数杂交条件下不形成热力学稳定的双链体。引物长度通常在8-50个核苷酸内变化。在某些实施方案中，引物介于大约15-25个核苷酸之间。本文使用的术语“正向引物”是指与靶DNA的一条特定链退火的寡核苷酸。本文使用的术语“反向引物”是指与靶DNA的相反链退火的寡核苷酸。总之，正向引物和反向引物通常以类似于PCR引物的方式定向在靶DNA序列上，使得其3'末端比其5'末端更接近靶序列。天然存在的核苷酸(尤其是鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，在下文称为“G”、“A”、“C”和“T”)以及核苷酸类似物，都可用于本发明的引物。本文使用的术语“测序引物”是指用于起始对核酸进行的测序反应的寡核苷酸引物。
本文使用的“扩增产物”是指自核酸模板，通过核酸扩增而产生的扩增的核酸。
本文使用的“模板DNA”或“模板RNA”是指作为用于扩增的所需靶标的核酸。例如，模板RNA被逆转录为cDNA，并且该模板cDNA用于产生扩增产物。
本文使用的术语“核苷酸类似物”指与天然存在的核苷酸在结构上相似的化合物。核苷酸类似物可以具有改变的磷酸骨架、糖部分、核碱基或其组合。通常具有改变的核碱基的核苷酸类似物尤其赋予不同的碱基配对和碱基堆积特性。具有改变的磷酸-糖骨架的核苷酸类似物(例如肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA))通常尤其改变链特性，例如二级结构形成。
用于基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的PCR引物、测序引物及靶系列的实例如表2。
本发明的PCR引物和测序引物的核苷酸序列还包括其修饰形式，只要所述引物的扩增或测序效果不受到明显的影响即可。所述修饰可以为例如在核苷酸序列中或两端添加一个或多个核苷酸残基、在核苷酸序列中缺失一个或多个核苷酸残基、或者将序列中的一个或多个核苷酸残基替换成另外的核苷酸残基，例如将A替换成T，将C替换成G等。本领域技术人员清楚，所述修饰形式的引物也涵盖在本发明之内、特别是权利要求的保护范围之内。在一个实施方案中，PCR引物和测序引物的核苷酸序列的修饰形式为如CN103270174A中所公开的化学增强型引物。
可以使用例如通用DNA合成仪(例如由Applied Biosystems制造的394型)，经化学方法合成本发明引物中的各个核苷酸。还可采用本领域众所周知的任何其它方法来合成寡核苷酸，例如PCR引物和测序引物。
使用从样品中提取的基因组DNA作为模板，并使用PCR引物对结核分枝杆菌（TB）耐药性基因进行扩增反应，以获得扩增产物。扩增反应包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCP)、自动维持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)和滚环扩增(RCA)，其公开于以下参考文献(在此引作参考)中：Mullis等，美国专利第4,683,195号；第4,965,188号；第4,683,202号；第4,800,159(PCR)号；Gelfand等，美国专利第5,210,015号(用“Taqman”或”Taq” [注册商标]探针进行的实时PCR)；Wittwer等，美国专利第6,174,670号；Kacian等，美国专利第5,399,491号(“NASBA”)；Lizardi,美国专利第5,854,033号；Aono等，日本专利公开第JP 4-262799号(滚环扩增)；等等。
优选使用PCR法对靶核苷酸进行扩增。PCR法本身是本领域众所周知的。术语“PCR”包括该反应的衍生形式，其包括但不限于反转录PCR、实时PCR、嵌套式PCR、多重PCR和荧光定量PCR等。优选使用荧光定量PCR法对靶核苷酸进行定量扩增。
在引物、模板DNA和耐热DNA聚合酶存在下，使用与有义链杂交的引物(反向引物)和与反义链杂交的引物(正向引物)，通过使变性、退火和延伸步骤的循环重复大约30次～50次(例如45次)来进行PCR。在一个实施方案中，PCR为实时荧光定量PCR。在一个实施方案中PCR使用了引物组1、2和/或3以及它们的任意组合(例如引物组1与2的组合(当靶基因是inhA和katG时)，引物组1与2和3的组合(当靶基因是inhA、katG和rpoB时)等)。本领域技术人员能够理解的是，也可使用其它PCR法和引物组，只要可扩增出目标片段即可。本领域技术人员可根据本发明的教导常规地选择PCR法，并常规设计出所需的PCR引物。
在本发明的PCR中，可使用各种常规的耐热DNA聚合酶进行扩增，包括但不限于FastStart Taq DNA聚合酶(Roche)、Ex Taq (注册商标, Takara)、Z-Taq、AccuPrime TaqDNA聚合酶和HotStarTaq Plus DNA聚合酶。
基于引物Tm值选择合适PCR反应条件的方法是本领域众所周知的，本领域普通技术人员可以根据引物长度、GC含量、目标特异性和灵敏度、所使用的聚合酶性质等，选出最佳条件。例如，可使用以下条件进行荧光定量PCR反应：95℃ 5 分钟，95℃ 15 秒，65℃ 10秒，72℃ 10 秒，循环45次，72℃ 5分钟。反应体系为30μL。
在获得PCR产物后，可对PCR产物进行处理，以获得与测序引物互补结合的单链PCR产物。单链PCR产物的产生和纯化可通过本领域周知的方法来进行。常见的产生和纯化单链PCR产物的方法包括但不限于T7逆转录法（Hughes等人, Nat. Biotechnol., 2001, 19:342-347）、核酸外切酶法（Higuchi和Ochman, Nucleic. Acids Res., 1989, 17:5865）、变性高效液相色谱法（denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC）（Dickman和Hornby, Anal. Biochem., 2000, 284:164-167）和磁珠捕获法（Espelund等人, Nucleic. Acids Res., 1990, 18:6157-6158）等。在一个实施方案中，本发明通过磁珠捕获法获得与测序引物互补结合的单链PCR产物。在另一个实施方案中，本发明通过PyroMark® Q24真空工作站按照制造商的说明书对PCR产物进行处理，以获得与测序引物互补结合的单链PCR产物。
另外，也可使用不对称PCR方法直接制备单链PCR产物，从而省去了在PCR后进行额外的处理。不对称PCR可在PCR扩增的同时制备DNA单链。常规不对称PCR使用两条不等量的引物，在开始的循环里进行正常扩增。随着循环的增加，量少的引物被逐渐耗尽，而超量的引物可继续直线扩增生成DNA单链（Gyllensten和Erlich, Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A., 1988, 85:7652-7656）。
在获得单链PCR产物后，可采用本发明的测序引物进行焦磷酸测序。在一个实施方案中，本发明的测序引物包含或具有至少一个(例如至少2、3、4或全部5个)选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 3、9、15、19和23。当本发明的测序引物包含或具有选自SEQ ID NO: 3、9、15、19和23的2、3、4或全部5个核苷酸序列时，这意指选自SEQ ID NO: 3、9、15、19和23的2、3、4或全部5个测序引物组合使用以检测多个靶基因的耐药性，例如包含或具有SEQ IDNO: 3的核苷酸序列的测序引物与包含或具有SEQ ID NO: 9、15、19和/或23的核苷酸序列的测序引物组合使用。
本发明的测序引物可以任意组合，以针对样品中的不同靶基因进行测序，例如SEQID NO: 3可与SEQ ID NO: 9、15、19和/或23组合，SEQ ID NO: 9可与SEQ ID NO: 3、15、19和/或23组合，SEQ ID NO: 19可与SEQ ID NO: 3、9、15和/或23组合，以此类推。因此，在一个实施方案中，本发明的测序引物可包含或具有选自SEQ ID NO: 3、9、15、19和23之一的核苷酸序列，并任选包含或具有选自SEQ ID NO: 3、9、15、19和23的另外一个、另外两个、另三个或全部另外四个的核苷酸序列；例如本发明的测序引物可包含SEQ ID NO: 3的核苷酸序列以及任选包含至少一个(例如至少2、3或全部4个)选自SEQ ID NO: 9、15、19和23的核苷酸序列；本发明的测序引物可包含SEQ ID NO: 9的核苷酸序列以及任选包含至少一个(例如至少2、3或全部4个)选自SEQ ID NO: 3、15、19和23的核苷酸序列；本发明的测序引物可包含SEQ ID NO: 19的核苷酸序列以及任选包含至少一个(例如至少2、3或全部4个)选自SEQ ID NO: 3、9、15和23的核苷酸序列，等等。
本发明一方面涉及用于基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的测序引物组，所述测序引物组包括：
包含或具有选自SEQ ID NO: 3、9、15、19和23之一的核苷酸序列的测序引物，和
包含或具有选自SEQ ID NO: 3、9、15、19和23的另外一个、另外两个、另三个或全部另外四个的核苷酸序列的测序引物。
在一个实施方案中，所述测序引物组包括：包含或具有SEQ ID NO: 9的核苷酸序列的测序引物，以及包含或具有至少一个(例如至少2、3或全部4个)选自SEQ ID NO: 3、15、19和23的核苷酸序列的测序引物。在另一个实施方案中，所述测序引物组包括：包含或具有SEQ ID NO: 19的核苷酸序列的测序引物，以及包含或具有至少一个(例如至少2、3或全部4个)选自SEQ ID NO: 3、9、15和23的核苷酸序列的测序引物。
本领域技术人员能够理解的是，当各测序引物组合使用时，所使用的PCR引物、靶基因、待分析序列、分配顺序和靶序列根据下文表2的对应关系也相应地组合使用。例如当SEQ ID NO: 9的测序引物与SEQ ID NO: 3、15、19和/或23的测序引物组合使用时，PCR引物组2与PCR引物组1和/或3组合使用，SEQ ID NO: 10的待分析序列和SEQ ID NO: 11的分配顺序与SEQ ID NO: 4的待分析序列和SEQ ID NO: 5的分配顺序、SEQ ID NO: 16的待分析序列和SEQ ID NO: 17的分配顺序、SEQ ID NO: 20的待分析序列和SEQ ID NO: 21的分配顺序、和/或SEQ ID NO: 24的待分析序列和SEQ ID NO: 25的分配顺序组合使用。
在一个实施方案中，采用QIAGEN公司的PyroMark Gold Q24 Reagents试剂盒和实时定量焦磷酸序列分析仪（型号：PyroMark® Q24 MDx），按照说明书方法进行焦磷酸测序。可使用以下杂交条件进行焦磷酸测序：80℃加热2min，室温退火20分钟。在一个实施方案中，焦磷酸测序还使用至少一种选自以下的待分析序列和分配顺序：
1）由SEQ ID NO: 4所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 5所示的分配顺序；
2）由SEQ ID NO: 10所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 11所示的分配顺序；
3）由SEQ ID NO: 16所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 17所示的分配顺序；
4）由SEQ ID NO: 20所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 21所示的分配顺序；和
5）由SEQ ID NO: 24所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 25所示的分配顺序。
待分析序列是测序实验完成后进行结果分析时使用的，分析仪的软件将此待分析序列与测序结果进行比对。比如待分析序列为GCCG/TCGGCGAG/TAC/TGATA/TGGT/ATGT/ACGGGGT，软件就会对标注有“/”的位点计算突变的比例；在实际应用中，比例值会随着样本而变化，这个比例值则指示突变的程度。分配顺序是仪器在进行测序过程中喷出的核苷酸底物的顺序；测序时，仪器按照分配顺序按次序将核苷酸底物加入反应池中，如果喷入A时检测到荧光信号，就代表这个位点的测序结果为A，以此类推。本领域技术人员可根据需要常规地选择和设计待分析序列和/或分配顺序，并在实际应用中根据具体的靶序列的情况而使用不同的待分析序列和/或分配顺序。在一个实施方案中，焦磷酸测序可使用如表2所示的分析序列和/或分配顺序。本领域技术人员能够理解的是，引物组、测序引物、分析序列和分配顺序均根据具体的靶序列而相应地变化。
试剂盒
本发明涉及一种用于基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的试剂盒，其含有本发明的测序引物(或本发明测序引物组)或者测序引物(或本发明测序引物组)与引物组的组合。本发明还涉及本发明测序引物(或本发明测序引物组)或者测序引物(或本发明测序引物组)与引物组的组合在制备用于基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的试剂盒中的用途。在一个实施方案中，所述测序引物可包含或具有至少一个(例如至少2、3、4或全部5个)选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 3、9、15、19和23。在一个实施方案中，所述引物组为选自引物组1、引物组2和引物组3的至少一个(例如至少2或全部3个)引物组。
试剂盒可包含实施本发明方法所用的材料或试剂(包括测序引物和引物组)。试剂盒可以包括储存反应试剂(例如在合适容器中的引物、dNTP、酶等)和/或支持材料(例如缓冲液、实施检测的说明书等)。例如，试剂盒可以包括一个或多个含有相应反应试剂和/或支持材料的容器(例如盒子)。这样的内容物可一起或分开递送给既定的接受者。例如，第一个容器可含有用于测定的酶，第二个容器含有引物组、而第三个容器含有测序引物。所述试剂盒还可含有适合容纳所述试剂或容器的隔室。作为一个实例，试剂盒可含有测序引物、引物组、PCR反应缓冲液、使用说明书。试剂盒还可含有聚合酶和dTNP等。试剂盒还可含有UNG、用于质控的内标、阳性和阴性对照等。试剂盒还可包含用于从样品制备核酸例如DNA的试剂。本发明试剂盒还可包含除了本发明的测序引物和/或引物组之外的其它任何测序引物和/或引物组，例如能够有效检测结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的测序引物和/或引物组。以上实例不能理解为限制适用于本发明的试剂盒及其内容物。
在一个实施方案中，试剂盒中的说明书表明了焦磷酸测序所用的分析序列和/或分配顺序为下列的至少一种：
1）由SEQ ID NO: 4所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 5所示的分配顺序；
2）由SEQ ID NO: 10所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 11所示的分配顺序；
3）由SEQ ID NO: 16所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 17所示的分配顺序；
4）由SEQ ID NO: 20所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 21所示的分配顺序；和
5）由SEQ ID NO: 24所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 25所示的分配顺序。。
微阵列
本发明涉及一种用于基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的微阵列，其含有本发明的测序引物(或本发明测序引物组)或者测序引物(或本发明测序引物组)与引物组的组合。本发明还涉及本发明测序引物(或本发明测序引物组)或者测序引物(或本发明测序引物组)与引物组的组合在制备用于基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的微阵列中的用途。在一个实施方案中，所述测序引物可包含或具有至少一个(例如至少2、3、4或全部5个)选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 3、9、15、19和23。在一个实施方案中，所述引物组为选自引物组1、引物组2和引物组3的至少一个(例如至少2或全部3个)引物组。
微阵列是指具有平坦表面的固相支持体，其具有核酸阵列，阵列中的各个成员包含固定在空间上确定的区域或位点上的寡核苷酸或多核苷酸的相同的拷贝，所述区域或位点不与阵列中的其它成员的区域或位点重叠；也就是说，所述区域或位点在空间上是离散的。此外，空间上确定的杂交位点可为“可寻址的”，因为其位置及其固定化的寡核苷酸的身份是已知或预先确定的(例如在其使用前是已知或预先确定的)。通常寡核苷酸或多核苷酸为单链，并通常由5'-端或3'-端与固相支持体共价连接。微阵列中含有非重叠区的核酸的密度通常大于100/cm2，更优选大于1000/cm2。微阵列技术公开于例如以下参考文献中：Schena编辑的Microarrays: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 2000)；Southern, Current Opin. Chem. Biol., 2:404-410，1998，其全部内容通过引用结合到本文中。
虽然上文已描述了本发明的各种实施方案，但是应理解的是，其仅以实例的方式提供，而并非限制。对公开的实施方案的许多改变可依照本文的公开内容来进行，而不会背离本发明的精神或范围。因此，本发明的广度和范围不应受到任何上述的实施方案所限制。
本文提及的所有文献都通过引用结合到本文中。本申请引用的所有出版物和专利文件都为所有目的而通过引用结合，引用程度如同单独地指出各个出版物或专利文件一样。
实施例
除非另外说明，否则本文实施例所用的材料均市购获得，用于进行实验的各种具体实验方法均为本领域常规的实验方法(参见例如F.奥斯伯等主编的《精编分子生物学实验指南》(1999)，科学出版社，ISBN 7-03-006408-9和J.萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实验指南(第三版)》(2002)，科学出版社，ISBN 7-03-010338-6)或者按照制造商所建议的步骤和条件，并能由本领域技术人员根据需要常规地确定。以下对某些材料和方法进行了详述。
实施例1：使用本发明测序引物进行的焦磷酸测序
材料和方法
1.1材料
质粒TBIKR（inh A-kat G-rpoB基因野生型质粒, SEQ ID NO: 27）和TBIKR-m（inhA-kat G-rpoB基因突变型质粒, SEQ ID NO: 28），为Invitrogen公司合成。
表1：本发明所使用的材料及来源
材料名称 来源 用量 单位
PCR反应液1-3(含引物、dNTP、MgCl2、缓冲液等） 自配 27.6 μl
dNTP Roche 0.24 μl
MgCl2 PG 2.4 μl
20X缓冲液 QIAGEN 1.5 μl
PCR引物组1-3 Invitrogen 0.09 μl
EvaGreen Biotium 0.75 μl
HS Taq QIAGEN 0.4 μl
测序引物1-5 Invitrogen 0.8 μl
PyroMark Gold Q24 Reagents QIAGEN 1 人份
1.2 设备
QIAGEN公司Rotor-gene Q PCR仪和PyroMark® Q24 MDx测序仪。
1.3方法
如图1所示，首先采用PCR反应液和HS Taq对纯化的结核分枝杆菌基因组DNA在Rotor-Gene Q平台上进行扩增，PCR反应液中包含荧光染料，在扩增过程中能够嵌入不断增加的PCR双链产物中。因此整个产物富集的过程能够通过Rotor-Gene Q的软件进行实时监测，从而确保质量可靠的PCR产物用于后续焦磷酸测序分析。通过PyroMark Q24真空工作站对PCR产物进行处理，最终获得与测序引物互补结合的单链PCR产物。之后在PyroMark Q24焦磷酸测序仪上运行特定的焦磷酸测序程序，仪器会根据特别设计的分配顺序依次加入四种dNTP，通过酶与底物的级联反应，dNTP在单链产物上的有效延伸以光信号的形式被仪器接收，并最终以信号峰的形式实时出现在软件界面中。运行后的结果由软件进行自动分析，减少了人工分析的负担和误差。
1.3.1样本制备
取等浓度的野生型和突变型质粒混合成0%、5%、10%、15%、20%、25%、50%、100%突变比例梯度样本。
1.3.2 样本PCR扩增
用PCR引物组1-3分别对3个基因(inhA、katG、rpoB)进行扩增，反应体系为30ul，每个样本重复3次。反应条件：95℃ 5 分钟，95℃ 15 秒，65℃ 10 秒，72℃ 10 秒，循环45次，72℃ 5分钟。
1.3.3焦磷酸测序
根据PyroMark Gold Q24 Reagents试剂盒说明书配制吸附缓冲液工作液，每管72ul分装至八排管中。PCR产物8ul，加入已装有吸附缓冲液工作液的八排管中。置于强力板式震荡仪(昊诺斯生物PS-1(机身编号：10030004）) 1400rpm震荡混匀10分钟。根据PyroMark Gold Q24 Reagents试剂盒说明书配制测序引物工作液,每管25ul分装至Q24板上。按照PyroMark Q24焦磷酸测序仪说明书准备和进行真空工作站操作：70%乙醇，来自PyroMark Gold Q24 Reagents试剂盒的变性液，1x洗液（PyroMark Gold Q24 Reagents试剂盒中10X洗液根据试剂盒说明书用ddH2O稀释所得），超纯水。经过凝胶珠吸附、变性、洗涤将样本释放到Q24板上。Q24板经过80℃加热2分钟，室温退火20分钟后用PyroMark® Q24仪器测序。
下表2给出了PCR反应和焦磷酸测序过程中所使用的各靶基因、PCR引物、测序引物、待分析序列、分配顺序和靶序列之间的关系以及相应的序列，其中rpoB516、rpoB526、rpoB531 533共用PCR引物组3。
表2. 靶基因、PCR引物、测序引物、待分析序列、分配顺序和靶序列之间的关系以及相应的序列
1.4 结果及分析
图2给出了使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 3)对inhA-15基因突变检测结果的一个截图，图3给出了使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 9)对katG315基因突变检测结果的一个截图，图4给出了一个使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 15)对rpoB516基因突变检测结果的一个截图，图5给出了使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 19)对rpoB526基因突变检测结果的一个截图，图6给出了使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 23)对rpoB531-533基因突变检测结果的一个截图。
从图2-6可知，本发明测序引物能够快速准确地检测出结核分枝杆菌耐药性基因(inhA、katG和rpoB)中的突变，测序特异性高，且测序背景低。
下表3给出了对各inhA、katG、rpoB基因突变比例梯度的检测结果，结果显示：突变比例的检测值与理论值接近，检测准确性较高；6个位点的突变比例的检测值与理论值呈现良好的线性关系，线性拟合的相关系数均大于0.99（见图7）。因此，本发明的测序引物可应用于定量检测且检测准确性高。
表3：突变比例的理论值与检测值
实施例2：不同测序引物的比较
本实施例中所用的材料、仪器与方法及条件均同实施例1，但在焦磷酸测序过程中使用了下表4所示的两种测序引物对rpoB531 533中的突变进行测序
测序引物 序列(5'—3')
01-S-20 CCACAAGCGCCGA (SEQ ID NO: 29)
01-S-21 CAAGCGCCGA (SEQ ID NO: 23)
测序结果见图8。从图8可知，尽管测序引物01-S-20与本发明测序引物01-S-21(即测序引物5)在序列上非常相近，但是对相同的样本(rpoB基因野生型质粒样本)的测序特异性不同，测序引物01-S-20的特异性明显不如本发明测序引物，测序背景较高。
实施例3：本发明测序引物对临床来源的样本的测序
本实施例中所用的材料、仪器与方法及条件均同实施例1，但所测序的样本为包含结核分枝杆菌的医院临床痰液样本而非野生型和突变型质粒，所述临床痰液样本包括耐药和非耐药痰液样本。将临床痰液样本用NaOH充分液化后用常规DNA提取液（含三羟甲基氨基甲烷、NP40和蛋白酶K）提取核酸，然后按照实施例1进行样本PCR扩增和焦磷酸测序。
本发明表2所示各测序引物对耐药和非耐药痰液样本的katG315基因、rpoB526基因以及rpoB531-533基因的测序结果见图9。
从图9可知，本发明表2所示各测序引物对临床样本的测序结果与常规药敏试验的结果良好一致，能准确地反映各样本的突变情况，从而准确地反映各样本的耐药情况。
另外，本发明人还使用表2所示各测序引物对临床来源的样本的突变位点inhA-15和rpoB516进行了测序，测序结果也表明本发明的测序引物的测序结果与常规药敏试验的结果良好一致，能准确地反映各样本的突变情况，从而准确地反映各样本的耐药情况(结果未显示)。

Claims (17)

1.一种用于基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的试剂盒或微阵列，其包含如下的引物组以及测序引物：1）引物组1以及其对应的测序引物1，其由具有由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的引物、具有由SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列的引物以及具有由SEQ ID NO: 3所示的测序引物1组成；
2）引物组2以及其对应的测序引物2，其由具有由SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列的引物、具有由SEQ ID NO: 8所示的核苷酸序列的引物以及具有由SEQ ID NO: 9所示的测序引物2组成；和
3）引物组3以及其对应的测序引物3-5，其由具有由SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列的引物、具有由SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列的引物以及具有由SEQ ID NO: 15、19、23所示的测序引物3-5组成。
2.权利要求1的试剂盒或微阵列，其还包含表明至少一种选自以下的待分析序列和分配顺序的说明书：
1）由SEQ ID NO: 4所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 5所示的分配顺序；
2）由SEQ ID NO: 10所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 11所示的分配顺序；
3）由SEQ ID NO: 16所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 17所示的分配顺序；
4）由SEQ ID NO: 20所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 21所示的分配顺序；和
5）由SEQ ID NO: 24所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 25所示的分配顺序。
3.权利要求1-2中任一项所述的引物组1-3以及测序引物1-5在制备用于基于焦磷酸测序技术检测样品中的结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的试剂盒或微阵列中的用途。
4.权利要求3的用途，其中所述试剂盒或微阵列还包含表明至少一种选自以下的待分析序列和分配顺序的说明书：
1）由SEQ ID NO: 4所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 5所示的分配顺序；
2）由SEQ ID NO: 10所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 11所示的分配顺序；
3）由SEQ ID NO: 16所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 17所示的分配顺序；
4）由SEQ ID NO: 20所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 21所示的分配顺序；和
5）由SEQ ID NO: 24所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 25所示的分配顺序。
5.权利要求3或4的用途，其中所述样品为生物样品。
6.权利要求3或4的用途，其中所述样品为体液样品或组织样品。
7.权利要求3或4的用途，其中所述样品选自活组织检查样品、细胞培养物、经固化处理的样品、全血、血浆、血清、痰、肺泡灌洗液、尿液、粪便、分泌液和腹膜液。
8.权利要求7的用途，其中所述分泌液为乳汁、唾液、脑髓液或汗液。
9.权利要求7的用途，其中经固化处理的样品为石蜡包埋样品。
10.一种基于焦磷酸测序技术检测样品中的结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的方法，所述方法包括：
(1)提取和任选纯化样品中的DNA，
(2)将提取和任选纯化的DNA进行扩增，从而获得扩增产物，
(3)对步骤(2)的扩增产物进行焦磷酸测序；
其中所述焦磷酸测序使用权利要求1-2中任一项所述的引物组1-3以及测序引物1-5进行，
其中检测样品中的结核分枝杆菌（TB）耐药性基因的方法不用于诊断受试者的耐药性。
11.权利要求10的方法，其中所述扩增为PCR扩增。
12.权利要求10或11的方法，其中所述焦磷酸测序还使用至少一种选自以下的待分析序列和分配顺序：
1）由SEQ ID NO: 4所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 5所示的分配顺序；
2）由SEQ ID NO: 10所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 11所示的分配顺序；
3）由SEQ ID NO: 16所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 17所示的分配顺序；
4）由SEQ ID NO: 20所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 21所示的分配顺序；和
5）由SEQ ID NO: 24所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 25所示的分配顺序。
13.权利要求10或11的方法，其中所述样品为生物样品。
14.权利要求10或11的方法，其中所述样品为体液样品或组织样品。
15.权利要求10或11的方法，其中所述样品选自活组织检查样品、细胞培养物、经固化处理的样品、全血、血浆、血清、痰、肺泡灌洗液、尿液、粪便、分泌液和腹膜液。
16.权利要求15的方法，其中所述分泌液为乳汁、唾液、脑髓液或汗液。
17.权利要求15的方法，其中经固化处理的样品为石蜡包埋样品。
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