CN108977515A - 一种基于snp位点核酸质谱检测的基因分型方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法及其应用。所述基因分型方法包括:(1)针对目标基因的基因序列SNP位点设计特异性引物;(2)利用单管多重PCR扩增出包含目标基因特定SNP位点的目的片段;(3)利用限制性内切酶消化PCR产物片段;(4)进行单碱基延伸反应;(5)进行脱盐纯化处理;(6)通过核酸质谱仪检测分析目标基因特定SNP位点的基因序列。上述基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法,检测准确性高、实验可重性高、通量大、成本低。本发明还提供了基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法在单核苷酸多态性检测上的应用,可以特异、简单的对目标基因或者病原微生物进行分型,大大提高了分型效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,特别是涉及一种基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法及其应用。
背景技术
基因分型(Genotyping)是利用生物学检测方法测定个体基因型(Genotype)的技术。又称为基因型分析(Genotypic assay),使用技术包括聚合酶链反应(PCR)、DNA片段分析、寡核苷酸探针(ASO probes)、基因测序、核酸杂交、基因芯片技术、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,缩写RFLP)技术等。这些技术在基因分型和病原微生物检测有了广泛的应用。但是其缺点也很明显,一个的通量低,另外一个就是有的基因型没法检测,尤其是病原微生物的耐药检测。核酸质谱技术通过PCR扩增,单碱基延伸,最后产品打质谱可以同时检测20到30多个位点。但是,由于个别耐药病原菌,连续的SNP位点加大单碱基引物设计难度,没法检测足够多的型别。
单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,且这些变异在人群中所占比例>1%。单核苷酸多态性在遗传疾病的诊断和筛查以及用药种类及剂量指导等多方面有着及其重要的作用。目前,临床最为常用的SNP检测手段主要为Sanger测序、荧光定量PCR、低浓度基因芯片和焦磷酸测序等,这些技术大大推动了基因检测在临床医学中的应用。但是,随着人们对疾病机制和治疗手段不断深入的研究,临床对SNP检测的需求正在从单基因的有限几个位点逐步转移至多基因多位点。所以,虽然上述现有临床常用基因检测技术在实验操作,TAT时间、成本、数据分析难易度等方面各有利弊,但总体来说并不完全适合多基因多位点的检测需求。现有的荧光定量PCR法,基因芯片法和Sanger测序法都是基于化学(荧光)方法,依赖于核苷酸的互补性对核酸序列进行分析。因此对于序列的长度、复杂性、反应条件等都具有较高的要求,容易受到多种化学因素的影响,导致检测结果出现偏差。以荧光PCR方法为例,一旦基因突变位点出现在引物杂交区域,则有可能导致探针不能与模板正确结合,导致检测结果出现误差。在基因芯片中,也同样存在探针内突变位点导致杂交结果出现假阴性的现象,甚至还会引起二次杂交时候的不正确配对,导致出现废片,影响检测结果。相比之下,核酸质谱技术利用多重PCR技术,即1个反应管可同时检测多个SNP位点,可极大地提高多基因多位点的检测效率以及降低样本用量,满足临床需求。核酸质谱的方法则是根据核酸序列本身的核苷酸组成分子,以及其被电离后在真空管中的飞行时间来确定其分子量大小,最终确定核苷酸序列。其检测结果仅仅依赖于分子量这一物理参数。尤其是在SNP位点已经确定的条件下,采用核酸质谱的方法还可以将检测大幅度通量提高,可在同一反应体系内对多个SNP位点进行多重检测与分析,从而提高检测通量、效率与正确率。这样的检测方法无疑是对现有荧光PCR、基因芯片和测序等方法的重要补充。核酸质谱技术的基本原理是通过样品离子化,产生不同质荷比的离子,然后再经过质量分析器测定该样品中不同种类离子的分析量,并按照从小到大的顺序依次排列从而得到一幅质量图谱。
发明内容
基于此,有必要针对上述现有技术中的不足,提供一种基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法及其应用,通过将PCR扩增技术,限制性核酸内切酶和质谱技术进行结合,可以特异、简单的对目标基因或者病原微生物进行分型。
一种基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法,所述基因分型方法包括如下步骤:
(1)针对目标基因的基因序列SNP位点设计特异性引物;
(2)利用单管多重PCR扩增出包含目标基因特定SNP位点的目的片段;
(3)利用限制性内切酶消化PCR产物片段;
(4)进行单碱基延伸反应;
(5)进行脱盐纯化处理;
(6)通过核酸质谱仪检测分析目标基因特定SNP位点的基因序列。
上述基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法,检测准确性高,同金标准Sanger测序法的结果相比,准确率超过99.7%,同时可以直接检测DNA质谱,能检测出样本中的三等位SNP位点的存在,实验可重性高。该方法在检测通量上面比起传统的SNP位点其他检测技术要大很多,一张芯片上可以完成上百个生物样本的多重实验,成本折算后单位点成本比其他同类检测技术方法花费少,适合多种用户和批量检测的需求,是进行基因分型的理想工具。
在其中一个实施例中,所述步骤(1)中设计的特异性引物包括用于扩增一个或多个目标基因的基因序列SNP位点的特异性引物对,所述每个目标基因的基因序列SNP位点的特异性引物对包含一条正向引物和一条反向引物。
在其中一个实施例中,所述步骤(2)中单管多重PCR扩增的反应程序为:98℃热启动,10分钟;95℃变性,30秒;56℃退火,30秒;72℃延伸,30秒;扩增40个循环;72℃终延伸,5分钟。
在其中一个实施例中,所述步骤(3)中的限制性内切酶进行消化处理条件为:37℃消化处理45分钟,85℃加热变性5分钟,冰浴10分钟。
在其中一个实施例中,所述步骤(3)中的限制性内切酶为碱性磷酸酶。
在其中一个实施例中,所述步骤(3)中的碱性磷酸酶选自虾碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶、大肠杆菌碱性磷酸酶、和大鼠碱性磷酸酶中的任意一种。
在其中一个实施例中,所述步骤(4)中单碱基延伸反应包括目标基因的基因序列SNP位点的单碱基延伸引物对,所述单碱基延伸引物对包含一条单碱基延伸正向引物和一条单碱基延伸反向引物。
在其中一个实施例中,所述步骤(4)中单碱基延伸反应的反应程序为:95℃热启动,1分钟;95℃变性,5秒;52℃退火,5秒;80℃延伸,5秒;扩增40个循环;72℃终延伸,3分钟。
在其中一个实施例中,所述步骤(6)的核酸质谱检测的具体步骤为:
(1)在树脂板上铺好待用树脂,风干5-10分钟;
(2)向样本板的反应孔中加入待测的样本,补充25ul ddH2O,用封口膜密封,3000转/分钟瞬时离心;
(3)除去封口膜,将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定,然后将样本板和树脂板一起翻转,使风干的树脂落入样本板的反应孔内,用封口膜密封,3000转/分钟瞬时离心;
(4)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟,再3000转/分钟离心5分钟,然后点样上机,用核酸质谱仪进行检测。
本发明还提供了上述基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法在单核苷酸多态性检测上的应用。
上述基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法在单核苷酸多态性检测上的应用,可以特异、简单的对目标基因或者病原微生物进行分型,大大提高了分型效率。
与现有技术相比,本发明具有如下的有益效果;
(1)本发明所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法在检测通量上面比起传统的SNP位点其他检测技术要大很多,一张芯片上可以完成上百个个生物样本的多重实验,是进行基因分型的理想工具;
(2)本发明所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法检测准确性高,同金标准Sanger测序法的结果相比,准确率超过99.7%,同时可以直接检测DNA质谱,能检测出样本中的三等位SNP位点的存在,实验可重性高。
(3)本发明所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法低成本、性价比高,一张芯片上可以完成上百个生物样本的多重实验,成本折算后单位点成本比其他同类检测方法花费少,适合多种用户和批量检测的需求。
(4)本发明所述的基因序列SNP位点核酸质谱基因分型方法实验流程简单、人员操作时间短、难度小,实验自动化程度高,数据处理软件处理方便,报告结果清晰易懂。
附图说明
图1为本发明一实施例的核酸质谱分析图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
一种基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法,所述基因分型方法包括如下步骤:
(1)针对目标基因的基因序列SNP位点设计特异性引物;
(2)利用单管多重PCR扩增出包含目标基因特定SNP位点的目的片段;
(3)利用限制性内切酶消化PCR产物片段;
(4)进行单碱基延伸反应;
(5)进行脱盐纯化处理;
(6)通过核酸质谱仪检测分析目标基因特定SNP位点的基因序列。
本发明所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法主要基于PCR和单碱基延伸技术,其原理是首先通过PCR引物对含待检SNP的目标片段进行扩增,PCR结束后加入限制性内切酶去除反应液中的dNTP。然后在反应液中加入SNP延伸引物及ddNTP等相关组分并进行单碱基延伸反应,反应过程中SNP延伸引物可与待检测SNP的5’端序列结合并延伸一个碱基,根据不同SNP模板可得到不同的延伸产物。
优选地,所述步骤(1)中设计的特异性引物包括用于扩增一个或多个目标基因的基因序列SNP位点的特异性引物对,所述每个目标基因的基因序列SNP位点的特异性引物对包含一条正向引物和一条反向引物。
相比于其他传统的基因分型所用手段,本发明经检测目标基因的基因序列SNP位点,这一点就与传统的荧光定量PCR、或Sanger测序法较为不同。正如上述核酸质谱的原理,利用核酸质谱基因分型方法仅在目的区域SNP位点延伸一个具有多态性的碱基,不需要检测整个特异性扩增的基因片段。整体检测的通量、实验时间、反应成本、结果进度均较传统方法有很大的提升及优化,具有很好的市场应该价值。
优选地,所述步骤(2)中单管多重PCR扩增的反应程序为:98℃热启动,10分钟;95℃变性,30秒;56℃退火,30秒;72℃延伸,30秒;扩增40个循环;72℃终延伸,5分钟。
优选地,所述步骤(3)中的限制性内切酶进行消化处理条件为:37℃消化处理45分钟,85℃加热变性5分钟,冰浴10分钟。
优选地,所述步骤(3)中的限制性内切酶为碱性磷酸酶。
优选地,所述步骤(3)中的碱性磷酸酶选自虾碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶、大肠杆菌碱性磷酸酶、和大鼠碱性磷酸酶中的任意一种。
优选地,所述步骤(4)中单碱基延伸反应包括目标基因的基因序列SNP位点的单碱基延伸引物对,所述单碱基延伸引物对包含一条单碱基延伸正向引物和一条单碱基延伸反向引物。
优选地,所述步骤(4)中单碱基延伸反应的反应程序为:95℃热启动,1分钟;95℃变性,5秒;52℃退火,5秒;80℃延伸,5秒;扩增40个循环;72℃终延伸,3分钟。
优选地,所述步骤(6)的核酸质谱检测的具体步骤为:
(1)在树脂板上铺好待用树脂,风干5-10分钟;
(2)向样本板的反应孔中加入待测的样本,补充25ul ddH2O,用封口膜密封,3000转/分钟瞬时离心;
(3)除去封口膜,将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定,然后将样本板和树脂板一起翻转,使风干的树脂落入样本板的反应孔内,用封口膜密封,3000转/分钟瞬时离心;
(4)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟,再3000转/分钟离心5分钟,然后点样上机,用核酸质谱仪进行检测。
核酸质谱检测时通过将反应液与树脂混合进行离子交换,用于去除液体中吸附于DNA片段上的K+、Na+、Mg2+等离子,防止其干扰质谱检测结果。
反应液与基质在靶板上结晶,进行质谱检测并得到图谱。由于各延伸产物分子量不同,因此可以在各自的分子量位置查看是否出现检测峰,然后判断该样品的SNP分型。核酸质谱平台特异性良好,使用国际通用标准品能达到30ppm,最低检测限为5ng基因组DNA,对比试验选择的金标准验证技术为Sanger测序技术和同类型获批的检测产品,符合性均为100%。
上述基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法在单核苷酸多态性检测上的应用。
上述基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法在单核苷酸多态性检测上的应用,可以特异、简单的对目标基因或者病原微生物进行分型,大大提高了分型效率。
以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述。
实施例1:利用基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法对结核分枝杆菌进行基因分型
1.结核分枝杆菌基因组DNA提取
(1)在生物安全柜中取病人的痰液样本2ml,加入等体积的10%NaOH溶液,在150rpm/min,37℃震摇30分钟后,用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen)进行结核分枝杆菌基因组DNA的提取。
(2)引物设计
针对结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB的三个位点rpoB516、rpoB526、ropB531进行SNP位点引物设计,分别针对这三个SNP设计特异性的PCR引物和单碱基延伸引物,所设计的PCR引物序列如表1所示。
表1
(3)单管多重PCR反应
利用单管多重PCR技术扩增出包含ropB基因的目的片段,按照表2的反应体系配制扩增反应,反应体系配制完成后按照表3的反应程序进行扩增。
表2
5ul体系/ul | |
10*PCR buffer | 0.5 |
2.5mmol/L MgCl2 | 0.2 |
2.5mmol/L Dntp | 0.25 |
rpoB F(10uM) | 0.5 |
rpoB R(10uM) | 0.5 |
Hot start PCR Taq(5U/ul) | 0.5 |
DNA(10ng/ul) | 1 |
ddH2O | 1.55 |
表3
(4)碱式磷酸酶消化处理
利用碱式磷酸酶对多重PCR反应产物进行消化,去除体系内多余的dNTP。每个反应体系中加入0.5U的碱式磷酸酶,用配套的10*Tris-Buffer调节缓冲液浓度,每个反应加入10*Tris-Buffer 0.5ul。然后在预热的水浴锅内进行37℃消化处理45分钟,然后85℃加热变性5分钟,最后冰浴10分钟。
(5)进行单碱基延伸反应
配制单碱基延伸反应体系,按照表4的反应体系配置。取2ul配制好的单碱基延伸反应的反应液加入到前步消化反应的体系内,然后按照表5的反应程序进行单碱基延伸反应。
表4
5ul | |
10*iPLEX buffer | 0.5 |
iPLEX ddNTP | 0.2 |
iPLEX延伸引物rpoB516E | 0.5 |
iPLEX延伸引物rpoB526E | 0.5 |
iPLEX延伸引物rpoB531E | 0.5 |
iPLEX单碱基延伸酶 | 0.2 |
10*Tris Buffer | 2.6 |
表5
(6)产物脱盐纯化及核酸质谱上机前处理
(a)在树脂板上铺好待用树脂,风干5-10分钟;
(b)向样本板的反应孔中加入待测的样本,补充25ul ddH2O,用封口膜密封,3000转/分钟瞬时离心;
(c)除去封口膜,将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定,然后将样本板和树脂板一起翻转,使风干的树脂落入样本板的反应孔内,用封口膜密封,3000转/分钟瞬时离心;
(d)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟,再3000转/分钟离心5分钟,然后点样上机,用核酸质谱仪进行检测。
(7)核酸质谱仪上机及软件数据分析
按照仪器的操作规程进行上机检测操作,待样品检测完毕,对检测结果进行软件处理分析,最终得到检测结果,核酸质谱分析图具体见图1。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (10)
1.一种基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法,其特征在于,所述基因分型方法包括如下步骤:
(1)针对目标基因的基因序列SNP位点设计特异性引物;
(2)利用单管多重PCR扩增出包含目标基因特定SNP位点的目的片段;
(3)利用限制性内切酶消化PCR产物片段;
(4)进行单碱基延伸反应;
(5)进行脱盐纯化处理;
(6)通过核酸质谱仪检测分析目标基因特定SNP位点的基因序列。
2.根据权利要求1所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法,其特征在于,所述步骤(1)中设计的特异性引物包括用于扩增一个或多个目标基因的基因序列SNP位点的特异性引物对,所述每个目标基因的基因序列SNP位点的特异性引物对包含一条正向引物和一条反向引物。
3.根据权利要求1所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法,其特征在于,所述步骤(2)中单管多重PCR扩增的反应程序为:98℃热启动,10分钟;95℃变性,30秒;56℃退火,30秒;72℃延伸,30秒;扩增40个循环;72℃终延伸,5分钟。
4.根据权利要求1所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法,其特征在于,所述步骤(3)中的限制性内切酶进行消化处理条件为:37℃消化处理45分钟,85℃加热变性5分钟,冰浴10分钟。
5.根据权利要求1所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法,其特征在于,所述步骤(3)中的限制性内切酶为碱性磷酸酶。
6.根据权利要求1所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法,其特征在于,所述步骤(3)中的碱性磷酸酶选自虾碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶、大肠杆菌碱性磷酸酶、和大鼠碱性磷酸酶中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法,其特征在于,所述步骤(4)中单碱基延伸反应包括目标基因的基因序列SNP位点的单碱基延伸引物对,所述单碱基延伸引物对包含一条单碱基延伸正向引物和一条单碱基延伸反向引物。
8.根据权利要求1所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法,其特征在于,所述步骤(4)中单碱基延伸反应的反应程序为:95℃热启动,1分钟;95℃变性,5秒;52℃退火,5秒;80℃延伸,5秒;扩增40个循环;72℃终延伸,3分钟。
9.根据权利要求1所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法,其特征在于,所述步骤(6)的核酸质谱检测的具体步骤为:
(1)在树脂板上铺好待用树脂,风干5-10分钟;
(2)向样本板的反应孔中加入待测的样本,补充25ul ddH2O,用封口膜密封,3000转/分钟瞬时离心;
(3)除去封口膜,将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定,然后将样本板和树脂板一起翻转,使风干的树脂落入样本板的反应孔内,用封口膜密封,3000转/分钟瞬时离心;
(4)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟,再3000转/分钟离心5分钟,然后点样上机,用核酸质谱仪进行检测。
10.根据权利要求1所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法在单核苷酸多态性检测上的应用。
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