CN114457147A - 一种检测痛风分型相关基因的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测痛风分型相关基因的方法及试剂盒,属于基因检测方法领域;本发明包括以下步骤:第一步,针对特定基因设计特异性引物;第二步,利用特异性PCR扩增出包含特定基因的目的片段;第三步,PCR产物碱性磷酸酶处理;第四步,进行单碱基延伸反应;第五步,进行树脂纯化处理;第六步,检测分析特定基因的序列;其中,所述特定基因为:rs3775948(SLC2A9)、rs2231142(ABCG2)、rs11231463(OAT7)和rs504915(SLC22A12)中多种以及多种以上的组合。本发明通过检测特定的基因,依据基因检测的分型结果,能够有效的判断患者是否属于尿酸排泄减少型的痛风患者,从而能够制定更合理的治疗策略。
Description
技术领域
本发明涉及医疗诊断用品制造技术,尤其涉及一种检测痛风分型相关基因的方法及试剂盒,属于检测药剂制造技术领域。
背景技术
痛风为多基因遗传性疾病,其发生是遗传因素和环境因素相互作用及共同作用的结果。参与尿酸排泄和代谢的基因共同作用的结果将导致肝脏中尿酸的合成增加和(或)肾脏尿酸的排泄减少,引起高尿酸血症,而高尿酸是痛风发病的重要生化基础。另外,内环境因素包括高血压、高血糖、脂代谢紊乱和食物等分别通过影响尿酸的合成和(或)排泄,诱发或加重高尿酸血症,增加痛风的发生风险。
痛风的发病机制非常复杂,目前临床上按照病因痛风的分型包括尿酸排泄减少型、尿酸合成增多型、混合型和肾尿酸排泄正常型。区分尿酸排泄减少或尿酸生成增多对痛风的临床分型和指导用药十分重要,既往大多以24h尿尿酸定量测定来简单区分,但此种方法受饮食、饮水、尿量及血尿酸的影响,而采用尿酸排泄分数(fractionexcretionofuricacid,FEUA)代替24h尿尿酸定量法,该指标消除了血尿酸波动、尿量等混杂因素的影响,更为准确可靠。尿酸排泄分数指经肾小球滤过的尿酸最终从尿中排出的百分率。计算公式为FEUA%=(血肌酐×尿尿酸)/(尿肌酐×血尿酸)×100。正常值为5%~10%。痛风患者中,尿酸排泄分数<5.5%的患者为尿酸排泄减少型,约占65%,尿酸排泄分数≥5.5%的患者为尿酸合成增多型。
前期研究结果显示,在肾尿酸排泄减少型患者中使用促尿酸排泄药物(苯溴马隆)比使用抑制尿酸合成药物(别嘌呤醇)降尿酸疗效更显著,而在尿酸生成增多型患者中使用抑制尿酸合成药物(非布司他)降尿酸比尿酸排泄减少型疗效更佳,提示根据病因分型选择降尿酸药物是更高效,更经济的治疗策略。区分尿酸排泄减少或尿酸生成增多对痛风的临床分型和指导用药十分重要,指导痛风的个体化治疗,实现痛风的精准诊疗。
基于尿酸排泄分数对痛风患者进行分型更为准确可靠。现有技术中,为了测量尿酸排泄分数,传统痛风病因分型方法需要患者进行两周的低嘌呤饮食,停用影响尿酸排泄的所有药物,在第14天时采集24小时内的所有尿液。并且,采集患者静脉血后,检测血生化、尿生化,计算尿酸排泄分数等。
现有技术中的这种分型方法,不仅操作步骤繁琐,非常不便,而且患者配合度不高(患者配合时间过长且难以坚持低嘌呤饮食),容易造成结果的重大偏差,从而使治疗策略出现错误。
现有技术中虽然存在多种痛风发病相关的基因,但是现有技术中并无确定的痛风分型相关基因,因此即便是采用基因检测的手段,痛风分型的
发明内容
本发明提供一种新的检测痛风分型相关基因的方法及试剂盒,通过检测特定几个基因组的基因型,从而即可进行痛风分型,以解决现有技术中难以快速准确进行痛风分型的技术问题。
本发明提供一种检测痛风分型相关基因的方法,该方法主要用于判断患者是否属于尿酸排泄减少型患者;
本发明的方法包括以下步骤:
第一步,针对特定基因设计特异性引物;
第二步,利用特异性PCR扩增出包含特定基因的目的片段;
第三步,PCR产物碱性磷酸酶处理;
第四步,进行单碱基延伸反应;
第五步,进行树脂纯化处理;
第六步,检测分析特定基因的序列;
其中,所述特定基因为:rs3775948、rs2231142、rs11231463和rs504915中多种以及多种以上的组合。
本发明另一实施例的检测痛风分型相关基因的方法,其中,所述特定基因分别为:rs3775948、rs2231142、rs11231463和rs504915。
本发明另一实施例的检测痛风分型相关基因的方法,其中,rs2231142基因的正向引物rs2231142_W1_F的序列为:ACGTTGGATGGTCATAGTTGTTGCAAGCCG,rs2231142基因的反向引物rs2231142_W1_R的序列为:ACGTTGGATGTGATGTTGTGATGGGCACTC,rs2231142基因的延伸引物rs2231142_W1_E的序列为:CCGAAGAGCTGCTGAGAACT;
rs11231463基因的正向引物rs11231463_W1_F的序列为:ACGTTGGATGAAAGGAGCTTCTTCCTGGAC,rs11231463基因的反向引物rs11231463_W1_R的序列为:ACGTTGGATGCTATAGCTACATGGCTCAGG,rs11231463基因的延伸引物rs11231463_W1_E的序列为:CCTTCCTGGACATGGATATTC;
rs504915基因的正向引物rs504915_W1_F的序列为:ACGTTGGATGTGAGGACCCCCAGGGAAAA,rs504915基因的反向引物rs504915_W1_R的序列为:ACGTTGGATGCTGGAACCCATTTTTCCTCG;rs504915基因的延伸引物rs504915_W1_E的序列为:GGACCCCCAGGGAAAAGAGACA;
rs3775948基因的正向引物rs3775948_W1_F的序列为:ACGTTGGATGACAACAACCCTCTGACATGG,rs3775948基因的反向引物rs3775948_W1_R的序列为:ACGTTGGATGGCTCCGATACACACAGCTAT,rs3775948基因的延伸引物rs3775948_W1_E的序列为:CATGTCATCGTGAACTAAGTAAAGAT。
本发明另一实施例的检测痛风分型相关基因的方法,其中,所述第二步中,首先提取血样中的DNA,然后配置PCR扩增体系;PCR反应条件为:
在95℃DNA预变性2分钟;扩增45个循环;然后在95℃DNA变性30秒;56℃条件下退火30秒;72℃延伸60秒;72℃延伸5分钟;4℃保温;启动PCR反应。
本发明另一实施例的检测痛风分型相关基因的方法,其中,所述第三步中,PCR反应结束后,将PCR产物用碱性磷酸酶处理,以去除体系中游离的dNTPs;此过程反应条件为:37℃保持40分钟,85℃保持5分钟,4℃保温。
本发明另一实施例的检测痛风分型相关基因的方法,其中,所述第四步中,单碱基延伸反应如下:
94℃30秒;
94℃5秒;
52℃5秒;
80℃5秒;
回到c,重复4次;
回到b,重复39次;
72℃3分钟;
4℃保温。
本发明另一实施例的检测痛风分型相关基因的方法,其中,所述第五步中,树脂纯化过程如下:
将clean Resin树脂平铺到6mg树脂板中;加16ul水到延伸产物的对应孔内;将干燥后的树脂倒入延伸产物板中,封膜,低速垂直旋转30分钟,使树脂与反应物充分接触,使树脂沉入孔底部。
本发明另一实施例的检测痛风分型相关基因的方法,其中,所述第六步中,将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP芯片上;
将点样后的SpectroCHIP芯片使用飞行时间质谱MALDI-TOF分析,从而检测并输出结果。
本发明还提供一种检测痛风分型相关基因的试剂盒,用于协助进行是否属于尿酸排泄减少型的判断;该试剂盒包括:用于扩增rs3775948、rs2231142、rs11231463和rs504915中任意两个或两个以上组合基因的特异性引物对;
所述试剂盒还包括:rs3775948、rs2231142、rs11231463和rs504915中任意两个或两个以上组合基因的单碱基延伸引物。
在本发明另一实施例的检测痛风分型相关基因的试剂盒,其中,所述试剂盒包括:用于扩增rs3775948、rs2231142、rs11231463和rs504915四种基因的特异性引物对,以及这四种基因的单碱基延伸引物。
本发明通过检测特定的基因,依据基因检测的分型结果,能够有效的判断患者是否属于尿酸排泄减少型的痛风患者,从而能够制定更合理的治疗策略。另外,本发明可以根据基因检测的分型结果同时结合病人的病历数据,进一步提高痛风分型判断的准确率。
本发明检测痛风分型相关基因的方法及试剂盒具有以下技术优势:
(1)本发明所述的检测痛风分型相关基因的方法,能够一次性检测到多个痛风分型相关基因,结合基因检测SNP位点后,即可获得有效的判断信息,同时结合病人的病历数据,经过计算或模型比对,能够有效的判断患者是否属于尿酸排泄减少型的痛风患者。
(2)本发明所述的检测痛风分型相关基因的方法检测准确性高,准确率超过99.8%,同时可以直接检测DNA质谱,能检测出样本中的三等位SNP位点的存在,实验可重性高。
(3)本发明所述的检测痛风分型相关基因的方法,检测低成本、性价比高,一张芯片上可以完成大批量生物样本的多重实验,成本折算后单位点成本比其他同类检测SNP位点的技术方法花费少,适合多种用户和批量检测的需求。
(4)本发明所述的检测痛风分型相关基因的方法,实验流程简单、人员操作时间短、难度小,实验自动化程度高,数据处理软件处理方便,报告结果清晰易懂。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解,构成本发明的一部分,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1为本发明实施例的检测痛风分型相关基因的方法的流程图。
具体实施方式
如图1所示为本发明实施例的检测痛风分型相关基因的方法的流程图;
本实施例的方法包括以下步骤:
第一步,针对特定基因设计特异性引物;
第二步,利用特异性PCR扩增出包含特定基因的目的片段;
第三步,PCR产物碱性磷酸酶处理;
第四步,进行单碱基延伸反应;
第五步,进行树脂纯化处理;
第六步,检测分析特定基因的序列;
其中,所述特定基因为:rs3775948、rs2231142、rs11231463和rs504915中多种以及多种以上的组合。
以上基因的全称分别为:rs3775948.GG of SLC2A9/GLUT9,rs504915.AA ofSLC22A12/URAT1,rs2231142.GG of ABCG2,rs11231463.GG of OAT7。
上述四个特定基因一般特指rs3775948.GG of SLC2A9/GLUT9,rs504915.AA ofSLC22A12/URAT1,rs2231142.GG of ABCG2,rs11231463.GG of OAT7中特定基因的SNP(单核苷酸多态性)。
本发明另一实施例的检测痛风分型相关基因的方法,其中,所述特定基因分别为:rs3775948、rs2231142、rs11231463和rs504915。
本发明另一实施例的检测痛风分型相关基因的方法,其中,rs2231142基因的正向引物rs2231142_W1_F的序列为:ACGTTGGATGGTCATAGTTGTTGCAAGCCG,rs2231142基因的反向引物rs2231142_W1_R的序列为:ACGTTGGATGTGATGTTGTGATGGGCACTC,rs2231142基因的延伸引物rs2231142_W1_E的序列为:CCGAAGAGCTGCTGAGAACT;
rs11231463基因的正向引物rs11231463_W1_F的序列为:ACGTTGGATGAAAGGAGCTTCTTCCTGGAC,rs11231463基因的反向引物rs11231463_W1_R的序列为:ACGTTGGATGCTATAGCTACATGGCTCAGG,rs11231463基因的延伸引物rs11231463_W1_E的序列为:CCTTCCTGGACATGGATATTC;
rs504915基因的正向引物rs504915_W1_F的序列为:ACGTTGGATGTGAGGACCCCCAGGGAAAA,rs504915基因的反向引物rs504915_W1_R的序列为:ACGTTGGATGCTGGAACCCATTTTTCCTCG;rs504915基因的延伸引物rs504915_W1_E的序列为:GGACCCCCAGGGAAAAGAGACA;
rs3775948基因的正向引物rs3775948_W1_F的序列为:ACGTTGGATGACAACAACCCTCTGACATGG,rs3775948基因的反向引物rs3775948_W1_R的序列为:ACGTTGGATGGCTCCGATACACACAGCTAT,rs3775948基因的延伸引物rs3775948_W1_E的序列为:CATGTCATCGTGAACTAAGTAAAGAT。
本发明实施例的方法所采用的引物使用Primer5软件设计待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物,交由生物公司合成,序列如下:
本实施例的检测痛风分型相关基因的方法,其中,所述第二步中,首先提取血样中的DNA(使用天根Genomic DNA purification Kit试剂盒提取血样中DNA。琼脂糖凝胶电泳、Nanodrop分光光度计测定DNA浓度及纯度),然后配置PCR扩增体系。
一般情况下,PCR反应前按如下表,在1.5ml离心管中配置PCR扩增体系:
PCR反应条件为:
在95℃DNA预变性2分钟;扩增45个循环;然后在95℃DNA变性30秒;56℃条件下退火30秒;72℃延伸60秒;72℃延伸5分钟;4℃保温;启动PCR反应。
本实施例的检测痛风分型相关基因的方法,其中,所述第三步中,PCR反应结束后,将PCR产物用碱性磷酸酶处理,以去除体系中游离的dNTPs;此过程反应条件为:37℃保持40分钟,85℃保持5分钟,4℃保温。
PCR产物碱性磷酸酶处理过程中,配置反应体系如下:
配置完成后,于PCR仪设定SAP反应条件37℃40分钟,85℃5分钟,4℃保温。启动PCR仪进行碱性磷酸酶处理。
本发明实施例的检测痛风分型相关基因的方法,其中,碱性磷酸酶处理后,进行单碱基延伸反应,所述第四步中,按如下配置反应体系:
单碱基延伸反应过程如下:
94℃30秒;
94℃5秒;
52℃5秒;
80℃5秒;
回到c,重复4次;
回到b,重复39次;
72℃3分钟;
4℃保温。
本发明实施例的检测痛风分型相关基因的方法,其中,所述第五步中,树脂纯化过程如下:
将clean Resin树脂平铺到6mg树脂板中;加16ul水到延伸产物的对应孔内;将干燥后的树脂倒入延伸产物板中,封膜,低速垂直旋转30分钟,使树脂与反应物充分接触,使树脂沉入孔底部。
本发明实施例的检测痛风分型相关基因的方法,其中,所述第六步中,将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP芯片上;
将点样后的SpectroCHIP芯片使用飞行时间质谱MALDI-TOF分析,从而检测并输出结果。
本发明实施例还提供一种检测痛风分型相关基因的试剂盒,用于协助进行是否属于尿酸排泄减少型的判断;该试剂盒包括:用于扩增rs3775948、rs2231142、rs11231463和rs504915中任意两个或两个以上组合基因的特异性引物对;
所述试剂盒还包括:rs3775948、rs2231142、rs11231463和rs504915中任意两个或两个以上组合基因的单碱基延伸引物。采用以上四个中任意两个或两个以上组合基因的单碱基延伸引物即可具有一定的判断能力,以判断痛风的分型。
本发明实施例的检测痛风分型相关基因的试剂盒,优选的,本实施例试剂盒包括:用于扩增rs3775948、rs2231142、rs11231463和rs504915四种基因的特异性引物对,以及这四种基因的单碱基延伸引物。
肾脏尿酸排泄低下是导致痛风患者高尿酸血症的主要原因,遗传因素对肾脏尿酸排泄有很大的影响。据估计,尿酸排泄分数(fractional excretion of uric acid,FEUA)的遗传度在46%-96%之间。在既往GWAS研究中报道了一些与FEUA相关的遗传变异位点,其中大部分SNP编码转运体参与肾尿酸排泄。因此,这些转运蛋白的遗传变异可能会改变FEUA。
ABCG2基因所转录出得是一种ATP结合转运蛋白,在近端肾小管表达的ABCG2主要负责肾小管尿酸的分泌,国内外大量研究资料显示,该基因与血尿酸水平密切相关。
SLC22A12编码尿酸盐阴离子交换体URAT1,在近端肾小管负责尿酸重吸收,其基因变异与血尿酸浓度升高、尿尿酸排泄减少密切相关,是目前临床常用降尿酸药物(苯溴马隆)的作用靶点。
SLC2A9编码的GLUT9,是一种在近端肾小管细胞和肝脏中高表达的葡萄糖转运载体家族成员,也是高效的尿酸转运体,参与体内尿酸盐的重吸收。
SLC22A9编码有机阴离子转运体7OAT7,影响肝脏尿酸盐摄取活性。
鉴于这些基因对血尿酸水平、尿酸排泄的影响,选取这四个基因对FEUA进行预测,即可实现对痛风患者精准分型。
大量对尿酸盐稳态调节机制的遗传学研究显示,ABCG2、GLUT9、URAT1对尿酸在肾脏中的分泌、重吸收的作用影响最大,这三个基因的变异可解释5%尿酸盐水平的变化,超过了迄今发现的其他变异的总和。因其对于尿尿酸排泄、血尿酸水平影响重大,联合OAT7,这些基因有望成为预测尿酸排泄分数(血肌酐×尿尿酸)/(尿肌酐×血尿酸)×100的重要标志物。
基因检测结果已知后,同时设定基因型rs504915AA(AA型为1,TT、AT型为0)为H、rs2231142GG(GG型为1,TT、GT型为0)为I、rs3775948GG(GG型为1,CC、GC型为0)为J和rs11231463GG(GG型为1,AA、GA型为0)为K。基因型共可能出现的情况:(0,0,0,0)、(1,0,0,0)、(0,1,0,0)、(0,0,1,0)、(0,0,0,1)、(1,1,0,0)、(0,1,1,0)、(0,0,1,1)、(1,0,1,0)、(0,1,0,1)、(1,0,0,1)、(1,1,1,1)、(0,1,1,1)、(1,0,1,1)、(1,1,0,1)、(1,1,1,0)。
获得基因的多态性分型后,结合数据挖掘算法的联合应用来建立基因标志物组合模型,利用多组学预测模型区分痛风亚型,如下所述。
通过收集1000-2000例痛风样品的临床诊疗数据和与并结合痛风亚型密切相关的四个基因单核苷酸多态性位点数据,首先将样本按照训练集:测试集=5:1执行随机分割;其中,四个痛风亚型密切相关基因为本发明首次提出且发现其应用价值。
在训练集中,本发明利用lasso算法从年龄、性别、血压、血糖、实验室检查、家族史、单核苷酸多态性位点等多种信息中,通过将系数的l1范数作为惩罚项加到损失函数上构造一个一阶惩罚函数,实现参数缩减执行特征选择,使结果向量产生稀疏性,最终通过将一些弱变量所对应的系数压缩为0执行特征筛选。
最终还可以筛选出7个与痛风亚型密切相关的电子病历特征(EHR),分别为患者年龄、是否有肾结石、是否高血压、空腹血糖、血尿素氮、血肌酐和血尿酸。
本发明使用支持向量机,逻辑回归,随机梯度下降算法建立模型。支持向量机是一种二类分类模型,其学习策略是的间隔最大化,最终可转化为一个凸二次规划问题的求解。
本实施例选择支持向量机的一个线性核函数,通过将数据映射到高维空间,解决在原始空间中线性不可分的问题。逻辑回归通过使用其固有的logistic函数估计概率,来衡量因变量与一个或多个自变量之间的关系,在本文中设置此模型超参数为C=1.0,penalty='l1'。随机梯度下降是一种用于在线性分类器下的线性分类器的判别学习方法,通过每次迭代都随机从训练集中抽取出一定量的样本,从而获得一个损失值在可接受范围之内的模型,在本文中此模型的超参数设置为alpha=0.001,l1_ratio=1.0,loss='log',penalty='elasticnet'。
最后,使用受试者工作特征曲线下的面积、敏感性、特异性、准确性和PR曲线来评估所有应用模型的识别能力。受试者工作特征曲线,即ROC曲线,它是根据一系列设定阈值,以真阳性率TPR(灵敏度)为纵坐标,假阳性率FPR(1-特异度)为横坐标绘制的曲线,反映在不同阈值下,TPR以及FPR的变化,曲线越靠近左上角,表明模型的分类性能越好;灵敏度是模型中正确预测的比例,表示的是所有正例中被分对的比例,衡量了分类器对正例的识别能力;准确度描述了分类器对整体数据的判断能力,能将正的判定为正,负的判定为负;正确率是最常见的评价指标,是被分对的样本数除以所有的样本数,通常来说,正确率越高,分类器越好;特异性表示的是所有负例中被分对的比例,衡量了分类器对负例的识别能力;PR(precision recall)曲线表现的是precision和recall之间的关系,是以Recall为X轴,Precision为Y轴绘制图像,是当处理一些高度不均衡的数据集时,PR曲线能表现出更多的信息,PR曲线在正负样本比例悬殊较大时更能反映分类的性能。
该模型的有效性验证:采用某队列数据验证结果证明预测性能良好,受试者工作特征曲线下可以很好的识别痛风亚群。
因此,只需通过本发明测定相应基因的点位,即可通过数学模型判定病人的痛风亚型。
本发明首次采用以上基因的相关SNP,经多种数学模型(如SGD、LG和SVC)测算;其结果都比较理想。
三种模型SGD、LG、SVC所测算的结果如下表所示
通过上表即可看出,单纯四个基因即可具有痛风分型的应用价值。且7个与痛风亚型密切相关的特征结合四个基因即可能够获得极高的AUC、灵敏度、特异性和准确率。
本发明通过检测特定的基因,依据基因检测的分型结果,同时结合病人的病历数据,能够有效的判断患者是否属于尿酸排泄减少型的痛风患者,从而能够制定更合理的治疗策略。
本发明实施例检测痛风分型相关基因的方法及试剂盒的优点在于:
(1)本发明所述的检测痛风分型相关基因的方法,能够一次性检测到多个痛风分型相关基因,结合基因检测SNP位点后,即可获得有效的判断信息,同时结合病人的病历数据,经过计算或模型比对,能够有效的判断患者是否属于尿酸排泄减少型的痛风患者。
(2)本发明所述的检测痛风分型相关基因的方法检测准确性高,准确率超过99.8%,同时可以直接检测DNA质谱,能检测出样本中的三等位SNP位点的存在,实验可重性高。
(3)本发明所述的检测痛风分型相关基因的方法,检测低成本、性价比高,一张芯片上可以完成大批量生物样本的多重实验,成本折算后单位点成本比其他同类检测SNP位点的技术方法花费少,适合多种用户和批量检测的需求。
(4)本发明所述的检测痛风分型相关基因的方法,实验流程简单、人员操作时间短、难度小,实验自动化程度高,数据处理软件处理方便,报告结果清晰易懂。
上述本发明实施例序号仅仅为了描述,不代表实施例的优劣。通过以上的实施方式的描述,本领域的技术人员可以清楚地了解到上述实施例方法可借助一些变形加必需的通用技术叠加的方式来实现;当然也可以通过简化上位一些重要技术特征来实现。基于这样的理解,本发明的技术方案本质上或者说对现有技术做出贡献的部分为:用于特定痛风分型的基因组及其试剂盒的应用,并配合本发明各个实施例所述的结构。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种检测痛风分型相关基因的方法,其特征在于,包括以下步骤:
第一步,针对特定基因设计特异性引物;
第二步,利用特异性PCR扩增出包含特定基因的目的片段;
第三步,PCR产物碱性磷酸酶处理;
第四步,进行单碱基延伸反应;
第五步,进行树脂纯化处理;
第六步,检测分析特定基因的序列;
其中,所述特定基因为:rs3775948、rs2231142、rs11231463和rs504915中多种以及多种以上的组合。
2.根据权利要求1所述的检测痛风分型相关基因的方法,其特征在于,所述特定基因分别为:rs3775948、rs2231142、rs11231463和rs504915。
3.根据权利要求2所述的检测痛风分型相关基因的方法,其特征在于,rs2231142基因的正向引物rs2231142_W1_F的序列为:ACGTTGGATGGTCATAGTTGTTGCAAGCCG,rs2231142基因的反向引物rs2231142_W1_R的序列为:ACGTTGGATGTGATGTTGTGATGGGCACTC,rs2231142基因的延伸引物rs2231142_W1_E的序列为:CCGAAGAGCTGCTGAGAACT;
rs11231463基因的正向引物rs11231463_W1_F的序列为:ACGTTGGATGAAAGGAGCTTCTTCCTGGAC,rs11231463基因的反向引物rs11231463_W1_R的序列为:ACGTTGGATGCTATAGCTACATGGCTCAGG,rs11231463基因的延伸引物rs11231463_W1_E的序列为:CCTTCCTGGACATGGATATTC;
rs504915基因的正向引物rs504915_W1_F的序列为:ACGTTGGATGTGAGGACCCCCAGGGAAAA,rs504915基因的反向引物rs504915_W1_R的序列为:ACGTTGGATGCTGGAACCCATTTTTCCTCG;rs504915基因的延伸引物rs504915_W1_E的序列为:GGACCCCCAGGGAAAAGAGACA;
rs3775948基因的正向引物rs3775948_W1_F的序列为:ACGTTGGATGACAACAACCCTCTGACATGG,rs3775948基因的反向引物rs3775948_W1_R的序列为:ACGTTGGATGGCTCCGATACACACAGCTAT,rs3775948基因的延伸引物rs3775948_W1_E的序列为:CATGTCATCGTGAACTAAGTAAAGAT。
4.根据权利要求1所述的检测痛风分型相关基因的方法,其特征在于,所述第二步中,首先提取血样中的DNA,然后配置PCR扩增体系;PCR反应条件为:
在95℃DNA预变性2分钟;扩增45个循环;然后在95℃DNA变性30秒;56℃条件下退火30秒;72℃延伸60秒;72℃延伸5分钟;4℃保温;启动PCR反应。
5.根据权利要求1所述的检测痛风分型相关基因的方法,其特征在于,所述第三步中,PCR反应结束后,将PCR产物用碱性磷酸酶处理,以去除体系中游离的dNTPs;此过程反应条件为:37℃保持40分钟,85℃保持5分钟,4℃保温。
6.根据权利要求1所述的检测痛风分型相关基因的方法,其特征在于,所述第四步中,单碱基延伸反应如下:
94℃30秒;
94℃5秒;
52℃5秒;
80℃5秒;
回到c,重复4次;
回到b,重复39次;
72℃3分钟;
4℃保温。
7.根据权利要求1所述的检测痛风分型相关基因的方法,其特征在于,所述第五步中,树脂纯化过程如下:
将clean Resin树脂平铺到6mg树脂板中;加16ul水到延伸产物的对应孔内;将干燥后的树脂倒入延伸产物板中,封膜,低速垂直旋转30分钟,使树脂与反应物充分接触,使树脂沉入孔底部。
8.根据权利要求1所述的检测痛风分型相关基因的方法,其特征在于,所述第六步中,将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP芯片上;
将点样后的SpectroCHIP芯片使用飞行时间质谱MALDI-TOF分析,从而检测并输出结果。
9.一种检测痛风分型相关基因的试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括:用于扩增rs3775948、rs2231142、rs11231463和rs504915中任意两个或两个以上组合基因的特异性引物对;
所述试剂盒还包括:rs3775948、rs2231142、rs11231463和rs504915中任意两个或两个以上组合基因的单碱基延伸引物。
10.根据权利要求9所述的检测痛风分型相关基因的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:用于扩增rs3775948、rs2231142、rs11231463和rs504915四种基因的特异性引物对,以及这四种基因的单碱基延伸引物。
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