CN110592204A - 血清miRNA组合作为分子标记物评估非阻塞性无精症 - Google Patents

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傅文婷
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Abstract

本发明公开了血清miRNA组合作为评估非阻塞性无精症的分子标记物的应用。所述血清miRNA组合为hsa‑miR‑1263、hsa‑miR‑221‑5p、hsa‑miR‑483‑3p、hsa‑miR‑4275和hsa‑miR‑194‑3p。并利用此miRNA组合制备了评估非阻塞性无精症的试剂盒。本发明得到了用于评估非阻塞性无精症的血清miRNA组合，进而得到了，以及含有该血清miRNA组合的定量RQ‑PCR检测的引物的检测试剂盒，利用该检测引物和检测试剂盒进行检测，操作简单，准确性高，值得大范围推广。

Description

血清miRNA组合作为分子标记物评估非阻塞性无精症
技术领域
本发明涉及医药检测技术领域，更具体地，涉及一种血清miRNA组合作为分子标记物评估非阻塞性无精症。
背景技术
目前，全球约有10％-15％育龄夫妇不育，其中50％与男方因素有关。非阻塞性无精症(Non-obstructive azoospermia，NOA)是最常见的男性不育症类型，成年男性发病率约为1％。除了感染、内分泌、免疫、遗传、先天畸形及精索静脉曲张等病因外，有50％男性不育病因不清楚，被诊断为特发性不育。一般认为，特发性不育与未知的遗传和表观遗传因素有关。男性不育病因复杂，但精液异常是最为普遍的实验室指标之一。精液质量直接关系到精子的受精能力与受胎率，如何评定精液质量一直是人们关心的问题。准确、客观地评价精液的质量和受精能力是人工授精和体外受精技术成功的关键。人们对精液质量评估尽管取得了很大的成果，但是目前对精液的检测还很难标准化。一些检测指标与受精能力的相关性不强，所以必须采用几种方法结合检测才能反映精液质量。因此，寻找新的男性特发性不育诊断的表观遗传标记物显得尤为重要。
表观遗传学是研究DNA序列未发生变化但表型却发生可遗传改变的一门学科，其主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控等几个方面，表观遗传修饰在精子发生及受精过程中都起着非常重要的作用。miRNA是一类可调节基因表达、调节生长发育、维持机体正常生理功能的重要的非编码RNA。越来越多的研究表明，miRNA对于正常精子发生是必要的。miRNA广泛存在于各条染色体中，这些miRNA虽然只占人类基因总数的2％，却调控着人类全基因组中30％以上基因的表达。在哺乳动物细胞中，大多数miRNA是由基因间DNA序列编码，也有部分miRNA是由位于基因内含子的DNA序列编码。每个miRNA可能有多个靶基因，而多个miRNAs可调节同一个基因。目前在人类细胞发现的miRNA共有上千种，人体内不同器官组织都具有各自独特的miRNA表达谱，miRNA在血液和尿液等体液中稳定存在，并与组织中的miRNA相关，分析miRNA在血液中的表达，能够了解机体组织状况，血清miRNA的表达改变能预示疾病的产生和转归。
所以，通过检测血清中miRNA组合的变化，可以有效评估非阻塞性无精症中精液质量，指导临床诊断及预后判断。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供种血清miRNA组合作为分子标记物评估非阻塞性无精症。
本发明的第一个目的是提供血清miRNA作为评估非阻塞性无精症的分子标记物的应用。
本发明的第二个目的是提供所述miRNA的定量RQ-PCR检测的引物。
本发明的第三个目的是提供所述引物在制备评估非阻塞性无精症的试剂盒中的应用。
本发明的第四个目的是提供所述一种评估非阻塞性无精症的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
血清miRNA作为评估非阻塞性无精症的分子标记物的应用。
优选地，所述血清miRNA为hsa-miR-1263、hsa-miR-221-5p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-4275和hsa-miR-194-3p中的一条或几条。
其中，hsa-miR-1263的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
hsa-miR-221-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
hsa-miR-483-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
hsa-miR-4275的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
hsa-miR-194-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
所述miRNA组合的定量RQ-PCR检测的引物，检测hsa-miR-1263的上游检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；hsa-miR-221-5p的上游检测引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：7所示；hsa-miR-483-3p的上游检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；hsa-miR-4275的上游检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；hsa-miR-194-3p的上游检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；以上5个miRNA的下游检测引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：11所示。
所述引物在制备评估非阻塞性无精症的试剂盒中的应用，也属于本发明的保护范围。
一种评估非阻塞性无精症的试剂盒，其特征在于，含有检测所述的miRNA的试剂。
优选地，所述试剂为所述引物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明得到了用于评估非阻塞性无精症的血清miRNA组合，进而得到了，以及含有该血清miRNA组合的定量RQ-PCR检测的引物的检测试剂盒，利用该检测引物和检测试剂盒进行检测，操作简单，准确性高，值得大范围推广。
附图说明
图1为非阻塞性无精症患者和健康捐精者血清中miRNA差异表达。
图2为非阻塞性无精症患者和健康捐精者血清中miRNA表达谱聚类分析结果。
图3为定量RQ-PCR与芯片杂交结果比较。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1芯片检测非阻塞性无精症患者和健康捐精者血清中miRNA差异表达
一、实验分组
样品组：非阻塞性无精症患者血清样品来源于广东省计划生育专科医院，经我院男科确诊为非阻塞性无精症患者；
对照组：为来广东省人类精子库捐精且符合供精条件的健康男性血清标本。非阻塞性无精症诊断标准为在排除输精管道梗阻因素外，精液常规分析两次未发现精子的无精症。
二、实验操作
标本采集前经广东省计划生育专科伦理委员会同意，患者知情同意后进行。
采集2ml空腹外周血置于无抗凝剂试管中，室温放置30-60min，使血液凝固，将上层血清小心转移到收集管中，置-80℃保存备用。
取2例非阻塞性无精症患者血清和2例健康捐精者血清，采用试剂TRIzol提取血清总RNA，按照试剂miRNeasy mini kit说明书纯化RNA。然后，采用分光光度计NanoDrop ND-1000检测RNA的量和纯度。采用Exiqon公司的miRCURYTM Array PowerLabeling kit，按照操作说明书进行miRNA标记。
采用miRCURYTM Array(16.0)试剂盒进行杂交，于56℃杂交16-20小时，芯片在室温条件下晾干后，分别用不同的缓冲液清洗2min，1000rpm离心5min，待芯片干燥后立即扫描。
采用Axon GenePix 4000B microarray scanner扫描，GenePix proV6.0处理原始图像。用原始信号值减去该点的前景值得到每个探针的修正值，选取本次实验中在芯片修正值都≥50的非对照探针，将这部分探针的修正值统计处理后，取其中值作为基准，对整张芯片的点做标准化处理。以Fold change不低于1.5.，P值不低于0.05的标准来筛选差异表达的miRNA，并进行聚类分析。
三、实验结果
非阻塞性无精症患者和健康捐精者血清miRNAs表达微阵列经扫描和数据分析，共筛选出71个差异表达的miRNAs(图1、图2)，包括47个表达上调的miRNAs和24个表达下调的miRNAs(表1)，其中hsa-miR-1263、hsa-miR-221-5p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-4275和hsa-miR-194-3p中5个miRNA表达显著差异。
表1：
实施例2实时定量PCR验证非阻塞性无精症患者和健康捐精者血清中miRNA差异表达
根据miRNA微阵列芯片结果，选取5个Fold change较高的miRNA(hsa-miR-1263、hsa-miR-221-5p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-4275和hsa-miR-194-3p)，采用Mir-XTM miRNAqRT-PCR Kit进行实时定量PCR验证。
一、实验操作
提取RNA，采用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit进行逆转录，逆转录引物为：5-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3，以5SrRNA为内参基因。其它按照试剂盒说明进行。所采用的上游引物见表2。下游引物采用试剂盒中的3′引物：5-GCTG TCAACGATA CGCTACG TAA-3′。
反应在96孔STEPONEPLUS(美国ABI)荧光PCR仪上进行扩增，每组设3个复孔。反应条件为：94℃预变性10s；94℃20s，60℃20s，共40个循环。反应结束由计算机自动计算得到各反应管循环阈值(threshold cycle,Ct)，采用2-ΔΔCt法对基因表达进行相对定量。
表2：
二、实验操作
将芯片结果与荧光定量RT-PCR结果进行比较，结果显示在非阻塞性无精症患者和健康捐精者血清中hsa-miR-483-3p，hsa-miR-194-3p，hsa-miR-4275表达增加，而hsa-miR-221-5p，hsa-miR-1263表达降低，芯片与定量RT-PCR检测到的差异miRNA表达一致，说明本研究芯片结果真实可靠。结果见图3。
序列表
<110> 广东省计划生育科学技术研究所
<120> 血清miRNA组合作为分子标记物评估非阻塞性无精症
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
augguacccu ggcauacuga gu 22
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
agcuacauug ucugcugggu uuc 23
<210> 3
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ucacuccucu ccucccgucu ucu 23
<210> 4
<211> 17
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
ccaauuacca cuucuuu 17
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
ccaguggggc ugcuguuauc ug 22
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
actcctctcc tcccgtctt 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
agtggggctg ctgttatctg 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
gccccaatta ccacttcttt a 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
acctggcata caatgtagat tt 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
taccctggca tactgagtaa a 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
gctgtcaacg atacgctacg taa 23

Claims (6)

1.血清miRNA作为评估非阻塞性无精症的分子标记物的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述血清miRNA为hsa-miR-1263、hsa-miR-221-5p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-4275和hsa-miR-194-3p中的一条或几条。
3.权利要求2中所述的miRNA的RQ-PCR检测的引物，其特征在于，检测hsa-miR-1263的上游检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；hsa-miR-221-5p的上游检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；hsa-miR-483-3p的上游检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；hsa-miR-4275的上游检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；hsa-miR-194-3p的上游检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；以上5个miRNA的下游检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
4.权利要求3所述引物在制备评估非阻塞性无精症的试剂盒中的应用。
5.一种评估非阻塞性无精症的试剂盒，其特征在于，含有检测权利要求2中所述的miRNA的试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为权利要求3所述引物。
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