CN104988239A - 一种快速分析单细胞性染色体倍性的方法和试剂盒 - Google Patents

一种快速分析单细胞性染色体倍性的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种快速分析单细胞性染色体倍性的方法和试剂盒。所述的方法首先使用分别针对X、Y和21号染色体的如SEQ ID NO.1-6所示的引物对来自于单细胞的痕量DNA预扩增，再分别使用如SEQ ID NO.7-12所示的套式引物进行实时荧光定量PCR，得到X、Y染色体DNA的相对于内参的含量K、L值，同时设置男性标准品、女性标准品和阴性对照组，最终计算K/L、K/K女 标、L/L女标、K/K男标和/或L/L男标值，得出待试样本的性染色体倍性。本发明方法用于分析单细胞性染色体倍性，具有准确度高、时间短、成本低的优势，有助于临床的遗传学诊断。

Description

一种快速分析单细胞性染色体倍性的方法和试剂盒
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种快速分析单细胞性染色体倍性的方法和试剂盒。
【背景技术】
体外受精－胚胎移植，简称试管婴儿技术，由于有机会在胚胎移植之前获得一个胚胎的细胞，从而为胚胎的种植前遗传和性别筛选提供了条件。然而，在我国和很多欧洲国家，法律不允许单纯进行性别筛选。但是，在一些国家，例如美国等，胚胎移植前的性别筛选是法律所允许的。可是通过性别筛选，以排除性连锁遗传疾病，是法律所允许的。例如X染色体增加一倍的47,XXYKlinefelter综合征，在男性新生儿中的发病率是1/850；X染色体缺失一倍的女性45,XO,Turner综合征，在女婴中的发病率为1/2500-5000；除此之外，性连锁遗传疾病还包括XYY综合征、多X综合征等。针对性染色体连锁疾病高危人群，在胚胎种植前进行性别的遗传学筛选，可以避免遗传疾病的发生，这是符合医学伦理道德要求的。
目前，对这类疾病的诊断方法包括细胞遗传学方法和分子遗传学方法。前者是借助于染色体核型分析方法，对处于分裂中期的细胞进行分析，操作过程繁琐，常因细胞培养污染等因素而影响结果判断，耗时长，不利于快速精确诊断；而且核型分析对于小于4.5Mb的染色体异常无法诊断，因此不适用于胚胎植入前诊断。另外一个方法是近年来发展很快的分子遗传学方法，主要是将细胞遗传学技术与分子生物学技术相结合的一种方法，它快速、敏感、特异性强，对许多遗传病的病因分析，致病基因的鉴定诊断等都具有重要价值。包括单细胞性染色体倍性诊断的方法是荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术和测序技术。FISH能检测的染色体数目有限，实验步骤长(长于24小时)，而且靠肉眼判断信号的“有”和“无”，准确性差。以上技术最近两年被芯片技术取代，包括比较基因组杂交芯片(array-based Comparative GenomicHybridization，array CGH)和单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism，SNP)芯片等，可同时检测23对染色体的拷贝数以及某些结构异常。但是这样的芯片造价高，时程长(1-2天)，而且医院本身不能操作，要外送公司检测，增加了样本污染的机会，一个胚胎卵裂球的检测费用大约在6000元人民币左右，对大多数试管婴儿患者并不适用。
总的来说，现有筛查方法的问题是费用高，时间长，周转实验室多。因此亟需一种快速和准确的，专门针对X，Y性染色体倍性的检测，可在医院胚胎实验室应用的胚胎植入前遗传学筛查方法。
【发明内容】
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种快速分析单细胞性染色体倍性的引物组合。
本发明的再一的目的是，提供所述的引物组合的用途。
本发明的另一的目的是，提供一种快速分析单细胞性染色体倍性的试剂盒。
本发明的第四个目的是，提供一种快速分析单细胞性染色体倍性的方法。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种快速分析单细胞性染色体倍性的引物组合，所述的引物组合包含序列分别如SEQ ID NO.1-6所示的引物。
所述的引物组合还包含序列分别如SEQ ID NO.7-12所示的引物。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上任一所述的引物组合在制备快速分析单细胞性染色体倍性的试剂中的应用。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
一种快速分析单细胞性染色体倍性的试剂盒，所述的试剂盒包含序列分别如SEQ ID NO.1-6所示的引物。
所述的试剂盒还包含序列分别如SEQ ID NO.7-12所示的引物。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
一种非治疗目的的快速分析单细胞性染色体倍性的方法，所述的方法包括以下步骤：
a)提取单细胞的全基因组DNA，加入分别针对X染色体、Y染色体和21号染色体的序列如SEQ ID NO.1-6所示的引物，进行PCR预扩增；
b)以步骤a)的扩增产物为模板，分别使用针对X染色体、Y染色体和21号染色体的套式引物进行实时荧光定量PCR；其中以针对21号染色体的引物作为内参，得出X染色体DNA相对含量K＝2－ΔCt(x)、Y染色体DNA相对含量L＝2－ΔCt(y)，以及X/Y＝2－ΔΔCt；同时设计标准男性对照组得到L男标和标准女性对照组得到K女标；
c)若男性标准品和女性标准品的K/L值在正常范围内，且阴性对照组Ct(x)和Ct(y)均大于25个周期，则进一步判断待试样本的K/L、K/K女标、L/L女标、K/K男标和/或L/L男标值，得出待试样本的性染色体倍性。
所述的针对X染色体、Y染色体和21号染色体的套式引物序列分别如SEQID NO.7-12所示。
所述的非治疗目的可以是用于科学研究，所述的单细胞可以是来自于人体的任何组织或体液等。
本发明优点在于：
本发明提供了一种快速分析单细胞性染色体倍性的方法和试剂盒。
一般的荧光定量PCR要求底物DNA的浓度在10pg以上，最适浓度为100pg，因此对于单细胞(DNA的浓度在5pg以下)的定量不能做出正确的诊断。本发明的方法解决了单细胞定量的问题，首先均衡地扩增单细胞中X，Y染色体上的标记DNA，达到荧光定量PCR要求的适合浓度范围后，再使用荧光定量PCR进行定量分析，最后得出性染色体相对拷贝数，进一步分析得到性染色体倍性。
1、本发明设计的引物之间不会发生非特异性的抑制作用，互相不干扰，能够均衡的扩增单细胞X，Y染色体上的标记DNA，确保结果的准确性；
2、本发明的方法分析了X，Y染色体的相对拷贝数，即进行了双重核对，准确性大大提高；
3、本发明的方法引入常染色体特定保守DNA片段作为内参，降低了假阳性率。
与现有的染色体核型分析方法相比，本发明还具有以下优点：
1、针对现有的诊断方法费用高的问题，本发明所需成本约为人民币200元/样本；
2、针对现有的诊断方法时间过长的问题，本发明所需时间约为两个小时；
3、针对现有的诊断方法周转实验室过多的问题，本发明所需设备为一台PCR仪、一台定量PCR仪、一台超净台。
综上所述可知，本发明为染色体突变高危病人和性连锁疾病高危病人提供了胚胎的遗传学诊断方法，可有效预防性染色体疾病在试管婴儿中出现。
【附图说明】
附图1是本发明快速分析单细胞性染色体倍性的技术原理图。
【具体实施方式】
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
1.技术原理
请参照图1，图1是本发明快速分析单细胞性染色体倍性的技术原理图。
本发明的试剂盒是基于单细胞DNA扩增与实时定量PCR技术。首先将来自胚胎的卵裂球或者胚胎滋养层细胞中的痕量DNA进行特别片段(X，Y和常染色体上的标志DNA片段)等量扩增(第一轮扩增)，再利用实时定量PCR(第二轮扩增)确定每个样本中标志DNA片段的Ct值(达到饱和浓度所需要的周期数)，ΔCt为标识基因与内源性参考基因Ct值之差；ΔΔCt是两个标识基因Ct值之差。由于Ct值与底物模板浓度的对数存在反比例的线性关系，即DNA相对量＝2－ΔΔCt，可以计算出每个标志DNA与常染色体上标志DNA的相对比例，获得性染色体相对拷贝数K(K＝X标识/常染色体标识)和L(L＝Y标识/常染色体标识)。每次检测均需要使用基因组男性、女性标准品和阴性对照组。对照组和实验组卵裂球加入针对每个染色体标志基因的引物(A1，A2，A6分别针对X，Y及21号常染色体上的单拷贝基因)，进行PCR预扩增。分别使用标志基因(A1,A2,A6)的套式引物(C1,C2,C6)进行实时荧光定量PCR。阴性对照组的Ct值大于25为结果可信。使用100pg标准男性和标准女性基因组测定预扩增的比例，计算C1/C6、C2/C6，得到男性和女性的标准常数。
以下为正常与异常核型的比值：
XX核型：K/L≈∞，K/K女标≈1:1；L/L女标≈0:0；
XY核型：K/L≈1，K/K男标≈1:1；L/L男标≈1:1；
XO核型：K/L≈∞，K/K女标≈1:2；L/L男标≈0:1；
XXX核型：K/L≈∞，K/K女标≈3:2；L/L男标≈0:1；
XXY核型：K/L≈2，K/K女标≈1:1；L/L男标≈1:1；
XYY核型：K/L≈0.5，K/K女标≈1:2；L/L男标≈2:1。
表1 PCR引物序列
第一轮扩增引物名称 引物序列 备注 SEQ ID NO.
B1-F tgtgaggatggcattcaact X染色体 1
B1-R tgcttccgtttgccttttatatg X染色体 2
B2-F gttctggaagtgaatggactcc Y染色体 3
B2-R tcgattcctttccattccagc Y染色体 4
B5-F tgtacccagccaaaggagtt 第21号染色体 5
B5-R ctgctgcatcaaaagagaggt 第21号染色体 6
第二轮扩增引物名称
B1-2F ggatggcattcaactcatgga X染色体 7
B1-2R tgcttccgtttgccttttatatg X染色体 8
B2-2F tggaagtgaatggactccaa Y染色体 9
B2-2R tcgattcctttccattccagc Y染色体 10
B5-2F ttgtggaaaatgcaggtgga 第21号染色体 11
B5-2R ctgctgcatcaaaagagaggt 第21号染色体 12
2.试验步骤
1)标准男性、女性基因组。
1)制备标准阴性对照基因组(纯净水)。
2)所有对照组和实验组卵裂球放入15μl水中，70℃裂解10分钟。加入针对每个染色体特异性标志DNA的引物(A1针对X染色体，A2针对Y染色体，A6针对21号染色体)，进行PCR预扩增，扩增后产物灭活。PCR反应体系为高保真PrimeStar DNA聚合酶50μl体系，其中15μl卵裂球裂解物；5×buffer 10μl；引物对(20μM)2μl；PrimeStarDNA聚合酶0.5μl；dNTP混合物4μl；水18.5μl。反应程序为98℃ 2分钟，94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒(10个循环)，72℃ 2分钟，95℃ 10分钟，4℃降温。
3)分别使用标志基因(A1,A2,A6)的套式引物进行实时荧光定量PCR。PCR反应体系为KAPA SYBR Fast qPCR Master Mix(2×)Universal 20μl体系，其中8.8μl为第一步PCR反应产物；2×buffer 10μl；引物对(10μM)0.8μl；50×ROX LOW 0.4μl。反应程序为95℃ 3分钟，95℃ 3秒，60℃ 30秒(40个循环)，95℃ 15秒，60℃ 1分钟，95℃ 30秒，60℃ 15秒。
4)实验组以标志基因A6的引物作为内部参照物，分别得到X和Y染色体DNA相对于内参A6的ΔCt(x)和ΔCt(y)，ΔCt(x)-ΔCt(y)＝ΔΔCt值。X染色体DNA相对含量K＝2－ΔCt(x)；Y染色体DNA相对含量L＝2－ΔCt(y)。X/Y＝2－ΔΔCt。
5)男性对照组得到L男标，女性对照组得到K女标。首先判断qPCR结果是否成功，男性女性标准品的K/L值在正常范围内，阴性对照组Ct(x)和Ct(y)均大于25个周期。
6)再判断样本是否含有Y染色体。含有Y染色体的男性K/L趋近于0.5～2之间；而不含Y染色体的女性K/L趋近于无穷大。
7)如果是女性，再根据K/K女标值判断X染色体倍性。正常XX女性K/K女标≈1:1；XO女性K/K女标≈1:2；XXX女性K/K女标≈3:2。
8)如果是男性，再根据L/L男标值和K/K女标值判断X和Y染色体倍性。正常XY男性L/L男标≈1:1，K/K女标≈1:2；XYY男性L/L男标≈2:1，K/K女标≈1:2；XXY男性K/K女标≈1:1；L/L男标≈1:1。
实施例2
使用捐赠胚胎一例，分析性染色体的倍性。诊断结果如表2所示，提示胚胎F为女性，性染色体比例正常XX。
表2 单细胞性染色体倍性分析诊断结果
实施例3
对使用本发明方法快速分析单细胞性染色体倍性的准确性进一步做大样本的验证。收集志愿者正常男性100例、正常女性100例、XXY Klinefelter综合征8例、XO Turner综合征7例、XYY综合征4例、多X综合征7例，采集志愿者外周血，提取全基因组DNA，采用实施例1的引物、按照实施例1的方法分析单细胞性染色体倍性，其中第一轮PCR使用的全基因组DNA模板量为3pg。结果显示本发明方法的准确度为100％。
实施例4
在试验过程中，针对第二轮扩增设计了多组套式引物，以寻找灵敏度高、可准确诊断的引物组合。表3为部分套式引物筛选实验结果。结果表明本发明选择的套式引物的灵敏度显著高于其他引物。
表3 单细胞性染色体倍性分析引物选择及灵敏度实验
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种快速分析单细胞性染色体倍性的引物组合，其特征在于，所述的引物组合包含序列分别如SEQ ID NO.1-6所示的引物。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述的引物组合还包含序列分别如SEQ ID NO.7-12所示的引物。
3.权利要求1或2所述的引物组合在制备快速分析单细胞性染色体倍性的试剂中的应用。
4.一种快速分析单细胞性染色体倍性的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含序列分别如SEQ ID NO.1-6所示的引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包含序列分别如SEQ ID NO.7-12所示的引物。
6.一种非治疗目的的快速分析单细胞性染色体倍性的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
a)提取单细胞的全基因组DNA，加入分别针对X染色体、Y染色体和21号染色体的序列如SEQ ID NO.1-6所示的引物，进行PCR预扩增；
b)以步骤a)的扩增产物为模板，分别使用针对X染色体、Y染色体和21号染色体的套式引物进行实时荧光定量PCR；其中以针对21号染色体的引物作为内参，得出X染色体DNA相对含量K＝2－ΔCt(x)、Y染色体DNA相对含量L＝2－ΔCt(y)，以及X/Y＝2－ΔΔCt；同时设计标准男性对照组得到L男标和标准女性对照组得到K女标；
c)若男性标准品和女性标准品的K/L值在正常范围内，且阴性对照组Ct(x)和Ct(y)均大于25个周期，则进一步判断待试样本的K/L、K/K女标、L/L女 标、K/K男标和/或L/L男标值，得出待试样本的性染色体倍性。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的针对X染色体、Y染色体和21号染色体的套式引物序列分别如SEQ ID NO.7-12所示。
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