CN105316420A - 一种单管四色双重相对荧光定量pcr技术快速检测人13号和18号染色体数目的试剂盒 - Google Patents

一种单管四色双重相对荧光定量pcr技术快速检测人13号和18号染色体数目的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种单管四色双重相对荧光定量PCR技术快速检测人13号和18号染色体数目的试剂盒，包括扩增检测试剂，该扩增检测试剂包括：一对可以同时扩增13号和5号染色体上特异重复序列的引物，以及分别检测上述13和5号染色体特异重复序列扩增量的2条荧光探针；另一对可以同时扩增18号和9号染色体上特异重复序列的引物，以及分别检测上述18号和9号染色体特异重复序列扩增量的2条荧光探针。本发明所述试剂盒能通过13号和5号染色体的2-△△CT13-5值以及18号和9号染色体的2-△△CT18-9值同时独立地分别检测出13号和18号染色体的数目，结果准确、可靠，且灵敏度高、特异性强。

Description

一种单管四色双重相对荧光定量PCR技术快速检测人13号和18号染色体数目的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种单管四色双重相对荧光定量PCR技术快速检测人13号和18号染色体数目的试剂盒，属于分子生物学领域。
背景技术
18-三体综合症又称Edwards综合征。本病在新生婴儿中的发生率为1/3500～1/8000，多发生在年龄较大的父母亲，52％超过35岁。女孩比男孩发生率高。18-三体综合征的特征表现为生长迟缓、上睑下垂、眼睑畸形、耳位低、小嘴、小下颏、皮肤斑点、示指超过中指并握紧拳头、并指(趾)畸形、摇篮底足、足趾大而短、室间隔缺损、脐疝或腹股沟疝、胸骨短、小骨盆和肌张力增高，偶有癫痫发作、严重精神发育迟滞等，常死于婴儿早期。
13-三体综合征又称Patau综合征。本病在新生儿中发病率为1/4000～1/10000，女性明显多于男性，发病率随孕母年龄增高而增加。本病主要特征为严重智能低下、特殊面容、手足及生殖器畸形，并可伴有严重的致死性畸形，90％患儿在一岁内死亡。
目前,该类染色体疾病尚无有效的治疗方法,因此,进行产前诊断防止患儿的出生是预防染色体疾病发生的主要方法。羊水细胞培养、染色体核型分析是产前诊断的经典方法(CasperssonT,ZechL,JohanssonC,etal.IdentificationofhumanchromosomesbyDNA-bindingfluorescentagents[J].Chromosoma,1970,30(2):215-227.),但是，该方法一般需要两周以上才能得到检测结果，容易导致孕妇及其家庭承受极大的心理压力。荧光原位杂交(FISH)技术应用于产前快速诊断，无需进行细胞培养，实现了染色体疾病的快速诊断(HoSSY,ChuaC,GoleL,etal.Same-dayprenataldiagnosisofcommonchromosomalaneuploidiesusingmicrofluidics-fluorescenceinsituhybridization[J].PrenatalDiagnosis,2012,32(4):321-328.)，但是由于该技术操作繁琐并且要求具有良好的技术专业性，使得该技术不能大量的进行临床标本的应用。因此，需要建立更加快速而有效的产前诊断方法来弥补以上方法的一些缺陷和不足。
随着分子生物学的发展,目前已出现了几种快速分子诊断非整倍体的方法。基于STR的QF-PCR方法是目前应用最广的一种方法，该方法能实现非整倍体的准确检测(AtefSH,HafezS,HelmyS,etal.QF-PCRasaRapidTechniqueforRoutinePrenatalDiagnosisofFetalAneuploidies[J].PediatricResearch,2011,70:412-412.)，该技术的主要缺点是诊断需要依靠多态性位点，而多态性位点可能在某一人群能较好的进行诊断，而因为种族的差异可能会出现在其它人群中出现无法进行诊断的情况(MannK,DonaghueC,FoxSP,etal.Strategiesfortherapidprenataldiagnosisofchromosomeaneuploidy[J].EurJHumGenet,2004,12:907-915.)；并且，其在PCR扩增后还需要毛细管电泳分析其片段片度，因此，仪器及试剂的费用也限制了该方法的广泛应用。多重连接探针扩增(MLPA)技术最开始应用于基因拷贝数的变化，目前也应用于非整倍体疾病的诊断(SlaterHR,BrunoDL,RenH,etal.Rapid,highthroughputprenataldetectionofaneuploidyusinganovelquantitativemethod(MLPA)[J].Journalofmedicalgenetics,2003,40(12):907-912.)，由于该技术需要杂交过夜、连接以及产物的后续毛细管电泳分析等步骤，实验相对繁琐且后续分析昂贵费用影响了该技术的广泛应用(WillisAS,VeyverI,EngCM.Multiplexligation‐dependentprobeamplification(MLPA)andprenataldiagnosis[J].PrenatDiagn,2012；32:315-320.)。
实时荧光定量PCR方法诊断非整倍体不需要PCR后处理或电泳检测,简便、快速,整个操作及结果的判定可在4小时内完成；而且数据的读取完全由仪器进行,排除了主观因素的影响,另外几十个标本可以一次完成,为开展大规模的产前筛查提供了技术保障。目前的研究主要是采用不同染色体间的特异性基因进行诊断，如21号染色体的诊断(ZimmermannB,HolzgreveW,WenzelF,etal.Novelreal-timequantitativePCRtestfortrisomy21[J].Clinicalchemistry,2002,48(2):362-363.)，以及21号和18号染色体的诊断(ZimmermannBG,DudarewiczL.Real-timequantitativePCRforthedetectionoffetalaneuploidies[M].PrenatalDiagnosis.HumanaPress,2008:95-109；眭建忠,张慧敏,孙筱放.多重实时定量PCR快速诊断唐氏及爱德华综合征[J].中华医学遗传学杂志,2010(4):449-452.)。但是，由于采用两对引物分别扩增不同的片段，很微小的退火温度的变化或DNA质量的差异都会引起假阴性或假阳性的结果，从而导致结果的不准确性(HelmySM,IsmailS,BassiouniR,etal.SensitivityofDCSR3/GAPDHratiousingquantitativereal-timePCRintherapidprenataldiagnosisfordownsyndrome[J].FetalDiagnTher,2009,25(2):220-223.)。
基于短串联片段(STR)的QF-PCR法的相关专利CN103103267A、CN101323877A、CN104818323A、CN104651488A、CN103555849A等均采用扩增STR分子标记，然后采用遗传分析仪(测序仪)的方法进行片段分析，实现了21号以及其它染色体的诊断，但是该类方法需要PCR反应后分析，操作繁琐且需昂贵的遗传分析仪，不利于方法的广泛推广应用。
公开号为CN101105454A的发明专利是基于21号染色体特异的DSCR区段序列和16号染色体上的GAPDH基因序列，分别设计了两对引物和两对探针对21号染色体的数目进行检测，该方法由于采用两对引物分别扩增不同的片段，因此，容易受到DNA纯度和PCR温度的影响，从而影响结果的准确性。公开号为CN101525661A的发明专利采用21号与2号染色体间的相似序列的相对荧光定量实现了21号染色体数目的诊断，但该方法仅针对21号染色体的检测，不涉及13号和18号染色体的诊断，且未能实现四色双重相对定量关键技术的突破。
目前尚未见有采用相似序列分子标记的实时荧光定量PCR技术，实现单管四色双重相对定量同时检测13号和18号染色体数目的方法或技术的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种单管四色双重相对荧光定量PCR技术快速检测人13号和18号染色体数目的试剂盒。采用该试剂盒可以在同一个反应管中实现两套独立检测系统，用于检测人13号和18号染色体数目结果准确、可靠，且灵敏度高、特异性强。
本发明所述的单管四色双重相对荧光定量PCR技术快速检测人13号和18号染色体数目的试剂盒，包括扩增检测试剂，所述的扩增检测试剂包括2对引物、4条不同荧光标记的探针，其中一对引物可以同时扩增13号染色体和5号染色体上的特异重复序列，另一对引物可以同时扩增18号染色体和9号染色体上的特异重复序列，所述的扩增引物和荧光探针具体为：
(1)同时扩增13号染色体特异重复序列chr13与5号染色体特异重复序列chr5的引物对，其碱基序列分别如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；
(2)特异性检测13号染色体特异重复序列chr13的Taqman探针chr13-Probe，其碱基序列如SEQIDNO：3所示；
(3)特异性检测5号染色体特异重复序列chr5的Taqman探针chr5-Probe，其碱基序列如SEQIDNO：4所示；
(4)同时扩增18号染色体特异重复序列chr18与9号染色体特异重复序列chr9的引物对，其碱基序列分别如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示；
(5)特异性检测18号染色体特异重复序列chr18的Taqman探针chr18-Probe，其碱基序列如SEQIDNO：7所示；
(6)特异性检测9号染色体特异重复序列chr9的Taqman探针chr9-Probe，其碱基序列如SEQIDNO：8所示。
本发明所述的试剂盒通过在染色体间相似序列的两端完全相同的DNA序列部位设计一对共同的扩增引物，避免了不同引物扩增不同序列产生的相互干扰或其它条件的干扰，从而保证了扩增效率的一致性；并选择在具有碱基差异的DNA序列部位设计Taqman探针，以便能通过重复片段的相对实时荧光PCR的2-△△CT值精确检测两个序列的相对扩增量；通过选择13号18号染色体与其它染色体间的相似序列，从而实现了4色双重相对荧光定量PCR，且两套检测系统可在同一管中同时进行检测，无相互干扰的情况发生，能同时检测13号和18号染色体数目的异常。
上述技术方案中，所述13号染色体特异重复序列chr13与5号染色体特异重复序列chr5为两个相似序列，其中，13号染色体特异重复序列chr13的碱基序列如SEQIDNO：9所示，5号染色体特异重复序列chr5的碱基序列如SEQIDNO：10所示。所述用于特异性检测13号染色体特异重复序列chr13的Taqman探针chr13-Probe的5’端标记CY5，3’端标记BHQ2；所述用于特异性检测5号染色体特异重复序列chr5的Taqman探针chr5-Probe的5’端标记FAM，3’端标记BHQ1。所述的Taqman探针chr13-Probe和Taqman探针chr5-Probe可以分别检测13号染色体上的特异重复序列chr13和5号染色体上的特异重复序列chr5，再通过Taqman探针chr13-Probe和Taqman探针chr5-Probe的相对定量指标2-△△CT13-5值判断13号染色体的数目。当2-[△(CT13-CT5)待测样本-△(CT13-CT5)正常对照 样本]＝2-△△CT13-5的理论值为1，实际值为0.8～1.2时，表示所检测标本为13号染色体正常标本；当2-△△CT13-5的理论值为1.5，实际值为1.3～1.7时，表示所检测标本为13-三体核型标本。
上述技术方案中，所述18号染色体特异重复序列chr18与9号染色体特异重复序列chr9为两个相似序列，其中，18号染色体特异重复序列chr18的碱基序列如SEQIDNO：11所示，9号染色体特异重复序列chr9的碱基序列如SEQIDNO：12所示。所述用于特异性检测18号染色体特异重复序列chr18的Taqman探针chr18-Probe5’端标记ROX，3’端标记BHQ2；用于特异性检测9号染色体特异重复序列chr9的Taqman探针chr9-Probe的5’端标记HEX，3’端标记BHQ1。所述的Taqman探针chr18-Probe和Taqman探针chr9-Probe可以分别检测18号染色体上的特异重复序列chr18和9号染色体上的特异重复序列chr9，再通过Taqman探针chr18-Probe和Taqman探针chr9-Probe的相对定量指标2-△△CT18-9值判断18号染色体的数目。当2-[△(CT18-CT9)待测样本-△(CT18-CT9)正常对照样本]＝2-△ △CT18-9的理论值为1，实际值为0.8～1.2时，表示所检测标本为18号染色体正常标本；当2-△△CT18-9的理论值为1.5，实际值为1.3～1.7时，表示所检测标本为18-三体核型标本。
本发明所述的荧光探针中，FAM指羧基荧光素，HEX指六氯-6-甲基荧光素，ROX指羧基-X-罗丹明，CY5是指花青染料分子5，BHQ1是指荧光淬灭基团。
本发明所述的试剂盒还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如阳性对照模板、阴性对照模板、缓冲液、酶液、dNTP、Mg2+等。
与现有技术相比，本发明所述试剂盒能通过13号染色体上的特异重复序列和5号染色体上的特异重复序列的相对定量2-△△CT13-5值；18号染色体上的异重复序列和9号染色体上的特异重复序列的相对定量2-△△CT18-9值的分布区间判定检测标本是否为正常标本、13-三体或18-三体核型标本，具有灵敏度高、特异性强和快速简便等优点。
附图说明
图1为13号染色体上的特异重复序列和5号染色体上的特异重复序列在染色体上的位置，其中，(a)为13号染色体上的特异重复序列chr13在13号染色体上的位置，(b)为5号染色体上的特异重复序列chr5在5号染色体上的位置；
图2为图1中13号染色体上的特异重复序列和5号染色体上的特异重复序列，以及根据序列设计的公共引物和各自的Taqman探针；
图3为18号染色体上的特异重复序列和9号染色体上的特异重复序列在染色体上的位置，其中，(a)为18号染色体上的特异重复序列chr18在18号染色体上的位置，(b)为9号染色体上的特异重复序列chr9在9号染色体上的位置；
图4为图3中18号染色体上的特异重复序列和9号染色体上的特异重复序列，以及根据序列设计的公共引物和各自的Taqman探针。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：采用本发明所述试剂盒对正常标本、待测13-三体标本和待测18-三体标本进行检测
1、试剂盒的组成：
1.1目标序列的选择以及引物和探针的设计
1)第一个相对定量检测位点：选择13号染色体上的特异重复序列chr13与5号染色体上特异重复序列chr5(chr13和chr5为两个相似序列)为相对实时荧光定量PCR扩增和检测序列，如图1所示，其中：
所述的13号染色体上的特异重复序列chr13的碱基序列为：5’-ctgccataggttgacatgaccgaattagggcccatcatgacgttctggcccagaacccggctgttgggctgggctaccccaggatcaactggtgtcataatgtcattatggggaggagag-3’(SEQIDNO：9)；
所述的5号染色体染色体上的特异重复序列chr5的碱基序列为：5’-ctgccataggttgacatggctgaattaaggcccatcatggtattctggcccagaaaccgactgttggattgggctactccaggatcagctggtgtcataatgtcattatggggaggagag-3’(SEQIDNO：10)。
在13号染色体的特异重复序列chr13与5号染色体的特异重复序列chr5的两侧完全相同的碱基序列位点处设计一对公用引物，如图2所示，该引物对可同时扩增13号染色体特异重复序列chr13与5号染色体特异重复序列chr5，该引物对中：
上游引物(以下用chr13-5-F代替)为：5’-ctgccataggttgacatg-3’(SEQIDNO：1)；
下游引物(以下用chr13-5-R代替)为：5’-ctctcctccccataatga-3’(SEQIDNO：2)。
在13号染色体的特异重复序列chr13与5号染色体的特异重复序列chr5的中间具有碱基差异的序列位点处设计用于特异性检测13号染色体特异重复序列chr13的Taqman探针chr13-Probe以及特异性检测5号染色体特异重复序列chr5的Taqman探针chr5-Probe，如图2所示，其中：
Taqman探针chr13-Probe的碱基序列为：5’-CY5-gggctgggctaccccaggatcaa-BHQ2-3’(SEQIDNO：3)；
Taqman探针chr5-Probe的碱基序列为：5’-FAM-ggattgggctactccaggatcag-BHQ1-3’(SEQIDNO：4)。
2)第二个相对定量检测位点：选择18号染色体上的特异重复序列chr18与9号染色体上特异重复序列chr9(chr18和chr9为两个相似序列)为相对实时荧光定量PCR扩增和检测序列，如图3所示，其中：
所述的18号染色体上的特异重复序列chr18的碱基序列为：5’-gcttgtggaagtgagaacaactctctcaacctgtgctataaagcactttctaagactttgctaacttttaagtttgatacagtcaaaagtgttctggaca-3’(SEQIDNO：11)；
所述的9号染色体上特异重复序列chr9的碱基序列为：5’-gcttgtggaagtgagaataactctctctacctgtgctataaaggactttctaagaccttgctaacttttaagtttgatacagtcaaaagtgttctggaca-3’(SEQIDNO：12)。
在18号染色体的特异重复序列chr18与9号染色体的特异重复序列chr9的两侧完全相同的碱基序列位点处设计一对公用引物，如图4所示，该引物对可同时扩增18号染色体特异重复序列chr18与9号染色体特异重复序列chr9，该引物对中：
上游引物(以下用chr18-9-F代替)为：5’-gcttgtggaagtgagaa-3’(SEQIDNO：5)；
下游引物(以下用chr18-9-R代替)为：5’-tgtccagaacacttttgac-3’(SEQIDNO：6)。
在18号染色体的特异重复序列chr18与9号染色体的特异重复序列chr9的中间具有碱基差异的序列位点处设计用于特异性检测18号染色体特异重复序列chr18的Taqman探针chr18-Probe以及特异性检测9号染色体特异重复序列chr9的Taqman探针chr9-Probe，如图4所示，其中：
Taqman探针chr18-Probe的碱基序列为：5’-ROX-tctctcaacctgtgctataaagcact-BHQ2-3’(SEQIDNO：7)；
Taqman探针chr9-Probe的碱基序列为：5’-HEX-tctctctacctgtgctataaaggact-BHQ1-3’(SEQIDNO：8)。
1.2其它组成成分：
Hotstar-Taq酶，缓冲液，dATP、dTTP、dCTP和dGTP以及Mg2+均购自北京康为世纪生物科技有限公司。
2、PCR反应体系的配制：
按下述表1配制PCR反应体系：
表1：(mM表示mmol/L，μM表示μmol/L)
PCR反应体系为50uL。
3、样本的来源及处理
样本来源于经传统的染色体核型分析方法确定核型的DNA样本，DNA样本采用实验室常规DNA提取方法进行提取，以双蒸水稀释至20ng/μL，并于-20℃保存备用。
4、PCR扩增程序：
PCR反应所用仪器为CFX96实时荧光定量PCR仪。PCR反应程序为：95℃预变性10min；95℃15sec，60℃1min，40个循环，于60℃退火步骤末采集荧光信号。
将正常标本、待测18-三体标本和待测18-三体标本，根据上述反应体系和反应程序，于荧光定量PCR仪上进行扩增检测，分别记录CTFAM值、CTCY5值、CTROX值和CTHEX值。
5、结果检测与分析：
正常标本的13号染色体与5号染色体的2-△△CT13-5值在1左右，而13-三体标本的13号染色体与5号染色体的2-△△CT13-5值在1.5左右；通过比较13号染色体与5号染色体正常标本与13-三体标本的2-△△CT13-5值，检测值相差0.5，表示其拷贝数相差1个拷贝，从而可判断该标本是正常或三体样本。
正常标本的18号染色体与9号染色体的2-△△CT18-9值在1左右，而13-三体标本的18号染色体与9号染色体的2-△△CT18-9值在1.5左右；通过比较18号染色体与9号染色体正常标本与18-三体标本的2-△△CT13-5值，检测值相差0.5，表示其拷贝数相差1个拷贝，从而可判断该标本是正常或三体样本。
实验结果显示，两个独立的检测系统均能分别有效的检测出待测13-三体标本和18-三体标本，与传统的染色体核型分析判断的结果一致，因此，本发明所述试剂盒能用于临床标本的检测。
实施例2：用实施例1所述试剂盒、方法、步骤等对临床标本进行检测
采用试剂盒对51例正常标本、3例13-三体标本和6例18-三体标本进行测试，所有样本均来源自经传统的染色体核型分析方法确定核型的DNA样本。
通过13号染色体与5号染色体的相对定量2-△△CT13-5值的不同分布区间，可判断出该标本是正常标本或是13-三体标本；通过18号染色体与9号染色体的相对定量2-△△CT18-9值的不同分布区间，可判断出该标本是正常标本或是18-三体标本，实时荧光定量检测△CT值及其范围如下：
正常标本的13号染色体与5号染色体的2-△△CT13-5值范围为0.8～1.0；13-三体标本的13号染色体与5号染色体的2-△△CT13-5值均为1.5，正常标本和13-三体标本两者之间的△CT值无交叉重叠，通过2-△△CT13-5值在区间范围的分布来判断待测标本是正常标本或13-三体患者标本。
正常标本的18号染色体与9号染色体的2-△△CT18-9值范围为0.9～1.1；18-三体标本的18号染色体与9号染色体的2-△△CT18-9值范围为1.4～1.6，正常标本和18-三体标本两者之间的△CT值无交叉重叠，通过2-△△CT18-9值在区间范围的分布来判断待测标本是正常标本或18-三体患者标本。
检测的临床正常核型标本(染色体核型结果表示为46,NN，46表示正常的染色体数目；NN表示正常的性染色体)、13-三体核型标本(染色体核型结果表示为47,NN,+13，47表示染色体的数目，NN表示正常的性染色体；+13表示多了一条13号染色体)和18-三体核型标本(染色体核型结果表示为47,NN,+18，47表示染色体的数目，NN表示正常的性染色体；+18表示多了一条18号染色体)的13号染色体与5号染色体的相对定量2-△△CT13-5值，以及18号染色体与9号染色体的相对定量2-△△CT18-9值的具体结果见表2。
表2:正常核型DNA、13-三体核型标本和18-三体核型标本DNA的多重实时荧光定量的ΔCT值结果及分析
实验结果表明，通过单管四色双重相对定量能有效、准确的检测出13号和18号染色体的数目，检测结果与传统的染色体核型分析方法一致，准确率为100％。本发明试剂盒可在同一反应体系和反应条件下对13号和18号染色体数目同时进行检测，结果可读性好，分析、检测过程简单、高效。

Claims (7)

1.一种单管四色双重相对荧光定量PCR技术快速检测人13号和18号染色体数目的试剂盒，包括扩增检测试剂，其特征在于：所述的扩增检测试剂包括：
(1)同时扩增13号染色体特异重复序列chr13与5号染色体特异重复序列chr5的引物对，其碱基序列分别如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；
(2)特异性检测13号染色体特异重复序列chr13的Taqman探针chr13-Probe，其碱基序列如SEQIDNO：3所示；
(3)特异性检测5号染色体特异重复序列chr5的Taqman探针chr5-Probe，其碱基序列如SEQIDNO：4所示；
(4)同时扩增18号染色体特异重复序列chr18与9号染色体特异重复序列chr9的引物对，其碱基序列分别如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示；
(5)特异性检测18号染色体特异重复序列chr18的Taqman探针chr18-Probe，其碱基序列如SEQIDNO：7所示；
(6)特异性检测9号染色体特异重复序列chr9的Taqman探针chr9-Probe，其碱基序列如SEQIDNO：8所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述13号染色体特异重复序列chr13与5号染色体特异重复序列chr5为两个相似序列，其中，13号染色体特异重复序列chr13的碱基序列如SEQIDNO：9所示，5号染色体特异重复序列chr5的碱基序列如SEQIDNO：10所示。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述Taqman探针chr13-Probe的5’端标记CY5，3’端标记BHQ2。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述Taqman探针chr5-Probe的5’端标记FAM，3’端标记BHQ1。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述18号染色体特异重复序列chr18与9号染色体特异重复序列chr9为两个相似序列，其中，18号染色体特异重复序列chr18的碱基序列如SEQIDNO：11所示，9号染色体特异重复序列chr9的碱基序列如SEQIDNO：12所示。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述Taqman探针chr18-Probe的5’端标记ROX，3’端标记BHQ2。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述Taqman探针chr9-Probe的5’端标记HEX，3’端标记BHQ1。
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