CN105039318A

CN105039318A - 用于筛查脊髓性肌萎缩症致病基因携带者的试剂盒及应用

Info

Publication number: CN105039318A
Application number: CN201510362673.6A
Authority: CN
Inventors: 周德富; 陈瑛
Original assignee: Suzhou Vocational University
Current assignee: Suzhou Vocational University
Priority date: 2015-06-26
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2015-11-11

Abstract

本发明公开了一种用于筛查脊髓性肌萎缩症(SMA)致病基因携带者的试剂盒及应用，属于基因检测领域。本发明采用基于Taqman探针的荧光定量PCR法，定量检测脊髓性肌萎缩症的主要致病基因SMN1基因的exon7的拷贝数，从而进行脊髓性肌萎缩症的致病基因携带者和非携带者的区分。本发明能够快速、方便的应用于大规模人群的SMA致病基因携带者的筛查，尤其适用于产前、婚前及孕前筛查及患者的基因诊断，重复性好，结果准确。

Description

用于筛查脊髓性肌萎缩症致病基因携带者的试剂盒及应用

技术领域

本发明特别涉及一种可用于筛查脊髓性肌萎缩症的致病基因携带者的试剂盒及筛查方法，属于基因检测领域。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(SMA)，是一种神经肌肉疾病，属于常染色体隐性遗传病。每6000名新生儿中就会有1名患有此病。临床表现为进行性、对称性的肌肉萎缩及肌无力。目前为止SMA无特效治疗方法，预后主要与疾病的类型有关，Ⅰ型患者一般生存期在2岁以内，Ⅱ型患者生存期在5岁以内，而Ⅲ型患者可存活至成人，其病情进展较慢，最终均死于呼吸肌麻痹，或全身衰竭。

目前发现的与SMA相关的基因有2个，即神经元凋亡抑制蛋白基因(neuronalapoptosisinhibitoryprotein，NAIP)和运动神经元存活基因(survivalmotoneuron，SMN)。NAIP基因定位于5q13区，67％的SMA患者发生此基因突变，相比之下正常人群中突变率仅2％。SMN基因也定位于5q13区，约98％以上的SMA患者发生此基因突变。5q13区存在2个SMN等位基因：SMN1和SMN2，只有SMN1基因的纯合缺失才会导致SMA，而SMN2基因的纯合缺失则出现在5％的正常人群中，因此作为基于人群范围的SMA致病基因筛查主要针对SMN1基因进行检测即可，也无需对SMN2基因拷贝数进行检测。SMN1基因的缺失突变，可引起脊髓前角运动神经元和脑干运动神经核变性，最终导致肌无力、肌萎缩。如此高的携带率和发病率，而目前国内还没有针对此疾病的携带者的临床筛查。

人群中SMA致病基因的携带者为1/40～1/50。携带者本人不发病，但是可以传给下一代，其配偶如果也是基因携带者，则生育患儿的几率为1/4。通过对SMN1基因的拷贝数进行定量检测，可筛查出95％以上的携带者。如果孕妇为携带者，则需对丈夫进行该基因的检测，如夫妻双方均为携带者，则后代患病概率为1/4，则需在妊娠时进行产前诊断。所以，通过检测SMA携带者并对其进行婚姻及生育指导，配合产前诊断，就可以从第一胎起防止重型患儿出生，这不仅降低了本病的发病率，而且防止了不良基因在群体中播散。

现有技术中所采用的SMA基因诊断方法主要有聚合酶链反应一限制性片段长度多态性分析技术、等位基因特异性扩增、多重连接探针依赖性扩增技术(MLPA)等，但限制性片段长度多态性分析技术、等位基因特异性扩增这些技术仅能定性的检测患者是否存在SMN1基因纯合缺失，不能区分SMN1致病基因携带者。而MLPA虽能够进行携带者检测，其技术成本高，仪器要求高，操作复杂，耗时长，不适合大规模的临床筛查。

虽然诸如CN103789440A、CN103614477A、CN104480206A等专利还提出了利用荧光PCR等技术检测脊髓性肌萎缩症相关基因突变的方案，但这些技术方案普遍存在准确性低，可靠性差，成本高而不利于大规模人群筛查等缺陷。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种用于筛查脊髓性肌萎缩症致病基因携带者的试剂盒。

为实现前述发明目的，在本发明的一实施方案之中提供的一种用于人群范围筛查脊髓性肌萎缩症致病基因携带者的试剂盒包括：

以SMN1基因exon7为检测对象而设计的PCR扩增引物和第一Taqman探针，

以及，PCR反应试剂，包括聚合酶及缓冲溶液；

其中，所述PCR扩增引物具有：

SEQIDNo.1、SEQIDNo.2所示序列，

或者，相对于SEQIDNo.1、SEQIDNo.2的核酸序列有一个或多个碱基缺失、替代或插入且保留与SEQIDNo.1、SEQIDNo.2相同生物活性的核酸序列；

所述第一Taqman探针具有：

SEQIDNo.3所示序列；

或者，相对于SEQIDNo.3的核酸序列有一个或多个碱基缺失、替代或插入且保留与SEQIDNo.3相同生物活性的核酸序列。

进一步的，所述试剂盒还包括以ALB基因exon12为检测对象而设计的内参引物和第二Taqman探针，所述内参引物具有SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示序列，所述第二Taqman探针具有SEQIDNo.6所示序列。

需要说明的是，在本发明中，还可以选择其他表达水平趋于相对稳定的管家基因作为内对照基因，例如β-actin(β-肌动蛋白)、glyceraldehyde-3-phosphate(GAPDH，磷酸甘油醛脱氢酶)和ribosomalRNA(rRNA，核糖体核糖核酸)。

进一步的，所述第一Taqman探针的一端连接有荧光基团，另一端连接有淬灭基团。

进一步的，所述第二Taqman探针的一端连接有荧光基团，另一端连接有淬灭基团。

其中，所述荧光基团包括FAM、TET或VIC等，但不限于此。

其中，所述淬灭基团包括MGBNFQ等，但不限于此。

例如，在一些实施例中，所述第一Taqman探针的序列可以为：

5’-VIC-CAGGGTTTCAGACAAA--MGBNFQ-3’

或者，5’-FAM-CAGGGTTTCAGACAAA-MGBNFQ-3’

或者，5’-TET-CAGGGTTTCAGACAAA-MGBNFQ-3’。

进一步的，所述PCR反应试剂包括TaqMan通用PCR扩增预混试剂。

本发明的另一重要目的在于提供一种采用前述任一种试剂盒筛查脊髓性肌萎缩症基因携带者的PCR扩增方法。

在一实施例中，该PCR扩增方法可以包括：

将受检样本(即待检测的基因样本)与所述PCR扩增引物、第一Taqman探针、内参引物、第二Taqman探针、PCR反应试剂混合形成PCR反应体系，

进行PCR扩增反应，包括：

第一步变性反应，条件包括：温度为95℃-97℃，时间为5min-10min；

第二步PCR循环扩增反应，条件包括：退火和延伸温度为58-61℃，40个循环；

以及，检测SMN1基因exon7拷贝数，从而判别所述基因样本是否来源于脊髓性肌萎缩症基因携带者。

其中，PCR扩增反应的最佳反应条件包括：

第一步，50℃、2min，95℃、10min；

第二步：95℃、15s，60℃、1min，40个循环。

其中，每个样本可检测三复孔。

进一步的，当计算的相对定量值为1.7-2.3之间时，定义为拷贝数为2，为正常人(非脊髓性肌萎缩症基因携带者)；当相对定量值为0.7-1.3之间时，定义为拷贝数为1，为SMA致病基因携带者(脊髓性肌萎缩症基因携带者)；当相对定量值低于0.3时，定义为拷贝数为0，为SMA患者；当相对定量值为2.5-3.3之间时，定义为拷贝数为3时，为SMN1基因多拷贝正常人。

本发明针对SMN1基因exon7设计引物及探针，利用Taqman探针，检测脊髓性肌萎缩症的基因携带者的SMN1拷贝数的变化，通过分析数据，绘制标准曲线来相对定量SMN1exon7的拷贝数，从而区分SMA的携带者和非携带者。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：藉由本发明的试剂盒，能够快速、方便、相对定量遗传病SMA致病基因，且还具有高通量、重复性好、结果准确、可靠性好、成本低等优点，可以大规模的的用于临床筛查，例如产前、婚前检测。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案进行更具体的说明，但并不是对本发明技术范围的限定。通过本说明书的记载，本领域技术人员可以容易的对本发明进行修饰/改变，这些包含在本发明的技术范围内。

本发明的一个方面公开了一种用于筛查脊髓性肌萎缩症基因携带者的试剂盒，其包含PCR扩增引物和第一Taqman探针，其中所述PCR扩增引物包括

引物SMN1-Ex7-1：5’-AATGCTTTTTAACATCCATATAAAGCT-3’；

引物SMN1-Ex7-2:：5’-CCTTAATTTAAGGAATGTGAGCACC-3’；

第一Taqman探针(或称特异性探针M1)为：5’-VIC-CAGGGTTTCAGACAAA-MGBNFQ-3’。

本发明的内参引物为表达水平趋于相对稳定的管家基因作为内对照基因，例如β-actin(β-肌动蛋白)、glyceraldehyde-3-phosphate(GAPDH)(磷酸甘油醛脱氢酶)和ribosomalRNA(rRNA)(核糖体核糖核酸)，管家基因ALB基因exon12等。优选的，内参基因为ALB基因exon12，其引物和探针序列分别为:

内参引物ALB－1：5’-ATGCTGCACAGAATCCTTGGT-3’

内参引物ALB－2：5’-TCATCGACTTCCAGAGCTGAAA-3’，

第二Taqman探针M2为:

5’-FAM-AACAGGCGACCATGC-MGBNFQ-3’。

针对目的基因的引物和探针可以重新设计或者标记不同的荧光染料，序列可以有单个碱基的差异，序列末端可以标记不同荧光基团和荧光淬灭基团，例如，可优选FAM、VIC作为荧光标记基团，MGBNFQ作为淬灭基团。

在本发明的一些实施例之中，第一Taqman探针可以为：

5’-VIC-CAGGGTTTCAGACAAA-MGBNFQ-3’

第二Taqman探针可以为：

5’-FAM-AACAGGCGACCATGC-MGBNFQ-3’。

相应的，本发明的另一方面还提供了一种基于所述试剂盒的用于筛查脊髓性肌萎缩症基因携带者的PCR扩增方法，其主要是利用Taqman探针，检测脊髓性肌萎缩症的基因携带者的SMN1拷贝数的变化。

在一些实施例之中，该PCR扩增方法可以包括如下步骤：

(1)根据SMN1基因序列设计，合成引物和第一Taqman探针，

(2)DNA的提取；

(3)将引物、探针，DNA提取物和反应试剂配比组合，构成实时荧光定量PCR反应体系；

(4)绝对定量实验，将100ng正常对照样本的DNA按照4个比例稀释，即1:10，1:100，1:1000，1:10000，采用绝对定量方法，分别检测SMN1基因及ALB基因荧光定量PCR的扩增效率。调整上述引物、探针配比，当获得的SMN1基因及ALB基因扩增效率接近100％，扩增斜率平行度一致时，可以进行后续相对定量检测。同一批次的引物和探针稀释后分装小份保存，调整好配比后就无需每次都做绝对定量检测。每新合成引物或探针以及新稀释引物和探针操作后，都要进行绝对定量调整。

(5)可以用本实验的引物和探针用相对定量的方法检测SMN1基因的拷贝数。以正常对照DNA样本(SMN1和ALB基因均为2拷贝)为对照和内参照，将待测样本的扩增曲线Ct值与之比较，采用SDS分析软件得出样本SMN1基因的相对定量值，从而判断SMN1基因的拷贝数。

当计算的相对定量值为1.7-2.3之间时，定义为拷贝数为2，为正常人；当相对定量值为0.7-1.3之间时，定义为拷贝数为1时，为SMA致病基因携带者，当相对定量值低于0.3时，定义为拷贝数为0，为SMA患者；当相对定量值为2.5-3.3之间时，定义为拷贝数为3时，为SMN1基因为多拷贝的正常人。

实施例1筛查脊髓性肌萎缩症的基因携带者的引物和探针及其筛查方法

(1)根据SMN1exon7基因序列设计，合成引物和荧光探针，所有引物/探针组合由于美国应用生物系统公司合成。

表1Real-TimePCR所用引物及探针、内参引物及探针

本实施例中，用VIC作为第一Taqman探针(SMN1Taqman探针)的荧光基团，FAM作为第二Taqman探针(ALBTaqman探针)的荧光基团，MGBNFQ作为淬灭基团。其序列具体如下：

第一Taqman探针序列：5’-VIC-CAGGGTTTCAGACAAA-MGBNFQ-3’；

第二Taqman探针序列为：5’-FAM-AACAGGCGACCATGC-MGBNFQ-3’；

(2)核酸提取：使用QIAampbloodminikit(Qiagen公司)，具体操作参见该试剂盒说明书，从200μL孕妇外周血中提取gDNA，溶于100μLAE溶液中，测定OD260、OD280以及OD230的值后，直接进行检测或保存于-20℃集中检测。

(3)PCR扩增及检测

TaqMan荧光定量PCR反应体系为13μL，其中包括以下组成(见表2)、采用多重PCR扩增法，即样本和内对照基因在同一个反应孔中进行扩增。使用管家基因ALB作为内对照。每个样本使用三个重复反应孔进行扩增。反应使用invitrogenPCRSuperMix-UDGwithROX作为扩增预混试剂进行TaqManPCR扩增，程序为第一步：50℃、2min，95℃、10min；第二步：95℃、15s，60℃、1min，40个循环。每个样本检测三复孔，反应过程收集荧光信号。

表2TaqMan荧光定量PCR反应体系

反应成分	μL/样本
		2×invitrogen PCR SuperMix-UDG with ROX	6.5
ddH₂O	3.1
		SMN1引物(10μM)	0.8
SMN1TaqMan探针(10μM)	0.2
		ALB引物(10μM)	0.1
ALB TaqMan探针(1μM)	0.3
		DNA(5ng/μL)	2.0
合计	13.0

(4)数据分析用ABI7500SDS2.0分析软件分析定量数据

根据引物和探针用△△ct相对对定量的方法检测SMN1基因的拷贝数。以正常对照DNA样本(SMN1和ALB基因均为2拷贝)为对照和内参，将待测样本的扩增曲线Ct值与之比较，采用SDS分析软件得出样本SMA基因的相对定量值，从而判断SMN1基因的拷贝数。

当计算的相对定量值为1.7-2.3之间时，定义为拷贝数为2，为正常人；当相对定量值为0.7-1.3之间时，定义为拷贝数为1，为SMA致病基因携带者；当相对定量值低于0.3时，定义为拷贝数为0，为SMA患者；当相对定量值为2.5-3.3之间时，定义为拷贝数为3时，为SMN1基因多拷贝正常人。

利用本实施例试剂盒进行筛查的重复性好，结果准确。经过387例样本初步筛查，筛选出单拷贝15例，三拷贝6例，与MLPA携带者检测试剂盒验证结果完全一致，参与室间质评单位提供的20份用于盲测的DNA样本检测结果和该实验室诊断结果一致。

对于387份普通人群DNA样本，分别采用上述步骤(1)－(4)中筛选的方法以及传统的MLPA携带者检测试剂盒进行检测，检测结果如表3所示。

表3本发明TaqManPCR与MLPA技术互验对比表

可以看到，采用本发明的试剂盒及方法，其准确率为100％，灵敏度为100％，特异性100％，假阳性率0％。换言之，本发明的筛选方法与MLPA携带者检测试剂盒验证结果一致，能够完全的区分脊髓性肌萎缩症(SMA)致病基因携带者和非携带者，重复性好且结果准确。

以上，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但并不是对本发明技术范围的限定。通过本说明书的记载，本领域技术人员可以容易的对本发明进行修饰/改变，这些包含在本发明的技术范围内。

<110>苏州市职业大学、陈瑛

<120>用于筛查脊髓性肌萎缩症致病基因携带者的试剂盒及其应用

<130>1001-2015

<160>6

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

aatgctttttaacatccatataaagct27

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ccttaatttaaggaatgtgagcacc25

<210>3

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cagggtttcagacaaa16

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

atgctgcacagaatccttggt21

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tcatcgacttccagagctgaaa22

<210>6

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

aacaggcgaccatgc15

Claims

1.一种用于筛查脊髓性肌萎缩症致病基因携带者的试剂盒，其特征在于包括：

以及，PCR反应试剂，包括聚合酶及缓冲溶液；

其中，所述PCR扩增引物具有：

SEQIDNo.1、SEQIDNo.2所示序列，

或者，相对于SEQIDNo.1、SEQIDNo.2的核酸序列有一个碱基缺失、替代或插入且保留与SEQIDNo.1、SEQIDNo.2相同生物活性的核酸序列；

所述第一Taqman探针具有：

SEQIDNo.3所示序列；

或者，相对于SEQIDNo.3的核酸序列有一个碱基缺失、替代或插入且保留与SEQIDNo.3相同生物活性的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于还包括以ALB基因exon12为检测对象而设计的内参引物和第二Taqman探针，所述内参引物具有SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示序列，所述第二Taqman探针具有SEQIDNo.6所示序列。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述第一Taqman探针的至少一端还连接有荧光基团。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述第一Taqman探针一端连接有荧光基团，另一端连接有淬灭基团。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述第二Taqman探针的至少一端还连接有荧光基团。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述第二Taqman探针一端连接有荧光基团，另一端连接有淬灭基团。

7.根据权利要求4或6所述的试剂盒，其特征在于所述荧光基团包括FAM、TET或VIC，所述淬灭基团包括MGBNFQ。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的试剂盒，其特征在于所述PCR反应试剂包括TaqMan通用PCR扩增预混试剂。

9.一种采用权利要求1-8中任一项所述的试剂盒筛查脊髓性肌萎缩症致病基因携带者的PCR扩增方法，其特征在于包括：

将受检样本与所述SMN1基因exon7和内参ALB基因exon12的PCR扩增引物、第一Taqman探针、第二Taqman探针PCR反应试剂混合形成PCR反应体系，

进行PCR扩增反应，包括：

变性反应，条件包括：温度为95℃-97℃，时间为5min-10min；

PCR循环扩增反应，条件包括：退火和延伸温度为58℃-61℃，40个循环；

10.根据权利要求9所述的PCR扩增方法，其特征在于：当SMN1基因exon7拷贝数为2时，受检样本为非脊髓性肌萎缩症致病基因携带者，拷贝数为1时，受检样本为脊髓性肌萎缩症致病基因携带者，拷贝数为0时，为脊髓性肌萎缩症患者；拷贝数为3时，受检样本为非脊髓性肌萎缩症致病基因携带者。