CN114634981B - 肝癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用 - Google Patents

肝癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114634981B
CN114634981B CN202011488134.4A CN202011488134A CN114634981B CN 114634981 B CN114634981 B CN 114634981B CN 202011488134 A CN202011488134 A CN 202011488134A CN 114634981 B CN114634981 B CN 114634981B
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
seq
liver cancer
probe
methylation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011488134.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114634981A (zh
Inventor
邵琦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui Dajian Medical Technology Co ltd
GUANGZHOU TARGENE BIOTECH CO Ltd
Original Assignee
Anhui Dajian Medical Technology Co ltd
GUANGZHOU TARGENE BIOTECH CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui Dajian Medical Technology Co ltd, GUANGZHOU TARGENE BIOTECH CO Ltd filed Critical Anhui Dajian Medical Technology Co ltd
Priority to CN202011488134.4A priority Critical patent/CN114634981B/zh
Publication of CN114634981A publication Critical patent/CN114634981A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114634981B publication Critical patent/CN114634981B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Abstract

本发明提供肝癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用，通过采用亚硫酸氢盐修饰法对待测肝癌核酸样品进行亚硫酸氢盐转化，结合数字PCR技术，综合分析文献研究结果、TCGA甲基化芯片数据库以及转录组测序表达谱，通过多重数据过滤分析，筛选肝癌高甲基化候选基因，针对肝癌高甲基化候选基因上的多个甲基化检测位点设计特异性的基因甲基化检测引物和探针，覆盖10个以上甲基化CpG位点，通过多重PCR扩增技术扩增经亚硫酸氢盐修饰的待测DNA样品，根据PCR扩增结果来确定待测样品中目标基因的甲基化情况，通过多种途径提高试剂盒的灵敏度与特异性，实现肝癌的早期筛查与诊断。

Description

肝癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地涉及肝癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用。
背景技术
肝癌是我国一种常见的恶性肿瘤疾病之一，死亡率位居恶性肿瘤第二位。好发于中年男性，肝癌早期一般没有症状或者症状不典型，可能会有食欲减退、腹胀、呕吐等非特异性消化道症状，当患者感受到明显不适或临床症状非常明显的时候，病情大多进入中晚期，而晚期肝癌治疗并不理想，生存时间往往只有半年到一年半。因此建立肝癌预警和早期筛查的方法，对肝癌的防治非常重要，早发现、早诊断、早治疗、早手术是防控肝癌的有效手段。
目前肝癌的诊断技术有：1)甲胎蛋白检测：一般在原发性肝癌当中表现出升高的比较多，但肝炎病变或者其他的肿瘤也有可能导致升高，特异性不高；2)影像学技术：MRI检查、B超检查、CT检查，但对较小的肿瘤不够灵敏，无法进行明确诊断；3)肝穿刺活检：在超声或CT引导下的肝穿刺活检是目前确诊肝癌最可靠的方法，但该方法属于有创性检查，还存在一定的假阴性率，对需要长期跟踪观察的患者，会造成身体不适，且经济负担较重。因此有必要开发灵敏、特异的新型肝癌标识物和检测技术，提高肝癌早癌检出率、改善肝癌治疗效果、降低肝癌死亡率。
表观遗传学是指基因的核苷酸序列不发生改变而基因表达发生了可遗传的变化，是近年来肿瘤研究的热点领域，DNA的甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA调控等表观遗传学改变都被认为与肿瘤的发生有着密切关系，其中DNA的甲基化是最为常见的表观遗传学改变，其可调控细胞增殖、凋亡与分化，且水平与肿瘤的生物学特性密切相关。目前研究表明肝癌与其他多种癌症一样，是由多种致癌因素长期作用的结果，其病变过程是一个多基因变异累积的复杂过程，涉及多种癌基因和抑癌基因的异常甲基化，其中大多数异常甲基化为抑癌基因的高甲基化，高甲基化往往导致抑癌基因的转录沉默。DNA甲基化异常通常发生在癌症早期，并贯穿癌症的发生和发展过程，其甲基化状态一旦形成需要受到外界环境较长时间的持续刺激才会发生改变，因此DNA甲基化指标的检测可以作为癌症诊断、早期筛查以及预后的重要生物指标。
DNA甲基化的检测方法大致可分两类：全基因组甲基化分析和特异位点甲基化检测。全基因组甲基化分析检测成本较高，常作为一种高通量筛选发现目标基因的手段。特异位点甲基化检测方法有联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)、甲基化特异性PCR法(MSP)、甲基化荧光定量法(MethyLight)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法等，限制性内切酶分析法只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，甲基化特异性PCR法基于普通PCR及电泳分析操作繁琐且易造成样本污染，甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法对仪器要求较高，需要带高分辨率熔解(HRM)模块的荧光定量PCR仪，甲基化荧光定量法基于其较高的通量和敏感性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差，在DNA甲基化的检测中应用较为广泛，但基于荧光定量PCR的甲基化荧光定量法需要额外制备标准曲线才能对样本核酸定量，同时在检测低浓度的核酸样本时灵敏度不足，容易造成假阴性从而延误癌症的早诊早治时机，给DNA甲基化的检测带来了技术挑战。与荧光定量PCR相比，数字PCR具有更高的检测灵敏度和准确性，数字PCR方法通过将核酸样本稀释，遵循泊松分布规律，将其分配至微反应单元中，在微反应单元内高效灵敏地完成目标核酸片段的PCR扩增，获取荧光信号进行统计学分析，彻底摆脱对标准曲线的依赖而直接给出靶序列的拷贝数，提高了实验结果在批内和批间的稳定性，实现对起始样品的绝对定量，同时提高核酸检测方法的灵敏度，有效减少假阴性的出现。
因此，本发明通过筛选肝癌相关甲基化基因，建立基于数字PCR的肝癌基因甲基化检测方法，期望获取具有更高灵敏度、特异性和准确性的检测试剂，实现肝癌的早期筛查与诊断。
发明内容
本发明提供肝癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用，采用亚硫酸氢盐修饰法对待测肝癌核酸样品进行亚硫酸氢盐转化，结合数字PCR技术，综合分析文献研究结果、TCGA甲基化芯片数据库以及转录组测序表达谱，通过多重数据过滤分析，筛选肝癌高甲基化候选基因，针对肝癌高甲基化候选基因上的多个甲基化检测位点设计特异性的基因甲基化检测引物和探针，覆盖10个以上甲基化CpG位点，通过多重PCR扩增技术扩增经亚硫酸氢盐修饰的待测DNA样品，根据PCR扩增结果来确定待测样品中目标基因的甲基化情况，通过多种途径提高试剂盒的灵敏度与特异性，实现肝癌的早期筛查与诊断。
为达到上述目的，本发明第一方面提供肝癌基因甲基化检测位点，所述的基因甲基化检测位点包括SCN4B、HOXA10、BDH1中的一种或多种。
本发明第二方面提供肝癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，包括以下1)-3)所示的核酸序列组合中的一种或多种：
1)SCN4B甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合2或引物探针组合3，其中所述引物探针组合2包括如SEQ ID NO.4所示的上游引物、如SEQ ID NO.5所示的下游引物、如SEQ ID NO.6所示的荧光探针，所述引物探针组合3包括如SEQ ID NO.7所示的上游引物、如SEQ ID NO.8所示的下游引物、如SEQ ID NO.9所示的荧光探针；
2)HOXA10甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合4或引物探针组合6，其中所述引物探针组合4包括如SEQ ID NO.10所示的上游引物、如SEQ ID NO.11所示的下游引物、如SEQ ID NO.12所示的荧光探针，所述引物探针组合6包括如SEQ ID NO.16所示的上游引物、如SEQ ID NO.17所示的下游引物、如SEQ ID NO.18所示的荧光探针；
3)BDH1甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合8或引物探针组合9，其中所述引物探针组合8包括如SEQ ID NO.22所示的上游引物、如SEQ ID NO.23所示的下游引物、如SEQ ID NO.24所示的荧光探针，所述引物探针组合9包括如SEQ ID NO.25所示的上游引物、如SEQ ID NO.26所示的下游引物、如SEQ ID NO.27所示的的荧光探针。
在本发明一实施例中，所述的肝癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，还包括括检测内参基因GAPDH的PCR引物及探针，所述引物包括如SEQ ID NO.28所示的上游引物、如SEQ ID NO.29所示的下游引物，所述探针包括如SEQ ID NO.30所示的荧光探针。
在本发明一实施例中，所述荧光探针的5’端包含有荧光报告基团，包括FAM、HEX、NED、ROX、TET、JOE、TAMRA、CY3、CY5中的任意一种。
在本发明一实施例中，所述荧光探针的3’端包含有荧光淬灭基团，包括MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3中的任意一种。
在本发明一优选实施例中，所述荧光淬灭基团为MGB。
本发明第三方面提供肝癌基因甲基化检测试剂盒，所述试剂盒包括如本发明第二方面所述的PCR引物探针组合，还包括阳性质控品以及阴性质控品。
在本发明一实施例中，所述阳性质控品为肝癌DNA。
在本发明一实施例中，所述阴性质控品为正常人白细胞DNA。
在本发明一实施例中，所述肝癌基因甲基化检测试剂盒反应体系的终浓度组成包括：0.1-1μM PCR引物、0.1-1μM探针。
在本发明一优选实施例中，所述肝癌基因甲基化检测试剂盒反应体系的终浓度组成包括：0.1-0.5μM PCR引物、0.1-0.5μM探针。
在本发明一实施例中，所述肝癌基因甲基化检测试剂盒的数字PCR反应条件如下：
在本发明一实施例中，所述肝癌基因甲基化检测试剂盒的数字PCR反应条件如下：
本发明第四方面提供肝癌基因甲基化检测的检测方法，包括以下步骤：
1)分离待测生物样品中目标基因的核酸；
2)将步骤1)所得核酸经亚硫酸氢盐转化处理，得到亚硫酸氢盐转化的DNA(Bis-DNA)；
3)采用甲基化数字PCR技术检测步骤2)所得Bis-DNA的甲基化状态。
在本发明一实施例中，步骤1)所述生物样品包括外周血、新鲜病理组织、石蜡包埋组织中的一种。
在本发明一优选实施例中，步骤1)所述生物样品包括外周血。
本发明第五方面提供如本发明第一方面所述的肝癌基因甲基化检测位点、如本发明第二方面所述的肝癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合、如本发明第三方面所述的肝癌基因甲基化检测试剂盒或如本发明第四方面所述的肝癌基因甲基化检测的检测方法在制备检测肝癌试剂盒中的应用。
本发明有益效果如下：
1)可作为肝癌的早期筛查、进程监测、预后评估的重要指标：本发明提供的肝癌基因甲基化检测试剂盒以DNA甲基化异常作为检测对象，DNA甲基化异常通常发生在癌症早期，并贯穿癌症的发生和发展过程，其甲基化状态一旦形成需要受到外界环境较长时间的持续刺激才会发生改变，因此DNA甲基化指标的检测可以作为肝癌的早期筛查、进程监测、预后评估的重要生物指标；
2)无创检测：本发明提供的肝癌基因甲基化检测试剂盒可通过检测外周血中肝癌相关基因甲基化状态来辅助诊断肝癌，实现无创检测；
3)单管多重基因甲基化检测：建立单管多重基因甲基化检测位点联检，减少试剂消耗，降低耗材成本，同时减少实验人员的操作步骤，减少劳动成本；
4)准确性高：本发明提供的肝癌基因甲基化检测试剂盒通过多重数据分析筛选肝癌高甲基化候选基因，针对肝癌高甲基化候选基因上的多个甲基化检测位点设计特异性的基因甲基化检测引物和探针，覆盖10个以上甲基化CpG位点，采用多重PCR扩增技术扩增经亚硫酸氢盐修饰的待测DNA样品，通过组合不同基因的甲基化情况进行联合检测或者通过检测单一基因的多个不同甲基化检测区域，同时为进一步提高检测灵敏度，本发明针对性地对单一基因的其中一个甲基化检测区域设计了两条上游引物或两条下游引物，通过多种途径提高试剂盒的灵敏度与特异性，实现肝癌早期筛查与诊断的准确检测。
附图说明
图1为本发明实施例提供的肝癌基因甲基化检测方法的典型检测结果阳性图，其中图1A为目标基因检测结果图，图1B为内参基因检测结果图，图1C为目标基因与内参基因检测的二维结果图；
图2为本发明实施例提供的肝癌基因甲基化检测方法的典型检测结果阴性图，其中图2A为目标基因检测结果图，图2B为内参基因检测结果图，图2C为目标基因与内参基因检测的二维结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行详细描述，以使本领域技术人员能够容易地根据本说明书的公开内容实施本发明。以下所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实施。
本发明通过采用亚硫酸氢盐修饰法对待测肝癌核酸样品进行亚硫酸氢盐转化，结合数字PCR技术，综合分析文献研究结果、TCGA甲基化芯片数据库以及转录组测序表达谱，通过多重数据过滤分析，筛选肝癌高甲基化候选基因，并设计特异性的基因甲基化检测引物和探针，扩增经亚硫酸氢盐修饰的待测DNA样品，根据PCR扩增结果来确定待测样品中目标基因的甲基化情况，实现肝癌的早期筛查与诊断。
本发明提供的肝癌基因甲基化检测试剂盒的基因甲基化检测位点包括SCN4B、HOXA10、BDH1中的一种或多种。
本发明提供的肝癌基因甲基化检测试剂盒的PCR引物探针组合，包括以下1)-3)所示的核酸序列组合中的一种或多种：
1)SCN4B甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合2或引物探针组合3，其中所述引物探针组合2包括如SEQ ID NO.4所示的上游引物、如SEQ ID NO.5所示的下游引物、如SEQ ID NO.6所示的荧光探针，所述引物探针组合3包括如SEQ ID NO.7所示的上游引物、如SEQ ID NO.8所示的下游引物、如SEQ ID NO.9所示的荧光探针；
2)HOXA10甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合4或引物探针组合6，其中所述引物探针组合4包括如SEQ ID NO.10所示的上游引物、如SEQ ID NO.11所示的下游引物、如SEQ ID NO.12所示的荧光探针，所述引物探针组合6包括如SEQ ID NO.16所示的上游引物、如SEQ ID NO.17所示的下游引物、如SEQ ID NO.18所示的荧光探针；
3)BDH1甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合8或引物探针组合9，其中所述引物探针组合8包括如SEQ ID NO.22所示的上游引物、如SEQ ID NO.23所示的下游引物、如SEQ ID NO.24所示的荧光探针，所述引物探针组合9包括如SEQ ID NO.25所示的上游引物、如SEQ ID NO.26所示的下游引物、如SEQ ID NO.27所示的的荧光探针。
本发明提供的肝癌基因甲基化检测试剂盒的PCR引物探针组合，还包括检测内参基因GAPDH的PCR引物及探针，所述引物包括如SEQ ID NO.28所示的上游引物、如SEQ IDNO.29所示的下游引物，所述探针包括如SEQ ID NO.30所示的荧光探针。
优选地，所述荧光探针的5’端包含有荧光报告基团，包括FAM、HEX、NED、ROX、TET、JOE、TAMRA、CY3、CY5中的任意一种。
优选地，所述荧光探针的3’端包含有荧光淬灭基团，包括MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3中的任意一种。
进一步优选地，所述荧光淬灭基团为MGB。
本发明提供的肝癌基因甲基化检测试剂盒检测样品包括外周血、新鲜病理组织、石蜡包埋组织中的一种。
本发明提供的肝癌基因甲基化检测试剂盒检测结果判读包括：
数字PCR采用微滴PCR技术(dropletdigital，PCR)，通过将数字PCR混合液加入微滴发生器，生成10000-20000个微反应液滴后进行PCR扩增。PCR扩增反应后，根据荧光信号的类型判断则待测样品中是否含有发生甲基化的DNA目标分子，为确定发生甲基化的目标DNA分子的数量和含量，同时设置内参基因，依据公式：甲基化比例＝[甲基化拷贝数/甲基化拷贝数+内参基因拷贝数]×100％，经试验研究结果确定：目的基因甲基化比例≥5％，判读结果阳性；目的基因甲基化比例＜5％，判读为结果阴性。
为更清楚展示本发明的技术方案，下面将结合具体实施例进一步阐述本发明。
实施例1：样品DNA提取及亚硫酸氢盐转化
1、血清样本的处理及DNA的提取
1)样品收集：
血清样品收集操作如下：选取临床患者血清样本：取被检者静脉血，用无菌注射针头抽取2mL，收集于无菌收集管中，室温放置30min血标本可自发完全凝聚析出血清，或直接使用水平离心机，3000rpm离心5min，吸取血清转入1.5mL离心管中备用。
2)DNA提取：
通过使用安徽达健医学科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(通用型)提取血清DNA，具体步骤如下：
(a)取1.5mL离心管，依次加入200μL待检样本，20μL胰脂肪酶，漩涡震荡，充分混匀后室温放置5min；
(b)向离心管中加入20μL的蛋白酶K，360μL裂解液，漩涡震荡，充分混匀，短暂离心，70℃水浴10min；
(c)短暂离心，向离心管中加入200μL预冷的异丙醇，漩涡震荡，充分混匀，短暂离心以去除管盖内壁的液滴，-20℃静置5min；
(d)将步骤c的溶液和絮状沉淀全部加入到吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，13000rpm离心1min，倒掉废液，收集管重复利用；
(e)向吸附柱中加入600μL漂洗液I(预冷)，13000rpm离心1min，弃废液；
(f)向吸附柱中加入600μL漂洗液II(预冷)，13000rpm离心1min，弃废液；
(g)将吸附柱放入一支洁净的1.5mL离心管中，13000rpm离心3min，弃离心管及废液；
(h)将吸附柱放入一支洁净的1.5mL离心管中，打开管盖，晾干3min；
(i)向吸附柱中间位置悬空滴加100μL洗脱液(Elution Buffer)，室温放置3min，13000rpm离心2min，收集DNA到离心管中，-20℃保存。
2、亚硫酸氢盐转化：
通过使用安徽达健医学科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(离心柱型)对步骤所得基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化，具步骤如下：
(a)取45μL待测DNA样品于新的1.5mL离心管中并加入5μL转化缓冲液，置于金属浴37℃恒温孵育15min。
(b)孵育完成后，向每个样品中加入100μL预先制备的转化液，混匀并短暂离心，金属浴50℃避光孵育12～16小时
(c)样品置于冰上(0～4℃)孵育10min
(d)将吸附柱置于收集管中，向吸附柱中加入400μL结合液
(e)将步骤c中的样品加入吸附柱中(含有结合液)，盖紧管盖上下颠倒混匀数次，全速(14000rpm)离心30s，弃废液
(f)向吸附柱中加入100μL漂洗液，全速离心30s，弃废液
(g)向吸附柱中加入200μL脱磺液，室温(20℃～30℃)孵育20min，之后全速离心30s，弃废液
(h)向吸附柱中加入200μL漂洗液，全速离心30s，重复加入200μL漂洗液，全速离心30s，弃废液及收集管
(i)将吸附柱放入1.5mL无菌离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30μL洗脱液，洗脱转化DNA，全速离心1min，收集Bis-DNA，-20℃保存。
实施例2：肝癌高甲基化候选基因及特异性引物、探针筛选
1、肝癌高甲基化候选基因的筛选
综合分析文献研究结果、TCGA甲基化芯片数据库以及转录组测序表达谱，筛选具有显著差异的甲基化位点，通过多重数据过滤分析，最终筛选确定SCN4B、HOXA10、BDH1为肝癌高甲基化候选基因。
2、肝癌基因甲基化检测的引物探针组合筛选
1)特异性引物、探针筛选：
根据上述SCN4B、HOXA10、BDH1的核酸序列，在Methyl primer Express v1.0软件上进行甲基化引物和探针的设计，经申请人反复设计和推敲，筛选得到相关基因甲基化的PCR探针和引物，并将设计好的引物和探针送北京睿博兴科生物技术有限公司合成，具体序列见下表：
同时设置针对内参基因GAPDH的特异性引物及探针，具体序列如下：
名称 序列(5’—3’)
Methy-GAPDH-F AAGTTAGGTTAGTTTGGTAGGGAAGTT(SEQ ID NO.28)
Methy-GAPDH-R AACCCTAAACCACCTCCCC(SEQ ID NO.29)
Methy-GAPDH-P TTTGGGTTTTTTTGGGGGTAAGGAGATGT(SEQ ID NO.30)
其中上述探针序列的5’端修饰有荧光基团，选自FAM、HEX、NED、ROX、TET、JOE、TAMRA、CY3、CY5中的任一种，3’端标记有荧光淬灭基团，选自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3中的任一种。
实施例3：肝癌基因甲基化数字PCR扩增检测(以伯乐QX200微滴式数字PCR为例)
1、反应体系：2×数字PCR反应预混液10μL，10μM的GAPDH引物及探针各0.1μL，10μM上述引物探针组合中引物各0.5μL，探针各0.2μL，6μL Bis-DNA，补水至20μL。
2、微滴制备：将上述每个20μL的反应体系中加入已含有70μL微滴发生油的微滴发生卡上并置于微滴发生器上生成微滴，一般2分钟之内完成，将生成的微滴转移至96孔板中，之后用预热好的PX1热封仪对其进行封膜，封好膜后应该在30分钟之内进行PCR反应。
3、反应条件
4、微滴读取及结果分析
微滴读取：将反应完成的PCR96孔板放入微滴读取仪中，打开QuantaSoftTM软件，按照样本量及样本布局，建立样本模块信息，设置完成后运行。数据读取完成后，自动调节阈值用以对每个检测通道进行阳性和阴性微滴指定。样本调整划分阈值，甲基化数据收集和分析显示在QuantaSoftTM软件界面中。
结果分析：检测样本的总微滴数大于15,000判断该次反应有效。受检样本甲基化拷贝数和内参基因拷贝数之和≥100，则该样本检测结果有效，可以继续结果分析；如果小于100，则该样本检测无效，需要重新检测。样本的甲基化比例由下列公式计算：甲基化比例＝[甲基化拷贝数/甲基化拷贝数+内参基因拷贝数]×100％，经试验研究结果确定：目的基因甲基化比例≥5％，判读结果阳性；目的基因甲基化比例＜5％，判读为结果阴性。
实施例4：临床样品检测验证试剂盒效果
1、外周血血清样品检测
依据上述实施例1、2、3所述实验步骤对临床血清样品进行检测验证试剂盒效果，为验证肝癌基因甲基化检测的引物探针组合的检测效果，分别用上述实施例2中的引物探针组合对30例肝癌患者血清样品以及10例非肝癌血清样品进行检测，其中编号1-30为肝癌患者血清样品，31-40为非肝癌血清样品，在阴性质控品、阳性质控品符合试剂盒有效性判定的情况下，典型的甲基化检测结果扩增图如图1、图2所示，详细结果见下表，其中“+”代表检测阳性，“-”代表检测阴性：
根据上述结果，统计分析如下：
/>
从上述结果可得，本发明提供的肝癌基因甲基化检测试剂盒中单重引物探针组合的检测灵敏度在70-86.67％之间，特异性在80-100％之间。
为进一步提高试剂盒的性能，筛选上述引物探针组合2、引物探针组合3、引物探针组合4、引物探针组合6、引物探针组合8、引物探针组合9的单管检测结果进行组合，以期提高试剂盒的检测效果，统计分析结果如下：
结果表明，通过单基因单检测位点的单管检测再组合分析，试剂盒的检测灵敏度可提高至90.00-96.67％之间，同时其特异性没有明显下降，在90.00-100％之间，然而此检测方式需要消耗较多的试剂同时增加实验人员的操作，实验成本较高，而单管多重基因甲基化检测位点联检可在较大程度减少试剂消耗，降低耗材成本，同时减少实验人员的操作，减少劳动成本。因此本发明建立单管多重基因甲基化检测位点联检进一步筛选肝癌基因甲基化检测试剂盒的优选组合，以肝癌患者血清样品以及非肝癌血清样品的DNA样本为模板，测试单管多重基因甲基化检测位点联检的检测效果，结果如下：
其中引物探针组合2、4、9，引物探针组合2、6、9，引物探针组合3、6、8，引物探针组合3、6、9的检测灵敏度与特殊性均在90％以上，筛选上述组合进一步检测测试本发明提供的试剂盒的检测效果。
2、组织样品检测
通过用上述优选组合检测组织样品，检测其对组织样品的检测效果，结果如下：
结果本发明提供的肝癌基因甲基化检测试剂盒的检测灵敏度为93.33-100％，特异性为100％，表明本发明提供的试剂盒在检测肝癌组织样品基因甲基化时具备较高的检测灵敏度和检测特异性。
综上所述，本发明提供的肝癌基因甲基化检测试剂盒有着较高的检测灵敏度和检测特异性，具备成为肝癌诊断、早期筛查的理想选择，助力肝癌的早诊早治。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 广州达健生物科技有限公司
安徽达健医学科技有限公司
<120> 肝癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggtagaagg tggcggga 18
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acttacgcct cctcgataac gt 22
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtacgcgcg ttatgt 16
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtagtgggt aagttcgtat acgtttattc 30
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gactccctct cccaaaaccg 20
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tagcgttcgt tgcggat 17
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtttacgcg gcggttatc 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcaacgacga acgaaactac g 21
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttgcggttgg agcgtt 16
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttatcgtggg gcgtcga 17
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aacaataact actccgaact ccgaa 25
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttggagcgtc gcgtta 16
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gggttcggag ttcggagtag t 21
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tccttcctcc caatataaat ccaac 25
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgttcgtagc gatcgtagt 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gggttttgag ggcgttttc 19
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaatttccgc gcgacca 17
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agcggtttcg cgttta 16
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
taagaggagg ggttcgcgt 19
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acgtaaaacc gaaccaaacc g 21
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgtagttcgg gcgggat 17
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcggtttttt tcgtaggaga gc 22
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aacgcgaacc cctcctctta 20
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agagtttcgg cgagttt 17
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cggaaagggt tgtagtttcg 20
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cacttcaaaa aacgacgcc 19
<210> 27
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cgggttgagg tcg 13
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aagttaggtt agtttggtag ggaagtt 27
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aaccctaaac cacctcccc 19
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tttgggtttt tttgggggta aggagatgt 29

Claims (8)

1.肝癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，其特征在于，包括以下1)-3)所示的核酸序列组合：
1)SCN4B甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合2或引物探针组合3，其中所述引物探针组合2包括如SEQ ID NO.4所示的上游引物、如SEQ ID NO.5所示的下游引物、如SEQ ID NO.6所示的荧光探针，所述引物探针组合3包括如SEQ ID NO.7所示的上游引物、如SEQ ID NO.8所示的下游引物、如SEQ ID NO.9所示的荧光探针；
2)HOXA10甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合4或引物探针组合6，其中所述引物探针组合4包括如SEQ ID NO.10所示的上游引物、如SEQ ID NO.11所示的下游引物、如SEQ ID NO.12所示的荧光探针，所述引物探针组合6包括如SEQ ID NO.16所示的上游引物、如SEQ ID NO.17所示的下游引物、如SEQ ID NO.18所示的荧光探针；
3)BDH1甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合8或引物探针组合9，其中所述引物探针组合8包括如SEQ ID NO.22所示的上游引物、如SEQ ID NO.23所示的下游引物、如SEQ ID NO.24所示的荧光探针，所述引物探针组合9包括如SEQ ID NO.25所示的上游引物、如SEQ ID NO.26所示的下游引物、如SEQ ID NO.27所示的的荧光探针。
2.如权利要求1所述的用于肝癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，其特征在于，还包括检测内参基因GAPDH的PCR引物及探针，所述引物包括如SEQ ID NO.28所示的上游引物、如SEQ ID NO.29所示的下游引物，所述探针包括如SEQ ID NO.30所示的荧光探针。
3.如权利要求1或权利要求2所述的用于肝癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，其特征在于，所述荧光探针的5’端包含有荧光报告基团，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、NED、ROX、TET、JOE、TAMRA、CY3、CY5中的任意一种。
4.如权利要求1或权利要求2所述的用于肝癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，其特征在于，所述荧光探针的3’端包含有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3中的任意一种。
5.一种肝癌基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的PCR引物探针组合，还包括阳性质控品以及阴性质控品。
6.如权利要求5所述的肝癌基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述肝癌基因甲基化检测试剂盒反应体系的终浓度组成包括：0.1-1μM PCR引物、0.1-1μM探针。
7.肝癌基因甲基化检测的非疾病诊断治疗检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)分离待测生物样品中目标基因的核酸；
2)将步骤1)所得核酸经亚硫酸氢盐转化处理，得到亚硫酸氢盐转化的DNA，即Bis-DNA；
3)采用如权利要求1所述的PCR引物探针组合配合甲基化数字PCR技术检测步骤2)所得Bis-DNA的甲基化状态。
8.如权利要求1所述的肝癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合在制备检测肝癌试剂盒中的应用。
CN202011488134.4A 2020-12-16 2020-12-16 肝癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用 Active CN114634981B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011488134.4A CN114634981B (zh) 2020-12-16 2020-12-16 肝癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011488134.4A CN114634981B (zh) 2020-12-16 2020-12-16 肝癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114634981A CN114634981A (zh) 2022-06-17
CN114634981B true CN114634981B (zh) 2024-01-26

Family

ID=81945514

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011488134.4A Active CN114634981B (zh) 2020-12-16 2020-12-16 肝癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114634981B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999064627A2 (en) * 1998-06-06 1999-12-16 Genostic Pharma Limited Probes used for genetic profiling
CN108753979A (zh) * 2018-07-09 2018-11-06 安徽达健医学科技有限公司 一种用于肝癌早期筛查的试剂盒及其使用方法
CN109136335A (zh) * 2018-09-06 2019-01-04 中国人民解放军陆军军医大学 一种dna甲基化特异位点的电化学分析方法
CN109790198A (zh) * 2016-09-02 2019-05-21 梅约医学教育与研究基金会 检测肝细胞癌
CN110499364A (zh) * 2019-07-30 2019-11-26 北京凯昂医学诊断技术有限公司 一种用于检测扩展型遗传病全外显子的探针组及其试剂盒和应用
CN110904225A (zh) * 2019-11-19 2020-03-24 中国医学科学院肿瘤医院 用于肝癌检测的组合标志物及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140045915A1 (en) * 2010-08-31 2014-02-13 The General Hospital Corporation Cancer-related biological materials in microvesicles

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999064627A2 (en) * 1998-06-06 1999-12-16 Genostic Pharma Limited Probes used for genetic profiling
CN109790198A (zh) * 2016-09-02 2019-05-21 梅约医学教育与研究基金会 检测肝细胞癌
CN108753979A (zh) * 2018-07-09 2018-11-06 安徽达健医学科技有限公司 一种用于肝癌早期筛查的试剂盒及其使用方法
CN109136335A (zh) * 2018-09-06 2019-01-04 中国人民解放军陆军军医大学 一种dna甲基化特异位点的电化学分析方法
CN110499364A (zh) * 2019-07-30 2019-11-26 北京凯昂医学诊断技术有限公司 一种用于检测扩展型遗传病全外显子的探针组及其试剂盒和应用
CN110904225A (zh) * 2019-11-19 2020-03-24 中国医学科学院肿瘤医院 用于肝癌检测的组合标志物及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOXA10基因在骨发生和骨形成中作用的研究进展;王可;胡泽兵;王艺璇;张丽君;李高志;曹新生;石菲;张舒;;解放军医学院学报(04);385-387，397 *
microRNA-218通过靶向HOXA10抑制肝癌细胞的实验研究;肖钟迪 等;中国实验诊断学(第8期);1423-1426 *
The Emerging Role of Voltage-Gated Sodium Channels in Tumor Biology;Weijia Mao 等;Front. Oncol.;第9卷;Article 124 *
肝癌相关差异基因的生物信息学分析;彭莉;王天骄;;胃肠病学和肝病学杂志(04);399-403 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114634981A (zh) 2022-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111534600B (zh) 食管癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用
US20150361502A1 (en) Method for screening cancer
CN113265456B (zh) 一种检测宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化的引物和探针组合
CN113943799B (zh) 用于检测膀胱癌的组合物及其试剂盒和应用
CN111826446A (zh) 用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物、探针和试剂盒
CN112280867A (zh) 肝癌早期的预警方法、及预警用检测试剂盒、检测方法
CN114634981B (zh) 肝癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用
CN113215257B (zh) 一种用于检测乳腺癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法
CN114107514A (zh) 一种用于结直肠癌诊断的miRNA分子标志物及其试剂盒
CN113528657B (zh) 用于检测食管癌的组合物及其试剂盒和应用
CN113774129B (zh) 用于检测肝癌的组合物及其试剂盒与应用
US11542559B2 (en) Methylation-based biomarkers in breast cancer screening, diagnosis, or prognosis
CN114672552B (zh) 食管癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用
CN114561461B (zh) 用于检测宫颈癌的组合物及其试剂盒和应用
CN114561462B (zh) 宫颈癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用
CN114085905B (zh) 用于检测结直肠癌的组合物及其试剂盒与应用
CN111850129A (zh) 检测微卫星nr21位点稳定性的引物对、试剂盒及方法
CN114540489B (zh) 一种宫颈癌早期筛查检测试剂盒及其应用
CN114085904B (zh) 结直肠癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用
CN116064797B (zh) 一种子宫内膜癌基因甲基化水平检测试剂及其应用
CN117701720B (zh) 宫颈癌clip3基因甲基化的检测试剂及试剂盒
CN116064798B (zh) 一种子宫内膜癌基因甲基化检测试剂及其应用
WO2024031860A1 (zh) 一种用于结直肠癌诊断的多基因dna甲基化联合检测试剂盒及应用
CN116162703A (zh) 用于食管癌基因甲基化检测的试剂及其试剂盒与应用
CN115851941A (zh) 用于筛查食管癌的标志物、核酸产品、试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant