CN116064798B - 一种子宫内膜癌基因甲基化检测试剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种子宫内膜癌基因甲基化检测试剂及其应用，所述检测试剂包括能够特异性检测生物样本中SEQ ID NO:37和/或SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列的全长或其任意部分区域核苷酸序列中CpG二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂。本发明提供的子宫内膜癌基因甲基化检测试剂以DNA甲基化异常作为检测对象，基于数字PCR技术，可在微反应单元内高效灵敏地完成目标核酸片段的PCR扩增，获取荧光信号进行统计学分析，彻底摆脱对标准曲线的依赖而直接给出靶序列的拷贝数，提高实验结果在批内和批间的稳定性，实现对起始样品的绝对定量，同时提高核酸检测方法的灵敏度，有效减少假阴性的出现，适用于临床检测。

Description

一种子宫内膜癌基因甲基化检测试剂及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种子宫内膜癌基因甲基化检测试剂及其应用。
背景技术
子宫内膜癌是发生于子宫内膜的上皮性恶性肿瘤，属于女性生殖道三大常见恶性肿瘤之一。子宫内膜癌多见于围绝经期及绝经后妇女，平均年龄55岁左右，发病高峰年龄为55～60岁，但近年来其发病率呈现持续上升和年轻化趋势。子宫内膜癌治疗效果与临床分期密切相关，早期子宫内膜癌病患通常有较好的预后，据统计I期、II期病患的五年生存率可达70％以上，III期病患的五年生存率约为40-50％，而IV期病患的五年生存率仅为15-20％。为了提高子宫内膜癌患者的生存质量及改善患者的预后，尽早发现并进行干预治疗显得尤其重要。因子宫内膜癌的致病因素复杂且发病机制尚不明确，想要对其实现早诊早治绝非易事，临床上不少子宫内膜癌患者被发现时已是中晚期，错失了最佳治疗时机。
在子宫内膜癌早期，多数患者没有明显的相关阳性体征，而目前为止尚没有推荐的子宫内膜癌常规筛查方法，当患者表现出临床症状如阴道出血、阴道排液和下腹疼痛时，去医院在妇科医生指导下进行临床诊断时，可能已是中晚期。目前，针对子宫内膜癌的主要诊断手段主要有：1)影像学检查：最常用的无创检查方法为阴道超声检查，主要用于初步判断，腹盆腔磁共振(MRI)检查可用于鉴别黏膜下子宫肌瘤、子宫内膜息肉、子宫肉瘤、宫颈癌等，然而此类方法对子宫内膜癌早癌不够灵敏，无法进行明确诊断；2)子宫内膜活检：子宫内膜癌的诊断标准，通过刮取子宫内膜组织，将刮出物送检，进行可视化观察，发现早期肿瘤，明确病变的性质、部位、累及程度，该方法是一种有创操作，易造成身体不适；3)实验室诊断方法：目前最常用的临床检测标记物是糖链抗原CA125、人附睾蛋白4(HE4)，该方法灵敏度特异性均较低，无法有效地筛检病人。因此有必要研发一种无创的准确可靠的新型子宫内膜癌标识物和检测方法。
表观遗传学是基因核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达可遗传变化的一门遗传学分支学科。近年来DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA调控等表观遗传学改变都被认为与肿瘤的发生有着密切关系，已经成为了癌症研究领域的热点。其中DNA甲基化是最早被发现、也是研究最深入的表观遗传调控机制之一，其可调控细胞增殖、凋亡与分化，且水平与肿瘤的生物学特性密切相关。异常的DNA甲基化发生在肿瘤发生的早期并可能是组织和癌症类型特异性的，DNA甲基化模式在肿瘤组织和相同肿瘤类型中广泛存在，而体细胞突变异常仅限于肿瘤细胞的亚群/克隆，因此DNA甲基化被认为是极有价值的癌症生物标志物。
研究表明子宫内膜癌是由多种致癌因素长期作用的结果，其病变过程是一个多基因变异累积的复杂过程，涉及多种癌基因和抑癌基因的异常甲基化，其中大多数异常甲基化为抑癌基因的高甲基化，高甲基化往往导致抑癌基因的转录沉默。DNA甲基化异常通常贯穿癌症的发生和发展的整个过程，其甲基化状态一旦形成需要受到外界环境较长时间的持续刺激才会发生改变。因此DNA甲基化指标的检测可以作为癌症诊断、早期筛查以及预后的重要生物指标，有必要开发一种基于DNA甲基化指标的子宫内膜癌筛查方法。
DNA甲基化的主要检测方法主要有亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencingPCR，BSP)、高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting，HRM)以及甲基化特异性PCR(Methylation-specificPCR，MSP)等。BSP依靠测序引物进行PCR扩增，再通过测序实现对甲基化位点的检测，结果准确性较高，易于直观进行判读，但该检测方法灵敏度较低，操作相对更为繁琐，且检测成本高；HRM则是通过从样本中CG含量变化导致的溶解温度变化来实现对DNA甲基化与非甲基化情况进行区分，该检测方法对仪器要求较高，需要带高分辨率熔解(HRM)模块的荧光定量PCR仪，且灵敏度相对较低，结果分析也较复杂；MSP通过利用引物与目标模板的结合以进行PCR扩增来检测甲基化位点，对样本的要求相对较低，检测时长较短、成本较低，结果易于判读，但MSP需要额外制备标准曲线才能对样本核酸定量，同时在检测低浓度的核酸样本时灵敏度仍存不足，从而容易产生假阴性。数字PCR技术是继一代普通PCR、二代荧光定量PCR之后的第三代PCR技术，与荧光定量PCR相比，数字PCR具有更高的检测灵敏度和准确性。该技术遵循泊松分布规律，通过将待测核酸样本稀释并分配至微反应单元中，在微反应单元内高效灵敏地完成目标核酸片段的PCR扩增，获取荧光信号进行统计学分析，彻底摆脱对标准曲线的依赖，可以直接给出靶序列的拷贝数，提高了实验结果在批内和批间的稳定性，实现了对起始样品的绝对定量，同时提高核酸检测方法的灵敏度，有效减少假阴性的出现。
有鉴于此，本发明期望通过筛选子宫内膜癌相关甲基化基因，建立基于数字PCR的子宫内膜癌基因甲基化检测方法，获取具有更高灵敏度、特异性和准确性的检测试剂，实现子宫内膜癌的早期筛查与诊断。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种子宫内膜癌基因甲基化检测试剂。
本发明还提出一种具有上述子宫内膜癌基因甲基化检测试剂的试剂盒。
本发明还提出一种子宫内膜癌基因甲基化水平检测试剂或试剂盒的应用。
根据本发明的一个方面，提出了一种子宫内膜癌基因甲基化水平检测的试剂，包括能够特异性检测生物样本中以下(a)-(e)中至少一种目标核苷酸序列中CpG二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂：
(a)SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列的全长或其任意部分区域；
(b)与SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列互补序列的全长或其任意部分区域；
(c)SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列的全长或其任意部分区域；
(d)与SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列互补序列的全长或其任意部分区域；
(e)与(a)、(b)、(c)或(d)至少80％以上同一性的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中，所述互补序列是与SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列的每个碱基一一对应互补所形成的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中，所述(a)或(b)中的部分区域为SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列或其互补序列中包括CpG二核苷酸位点的区域。
在本发明的一些实施方式中，所述部分区域的核苷酸序列长度为小于203bp。
在本发明的一些实施方式中，所述部分区域的核苷酸序列长度为小于200bp、180bp、150bp……。
在本发明的一些实施方式中，所述部分区域的核苷酸序列中具有至少1个、2个、3个、4个、5个、8个、10个、15个、20个……CpG二核苷酸位点。
在本发明的一些实施方式中，所述(a)或(b)中的部分区域为如SEQ ID NO.39-41所示的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中，所述(c)或(d)中的部分区域为SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列或其互补序列中包括CpG二核苷酸位点的区域。
在本发明的一些实施方式中，所述部分区域的核苷酸序列长度为小于285bp。
在本发明的一些实施方式中，所述部分区域的核苷酸序列长度为小于250bp、200bp、180bp、150bp……。
在本发明的一些实施方式中，所述部分区域的核苷酸序列中具有至少1个、2个、3个、4个、5个、8个、10个、15个、20个……CpG二核苷酸位点。
在本发明的一些实施方式中，所述(c)或(d)中的部分区域为如SEQ ID NO.42-44所示的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂包括核酸分子。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子包括可PCR扩增所述(a)-(e)中至少一种所示核苷酸序列的引物对。
在本发明的一些实施方式中，所述引物对选自以下组中的至少一组：
(1)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示的核酸分子；
(2)SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的核酸分子；
(3)SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示的核酸分子；
(4)SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20所示的核酸分子；
(5)SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26所示的核酸分子；
(6)SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示的核酸分子。
在本发明的一些实施方式中，(1)～(6)所述的核酸分子为甲基化引物。
在本发明的一些实施方式中，所述引物对选自以下组中的至少一组：
(1)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核酸分子；
(2)SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的核酸分子；
(3)SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示的核酸分子；
(4)SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示的核酸分子；
(5)SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所示的核酸分子；
(6)SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35所示的核酸分子。
在本发明的一些实施方式中，序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQID NO:29、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35所示和核酸分子为非甲基化引物。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子包括可标记所述(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示核苷酸序列的探针。
在本发明的一些实施方式中，所述探针选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中，所述探针选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO.24、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中，所述SEQ ID NO:3所示的探针序列为与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示的核酸分子相匹配的荧光序列；所述SEQ ID NO:6所示的探针序列为与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示的核酸分子相匹配的序列；所述SEQ ID NO:9所示的探针序列为与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的核酸分子相匹配的序列；所述SEQ ID NO:12所示的探针序列为与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11所示的核酸分子相匹配的荧光序列；所述SEQID NO:15所示的序列为与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示的核酸分子相匹配的荧光序列；所述SEQ ID NO:18所示的探针序列为与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17所示的核酸分子相匹配的荧光序列；所述SEQ ID NO:21所示的探针序列为与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20所示的核酸分子相匹配的序列；所述SEQ ID NO:24所示的探针序列为与SEQ ID NO:22、SEQID NO:23所示的核酸分子相匹配的荧光序列；所述SEQ ID NO:27所示的序列为与SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26所示的核酸分子相匹配的荧光序列；所述SEQ ID NO:30所示的探针序列为与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29所示的核酸分子相匹配的荧光序列；所述SEQ ID NO:33所示的探针序列为与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示的核酸分子相匹配的荧光序列。
在本发明的一些实施方式中，所述引物对SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，探针SEQ ID NO:3、SEQ ID NO.6均为针对区域SEQ ID NO:39设计的序列。
在本发明的一些实施方式中，所述引物对SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，探针SEQ ID NO:9、SEQ ID NO.12均为针对区域SEQ ID NO:40设计的序列。
在本发明的一些实施方式中，所述引物对SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16和SEQ ID NO:17，探针SEQ ID NO:15、SEQ ID NO.18均为针对区域SEQ ID NO:41设计的序列。
在本发明的一些实施方式中，所述引物对SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22和SEQ ID NO:23，探针SEQ ID NO:21、SEQ ID NO.24均为针对区域SEQ ID NO:42设计的序列。
在本发明的一些实施方式中，所述引物对SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28和SEQ ID NO:29，探针SEQ ID NO:27、SEQ ID NO.30均为针对区域SEQ ID NO:43设计的序列。
在本发明的一些实施方式中，所述引物对SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:34和SEQ ID NO:35，探针SEQ ID NO:33、SEQ ID NO.36均为针对区域SEQ ID NO:44设计的序列。
在本发明的一些实施方式中，所述探针的5’端包含有荧光报告基团，包括FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、TAMRA、CY3、CY5中的任意一种。
在本发明的一些实施方式中，所述探针的3’端包含有3’基团，包括MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、MGB-NFQ中的任意一种。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂还包括能差异修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的反应试剂。
在本发明的一些实施方式中，这些试剂可以将未甲基化的胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶，而已经甲基化的胞嘧啶则保持不变。
在本发明的一些实施方式中，所述反应试剂为亚硫酸氢盐、重亚硫酸氢盐、肼盐、或酶。
在本发明的一些实施方式中，所述生物样本选自子宫内膜组织、子宫内膜脱落细胞、阴道分泌物、血液、血清或血浆。
在本发明的一些实施方式中，所述生物样本为来源于哺乳动物的离体生物样本。
在本发明的第二方面，提出了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。
在本发明的一些实施方式中，所述阳性对照品为人子宫内膜癌细胞株。
在本发明的一些实施方式中，所述阴性对照品正常阴道细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括微滴发生油和缓冲液。
在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液为数字PCR反应预混液。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括无核酸酶的水。
在本发明的第三方面提出了上述试剂或试剂盒的应用，所述应用为在制备子宫内膜癌诊断试剂中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述子宫内膜癌诊断试剂使用方法如下：
S1、将待测样品中目标基因的核酸中未甲基化的胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶，获得经修饰的待测样品；
S2、利用上述试剂或试剂盒对步骤S1经修饰的待测样品进行甲基化情况检测。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S2中的检测采用微滴数字PCR进行。
在本发明的一些实施方式中，所述子宫内膜癌基因甲基化情况检测的判断标准为：检测样本的总微滴数大于10,000判断该次反应有效。受检样本甲基化拷贝数和非甲基化拷贝数之和≥100，则该样本检测结果有效，可以继续结果分析；如果小于100，则该样本检测无效，需要重新检测。
在本发明的一些实施方式中，所述样本的甲基化比例由下列公式计算：甲基化比例＝[甲基化拷贝数/(甲基化拷贝数+非甲基化拷贝数)]×100％，目的基因甲基化比例≥3％，判读结果阳性；目的基因甲基化比例＜3％，判读为结果阴性。
在本发明的一些实施方式中，所述微滴数字PCR的扩增反应体系为：
在本发明的一些实施方式中，所述微滴数字PCR的扩增程序为：
92-97℃8-12min
92-97℃25-35s 40-50cycles
56-62℃0.5-1.5min 40-50cycles
95-99℃8-12min。
在本发明的一些实施方式中，所述子宫内膜癌基因为PTPRO基因和SHISA3基因。本发明方案的PTPRO基因和SHISA3基因均可以用于作为子宫内膜癌的早期检测的生物标志物。
根据本发明的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明提供的子宫内膜癌基因甲基化检测试剂以DNA甲基化异常作为检测对象，基于数字PCR技术进行检测，可在微反应单元内高效灵敏地完成目标核酸片段的PCR扩增，获取荧光信号进行统计学分析，彻底摆脱对标准曲线的依赖而直接给出靶序列的拷贝数，提高实验结果在批内和批间的稳定性，实现对起始样品的绝对定量，同时提高核酸检测方法的灵敏度，有效减少假阴性的出现，可以准确的检测子宫内膜癌，适用于临床检测。
附图说明
图1为本发明实施例提供的子宫内膜癌基因甲基化数字PCR检测的典型检测结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1一种子宫内膜癌基因甲基化水平检测试剂
通过对癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome Atlas，TCGA)(http://cancergenome.nih.gov/)获取与子宫内膜癌相关的甲基化芯片数据及其对应的转录组测序数据，筛选具有显著差异的甲基化位点，最终筛选出PTPRO、SHISA3作为子宫内膜癌的甲基化差异候选基因。根据上述PTPRO、SHISA3基因及其启动子区的核酸序列进行甲基化引物和探针的设计，发明人经过反复设计和比较，确定PTPRO的基因甲基化检测区域所在基因组位置为Chr12:15322341-15322543(GRCh38/hg38)，SHISA3的基因甲基化检测区域所在基因组位置为Chr4:42397129-42397413(GRCh38/hg38)。
PTPRO的基因甲基化检测区域Chr12:15322341-15322543(GRCh38/hg38)的原始序列如下(5’-3’)：
GGGTCGGCAGCCAGAGTGAGAGTGTCCCTGCTGCCAGAGGACTACGGCGGGCTGGGCGCGGGGTCCCCGCCTCTCGCTCACCACACAGACCCCGCGCCTCCTCTGGCAGCCGCGGTGGTGGCGGCGGCAGAGCCTCGCCCACTCCAATCCCCACCCTCTCCATCCTTAGTCATTAAAGAACAGCAGCGCCTGGCACGTTCTTG(SEQ ID NO:37)。
SHISA3的基因甲基化检测区域Chr4:42397129-42397413(GRCh38/hg38)的原始序列如下：
AATCCAGCGTCTCCACTCGCGCGCCCACGTGCGTGGATAAACGCGGGAATTCGGCAGCCCTCAACGTCACTCTGCAGAGATTTCCGGGCTGTGAGAGAGTTGGGGTGTGCGGCGGGGGAGGGGAGGGTCTGATATCTTCAGGTTGAGAGTCAAGTCCTGGGGGAGCGGCATGGGCGGGGGTGGCCGGGGGGAGGCGGAGGATGGAGCGCGAACCAGAAAGCGCAGAGGACCCTCGGCCCGCGCCGCACCCGCTGTGATTAGCTCCAGAGGCGCGATCCGGGAGGG(SEQ ID NO:38)。
1、检测区域的选择
由于同一个基因的甲基化状态和分布并不均匀，因此对于同一个基因来说，选择不同的区域设计的甲基化引物、探针检测体系对同一样本，同一肿瘤的诊断检测效能并不一样，甚至有时候选择的区域不合适造成对肿瘤完全没有诊断效果，发明人经过反复的研究和比较后，筛选得到PTPRO的基因甲基化检测区域Chr12:15322341-15322543和SHISA3的基因甲基化检测区域Chr4:42397129-42397413，再从PTPRO的基因甲基化检测区域Chr12:15322341-15322543筛选得到检测PTPRO基因甲基化最好的3个靶区域序列(区域1-3)，从SHISA3的基因甲基化检测区域Chr4:42397129-42397413，筛选得到检测SHISA3基因甲基化最好的3个靶区域序列(区域4-6)，具体原始序列如表1所示：
表1
2.引物探针序列的设计与选择
针对上述两个基因区域经重亚硫酸盐处理后的序列作为模板，分析不同检测区域的扩增产物长度、退火温度、特异性等一系列参数，设计筛选得到针对区域1的PTPRO基因引物探针组合1，设计筛选得到针对区域2的PTPRO基因引物探针组合2，设计筛选得到针对区域3的PTPRO基因引物探针组合3，设计筛选得到针对区域4的SHISA3基因引物探针组合1，设计筛选得到针对区域5的SHISA3基因引物探针组合2，设计筛选得到针对区域6的SHISA3基因引物探针组合3，序列如表2所示。所设计的引物探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中，“M”代表甲基化引物，“U”为非甲基化引物。
表2甲基化检测的引物、探针序列
其中，上述探针序列的两端标记有修饰基团，包括5’基团及3’基团，其中5’基团选自FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、TAMRA、CY3、CY5中的任一种，在本实施例中PTPRO基因选用FAM。3’基团选自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、MGB-NFQ中的任一种，在本实施例中选用BHQ-1。
针对表2中不同的引物探针组合，采用子宫内膜癌确诊患者以及健康人的子宫内膜脱落细胞DNA样本进行重亚硫酸氢盐处理后作为模板进行筛选测试，采用针对表1中不同区域设计得到的引物探针组合分别进行扩增。
反应体系：2×数字PCR反应预混液(伯乐，货号：1863023)10μL，10μM上述引物探针组合中(分别为甲基化引物或非甲基化引物)引物各0.5μL，(甲基化或非甲基化)探针各0.2μL，4μLBis-DNA(重亚硫酸氢盐处理后子宫内膜脱落细胞DNA样本)，补水至20μL。
微滴制备：将上述每个20μL的反应体系中加入已含有70μL微滴发生油(伯乐，货号：1863005)的微滴发生卡上并置于微滴发生器上生成微滴，一般2分钟之内完成，将生成的微滴转移至96孔板中，之后用预热好的PX1热封仪对其进行封膜，封好膜后应该在30分钟之内进行PCR反应，其中，PCR反应条件如表3所示。
表3
退火温度依据各引物组合的TM值在56-62℃选择。
微滴读取及信号分析：将反应完成的PCR 96孔板放入微滴读取仪中进行结果分析，按照样本量及样本布局，建立样本模块信息，设置完成后运行。数据读取完成后，调节阈值用以对每个检测通道进行阳性和阴性微滴指定。
检测结果判读如下：检测结果判读如下：检测样本的总微滴数大于10,000判断该次反应有效。受检样本甲基化拷贝数和非甲基化拷贝数之和≥100，则该样本检测结果有效，可以继续结果分析；如果小于100，则该样本检测无效，需要重新检测。样本的甲基化比例由下列公式计算：甲基化比例＝[甲基化拷贝数/(甲基化拷贝数+非甲基化拷贝数)]×100％，经试验研究结果确定：目的基因甲基化比例≥3％，判读结果阳性；目的基因甲基化比例＜3％，判读为结果阴性，子宫内膜癌基因甲基化数字PCR检测的典型检测结果图如图1所示。
表4
表5
结果如表4和表5所示，从表4中可以看出，无论PTPRO基因引物探针组合1、2、3检测同一正常人子宫内膜脱落细胞样本时，PTPRO基因甲基化比例均＜3％，检测结果均为阴性，而在检测同一子宫内膜癌病患的脱落细胞时，引物探针组合2检测得到甲基化拷贝数明显少于引物探针组合1、3，其检测得到的PTPRO基因甲基化比例仅为18.68％，明显低于引物探针组合1(32.58％)、引物探针组合3(28.69％)，因此将选用PTPRO基因引物探针组合1、3进行进一步后续试验。从表5可以看出，SHISA3基因引物探针组合1、2、3在检测同一正常人子宫内膜脱落细胞样本时，SHISA3基因甲基化比例均＜3％，检测结果均为阴性，而在检测同一子宫内膜癌病患的脱落细胞时，引物探针组合3检测得到甲基化拷贝数明显少于引物探针组合1、2，其检测得到的SHISA3基因甲基化比例仅为18.15％，明显低于引物探针组合1(26.35％)、引物探针组合2(24.92％)，因此将选用引物探针组合1、2进行进一步后续试验。
实施例2一种子宫内膜癌检测试剂盒
本实施例制备了一种用于子宫内膜癌相关基因甲基化检测的微滴数字PCR试剂盒，包括实施例1筛选得到的SHISA3基因引物探针组合1和/或SHISA3基因引物探针组合2、PTPRO基因引物探针组合1和/或PTPRO基因引物探针组合3、内参基因GAPDH引物探针组合、2×数字PCR反应预混液(伯乐，货号：1863023)、无酶无菌水、阳性对照(人子宫内膜癌细胞株)和阴性对照(正常人阴道细胞)。
实施例3子宫内膜癌的临床检测
本实施例检测了实施例2中制备得到的试剂盒对子宫内膜癌的检出率，将试剂盒根据引物分为SHISA3单基因组(SHISA3-1、SHISA3-2)、PTPRO单基因组(PTPRO-1、PTPRO-3)和SHISA3基因和PTPRO单基因混合检测组(PTPRO-1和SHISA3-1组、PTPRO-1和SHISA3-2组、PTPRO-3和SHISA3-1组、PTPRO-3和SHISA3-2组)。
1生物样本的获取
本发明中所有样本均为子宫内膜脱落细胞标本，其中子宫内膜癌患者标本70例，正常样本30例。
2样本提取
1)DNA提取：通过使用安徽达健医学科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(通用型)(货号：GE100)提取子宫内膜脱落细胞DNA，具体步骤如下：
a)取适量的细胞样本或组织样本，加入500μL裂解液，30μL蛋白酶K，充分混匀后70℃裂解40min。
b)短暂离心，加入200μL异丙醇，充分混匀，转移至吸附柱，12000rpm离心1min，弃废液。
d)加入600μL漂洗液I漂洗，12000rpm离心30s，弃废液。
e)加入600μL漂洗液II漂洗，12000rpm离心30s，弃废液。
f)再次加入600μL漂洗液II漂洗，12000rpm离心30s，弃废液，12000rpm离心3min。
g)开盖，通风橱内晾干2min。
h)向吸附柱中加入洗脱液50-100μL，室温静置3min，12000rpm离心2min。
i)重复步骤h)，收集DNA到离心管中，-20℃保存。
2)亚硫酸氢盐转化：通过使用安徽达健医学科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(离心柱型)(货号：ME100)对步骤所得基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化，具步骤如下：
(a)取45μL待测DNA样本(若提取的DNA样本浓度高于45ng/μL，用TE缓冲液稀释至45ng/μL，适当进行稀释，使DNA总投入量为2μg；低于45ng/μL样本则取45μL参与转化)于新的1.5mL离心管中并加入5μL转化缓冲液，置于金属浴37℃恒温孵育15min；
(b)孵育完成后，向每个样本中加入100μL预先制备的转化液，混匀并短暂离心，金属浴50℃避光孵育12-16小时；
(c)样本置于冰上(0-4℃)孵育10min；
(d)将吸附柱置于收集管中，向吸附柱中加入400μL结合液；
(e)将步骤c中的样本加入吸附柱中(含有结合液)，盖紧管盖上下颠倒混匀数次，全变(14000rpm)离心30s，弃废液；
(f)向吸附柱中加入100μL漂洗液，全变离心30s，弃废液；
(g)向吸附柱中加入200μL脱磺液，室温(20℃-30℃)孵育20min，之后全变离心30s，弃废液；
(h)向吸附柱中加入200μL漂洗液，全变离心30s，重复加入200μL漂洗液，全变离心30s，弃废液及收集管；
(i)将吸附柱放入1.5mL无菌离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30μL洗脱液，洗脱转化DNA，全变离心1min，收集Bis-DNA，-20℃保存。
3PCR扩增进一步筛选引物探针组合：
反应体系：2×数字PCR反应预混液10μL，10μM的GAPDH引物及探针各0.1μL，10μM上述引物探针组合中引物各0.5μL，探针各0.2μL，4μL Bis-DNA，补水至20μL。
微滴制备：将上述每个20μL的反应体系中加入已含有70μL微滴发生油的微滴发生卡上并置于微滴发生器上生成微滴，一般2分钟之内完成，将生成的微滴转移至96孔板中，之后用预热好的PX1热封仪对其进行封膜，封好膜后应该在30分钟之内进行PCR反应，反应条件同实施例1一致。
微滴读取及信号分析：将反应完成的PCR 96孔板放入微滴读取仪中，打开QuantaSoftTM软件，按照样本量及样本布局，建立样本模块信息，设置完成后运行。数据读取完成后，自动调节阈值用以对每个检测通道进行阳性和阴性微滴指定。样本调整划分阈值，甲基化数据收集和分析显示在QuantaSoftTM软件界面中。
检测结果判读如下：检测样本的总微滴数大于10,000判断该次反应有效。受检样本甲基化拷贝数和非甲基化拷贝数之和≥100，则该样本检测结果有效，可以继续结果分析；如果小于100，则该样本检测无效，需要重新检测。样本的甲基化比例由下列公式计算：甲基化比例＝[甲基化拷贝数/(甲基化拷贝数+非甲基化拷贝数)]×100％，经试验研究结果确定：目的基因甲基化比例≥3％，判读结果阳性；目的基因甲基化比例＜3％，判读为结果阴性，子宫内膜癌基因甲基化数字PCR检测的典型检测结果图如图1所示。
(1)单基因单重核酸检测结果
表6单基因单重核酸检测结果
单基因单重核酸检测结果如表6所示，从表中可以看出，PTPRO基因引物探针组合1检测PTPRO基因甲基化在30例正常人样本中检出2例，在70例子宫内膜癌样本中检出64例，PTPRO基因引物探针组合3检测PTPRO基因甲基化在30例正常人样本中检出1例，在70例子宫内膜癌中检出65例；SHISA3基因引物探针组合1检测SHISA3基因甲基化在30例正常人样本中检出1例，在70例子宫内膜癌中检出66例，SHISA3基因引物探针组合2检测SHISA3基因甲基化在30例正常人样本中检出2例，在70例子宫内膜癌中检出65例，即PTPRO基因引物探针组合1、3和SHISA3基因引物探针组合1、2的检测灵敏度在91％-95％之间，检测特异性在93％-97％，具备良好的检测灵敏度与特异性，结果说明本发明所选甲基化标志物PTPRO基因和SHISA3均可为临床子宫内膜癌进行辅助诊断。
(2)双基因两个不同引物探针组合单重核酸检测结果叠加统计判断检测结果，当两个引物探针组合任一检测结果为阳性判断检测结果阳性。
表7
双基因两个不同引物探针组合单重核酸检测结果叠加统计判断检测结果如表7所示，从表中可以看出，PTPRO-1和SHISA3-1引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出3例，在70例子宫内膜癌中检出67例，PTPRO-1和SHISA3-2引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出2例，在70例子宫内膜癌中检出66例；PTPRO-3和SHISA3-1引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出2例，在70例子宫内膜癌中检出68例，PTPRO-3和SHISA3-2引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出2例，在70例子宫内膜癌中检出67例，即此条件下，本发明提供的引物探针组合的检测灵敏度在94％-98％之间，检测特异性在90％-94％，检测灵敏度高于单一引物探针组合单重核酸检测，但检测特异性有所下降。
(3)以双基因中两个不同引物探针组合单重核酸检测结果叠加统计判断检测结果，当两个引物探针组合检测结果均为阳性判断检测结果阳性
表8
结果如表8所示，从表中可以看出，PTPRO-1和SHISA3-1引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出0例，在70例子宫内膜癌中检出64例，PTPRO-1和SHISA3-2引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出2例，在70例子宫内膜癌中检出63例；PTPRO-3和SHISA3-1引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出0例，在70例子宫内膜癌中检出65例，PTPRO-3和SHISA3-2引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出1例，在70例子宫内膜癌中检出64例，说明此条件下，本发明提供的引物探针组合的检测灵敏度在90％-93％之间，检测特异性在93％-100％，检测灵敏度略低于单一引物探针组合单重核酸检测，但检测特异性得到了提升。表明此条件下本发明提供的引物探针组合在提高特异性的同时可能会导致灵敏度的下降。
(4)单基因两个不同引物探针组合单重核酸检测结果叠加统计判断检测结果，当两个引物探针组合任一检测结果为阳性判断检测结果阳性
表9
结果如表9所示，从表9中可以看出，PTPRO-1和PTPRO-3引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出3例，在70例子宫内膜癌中检出67例，SHISA3-1和SHISA3-2引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出2例，在70例子宫内膜癌中检出68例，即在此条件下，本发明提供的引物探针组合的检测灵敏度在95％-98％之间，检测特异性在90％-94％，检测灵敏度高于单一引物探针组合单重核酸检测，但检测特异性有所下降。表明此条件下本发明提供的引物探针组合在提高灵敏度的同时可能会导致特异性的下降。
(5)单基因两个不同引物探针组合单重核酸检测结果叠加统计判断检测结果，当两个引物探针组合检测结果均为阳性判断检测结果阳性
表10
结果如表10所示，从表10中可以看出，PTPRO-1和PTPRO-3引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出0例，在70例子宫内膜癌中检出63例，SHISA3-1和SHISA3-2引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出1例，在70例子宫内膜癌中检出64例，即在此条件下，本发明提供的引物探针组合的检测灵敏度在90％-92％之间，检测特异性在96％-100％，检测灵敏度略低于单一引物探针组合单重核酸检测，但检测特异性得到了提升。表明此条件下本发明提供的引物探针组合在提高特异性的同时可能会导致灵敏度的下降。
(6)双基因双重核酸检测结果，以任一基因核酸检测为阳性判断检测结果阳性
表11
检测结果如表11所示，从表中可以看出，PTPRO-1和SHISA3-1引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出2例，在70例子宫内膜癌中检68例，PTPRO-1和SHISA3-2引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出2例，在70例子宫内膜癌中检出67例；PTPRO-3和SHISA3-1引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出1例，在70例子宫内膜癌中检出68例，PTPRO-3和SHISA3-2引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出2例，在70例子宫内膜癌中检出66例，即在此条件下，本发明提供的引物探针组合的检测灵敏度在94％-98％之间，检测特异性在93％-97％，检测特异性与单一引物探针组合单重核酸检测相当，但具备了更高的检测灵敏度。表明此条件下本发明提供的引物探针组合在维持与单一引物探针组合单重核酸检测相当的特异性的同时有效地提升了检测灵敏度。
(7)以双基因核酸检测均为阳性判断检测结果阳性
表12
检测结果如表12所示，从表中可以看出，PTPRO-1和SHISA3-1引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出1例，在70例子宫内膜癌中检出63例，PTPRO-1和SHISA3-2引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出2例，在70例子宫内膜癌中检出62例；PTPRO-3和SHISA3-1引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出0例，在70例子宫内膜癌中检出64例，PTPRO-3和SHISA3-2引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出1例，在70例子宫内膜癌中检出63例，即在此条件下，本发明提供的引物探针组合的检测灵敏度在88％-92％之间，检测特异性在93％-100％，虽然其特异性得到了维持甚至略有提升，但其灵敏度要比单一引物探针组合单重核酸检测低。表明此条件下本发明提供的引物探针组合在提高特异性的同时可能会导致灵敏度的下降。。
(8)单管单基因双引物探针组合双重核酸检测结果：在单一测试管中针对单一基因的两组不同的引物探针组合双重核酸检测，当两个引物探针组合任一检测结果为阳性判断检测结果阳性。
表13
单基因双重引物探针核酸检测结果如表13所示，从表13中可以看出，PTPRO-1和PTPRO-3引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出1例，在70例子宫内膜癌中检出66例，SHISA3-1和SHISA3-2引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出2例，在70例子宫内膜癌中检出67例，即在此条件下，本发明提供的引物探针组合的检测灵敏度在94％-96％之间，检测特异性在93％-97％，检测特异性与单一引物探针组合单重核酸检测相当，但具备了更高的检测灵敏度。表明此条件下本发明提供的引物探针组合在维持与单一引物探针组合单重核酸检测相当的特异性的同时有效地提升了检测灵敏度。
(9)单管单基因双引物探针组合双重核酸检测结果：在单一测试管中针对单一基因的两组不同的引物探针组合双重核酸检测，当两个引物探针组合检测结果均为阳性判断检测结果阳性。
表14
结果如表14所示，从表14中可以看出，PTPRO-1和PTPRO-3引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出0例，在70例子宫内膜癌中检出63例，SHISA3-1和SHISA3-2引物探针组合检测目标基因甲基化在30例正常人样本中检出0例，在70例子宫内膜癌中检出64例，说明本申请方案的引物探针组合均可以有效的检测子宫内膜癌，结果表明，在此条件下，本发明提供的引物探针组合的检测灵敏度在90％-92％之间，检测特异性均为100％，检测灵敏度略低于单一引物探针组合单重核酸检测，但检测特异性得到了提升，达到100％。表明此条件下本发明提供的引物探针组合检测灵敏度虽然略有下降，但特异性却得到了极大的提升。
从上述结果的判断方案可以看出，本发明试剂盒可准确用于子宫内膜癌的检测。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (5)

1.一种子宫内膜癌基因甲基化检测的引物探针在制备子宫内膜癌诊断试剂中的应用，其特征在于，包括能够特异性检测生物样本中以下（a）-（b）中至少一种目标核苷酸序列中CpG二核苷酸位点甲基化水平的引物探针：
（a）如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41任一所示的核苷酸序列；
（b）如SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43任一所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用于扩增所述目标核苷酸序列的引物对选自以下组中的至少一组：
(1)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示的核酸分子；
(2)SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示的核酸分子；
(3)SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20所示的核酸分子；
(4)SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26所示的核酸分子。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，标记所述目标核苷酸序列的探针选自SEQID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:27中的一种或多种。
4.试剂盒在制备子宫内膜癌诊断试剂中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1中所述的子宫内膜癌引物探针。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述子宫内膜癌诊断试剂使用方法如下：
S1、将待测样品中目标基因的核酸中未甲基化的胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶，获得经修饰的待测样品；
S2、利用权利要求1-3任一项中所述的引物探针或权利要求4中所述的试剂盒对步骤S1经修饰的待测样品进行甲基化情况检测。
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