CN115851937A - 一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物及试剂盒和应用 - Google Patents
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Abstract
一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物及试剂盒和应用，涉及体外检测技术领域；包括用于检测PAX1、SOX1和PCDH10基因甲基化的引物对和探针；用于检测PAX1基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ IDNO:1‑2所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:3所示；用于检测SOX1基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:4‑5所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:6所示；用于检测PCDH10基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:7‑8所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:9所示。本发明的引物探针组合物，灵敏度高，特异性强，适用于宫颈癌的筛查和诊断。
Description
技术领域
本发明属于体外检测技术领域，具体涉及一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物及试剂盒和应用。
背景技术
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，其病变过程是从宫颈的低级别鳞状上皮内病变，逐渐变化为宫颈的高级别鳞状上皮内病变，进一步就会变成了癌变；宫颈癌的发展周期较长，在宫颈癌早期通过积极的治疗具有较高的生存率，因此，宫颈癌的早期发现、早期诊断、早期治疗具有极大的意义。
在大多数类型的癌症中基因改变的频率通常很低，在人类所有癌症种类中表观遗传学的改变远远超过体细胞的基因突变，表观遗传学的主要研究内容包括DNA的甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控和染色质结构重构，表观遗传学改变都被认为与肿瘤的发生有着密切关系；其中，DNA的甲基化是最为常见的表观遗传学改变，其可调控细胞增殖、凋亡与分化，且水平与肿瘤的生物学特性密切相关，因此DNA甲基化指标检测可以作为癌症诊断、早期筛查以及预后的重要生物指标。
针对DNA甲基化检测方法大致可分为两类：全基因组甲基化分析和特异位点甲基化检测。全基因组甲基化分析检测成本较高，常作为一种高通量的筛选发现目标基因的手段；特异位点甲基化检测方法有联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)、甲基化特异性PCR法(MSP)、甲基化荧光定量法(MethyLight)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法等，甲基化荧光定量法基于其高通量和高灵敏性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差，在DNA甲基化的检测中应用广泛。
通过血浆循环游离DNA和宫颈分泌物中脱落细胞以及游离DNA的检测可对宫颈癌进行无创诊断；但是目前还没有效果好的宫颈癌的诊断指标。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物，灵敏度高，特异性强，可实现多个目的基因甲基化特异性扩增检测，适用于宫颈癌的筛查和诊断。
本发明的目的之二在于提供一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物在制备宫颈癌的早期筛查和诊断试剂中的应用。
本发明的目的之三在于提供一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的试剂盒，其敏感度高、特异性强，对宫颈癌的早期筛查、辅助诊断和预后评估具有较好效果。
本发明的目的之四在于提供一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的试剂盒在宫颈癌检测中的应用。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物，包括用于检测PAX1、SOX1和PCDH10基因甲基化的引物对和探针；
用于检测PAX1基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:1-2所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:3所示；
用于检测SOX1基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:4-5所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:6所示；
用于检测PCDH10基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:7-8所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:9所示。
进一步地，用于检测PAX1、SOX1和PCDH10基因甲基化的探针的5’端标记有FAM、ROX和CY5荧光基团中的任一种；探针的3’端标记有MGB、BHQ和TAMRA淬灭基团的任一种。
一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物在制备宫颈癌的早期筛查和诊断试剂中的应用。
进一步地，包括实时荧光定量PCR反应液，所述实时荧光定量PCR反应液包括所述的用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物。
进一步地，所述实时荧光定量PCR反应液还包括内参GAPDH基因的引物对和探针；所述内参GAPDH基因的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:10-11所示，探针的碱基序列如SEQID NO:12所示。
进一步地，内参GAPDH基因的探针的5’端标记有FAM、ROX和CY5荧光基团中的任一种；探针的3’端标记有MGB、BHQ淬灭基团的任一种。
进一步地，还包括裂解液、亚硫酸盐转化试剂和漂洗液。
一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的试剂盒在宫颈癌检测中的应用，所述应用中包括以下步骤：
1)收集样本(样本包括血浆、血清、宫颈分泌液中的任一种)，并从所述样本中提取游离DNA；
2)将所述游离DNA用亚硫酸氢盐转化试剂进行甲基化转化，得到bis-DNA；
3)将所述bis-DNA进行实时荧光定量PCR扩增反应，检测荧光信号并判定结果。
进一步地，步骤3)中，实时荧光定量PCR扩增的程序为：温度93-97℃处理4-6min，循环1-2次；温度93-97℃处理14-16s，然后温度64-68℃处理28-32s，循环18-22次；温度93-97℃处理9-11s，然后温度60-64℃处理30-32s，采集荧光，循环38-42次。
进一步地，步骤3)中，实时荧光定量PCR扩增的程序为：温度95℃处理5min，循环1次；温度95℃处理15s，然后温度66℃处理30s，循环20次；温度95℃处理10s，然后温度62℃处理31s，采集荧光，循环40次。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明的一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物，可对PAX1、SOX1和PCDH10基因的甲基化特异性扩增和标记，灵敏度高，特异性强，可应用在制备宫颈癌的早期筛查和诊断试剂。
本发明的一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的试剂盒，可以方便快捷地在分子水平上实现对宫颈癌的检测，通过多个靶基因的甲基化联合检测以提高准确度，对宫颈癌的恶性程度和预后判断，具有准确度高、灵活快速和经济节约的优点，可进行无创早期筛查，有利于宫颈癌的早期发现。
附图说明
图1为本发明实施例3中采用第一实时荧光定量PCR反应液的扩增曲线图；其中，线1为GAPDH，线2为PAX1。
图2为本发明实施例3中采用第二实时荧光定量PCR反应液的扩增曲线图；其中，线1为GAPDH，线2为SOX1。
图3为本发明实施例3中采用第三实时荧光定量PCR反应液的扩增曲线图；其中，线1为GAPDH，线2为PCDH10。
具体实施方式
下面，结合附图与具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物，所述引物探针组合物用于PAX1、SOX1和PCDH10基因甲基化检测。
本实施例根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)公开的人类全基因组序列，筛选得到对宫颈癌具有显著差异性的靶基因：PAX1、SOX1和PCDH10基因，设计得到对应的引物及探针，经筛选获得特异性和灵敏度效果最优的引物序列如下：
用于检测PAX1基因甲基化的引物对包括正向引物PAX1-Me-F和反向引物PAX1-Me-R，碱基序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；其探针的5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有MGB淬灭基团，命名为：PAX1-Me-Probe(FAM)，序列如SEQ ID NO:3所示。
用于检测SOX1基因甲基化的引物对包括正向引物SOX1-Me-F和反向引物SOX1-Me-R，碱基序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；其探针的5’端标记有ROX荧光基团，3’端标记有BHQ淬灭基团，命名为：SOX1-Me-Probe(ROX)，序列如SEQ ID NO:6所示。
用于检测PCDH10基因甲基化的引物对包括正向引物PCDH10-Me-F和反向引物PCDH10-Me-R，碱基序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；其探针的5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有MGB淬灭基团，命名为：PCDH10-Me-Probe(FAM)，序列如SEQ ID NO:9所示。
内参基因为GAPDH，所述内参基因的引物对分别记为GAPDH-Me-F和GAPDH-Me-R，序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示；其探针标记有CY5荧光基团，命名为：GAPDH-Me-Probe(CY5)，序列如SEQ ID NO:12所示。
本实施例的引物探针组合物的碱基序列具体如表1所示。
表1引物探针组合物序列
实施例2
一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、裂解液、亚硫酸盐转化试剂和漂洗液，所述实时荧光定量PCR反应液包括实施例1中用于检测PAX1、SOX1和PCDH10基因甲基化的引物探针组合物以及所述内参GAPDH基因的引物探针组合物。
实施例3
本实施例为采用实施例2的用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的试剂盒在宫颈癌检测的使用方法和应用，包括以下步骤：
1、收集宫颈脱落细胞样本，并从所述宫颈脱落细胞样本中提取游离DNA；
具体为：(1)取宫颈脱落细胞样本，加入500μL细胞保存液混合均匀，再加入500μL裂解液，70℃下裂解40min；
(2)向裂解处理后的物料加入200μL异丙醇充分混匀，加入吸附柱中，全速离心30s，加入漂洗液进行洗涤，重复洗涤2-4次后，静置，离心收集DNA。
2、将所述游离DNA用亚硫酸氢盐转化试剂进行转化，将基因中的胞嘧啶转化成尿嘧啶，得到bis-DNA；
具体为：(1)将游离DNA全部转移至0.2mL离心管中，添加150μL亚硫酸氢盐转化剂，摇匀后置于变温器中，设置条件为：
①98℃，10min；
②62℃，90min；
③4℃保持(不超过20h)。
(2)待转化反应完成后，移至吸附柱中，洗涤，离心，收集，得到bis-DNA。
通过轻弹离心管或移液器轻柔吹打操作混匀后短暂离心。
3、将所述bis-DNA进行实时荧光定量PCR扩增反应，检测荧光信号并判定结果。
具体为：(1)按照表2-4分别配制第一实时荧光定量PCR反应液和第二实时荧光定量PCR反应液和第三实时荧光定量PCR反应液。
表2
| 引物探针名称 | 加入量(μL) |
| PAX1-Me-F | 0.23 |
| PAX1-Me-Probe(FAM) | 0.10 |
| PAX1-Me-R | 0.23 |
| GAPDH-Me-F | 0.08 |
| GAPDH-Me-R | 0.08 |
| GAPDH-Me-Probe(CY5) | 0.08 |
| Bis-DNA | 5 |
| 2×Epitectmethylight master mix | 7.5 |
| RNase-Free Water | 1.7 |
| 总量 | 15 |
表3
表4
| 引物探针名称 | 加入量(μL) |
| PCDH10-Me-F | 0.12 |
| PCDH10-Me-Probe(FAM) | 0.10 |
| PCDH10-Me-R | 0.12 |
| GAPDH-Me-F | 0.08 |
| GAPDH-Me-R | 0.08 |
| GAPDH-Me-Probe(CY5) | 0.08 |
| Bis-DNA | 5 |
| 2×Epitectmethylight master mix | 7.5 |
| RNase-Free Water | 1.92 |
| 总量 | 15 |
(2)将第一实时荧光定量PCR反应液和第二实时荧光定量PCR反应液和第三实时荧光定量PCR反应液分别送入PCR仪器中进行反应，反应条件如表5所示。
表5PCR反应条件设置
(3)分别读取第一实时荧光定量PCR反应液和第二实时荧光定量PCR反应液和第三实时荧光定量PCR反应液的CT值。
本实施例中采用20组正常样本(标记为N1～N20)和20组宫颈癌样本(标记为C1～C20)进行荧光定量PCR检测，扩增曲线图如图1-3所示，根据检测的CT值换算成甲基化数值(EI)，结果如表6所示。
计算方法为：
总EI值＝各目的基因EI值之和；
△CT＝目的基因CT值-内参基因CT值；
CT值与EI值的换算
(1)目的基因CT＝0；EI＝0；
(2)△CT≤7时，EI＝1；
(3)△CT＞7时，EI＝0。
表6
本实施例取EI的临界值(cut-off值)＝2，当总EI值≥2时，检测结果为阳性，总EI值＜2时，检测结果为阴性；
灵敏性＝检测结果为阳性的宫颈癌样本数/总宫颈癌样本数；
特异性＝检测结果为阴性的正常样本数/总正常样本数。
根据表6的检测结果，对检测结果为阳性的胃癌样本数和检测结果为阴性的正常样本数进行统计得到表7-8。
表7宫颈癌样本的检测结果
| 样本数量 | I期 | II期 | III期 | IV期 | 总计 |
| 20 | 8/11 | 6/7 | 1/1 | 1/1 | 16/20 |
表8正常样本的检测结果
| 样本数量 | 正常人 |
| 20 | 19/20 |
从表6-8可得，在20组正常样本和20组宫颈癌样本，本实施例的试剂盒的灵敏性为80.00％(16/20)，特异性为95.00％(19/20)；证明本发明的试剂盒及其检测方法能有效对PAX1、SOX1和PCDH10基因甲基化检测，并具有较高的灵敏性和特异性，为宫颈癌的早期筛查和诊断提供参考依据。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物，其特征在于，包括用于检测PAX1、SOX1和PCDH10基因甲基化的引物对和探针；
用于检测PAX1基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:1-2所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:3所示；
用于检测SOX1基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:4-5所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:6所示；
用于检测PCDH10基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:7-8所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:9所示。
2.如权利要求1所述的用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物，其特征在于：用于检测PAX1、SOX1和PCDH10基因甲基化的探针的5’端标记有FAM、ROX和CY5荧光基团中的任一种；探针的3’端标记有MGB、BHQ和TAMRA淬灭基团的任一种。
3.一种权利要求1或2所述的用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物在制备宫颈癌的早期筛查和诊断试剂中的应用。
4.一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的试剂盒，其特征在于：包括实时荧光定量PCR反应液，所述实时荧光定量PCR反应液包括权利要求1或2所述的用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物。
5.如权利要求4所述的用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的试剂盒，其特征在于：所述实时荧光定量PCR反应液还包括内参GAPDH基因的引物对和探针；所述内参GAPDH基因的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:10-11所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:12所示。
6.如权利要求5所述的用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的试剂盒，其特征在于：内参GAPDH基因的探针的5’端标记有FAM、ROX和CY5荧光基团中的任一种；探针的3’端标记有MGB、BHQ淬灭基团的任一种。
7.如权利要求4所述的用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的试剂盒，其特征在于：还包括裂解液、亚硫酸盐转化试剂和漂洗液。
8.一种权利要求4-7任一项所述的用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的试剂盒在宫颈癌检测中的应用，其特征在于，所述应用中包括以下步骤：
1)收集样本，并从所述样本中提取游离DNA；
2)将所述游离DNA用亚硫酸氢盐转化试剂进行甲基化转化，得到bis-DNA；
3)将所述bis-DNA进行实时荧光定量PCR扩增反应，检测荧光信号并判定结果。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤3)中，实时荧光定量PCR扩增的程序为：温度93-97℃处理4-6min，循环1-2次；温度93-97℃处理14-16s，然后温度64-68℃处理28-32s，循环18-22次；温度93-97℃处理9-11s，然后温度60-64℃处理30-32s，采集荧光，循环38-42次。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤3)中，实时荧光定量PCR扩增的程序为：温度95℃处理5min，循环1次；温度95℃处理15s，然后温度66℃处理30s，循环20次；温度95℃处理10s，然后温度62℃处理31s，采集荧光，循环40次。
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