CN109837344B - 一种甲基化的EphA7核苷酸片段及其检测方法和应用 - Google Patents

一种甲基化的EphA7核苷酸片段及其检测方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109837344B
CN109837344B CN201910159469.2A CN201910159469A CN109837344B CN 109837344 B CN109837344 B CN 109837344B CN 201910159469 A CN201910159469 A CN 201910159469A CN 109837344 B CN109837344 B CN 109837344B
Authority
CN
China
Prior art keywords
epha7
dna
methylated
cervical cancer
cervical
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910159469.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109837344A (zh
Inventor
王蓉
曹会玲
范永娟
赵敬
梁政
时淑娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Medical University
Original Assignee
Tianjin Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Medical University filed Critical Tianjin Medical University
Priority to CN201910159469.2A priority Critical patent/CN109837344B/zh
Publication of CN109837344A publication Critical patent/CN109837344A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109837344B publication Critical patent/CN109837344B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及基因工程和医学检测技术领域，本发明提供一种作为宫颈癌特异性诊断标志物的甲基化的EphA7核苷酸片段，以及相关的检测方法的引物组、探针和试剂盒，以及甲基化的EphA7核苷酸片段在制备宫颈癌筛查诊断制剂中的应用。本发明发现宫颈组织中EphA7基因的启动子区域的甲基化程度与宫颈癌的发生显著相关，可以作为辅助诊断宫颈癌的生物标志物，从而及时对人宫颈癌进行筛查和早期诊断，避免医疗资源的浪费。

Description

一种甲基化的EphA7核苷酸片段及其检测方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程和医学检测技术领域，尤其涉及一种甲基化的EphA7核苷酸片段及其检测方法和应用。
背景技术
宫颈癌(Cervical cancer，CC)是女性的常见癌症之一，据统计，2018年全世界约有570,000新发病例和311,000死亡病例。在发达国家宫颈癌位居女性癌症的第四位，而在发展中国家宫颈癌仍位居女性癌症的第二位。我国每年的新发病例数为13.3万以上，每年约有2-3万妇女死于宫颈癌，且近年来我国年轻妇女的宫颈癌发病率，死亡率呈上升趋势。
宫颈癌不同于其他肿瘤，疾病自然史明确，有一系列的癌前病变，它的发生和发展是由量变到质变、渐变到突变，要经历几年到十几年的过程。因此，宫颈癌的防治关键在于通过筛查及时发现和治疗宫颈病变，终止其向宫颈癌的发展。因而，早发现、早诊断及早治疗对于提高宫颈癌治疗效果具有重大意义。
目前采用的宫颈癌常规筛查技术包括基于细胞学的巴氏涂片法(Pap smear)和液基薄层细胞学法(Thin-Cytologic Test，TCT)及-人乳头瘤状病毒(Humanpapillomavirus,HPV)的检测。
然而，巴氏涂片法和液基薄层细胞学检测灵敏度低，特异性一般，检测方法的人为干扰因素较大；
HPV-DNA检测技术灵敏度高，特异性低，检测方法通量高，适用于大规模临床筛查，但是假阳性率高，尤其不适于年轻妇女的筛查。
上述这些方法均存在操作繁琐、或灵敏度低、或假阳性率高等缺点，限制了其在临床实验室的应用。
近年来，随着人们对甲基化认识的不断深入，发现基因启动子区异常甲基化是肿瘤发生的一个早期事件，是肿瘤早期诊断非常有效的分子标志。此外，在肿瘤的发生发展过程中，DNA甲基化的动态改变还反映了肿瘤的病变程度、侵袭转移及患者的预后情况。在肿瘤的发生发展过程中包含两类机制：一是遗传学机制，即DNA序列改变造成基因突变；二是表观遗传学机制，即不依赖DNA序列的改变，而是通过碱基修饰调整染色质结构导致基因表达的改变，是一种可逆的变化过程，其分子机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰等。其中，DNA甲基化(DNAmethylation)是表观遗传学修饰的最重要调控方式之一,某些抑癌基因启动子区发生甲基化修饰，可降低其转录活性，使基因表达沉默，导致细胞增殖异常而产生恶性肿瘤。
EphA7基因定位于染色体6q16.1，其基因同源性较高且在人体内广泛分布。EphA7受体及其配体Ephrin结合，参与脊椎动物胚胎的早期发育和轴突导向等许多重要的生理过程，其在中枢神经系统发育、大脑连接处的形成、神经嵴细胞导向以及运动神经轴突形成过程中发挥着关键作用。然而既往研究多集中在其生理角色，近年来，研究发现了一些Eph家族基因与肿瘤的发生相关，但对EphA7的研究相对较少，亦未见其与宫颈癌相关性的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种作为宫颈癌特异性诊断标志物的甲基化的EphA7核苷酸片段，以及相关的检测方法的引物组、探针和试剂盒，以及甲基化的EphA7核苷酸片段在制备宫颈癌筛查诊断制剂中的应用。
本发明采取以下技术方案实现：一种甲基化的EphA7核苷酸片段，该片段作为宫颈癌特异性诊断标志物，该片段的核苷酸序列为：
5’-ATTTGATTTCGTTCGGTATCGATTGGTTTTTGTTTCGGATTTCGTTTTCGTGGTCGGGGCGGTTATTTCGTCGGGATTCGTTTTTTGGTTTTGGGAATCGTTTTTTGGTAGGTCGGT-3’(如SEQ ID NO:1所示)。
本发明的第二个目的在于，提供了一种甲基化的EphA7核苷酸片段的检测方法，采用焦磷酸测序法检测，包括以下步骤：
步骤一，取待检测样本抽提的DNA,对其进行亚硫酸盐转化处理,经亚硫酸盐转化后的DNA(BS-DNA)作为PCR扩增模板；
步骤二，对所述模板进行PCR扩增。
步骤三，采用实时定量焦磷酸序列分析仪对PCR产物进行焦磷酸测序。
进一步优选的，所述PCR扩增反应体系为25μl，反应终浓度包括1x PCR反应混合液，1x PCR反应优化液，无核酶水，15-20ng亚硫酸盐转化后的DNA(BS-DNA)，并使用焦磷酸测序PCR正向引物0.2μM，所述焦磷酸测序PCR正向引物序列为：5’-ATTTGGAGGGAATTTTGGATTAG-3’(如SEQ ID NO:2所示)，生物素(biotin)标记的焦磷酸测序PCR反向引物0.2μM，所述焦磷酸测序PCR反向引物序列为：5’-ACTCCACACTCCAATAATATCAATTAA-3’(如SEQ ID NO:3所示)，所述PCR扩增循环反应条件95℃15分钟；94℃、56℃、72℃各30秒，45个循环；72℃10分钟，然后对PCR产物进行焦磷酸测序。
进一步优选的，所述焦磷酸测序包括以下步骤：
步骤一，将混悬的链霉素包被的琼脂磁珠与PCR扩增产物混合；
步骤二，采用用真空过滤梳子吸附混有磁珠的PCR产物，再经70％乙醇，变性试剂，漂洗液逐步清洗，释放真空过滤梳子吸附的PCR产物到24孔测序板，并加入焦磷酸测序引物，所述焦磷酸测序引物序列为：5’-AGGGAATTTTGGATTAGTAA-3’(如SEQ ID NO:4所示)，80℃加热2分钟，室温冷却5分钟；
步骤三，将冷却后的板子放入焦磷酸序列分析仪(PyroMark Q24)，将焦磷酸测序反应的酶、核苷酸和底物，将这些试剂加入黑色的分配吸头，按照测序仪器软件程序中提供的体积，将黑色的分配吸头放到仪器中，开始测序。
进一步优选的，所述待检测样本是离体的宫颈组织、或宫颈刮片细胞、宫颈阴道拭子细胞、宫颈液基细胞学样品。
本发明的第三个目的在于，提供了一种甲基化的EphA7核苷酸片段的检测方法，采用荧光定量甲基化特异性PCR法检测，包括以下步骤：
步骤一，取待检测样本抽提的DNA,对其进行亚硫酸盐转化处理,经亚硫酸盐转化后的DNA(BS-DNA)作为PCR扩增模板；
步骤二，对所述模板进行荧光定量甲基化特异性PCR扩增；
步骤三，根据甲基化的EphA7基因与内参基因ACTB(β-actin)扩增结果的相对DNA量值来确定待检测样本的甲基化水平,即
Figure BDA0001984099990000031
优选的，所述PCR扩增的反应体系是10μl，反应混合物最终包括1×PCR反应混合液，无核酶水，25ng的BS-DNA，并使用荧光定量甲基化特异性PCR正向引物+荧光定量甲基化特异性PCR反向引物混合液共300nM(混合比例1:1)，FAM/BHQ1标记的荧光定量甲基化特异性PCR检测探针200nM，所述荧光定量甲基化特异性PCR正向引物序列为：5’-ATTTGATTTCGTTCGGTATC-3’(如SEQ ID NO:5所示)，所述荧光定量甲基化特异性PCR反向引物序列为：5’-ACCGACCTACCAAAAAACGAT-3’(如SEQ ID NO:6所示)，所述荧光定量甲基化特异性PCR检测探针序列为：5’-CGAAATCCGAAACAAAAACC-3’(如SEQ ID NO:7所示)，采用荧光定量PCR仪进行扩增反应，反应条件为95℃10分钟；95℃15秒，60℃1分钟，50个循环。
进一步优选的，所述待检测样本是离体的宫颈组织、或宫颈刮片细胞、宫颈阴道拭子细胞、宫颈液基细胞学样品。
本发明的第四个目的在于，提供了一种甲基化的EphA7核苷酸片段在制备宫颈癌诊断制剂中的应用。
本发明的第五个目的在于，提供了一种检测甲基化的EphA7核苷酸片段的试剂盒，采用焦磷酸测序法检测，所述试剂盒内包含PCR反应混合液、PCR反应优化液、无核酶水、链霉素包被的琼脂磁珠、酶混合液、底物混合液、四种脱氧核苷酸(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)、以及焦磷酸测序PCR正向引物、生物素(biotin)标记的焦磷酸测序PCR反向引物、焦磷酸测序引物；
所述焦磷酸测序PCR正向引物序列为：5’-ATTTGGAGGGAATTTTGGATTAG-3’(如SEQID NO:2所示)；
所述焦磷酸测序PCR反向引物序列为：5’-ACTCCACACTCCAATAATATCAATTAA-3’(如SEQ IDNO:3所示)；
所述焦磷酸测序引物序列为：5’-AGGGAATTTTGGATTAGTAA-3’(如SEQ ID NO:4所示)。
本发明的第六个目的在于，提供了一种检测甲基化的EphA7核苷酸片段的试剂盒，采用荧光定量甲基化特异性PCR法检测，所述试剂盒内包含荧光定量PCR反应混合液、无核酶水、以及荧光定量甲基化特异性PCR正向引物、荧光定量甲基化特异性PCR反向引物、FAM/BHQ1标记的荧光定量甲基化特异性PCR检测探针；
所述荧光定量甲基化特异性PCR正向引物序列为：5’-ATTTGATTTCGTTCGGTATC-3’(如SEQ ID NO:5所示)；
所述荧光定量甲基化特异性PCR反向引物序列为：5’-ACCGACCTACCAAAAAACGAT-3’(如SEQ ID NO:6所示)；
所述荧光定量甲基化特异性PCR检测探针序列为：5’-CGAAATCCGAAACAAAAACC-3’(如SEQ ID NO:7所示)。
本发明的优点和积极效果是：本发明解决上述传统宫颈癌筛查诊断方法客观性差、或操作繁琐、或灵敏度低、或假阳性率高、或不适于大样本筛查及自检样本筛查等缺点,本发明提供一种作为宫颈癌特异性诊断标志物的甲基化的EphA7核苷酸片段，以及相关的检测方法的引物组、探针和试剂盒，以及甲基化的EphA7核苷酸片段在制备宫颈癌筛查诊断制剂中的应用。本发明发现宫颈组织细胞中EphA7基因的启动子区域的甲基化程度与宫颈癌的发生显著相关，可以作为辅助诊断宫颈癌的生物标志物，从而及时对人宫颈癌进行筛查和早期诊断，避免医疗资源的浪费。
附图说明
图1EphA7核苷酸片段在宫颈组织中焦磷酸测序结果示意图；
图2EphA7核苷酸片段在宫颈组织的平均甲基化水平；
图3EphA7核苷酸片段每个CpG位点在宫颈组织的平均甲基化水平；
图4EphA7核苷酸片段在各期宫颈液基细胞中甲基化水平及检出率。
具体实施方式
1.1生物样本收集
收集就诊于天津市第一中心医院和天津市医科大学总医院妇产科患者及体检健康者的宫颈组织及脱落上皮细胞样本。
本发明所收集的宫颈正常组织样本来自不孕，纤维瘤，子宫下垂或多经患者，经子宫切除或宫颈切除术获得的组织，经病理诊断全部为良性，且患者没有非正常细胞学记录或癌症史的标本作为正常组织样本。
宫颈癌组织样本来自于病理诊断为癌症患者的放化疗前的宫颈活检组织标本或宫颈全切术中的肿瘤组织标本。
宫颈组织样本共计16例，其中，正常组织样本8例，宫颈癌组织样本8例，-80℃冷冻保存。
本发明所收集的正常宫颈细胞样本取自体检健康者的宫颈脱落上皮细胞。
宫颈癌前期病变的宫颈上皮内瘤变期(CIN2/CIN3)细胞样本取自宫颈液基细胞学检测异常，并经病理诊断为CIN的患者。
宫颈癌细胞样本采自病理诊断为癌症的患者，收集其放化疗前的液基细胞学标本。
宫颈细胞标本采用新柏氏薄层细胞学样本收集瓶(广州三渡医疗公司)收集，4℃保存，共计114例。其中，正常宫颈细胞样本28例，CIN2期宫颈细胞样本24例，CIN3期宫颈细胞样本45例，宫颈癌细胞学样本17例。
1.2DNA提取及质量检测
宫颈组织/细胞的DNA采用标准的酚氯仿法抽提.宫颈液基细胞学标本需先离心，取细胞沉淀，在宫颈组织/细胞沉淀中加入TNE裂解液(10mM Tris/HCL，pH＝7,5；150mMNaCl；10mM EDTA)，1％SDS和蛋白酶K，56℃过夜孵育，然后加入等体积的氯仿和酚混合液(24:1)抽提DNA，离心取上清液，再用等体积的异丙醇沉淀DNA，离心沉淀的DNA经70％乙醇漂洗2次,室温干燥后溶于150μl TE-4保存液(10mM Tris/HCL,pH＝7.5；0.1mM EDTA)。提取的DNA经Nanodrop 2000c检测，所有DNA溶液A260/A280比值均为1.7～1.9之间。
1.3DNA亚硫酸盐修饰(bisulfite conversion)
提取的DNA经亚硫酸盐处理后，DNA样品中的甲基化的胞嘧啶C不能发生脱氨基反应，保持C碱基不变，而非甲基化的胞嘧啶C发生脱氨基反应变成尿嘧啶U，在随后的PCR扩增反应中转换成胸腺嘧啶T，这样就造成了甲基化的DNA和非甲基化的DNA的序列差异，可以为后续的核酸检测方法检出。
本发明采用EZ DNA MethylationTM Kit试剂盒(美国Zymo Research公司)对提取的基因组DNA进行亚硫酸盐转化，按照操作说明，其主要操作流程包括：
取1μg样本DNA，采用试剂盒中的稀释缓冲液(Dilution buffer)变性样本DNA，加入“CT”碱基转换试剂(CT conversion reagent)，过夜孵育，将样品和结合缓冲液(Bindingbuffer)一起加入试剂盒中的DNA吸附柱，离心，洗涤柱子，再加入脱硫缓冲液(Desulphonation buffer)，然后再经洗涤缓冲液清洗柱子两次，最后用洗脱液洗脱DNA吸附柱上的DNA，收集洗脱的经亚硫酸盐转化的DNA(BS-DNA)，于-20℃妥善保存，作为后续实验的模板。
其中，未经亚硫酸盐处理的EphA7基因核苷酸片段序列为：
5’-ACCTGACTCCGCTCGGCACCGATTGGCTCCTGCCTCGGACCCCGCCCCCGTGGCCGGGGCGGCCATTTCGCCGGGACCCGCCCCTTGGCCCTGGGAATCGCCTCCTGGCAGGCCGGT-3’(如SEQ ID NO:8所示)。
经亚硫酸盐处理的甲基化的EphA7基因核苷酸片段序列为：
5’-ATTTGATTTCGTTCGGTATCGATTGGTTTTTGTTTCGGATTTCGTTTTCGTGGTCGGGGCGGTTATTTCGTCGGGATTCGTTTTTTGGTTTTGGGAATCGTTTTTTGGTAGGTCGGT-3’(如SEQ ID NO:1所示)。
经亚硫酸盐处理的甲基化的EphA7基因核苷酸片段的反向互补序列为：
5’-ACCGACCTACCAAAAAACGATTCCCAAAACCAAAAAACGAATCCCGACGAAATAACCGCCCCGACCACGAAAACGAAATCCGAAACAAAAACCAATCGATACCGAACGAAATCAAAT-3’(如SEQ ID NO:9所示)。
经亚硫酸盐处理的非甲基化的EphA7基因片段序列为：
5’-ATTTGATTTUGTTUGGTATUGATTGGTTTTTGTTTUGGATTTUGTTTTUGTGGTUGGGGUGGTTATTTUGTUGGGATTUGTTTTTTGGTTTTGGGAATUGTTTTTTGGTAGGTUGGT-3’(如SEQ ID NO:10所示)
在PCR反应中经亚硫酸盐处理的非甲基化的EphA7基因片段序列为：
5’-ATTTGATTTTGTTTGGTATTGATTGGTTTTTGTTTTGGATTTTGTTTTTGTGGTTGGGGTGGTTATTTTGTTGGGATTTGTTTTTTGGTTTTGGGAATTGTTTTTTGGTAGGTTGGT-3’(如SEQ ID NO:11所示)。
在PCR反应中经亚硫酸盐处理的非甲基化的EphA7基因片段的反向互补序列为：
5’-ACCAACCTACCAAAAAACAATTCCCAAAACCAAAAAACGAATCCCAACAAAATAACCACCCCAACCACAAAAACAAAATCCAAAACAAAAACCAATCAATACCAAACAAAATCAAAT-3’(如SEQ ID NO:12所示)。
实施例1：
焦磷酸测序法检测宫颈癌特异性EphA7基因甲基化
2.1焦磷酸测序法(Pyrosequencing)
焦磷酸测序法被称为甲基化分析的金标准，其测序原理为:首先使用亚硫酸盐处理的BS-DNA，经过PCR扩增基因片段作为待测序模板，然后测序部分是由4种酶，包括DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。每一轮测序反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果该dNTP与模板配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3'末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。加入的dNTP和释放的PPi是等量的。ATP硫酸化酶催化PPi与5'-磷酰硫酸(APS)结合形成ATP。然后生成的ATP在荧光素酶的催化作用下，和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。CCD感应器检测到光信号后，热解图(Pyrogram)再将光信号转化为检测峰，每个峰的高度(光信号)与加入的核苷酸数目呈正比。杂合子样本在CpG位点会出现两种碱基序列，同时，不同的信号峰可作为定量分析的根据。
2.2引物与探针设计
PCR扩增及测序引物采用PyroMark Assay Design Software 2.0设计，引物及探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列见表1。
表1引物/测序序列及PCR扩增产物大小
Figure BDA0001984099990000071
Figure BDA0001984099990000081
2.3PCR扩增与测序
按
Figure BDA0001984099990000083
PCR Kit(Qiagen，Hilden,德国)进行扩增，PCR反应体系为25μl(见表2)，反应终浓度包括1x PCR反应混合液(Pyromark master mix)，1x PCR反应优化液(Coralload conc.)，15-20ng的BS-DNA，无核酶水，和焦磷酸测序PCR正向引物(如SEQIDNO:2所示)0.2μM，生物素(biotin)标记的焦磷酸测序PCR反向引物(如SEQ ID NO:3所示)0.2μM，采用体检健康女性的白细胞BS-DNA混合液，作为甲基化水平的阴性对照；采用MsssI甲基化酶(美国NEB公司)修饰的健康女性白细胞BS-DNA作为甲基化水平的阳性对照。
表2.焦磷酸测序PCR反应体系
Figure BDA0001984099990000082
PCR循环反应条件95℃15分钟；94℃-56℃-72℃各30秒，45个循环；72℃10分钟。
采用PyroMark Q24(version 2.0.6)program设计焦磷酸测序的CpG实验，将模板序列输入程序，按软件说明设定仪器(PyroMark Q24)运行模拟程序。
然后按照仪器使用说明，采用测序试剂PyroGold Q24(Qiagen,Hilden,Germany)进行测序。
测序主要流程包括：
a.固定PCR产物：将60–75μl混悬的链霉素包被的琼脂磁珠(streptavidin-coated
Figure BDA0001984099990000084
beads，GE Health)加入PCR产物样品管(5–20μl)，制成终体积80μl；封口，将PCR管(盘)在室温(15–25℃)下，1400rpm震荡5–10分钟。
b.分离DNA链，置样本于PyroMark Q24板：采用PyroMark退火缓冲液稀释测序引物为0.3μM后，每个样品孔加入25μl，然后将样品板放入PyroMark Q24工作站。打开真空泵和过滤梳子(vacuum tool)的开关，用高纯水(
Figure BDA0001984099990000092
18.2MWx cm)冲洗过滤齿梳一次，再重新加入高纯水备用。将真空过滤梳子放入PCR板15秒来捕获磁珠和PCR产物的混合物。经70％乙醇冲洗梳子5秒，灭活试剂冲洗5秒，漂洗液洗涤10秒，然后抬高梳子呈90度，持续5秒，关闭梳子。将过滤梳子放在PyroMark Q24板子上，摇动，将测序引物与吸附的磁珠充分混合。将PyroMark Q24板子置入加热器。80℃加热2分钟，室温冷却5分钟，从而使得PCR扩增链与测序引物退火。
c.将冷却后的板子放入PyroMark Q24测试仪，将PyroMark Gold试剂包含用于焦磷酸测序反应的酶、核苷酸和底物，将这些试剂加入黑色的分配吸头，按照PyroMark Q24软件程序中提供的体积，试剂被加入到仪器中，用于焦磷酸测序。
采用SPSS软件包(SPSS20，Chicago，IL，USA)进行统计学分析。焦磷酸测序样本的平均甲基化水平采用student t检验比较。P<0.05为差异显著。
2.4焦磷酸测序结果
结果证实EphA7基因片段(SEQ ID NO:8的CpG位点)在宫颈癌组织呈现甲基化修饰(见图1)，癌症组平均甲基化水平(17.82±2.55)显著高于正常组甲基化水平(4.36±0.56)，P<0.001(见表3，图2)，且EphA7基因片段的每一个CpG位点在宫颈癌组织中的平均水平均高于正常组织(见表3，图3)。
表3 EphA7基因在宫颈组织中的甲基化水平
Figure BDA0001984099990000091
实施例2：
荧光定量法检测宫颈癌特异性EphA7基因甲基化
3.1荧光定量甲基化特异性PCR(QMSP)
荧光定量甲基化特异性PCR的原理为，经过亚硫酸盐处理后EphA7的DNA，甲基化的CpG位点的C碱基仍然保持C碱基，而没有甲基化的CpG位点的C碱基变成了U碱基，进而在PCR反应中转换成T碱基，因此，针对特异的甲基化的EphA7基因片段(如SEQ ID NO:1所示)设计引物和探针，经过QMSP扩增，则只有甲基化的EphA7基因被扩增，非甲基化的片段不能被扩增。
3.2引物与探针设计
QMSP引物设计采用methyl—primer v1.0设计，合成由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列见表4。
表4引物/探针序列及PCR扩增产物大小
Figure BDA0001984099990000101
3.3PCR扩增
QMSP的反应体系是10μl(表5)，反应混合物最终包括300nM的正向引物+反向引物混合液(混合比例1:1)，200nM的探针，1×的PCR反应混合液(QuantiTect ProbePCRbuffer)和25ng的BS-DNA。
表5:QMSP的反应体系
Figure BDA0001984099990000111
采用荧光定量PCR仪(Applied Biosystems 7900Sequence Detector)在384孔板中进行检测，每个样品均进行三次重复，所有的反应曲线均在临床资料未知的情况下进行分析和评分，一个DNA样品只有在3次重复中的2个或以上在50个循环前出现指数形曲线才被当作是阳性的。采用MsssI甲基化酶(美国NEB公司)修饰的健康女性白细胞的BS-DNA作为阳性对照，ddH2O作为PCR(QMSP)反应的阴性对照。
QMSP值通过校正DNA用量后获得，是两个绝对表达量的比值，即(见表6)
Figure BDA0001984099990000112
统计采用SPSS软件包(SPSS20，Chicago，IL，USA)进行统计学分析。各组间基因甲基化水平比较采用Kruskall-Wallis H；组间甲基化阳性率比较采用Fisher确切概率法。P<0.05为差异显著。
3.4检测结果
结果显示EphA7基因的甲基化水平和阳性率在正常组和癌症组具有显著差异(P<0.001)，且EphA7基因的甲基化水平随癌变进程的增加而增高(见图4)，其甲基化阳性检出率也随着病变级别的增高而增加，分别为正常0％(0/28)，CIN24.17％(1/24)，CIN311.11％(5/45)，肿瘤58.82％(10/17)(见图4)。
表6部分宫颈细胞学检测样本的QMSP值
样本ID EphA7DNA量 ACTBDNA量 QMSP值
正常 0 56.89452 0
CIN2 0.00045289248 318.2755 0.01423
CIN3 12.5519905 119.7181 1048.462
CIN3 0.00080929697 46.63625 0.173534
CIN3 0.07693311 103.6995 7.418849
CIN3 0.7148045 69.52565 102.8116
CIN3 0.0006545609 25.23304 0.259406
癌症 1.313756 48.46759 271.0586
癌症 7.723337 49.31247 1566.203
癌症 0.230289 4.195746 548.862
癌症 2.564833 10.92426 2347.832
癌症 0.010053 941.4521 0.106781
癌症 0.446355 23.0222 193.8804
癌症 0.254685 14.52319 175.3647
癌症 3.861625 103.6995 372.386
癌症 3.452016 138.804 248.6971
癌症 1.49352 140.8695 106.0216
综上所述，本发明提供一种作为宫颈癌特异性诊断标志物的甲基化的EphA7核苷酸片段，以及相关的检测方法的引物组、探针和试剂盒，以及甲基化的EphA7核苷酸片段在制备宫颈癌诊断制剂中的应用。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换,或直接或间接运用在其它相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内本发明中依赖于特异性序列的其他检测手段可以使用，包括但不限于电泳、杂交、扩增、定量甲基化特异性PCR(QMSP)、测序、链接酶链式反应、色谱法、质谱法。也可以使用这些技术的组合。
序列表
<110> 天津医科大学
<120> 一种甲基化的EphA7核苷酸片段及其检测方法和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atttgatttc gttcggtatc gattggtttt tgtttcggat ttcgttttcg tggtcggggc 60
ggttatttcg tcgggattcg ttttttggtt ttgggaatcg ttttttggta ggtcggt 117
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atttggaggg aattttggat tag 23
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actccacact ccaataatat caattaa 27
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agggaatttt ggattagtaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atttgatttc gttcggtatc 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
accgacctac caaaaaacga t 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgaaatccga aacaaaaacc 20
<210> 8
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acctgactcc gctcggcacc gattggctcc tgcctcggac cccgcccccg tggccggggc 60
ggccatttcg ccgggacccg ccccttggcc ctgggaatcg cctcctggca ggccggt 117
<210> 9
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
accgacctac caaaaaacga ttcccaaaac caaaaaacga atcccgacga aataaccgcc 60
ccgaccacga aaacgaaatc cgaaacaaaa accaatcgat accgaacgaa atcaaat 117
<210> 10
<211> 117
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atttgatttu gttuggtatu gattggtttt tgtttuggat ttugttttug tggtuggggu 60
ggttatttug tugggattug ttttttggtt ttgggaatug ttttttggta ggtuggt 117
<210> 11
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atttgatttt gtttggtatt gattggtttt tgttttggat tttgtttttg tggttggggt 60
ggttattttg ttgggatttg ttttttggtt ttgggaattg ttttttggta ggttggt 117
<210> 12
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
accaacctac caaaaaacaa ttcccaaaac caaaaaacga atcccaacaa aataaccacc 60
ccaaccacaa aaacaaaatc caaaacaaaa accaatcaat accaaacaaa atcaaat 117

Claims (2)

1.检测核苷酸序列如SEQ IDNO:1 所示的一种甲基化的EphA7 核苷酸片段的试剂在制备宫颈癌诊断制剂中的应用。
2.荧光定量 PCR 反应混合液、无核酶水、序列如SEQ ID NO:5 所示的荧光定量甲基化特异性PCR 正向引物、序列如SEQ ID NO:6 所示的荧光定量甲基化特异性 PCR 反向引物、序列如SEQ ID NO:7 所示的FAM/BHQ1 标记的荧光定量甲基化特异性PCR 检测探针在制备宫颈癌诊断试剂盒中的应用。
CN201910159469.2A 2019-03-04 2019-03-04 一种甲基化的EphA7核苷酸片段及其检测方法和应用 Active CN109837344B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910159469.2A CN109837344B (zh) 2019-03-04 2019-03-04 一种甲基化的EphA7核苷酸片段及其检测方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910159469.2A CN109837344B (zh) 2019-03-04 2019-03-04 一种甲基化的EphA7核苷酸片段及其检测方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109837344A CN109837344A (zh) 2019-06-04
CN109837344B true CN109837344B (zh) 2022-12-27

Family

ID=66885313

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910159469.2A Active CN109837344B (zh) 2019-03-04 2019-03-04 一种甲基化的EphA7核苷酸片段及其检测方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109837344B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112195251B (zh) * 2020-11-30 2022-08-05 中南大学 一种用于宫颈癌早筛的分子标志物、引物、方法及试剂盒
CN113201542B (zh) * 2021-04-29 2023-05-16 天津医科大学 单链向导rna在制备治疗宫颈癌等靶向药物上的用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105339507A (zh) * 2013-02-21 2016-02-17 托马生物科学公司 用于核酸分析的方法、组合物和试剂盒
CN106460070A (zh) * 2014-04-21 2017-02-22 纳特拉公司 检测染色体片段中的突变和倍性

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2852851A1 (en) * 2011-10-17 2013-04-25 King Abdullah University Of Science And Technology Composite biomarker for non-invasive screening, diagnosis and prognosis of colorectal cancer

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105339507A (zh) * 2013-02-21 2016-02-17 托马生物科学公司 用于核酸分析的方法、组合物和试剂盒
CN106460070A (zh) * 2014-04-21 2017-02-22 纳特拉公司 检测染色体片段中的突变和倍性

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Aberrant methylation of EphA7 in human prostate cancer and its relation to clinicopathologic features;M. Guan等;《Int. J. Cancer》;20080926;第124卷;第88-94页 *
The Identification and Validation of EphA7 Hypermethylation, a Novel Biomarker, in Cervical Cancer;W. Zhang等;《Research Square》;20211112;第1-21页 *
高甲基化导致EphA7基因在结直肠癌中低表达;王建东,周晓军;《医学研究生学报》;20070120;第20卷(第1期);第6-9、14页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109837344A (zh) 2019-06-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110964826B (zh) 一种结直肠癌抑癌基因甲基化高通量检测试剂盒及其应用
CN109207592B (zh) 用于结直肠癌检测的试剂盒及其应用
EP2891720B1 (en) Method for screening cancer
CN105555965B (zh) 确定核酸混合物中核酸组成的方法
CN114317738B (zh) 用于检测胃癌淋巴结节转移相关的甲基化生物标记物或其组合及应用
CN110484621B (zh) 一种肝癌早期预警的方法
CN109837344B (zh) 一种甲基化的EphA7核苷酸片段及其检测方法和应用
CN115820847A (zh) 一种用于宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂及其应用
CN106048021B (zh) 用于检测微量组织中p53基因突变的引物组合及其应用
CN113549694A (zh) 一种新型宫颈癌甲基化基因检测方法
CN113355414A (zh) 食管癌检测试剂盒及其应用
CN117431321A (zh) 一种用于前列腺癌或癌前病变检测的核酸组合物、试剂盒及应用
TWI385252B (zh) 一種癌症篩檢的方法
CN114891886B (zh) 用于诊断膀胱癌的核酸产品、试剂盒及应用
CN110791567B (zh) 一种单个位点dna甲基化检测试剂盒
CN116555423A (zh) 肺癌甲基化标志物组合、检测产品及其应用
EP2450455A1 (en) Method for determining presence or absence of epithelial cancer-origin cell in biological sample, and molecular marker and kit therefor
CN113122632A (zh) 检测dna甲基化的试剂及用途
CN114959030B (zh) 检测hcg9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用
CN116397024B (zh) 一种用于肺癌患者筛查的多基因联合检测试剂盒
CN117327794A (zh) 一种用于检测肺结节良恶性的试剂、试剂盒及应用
CN116463417A (zh) 检测目标区域甲基化水平的试剂在制备肝癌诊断产品中的应用
CN117265110A (zh) 一种用于检测肺鳞癌的试剂盒及应用
CN117778573A (zh) 一种用于检测甲状腺癌生物标志物的核酸组合、试剂盒及应用
CN117106899A (zh) 一种用于检测肺结节良恶性的引物对、引物探针组合、试剂盒及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
OL01 Intention to license declared
OL01 Intention to license declared